JPS61247396A - ゲニステインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は９発酵法によるゲニステインのＱ法に関する。

さらに詳しくは１本発明は、シー−トモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　）属に属するゲニステイン（化学名：
　５，７．４’−）リヒドロキシインフラボン）生産菌
を培地に培養し、培讐物よりゲニステインを採取するこ
とを特徴とするゲニステインの製造法に関する。

（従来の技術） ゲニステインは、ジャーナル　オプ　ザ　ケミカル　ソ
サエティー３４４７頁（１９５１年）に記載されている
公知化合物である。同刊行物によればゲニステインは、
ある糧のクローバ−（Ｔｒｉｆｏ−１ｉｕｍ　ｓｕｂｔ
ｅｒｒａｎｅｕｍ　Ｌ、）から単離され、ニストロジー
ン作用を有する物質として報告されている。

（解決手段） 、本発明者等は、土壌から分離したシュードモナス　ニ
ス・ビーＹＯ−０１７０Ｊ株（微工研菌寄第８１７０号
）を培養し、その培養液から、癌遺伝子産物であるチロ
シン特異的リン酸化酵素の阻止作用を有する物質を分離
した。そしてこの物質がゲニステインであることを確認
し１本発明を完成した。

本発明の製造法で使用される　ＹＯ−０ｔ７０　Ｊ株の
菌学的性状は、以下の通りである。

ＹＯ−０１７０Ｊ株の菌学的性質 １、形態的性債 肉汁寒天培地で２〜３日培養した細胞は。

０．６　＋、　ｏ、ｓ　Ｘ　１．２〜１．８　Ａｍの桿
菌で、１〜２本の極鞭毛を有し、運動性がある。胞子は
形成せず、ダラム陰性である。

２、各種培地での生育状態 ■肉汁寒天培地（２８Ｃ，２〜７日） 菌体はうす黄茶色を呈し、増殖はさかんである。

■肉汁プロス（２８Ｃ，２〜７日） 培地が全体に濁る。

■　リドマスミルク（３７Ｃ，２〜１ｏ日）中性〜アル
カリ性のまま液化される。

■肉汁ゼラチン穿刺培養（２８Ｃ，２〜１ｏ日）わずか
に液化する。

■生理的性質 ■炭素源の利用性 以上の菌学的性質を有する既知菌種をパージエイズ　マ
ニュアル　オプ　デターミネイティブ　バクテリオロジ
イ第８版及びパージエイズマニュアル　オプ　システマ
ティ、り　バクテリオロジイ第−巻、及び過去の文献に
より検索した。

ＹＯ−０１７０Ｊ株は、ダラム陰性桿菌で、胞子を形成
せず極毛性の鞭毛な有する絶対好気性の菌である。この
様な性質を有する菌属として。

シュードモナス属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏ
−ｎａｓ　）属、フラトイリア（Ｆｒａｔｅｕｒｉａ　
）属、ズーグロア（Ｚｏｏｇｌｏｅａ　）属があげられ
るが、キサントモナス属の菌は特徴的な黄色の色素キサ
ントモナスン（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄｉｎ　）を生成
するのに対し２本菌株ではその様な特徴はみられない。

また、フラトイリア属の菌は、３０％グルコース中で生
育し。

ＧＹＣ寒天培地（グルコース１％、イーストエキス０．
２％、カザミノ酸０．２％、リン酸二カリウム０．０５
％。

寒天１．５％、ｐＨ７，３）で特徴的な可溶性色素を生
成する点で本菌株と異なる。ズーグリア属の菌は、菌体
外にスライムを形成し、寒天培地中で特徴ある生育を示
す（Ｚｏｏｇｌｏｅａの形成）ことで本菌株と明白に異
なる。一方、シュードモナス属について記載された諸性
貴は１本菌株の性質と一致している事より２本菌株はシ
ュードモナス属の一菌種であると判断される。

さらに、シュードモナス属の菌について上記の文献など
により検索すると本菌株は、ポリβ−ハイドロキシブチ
レートを菌体内に蓄積せず。

又これを炭素源として利用できないことから。

シュードモナス属のセクションＩＫ属すると考えられる
。これらのグループのうちで、蛍光色素を生成せず、グ
ルコースを唯一の炭素源として生育でき゛る菌としては
、シュードモナスシュトッツェイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　５ｔｕｔｚｅｉ）及びシュ−ドモナス属シナ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）があげら
れる０前者は脱窒反応及びデンプンの加水分解能が陽性
であるが本菌株ではこれらは陰性である。又、炭素源の
利用性も若干具なる。一方後者は９本菌株でみられない
黄色の可溶性色素を生産するが、それ以外の性質は、は
ぼ一致していることから。

本菌株は、シュードモナス　メンドシナにきわめて近縁
の種であると判断される。これらの観点て基づき１本菌
株をシュードモナス　ニス・ピーＹＯ−０１７０Ｊ株と
命名した。

本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所て受託番号
微工研菌寄第８１７０号として寄託されている。

ゲニステイン生産菌については、土壌分離株のほか自然
の突然変異によって得られる突然変異体ならびに上記記
載の微生物から、Ｘ線照射、紫外線照射、ニトロソグア
ニジン処理、ナイトロジ。

ンマスタード等のような慣用の手段によって得られる。

人工突然変異体を得ることＫよって。

ゲニステインの生産を高めることが出来る。

この発明のゲニステインの生産は１例えば。

シュードモナス・ニス・ヒーＹＯ−０１７ｏＪ株ヲ。

炭素源、および窒素源を含有する栄養培地中。

例えば、振とう培養、液体培養９等の好気的培養条件下
知培養する事てよって行われる。

栄養培地中の好ましい炭素源としては９例えば、ぶどう
糖、澱粉、果糖、グリセリン等のような炭水化物等が挙
げられ、その他、乳糖、アラビノース、キシロース、デ
キストリン、糖蜜等が挙げられる。

好ましい窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、グル
テンミール、綿実粉、大豆粉、乾燥酵母、小麦胚芽、ふ
すま、コーンステイープリカー、７アーマメデイア、硫
酸アンモニウム。

リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、等のアンモニ
ウム塩、尿素、アミノ酸等のような無機および有機窒素
化合物が挙げられる。

炭素源および窒素源は組合せて使用するのが有利である
。又、必要な場合は、培地に、炭酸カルシウム、リン酸
ナトリウム、またはリン酸カリウム、塩化ナトリウム、
または塩化カリウム、マグネシウム塩類、銅塩、コバル
ト塩類等のようなミネラル塩類を添加してもよい。

培地が著しく発泡する場合には、液状パラフィン、脂肪
油、植物油、鉱物油、−又はシリコンのような消泡剤を
加えてもよい。

ゲニスティ７の生産には好気的液体培養が望ましい。

小量生産の場合にはフラスコ等により振と５培養か表面
培養が行われる。さらにまた大型タンク中で培養する場
合には、ゲニステインの生産工程での生育遅延を避ける
ために生産タンつて微生物を成長能力のある形で接種す
ることが゛　好ましく・。すなわち、最初に成長力のあ
る微生物を、少量の培地に該微生物の菌体を接種するこ
とＫより生長させ、これらを培養し２次いで培養した成
長力のある微生物を大型夕／りに無菌接種する。

培養物の攪拌および通気は種々の方法で行なうことが出
来る。攪拌はプロペラまたは、類似の機械的攪拌装置て
よるか、醗酵フラスコの回転又は振とうによるか１種々
のポンプ装置によるか、または培地中を滅菌空気を通過
させることにより行うことが出来る。

醗酵は通常、約２０°〜４０Ｃの温度範囲、好ましくは
２７Ｃで約５０〜１５０時間行われる、ゲニステインは
培地から、従来公知の他の醗酵生産物の回収に通常使用
される慣用の手段によって回収する事が出来る。

このようにして生産されたゲニステインの大部分は通常
、培養液中に見い出されるので、培養液の菌体をｒ過ま
たは遠心分離で除去して得られるｒ液から有機溶剤によ
る抽出、非イオン吸着樹脂等の処理、　ｐＨ調整、凍結
乾燥、減圧濃縮等の手段を組合せて分離・精製すること
が出来る。

有機溶剤としては酢酸エチル、クロロホルム。

メチルインブチルケトン、ブタノール等が利用され、非
イオン吸着樹脂としては１例えばＨＰ　−２０、活性炭
、ケイ酸、シリカゲル、セルロース。

アルミナ等の吸着剤処理が用（・られる。

このようにして得られるゲニステインは下記の物理化学
的性質を有する。

１）分子量 質量分析（マススペクトル） Ｍ　＝　２７０ ２）分子式 Ｃ１０ＨＩＯＯ４０ ３）紫外部吸収　２６３ｍμ ４）核磁気共鳴スペクトル 、ＣＤ、ＯＤ（δ）　：　８．０５（ＩＨｔ　ｓ）　７
．３７（２Ｈ＋　ｄ）６．８４（２Ｈ，ｄ）　６．３４
（ＩＨ，ｄ）６．２２（ＩＨ，ｄ） ５）溶解度 メタノール、エタノールに可溶、酢酸エチル、アセトン
、クロロホルムに難溶。

水、ベンゼン、トルエン如不溶 ６）呈色反応 過マンガン酸カリウム、ヨウ素に対して陽性、ニンヒド
リン、ドラゲンドルフ陰性 ７）物質の性質 酸性 上記物理化学的性質は、別途化学的に合成された下記化
学構造式を有するゲニステインと一致する。

（ゲニステイン） （実施例） つぎに１本発明をさら忙説明するため、実施例を掲記す
るが１本発明はこの実施例に限定されるものではない。

実施例　１゜ （１）土壌より、ゲニステイン生産菌株の分離ゲニステ
インはシュードモナス属に属するゲニステイン生産菌を
培地に培養することにより行われる。シュードモナス属
に属するゲニステイン生産菌株は以下忙示す希釈平板法
を用いて土壌中より分離される。

乾燥重量で約１ｇ当量の土壌を滅菌試験管に取り、滅菌
蒸留水を加えて１０ｍＬとした。次いでこの混合物を試
験管振盪器により１０秒間混合し、１０分間放置した。

試験管内容物０．５　ｍｌを滅菌水４．５　ｍｌに注ぎ
、　　１０倍希釈とした。　この操作を次の試験管から
繰り返して１００倍希釈液１．０００倍希釈液を作り夫
々の希釈液の０．０５　ｍｌ−０，５ｒｎｌをベトＩＪ
血中の１２０　Ｃ２０分滅菌溶解したアルギニ７・ビタ
ミン寒天培地（ＡＶ培地）（Ｌ−アルギニン０．３ｇ。

グルコースｉ、Ｏｒ、　　グリセロール１．ｏｇ、リン
酸二カリウム０．３　ｇ　、硫酸マグネシウム０．３　
ｇ　＋食塩０．３　ｇ　を硫酸鉄１呵、塩化マンガン１
１Ｑｇ、硫酸亜鉛１ｍｇ、チアミン塩酸塩０．５ｆｔ１
ｇ、　　リボフラビン０．５■、ニコチン酸アミドｏ、
ｓｍｇ、　　ピリドキシン塩酸塩０．５ｆｆ１ｇ、イノ
シトール０．５■、パントテン酸カルシウムｏ、ｓ　ｍ
ｇ　。

パラアミノ安息香酸ｏ、ｓｍｇ、　　ビオチン０．２５
ｒｒ＠、寒天１５ｇ、蒸留水１１．　ｐＨ６，４）　１
０〜２０　ｍｌの中に混和し、室温放置し固まらせた。

平板を２７Ｃで５〜７日間培養し１次いで生育コロニー
を釣り上げ。

ベネット寒天培地（グルコース１％＊　ＮＺ　　７　ミ
ン０．２％、牛肉エキス０．１％、酵母エキス０．１％
、寒天１５ｇ／Ｚ、　ｐＨ７，３）斜面に移植し、２７
Ｃで２日間培養した。

単離したコロニー中にシュードモナス属に属する菌株を
見い出すことが出来た。シー−トモナス属に属するゲニ
ステイ／生産菌中好ましい菌株（ＹＯ−０１７０Ｊ株と
称す）が、上記分離法によって土壌試料から新たに単離
された。これは前記の菌学的性質を有する。

（２）　　醗酵法によるゲニステインの採取ベネット寒
天培地に発育させたシュードモナス　ニス・ビー　ＹＯ
−０１７０Ｊ株の菌体を、グルコース３％、デキストリ
ン３％、　Ｓ［Ｉミート１．５％ファーマメディア１．
５％、リン酸二カリウム０−６ｇＡｓリン酸−カリウム
０．２５ｇ／ｌ＋塩化コバルト０．００４ｇ／ｌ＋を含
む培地（５００ｍｌ容の三角フラスコに各々６０ｍ４の
培地を分注して１２０　ｔ：’　２０分間滅菌したもの
）に接種して２８　Ｃで三日間振盪培養し１種培養液と
する（消泡剤としてアデカノールを用いた）、次に、同
じ培地成分を同容量含む三角フラスコ８５０本を用意し
、　１２０　ｔ：’　２０分間滅菌したものＫ。

種培養液より３％の割合に接種して、２８Ｃ，４日間２
２０回転／分で振盪培養する。培養終了後、夫々の三角
フラスコの培養液を集め合せて、希塩酸水溶液でｐＨ２
，０に調整し、　　３，０００回転１５分間遠心して菌
体を除き、その上清を集めると約４５ｔの培養液が得ら
れる。この液に同量の酢酸エチルを加えて攪拌したのち
、溶媒層を分離する。この溶媒層に水酸化ナトリウム水
溶液を用いてｐＨ７，０〜８．０に調整した蒸留水の等
量を加えて、攪拌したのち溶媒層を分離する。この分離
した酢酸エチル層を減圧下に蒸留乾個すると褐色の組物
５ｇ　５．１３ｇが得られる。この物質はグロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイ
エンシズ・オプ・ザ・ニーニスニー７５巻、　２０２１
〜２０２４頁（１９７８年）に記載のプロティンキナー
ゼ酵素阻止法を用いて検定すると、　８１．３　ｍｃｇ
／ｒｎｌが５０％阻止濃度（ＩＤｓｏ）であった。

この組物質５．１３ｇをシリカゲルクロマトグラフィ（
和光純薬製、カラムサイズ２．５　Ｘ　４５　ａｍ、担
体量２４０　ｍＺ　、　溶媒系　　クロロホルム：酢酸
エチル＝９：１）で１フラクシ１ン、１６ｍＺで精製分
画するとフラクシ首・７１６〜１００に有効成分の阻止
活性が認められた。この阻止活性の見られたフラクショ
ンを一つにまとめて、減圧下に蒸留乾個すると約４００
　ｆｆ１ｇの黄褐色の物質が得られ、そのＩＤ、。値は
２７．６　ｍｃｉ／ｍＺであった。さらに、この物質を
精製するために、再度シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ（和光純薬製、カラムサイズ１．Ｉ　Ｘ　２８　ａｍ
、　担体量２７ｒｎ１．溶媒系　トルエン：酢酸エチル
＝１９　：　１　）にかけ同溶媒系で展開し、１フラク
シ盲ン７　ｒｎｌで分画するとフラクション２６〜１３
８に阻止活性が認められた。夫々の７ラクシヨンを合わ
せたのち。

減圧下に濃縮転属すると１４４．６ｆｌ１ｇの淡黄色の
物質が得られ、そのＩＤ、ｏは１２．２　ｍｃｇ／　ｍ
ｌを示した。この物質を少量のメタノールに溶解し、セ
ルローズ薄層クロマトプレート（メルク社製）に付けて
。

０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ニアセトニトリル
：ノルマルプロパノール＝８０　：　２０　：　２．５
の混合溶媒で展開して、マナスルライ）　（，２５３６
Ｘ、マナスル工業株式会社製）で紫外部吸収の見られる
Ｒｆ値０．６附近をかきとり、それにメタノールを加え
て有効成分を溶離させた。

セルローズ担体をＰ紙でｒ過して除いたのち。

ｒ液を減圧下知濃縮転属する。これにメタノールの少量
を加えて溶解したのち、トルエンを加えて結晶化させる
と、白色の結晶１２［Ｏｇが得られる。

この結晶の物理化学的性質は前述した通りである。

また、この結晶のラウス肉腫由来チロシンキナーゼに対
するＩ　Ｄ、、は８．Ｏｍｃｇ／ｍｌであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ゲニステイン（化学名：５，７，４′−トリヒドロ
   キシイソフラボン）生産能を有するシュードモナス（Ｐ
   ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を培養し、培
   養液よりゲニステインを採取することを特徴とするゲニ
   ステインの製造法 ２　シュードモナス属に属する微生物がシュードモナス
   　エス・ピーＹＯ−０１７０Ｊ株（微工研菌寄第８１７
   ０号）である特許請求の範囲第１項記載の製造法