JP2868237B2 - 新規生理活性物質ｏｍ―６５１９およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はPC−12細胞の突起伸長促進活性を有する新規
生理活性物質OM−6519およびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

神経成長因子（以下、NGFと称する）は知覚および交
感神経の分化・成長・機能維持に必要な分子量14万のポ
リペプチドである。このNGFはα、β、γの３種のサブ
ユニットから成るが、このうち、βサブユニットは単独
でNGF活性を発現するため、β−NGFとも呼ばれている。

NGFには、神経突起を伸ばす作用、神経伝達物質の産
生を調節する作用があり、老動物の神経細胞に対し再生
作用を示すことが試験管内で証明されており、〔エイ
ジ、８巻、19頁（1985年）〕、このような作用があるこ
とから、近年、抗痴呆薬として注目されているものの１
つである。

一方、ラット副腎髄質褐色細胞腫よりクローン化され
た株細胞であるPC−12細胞は、NGFを添加することによ
り、増殖を停止し、神経突起をもつ細胞へ分化すること
が知られている。このため、PC−12細胞は神経分化のモ
デル系としてよく利用されている。この細胞を用いてNG
Fの他に、線維芽細胞成長因子やインターロイキン６も
突起の伸長を誘導することが調べられたが、最近、微生
物由来の低分子物質スタウロスポリンも同様に神経突起
の伸長をもたらすことが示された〔神経化学、26巻、20
0−220頁（1987年）〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記と同様の作用を有する低分子物質はスタウロスポ
リンの他には見出されておらず、他の培養細胞を用いた
系においてもスタウロスポリンが神経突起伸長をもたら
す物質として同定された。

しかしながら、スタウロスポリンは毒性が強いため、
実際の使用にあたっては、なお、検討の余地があると考
えられる。

かかる実状において、より毒性が低く、低濃度で神経
突起伸長作用を示す低分子物質を提供することは、ヒト
の医療上または社会問題の解決策として極めて重要なこ
とである。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、上記の如き課題を解決すべ
く、新規な生理活性物質の探索を目的として種々の土壌
から菌株を分離し、その生産物について研究を続けた結
果、千葉県印旛郡の土壌から分離した放線菌OM−6519菌
株の培養物中にPC−12細胞の突起伸長を促進する物質が
産生されることを見出した。

そこで、該培養物から活性物質を分離、精製し、該物
質の理化学的性質を調べた結果、後記の通りの理化学的
性質を有することが判った。このような理化学的性質を
有する物質は他に見当たらないことから、該物質を生理
活性物質OM−6519と命名した。本発明はかかる知見に基
づいて完成されたものである。

すなわち、本発明は、後記の理化学的性質を有する生
理活性物質OM−6519（以下、OM−6519物質と称する）ま
たはその塩およびストレプトマイセス属に属するOM−65
19生産菌を倍地に培養し、得られた培養物からOM−6519
物質を採取することを特徴とするOM−6519物質またはそ
の塩の製造法を提供するものである。

本OM−6519生産菌はストレプトマイセス属に属する
が、例えば本発明者らが分離したOM−6519菌株は、本発
明に最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株
の菌学的性質を示すと次のとおりである。

（Ｉ）形態的性質 栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察
されない。気菌糸は各種天然培地上で豊富に着生し、ホ
ワイトあるいはグレイ系を呈する。顕微鏡下の観察で
は、気菌糸は直線状を呈し、20ケ以上の胞子の連鎖が認
められる。胞子の大きさは1.1×0.8μｍで円柱状であ
る。胞子の表面はしわ状である。菌核、胞子のうおよび
遊走子は見出されない。

（II）各種培地上での性状 イー・ビー・シャーリング（E.B.Shirling）とデー・
ゴットリーブ（D.Gottlieb）の方法（インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリ
オロジー、16巻、313頁、1966年）によって調べた本生
産菌の培養性状を次表に示す。色調は標準色として、カ
ラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コ
ーポレーション・オブ・アメリカ、シカゴ、1958年）を
用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併
せて記した。以下は特記しない限り、27℃、２週間目の
各培地における観察の結果である。

（III）生理学的諸性質 （１）メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天 陰性 （ロ）ペプトン・イースト鉄寒天 陰性 （ハ）グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（21〜23
℃） 陰性 （ニ）トリプトン・イースト液 陰性 （２）チロシナーゼ反応 陰性 （３）硫化水素の生産 陰性 （４）硝酸塩の還元 陽性 （５）ゼラチンの液化（21〜23℃） （グルコース・ペプトン・ゼラチン培地） 陰性 （６）スターチの加水分解 陽性 （７）脱脂乳の凝固（37℃） 陰性 （８）脱脂乳のペプトン化（37℃） 陽性 （９）生育温度範囲 15〜37℃ （10）炭素源の利用性（プリーダム・ゴトリーブ寒天培
地） 利用する；グルコース、キシロース、ラフイノース、
メリビオース、マンニトール、フルクトース、シューク
ロス 利用しない；アラビノース、ラムノース、イノシトー
ル （11）セルロースの分解 陰性 （IV）細胞壁組成 細胞壁のジアミノピメリン酸はLL型である。

以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりであ
る。細胞壁中のジアミノピメリン酸はLL型である。気菌
糸の形態は直線状で、長い胞子鎖を形成する。胞子の表
面はしわ状である。培養状の諸性質としては、栄養菌糸
はイエローあるいはブラウンの色調を呈し、気菌糸はホ
ワイトあるいはグレー系の色調を呈する。可溶性色素は
産生しない。

これらの結果から、本菌株はストレプトマイセス属に
属する菌種であり、プリドハムとトレスナーの分類（バ
ージズ・マニュアル・オブ・デターミネーティブ・バク
テリオロジー、第８版、748〜829頁、1974年）によるグ
レイシリーズに属する菌種であると考えられるが、取敢
えず、ストレプトマイセス・エスピー・（Streptomyces
sp.OM−6519）と命名した。本菌株は、工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第10870号（FERM P−108
70）として寄託されている。

以上、OM−6519物質の生産菌について説明したが、放
線菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易
く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行わ
れる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導剤などを用い
る人工的変異手段により変異することは周知の事実であ
り、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含
め、ストレプトマイセス属に属し、OM−6519物質を生産
する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することが
できる。

本発明においては、先ずストレプトマイセス属に属す
るOM−6519物質を生産する能力を有する微生物が適当な
培地に培養される。培地としては、通常の放射菌の培養
に適する炭素源、窒素源および無機物、さらに必要に応
じてその他の栄養物をほどよく含有する合成培地または
天然培地を使用することができる。

培地に使用される炭素源および窒素源は、使用菌株の
利用可能なものならばいずれの種類でもよい。すなわ
ち、炭素源としては、たとえばグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、マルトース、マンニット、キシロー
ス、ガラクトース、リボース、澱粉またはその加水分解
物等の種々の炭水化物が使用できる。その濃度は通常、
培地に対して0.1〜５％が好ましい。またグルコン酸、
ピルビン酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸、グリシン、グ
ルタミン酸、アラニン酸等の各種アミノ酸、さらにはメ
タノール、エタノール等のアルコール類やノルマルパラ
フイン等の各種の非芳香属系炭化水素、あるいは植物も
しくは動物性の各種油脂等も使用可能である。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム等の各種の無機酸あるいは有機酸のアンモニウム
塩類、尿素、ペプトン、NZ−アミン、肉エキス、酵母エ
キス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、フイッシュミールあるいはその消化物、大豆粉
あるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物、加
水分解物などの含窒素有機物質、さらにはグリシン、グ
ルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸が使用可能であ
る。

無機物としては、例えば各種リン酸塩、硫酸マグネシ
ュウム、食塩、さらに微量の重金属塩が使用される。

また栄養要求性を示す変異株を用いる場合には、当然
その栄養要求を満足させる物質を培地に加えなければな
らないが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用
する場合にはとくに添加を必要としない場合がある。

培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的
条件下で行うのがよい。実用的には、深部通気攪拌培養
が好ましい。培地のpHはたとえば5.0〜8.0であるが、中
性付近が好ましい。培養温度は例えば20〜40℃である
が、通常はたとえば26〜32℃（好ましくは27℃付近）と
する。培養時間は、液体培養の場合、通常３〜６日培養
を行い培養物中のOM−6519物質蓄積量が最大に達したと
きに培養を終了する。これらの培地組成、培地の液性、
培養温度、攪拌速度、通気量等の培養条件は使用する菌
株の種類や外部の条件等に応じて好ましい結果が得られ
るように適宜調節、選択されることはいうまでもない。
液体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物
油、界面活性剤などの消泡剤が適宜使用される。

このようにして得られた培養物中に蓄積されたOM−65
19物質は、通常は培養濾液中に生成される。

培養濾液からOM−6519物質を採取するには、通常微生
物の培養物から代謝物を採取するのに用いられる手段を
単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復し
て用いられる。すなわち例えば、濾過、遠心分離、透
析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対する
溶解度の差を利用する方法（例えば、沈澱、結晶化、再
結晶、転溶、向流分配等）、クロマトグラフィー等の手
段が用いられる。OM−6519物質は、主として培養濾液に
生成蓄積されるので、本化合物を分離採取するには、培
養液から菌体を除去した培養濾液から採取すればよい。

例えば培養物から菌体その他を除去した培養濾液か
ら、活性炭などに本物質を吸着させ含水アセトン等で溶
出する。溶出液を濃縮した後セルロースカラムクロマト
グラフィー、セファデックスLH−20、シリカゲルカラム
クロマトグラフィー等によって本物質を単離することが
できる。

このようにして得られたOM−6519物質は弱酸性物質で
あるから、公知の方法により塩を形成し得る。

このような塩としては、医薬的に許容し得る非毒性塩
が挙げられる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などの
アルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの
アルカリ金属塩、公知の有機アミン、塩基性アミン酸な
どの塩が挙げられる。

次に、本OM−6519物質の理化学的性質について述べ
る。

元素分析;C＝45.56％;H＝6.27％;N＝6.89％;S＝7.65
％;O＝33.63％ 分子量および分子式;376（ファーストアトムボンバー
ドメント質量分析による、Ｍ＋１、m/z＝377）が求めら
れ、さらに高分解能ファーストアトムボンバードメント
（HR・FAB）質量分析および元素分析値から分子式C₁₅H
₂₄N₂O₇Sが与えられる。

融点;225〜230℃ 比旋光度；＋71.3゜（Ｃ＝１、メタノール） 紫外線吸収スペクトル；第１図の通りである。

赤外線吸収スペクトル（KBr法）；第２図の通りであ
り、3310、2955、1685、1665、1610、1565、1455、140
0、1380、1250、1140cm^-1付近に特徴的な吸収帯を有す
る。

溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ピリジン、ジ
メチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホル
ム、ベンゼン、石油エーテル、ｎ−ヘキサンに不溶、 呈色反応；アニスルアルデヒド硫酸、モリブデン酸反
応およびニンヒドリン反応に陽性 塩基性、酸性、中性の区別；弱酸性 物質の色；白色粉末 プロト核磁気共鳴スペクトル（バリアンXL−400、400
MHz、＊測定溶媒量ピリジンンの吸収）；第３図の通
り。

〔作用〕

次に、本OM−6519物質のPC−12細胞に対する神経様突
起伸長作用について述べる。

グリーン（Green）らの方法〔Ann.Rev.Neurosci.,3
巻、353頁（1980）〕に準じて形態変化により判定し
た。

その結果、OM−6519物質のPC−12細胞に対する神経様
突起伸長をひき起こす最小有効濃度は、0.8μg/mlであ
った。対照として同様の作用を示すスタウロスポリンの
活性を上記の方法と同様に測定したところ、50μＭで突
起伸長が認められたが、添加２日後に細胞毒性により細
胞は死滅した。

〔発明の効果〕

上記の通り、本OM−6519物質はPC−12細胞の突起伸長
促進活性を有し、かつ微生物由来のスタウロスポリンよ
り低毒性であることから、神経障害の治療剤、例えば抗
痴呆薬として有用であると考えられる。

〔実施例〕

以下に本発明を実施例により説明するが、これにより
限定されるものではない。

実施例 １ 500ml容坂口フラスコに、グルコース0.1％、馬鈴薯デ
ンプン2.4％、ペプトン0.3％、肉エキス0.3％、酵母エ
キス0.5％、炭酸カルシウム0.4％を含む液体培地（pH7.
0）100mlを分注し、121℃で15分間蒸気滅菌し、これに
グリセロール1.0％、カゼイン0.03％、硝酸カリウム0.2
％、塩化ナトリウム0.2％、燐酸二カリウム0.2％、硫酸
マグネシウム0.005％、炭酸カルシウム0.002％、硫酸第
二鉄0.001％、寒天1.8％を含む寒天斜面培地上で27℃で
培養したストレプトマイセス・エスピー・OM−6519株の
斜面培養から１白金耳づつ接種し、回転式振とう機を用
いて27℃で３日間振とう培養し、種母を得た。

30容ジャー・ファーメンター１基にオートミール2.
0を含む液体培地（pH7.0）15をそれぞれ仕込み、121
℃で30分間蒸気滅菌した。これに蒸気の種母６本分をそ
れぞれ移植し、攪拌速度250rpm通気量15／分条件下で
27℃で92時間通気攪拌した。

培養液をシャープレス型遠心分離機で遠心分離（10,0
00rpm）して菌体と培養液上清に分別した。

上清を活性炭カラム５に通した。10の脱イオン水
で洗浄後、50％アセトン水で溶出した。各フラクション
をPC−12細胞を用いる生物検定法によって追跡し、活性
画分を集め、減圧濃縮し、粗物質5gを得た。これを活性
炭カラムに通し、30％アセトン水にて溶出した。活性を
有する画分をあわせ、減圧濃縮し、粗物質500mgを得
た。これをできるだけ少量のメタノールに溶し、1/10量
づつを高速液体クロマトグラフィー用分取逆相カラム
（山村化学研究所製:AM−524（obs）:10×300mm）に供
し、６％アセトニトリル水0.5％酢酸で溶出（流速:6ml/
mins.）した。

保持時間28.5分のピークを示す活性画分を集め、減圧
乾固し、OM−6519物質20mg得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生理活性物質OM−6519の紫外線吸収ス
ペクトルを示し、 第２図は同物質の赤外線吸収スペクトルを示し、 第３図は同物質のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す
ものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の理化学的性質を有する生理活性物質OM
   −6519。 元素分析;C＝45.56％、Ｈ＝6.27％、Ｎ＝6.89％、Ｓ
   ＝7.65％、Ｏ＝33.63％ 分子量;376（ファーストアトムボンバードメント質量
   分析でＭ＋１、m/z377による） 融点;225〜230℃（分解） 比旋光度；＋71.3゜（Ｃ＝１、メタノール） 紫外線吸収スペクトル（溶媒，水）；下記に示す通
   り、 吸収極大を示す 赤外線吸収スペクトル（KBr法）;3310、2955、1685、
   1665、1610、1565、1455、1400、1380、1250、1140cm^-1
   付近に特徴的な吸収帯を有する 溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ピリジン、ジ
   メチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホル
   ム、ベンゼン、石油エーテル,n−ヘキサンに不溶 呈色反応；アニスアルデヒド硫酸、モリブデン酸反応
   およびニンヒドリン反応に陽性 塩基性、酸性、中性の区別；弱酸性 由来；ストレプトマイセス属に属する菌種 活性;PC−12細胞に対する神経様突起伸長作用を有す
   る。
2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載のストレプト
   マイセス属に属する生理活性物質OM−6519生産菌を倍地
   に培養し、得られた培養物から生理活性物質OM−6519を
   採取することを特徴とする新規生理活性物質OM−6519ま
   たはその塩の製造法。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項に記載のストレプト
   マイセス属に属する生理活性物質OM−6519生産菌が、ス
   トレプトマイセス・エスピー・OM−6519（FERM P−1087
   0）である特許請求の範囲第２項に記載の製造法。