JPH0398594A - 新規生理活性物質ｏｍ―６５１９およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＰＣ−１２細胞の突起伸長促進活性を有する新
規生理活性物ｉｉＯＭ−６　５　１　９およびその製造
法に関する。

〔従来の技術〕

神経戒長因子（以下、ＮＧＦと称する）は知覚および交
感神経の分化・或長・機能維持に必要な分子ｉ１）４万
のポリベブチドである。このＮＧＦはα、β、γの３種
のサブユニットから或るが、このうち、βサプユニソト
は単独でＮＧＦ活性を発現するため、β−ＮＧＦとも呼
ばれている。

ＮＧＦには、神経突起を伸ばす作用、神経伝達物質の産
生を調節する作用があり、老動物の神経細胞に対し再生
作用を示すことが試験管内で証明されており、〔エイジ
、８巻、１９頁（１　９　８　５年）〕、このような作
用があることから、近年、抗痴呆薬として注目されてい
るものの１つである。

一方、ラット副腎髄質褐色細胞腫よりクローン化された
株細胞であるＰＣ−１２細胞は、ＮＧＦを添加すること
により、増殖を停止し、神経突起をもつ細胞へ分化する
ことが知られている。このため、ＰＣ−１２細胞は神経
分化のモデル系としてよく利用されている。この細胞を
用いてＮＧＦの他に、線維芽細胞威長因子やインターロ
イキン６も突起の伸長を誘導することが調べられたが、
最近、微生物由来の低分子物質スタウロスボリンも同様
に神経突起の伸長をもたらすことが示された〔神経化学
、２６巻、２００−２２０頁（１　９　８　７年）〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記と同様の作用を有する低分子物質はスタウロスボリ
ンの他には見出されておらず、他の培養細胞を用いた系
においてもスタウロスボリンが神経突起伸長をもたらす
物質として同定された。

しかしながら、スタウロスポリンは毒性が強いため、実
際の使用にあたっては、なお、検討の余地があると考え
られる。

かかる実状において、より毒性が低く、低濃度で神経突
起伸長作用を示す低分子物質を提供することは、ヒトの
医療上また社会問題の解決策として極めて重要なことで
ある。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、上記の如き課題を解決すべく、
新規な生理活性物質の探索を目的として種々の土壌から
菌株を分離し、その生産物について研究を続けた結果、
千葉県印旙郡の土壌から分離した放線菌ＯＭ−６５１９
菌株の培養物中にＰＣ−１２細胞の突起伸長を促進する
物質が産生されることを見出した。

そこで、該培養物から活性物質を分離、精製し、該物質
の理化学的性質を調べた結果、後記の通りの理化学的性
質を有することが判った。このような理化学的物質を有
する物質は他に見当たらないことから、該物質を生理活
性物質ＯＭ−６５１９と命名した。本発明はかかる知見
に基づいて完威されたものである。

すなわち、本発明は、後記の理化学的性質を有する生理
活性物質ＯＭ−６５１９（以下、ＯＭ−６５１９物質と
称する）またはその塩およびストレプトマイセス属に属
するＯＭ−６５１９生産菌を培地に培養し、得られた培
養物からＯＭ−６５１９物質を採取することを特徴とす
るＯＭ−６５１９物質またはその塩の製造法を提供する
ものである。

本ＯＭ−６５１９生産菌はストレプトマイセス属に属す
るが、例えば本発明者らが分離したＯＭ−６５１９菌株
は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例であって
、本菌株の菌学的性質を示すと次のとおりである。

（１）形態的性質 栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察さ
れない。気菌糸は各種天然培地上で豊富に着生し、ホワ
イトあるいはグレイ系を呈する。ｌｍ鏡下の観察では、
気菌糸は直線状を呈し、２０ケ以上の胞子の連鎖が認め
られる。胞子の大きさは１．　　１×０．８μｍで円柱
状である。胞子の表面はしわ状である。菌核、胞子のう
および遊走子は見出されない。

（Ｉ［）各種培地上での性状 イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ，Ｓｈｉｒｌｉｎｇ
）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方
法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィ
マテインク・バクテリオロジー、１６巻、３１３頁、１
９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を次表に
示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニ
ュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・
アメリカ、シカゴ１９５８年）を用いて決定し、色票名
とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特
記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察
の結果である。

（ＩＩＩ）生理学的諸性質 （】）メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天 （ロ）ベプトン・イースト鉄寒天 （ハ）グルコース・ペプトン・ゼ ラチン培地（２１〜２３℃） 陰性 陰性 陰性 （二）トリプトン・イースト液　　　　陰性（２）チロ
シナーゼ反応　　　　　　　　　陰性（３）硫化水素の
生産　　　　　　　　　　陰性（４）硝酸塩の還元　　
　　　　　　　　　陽性（５）ゼラチンの液化（２１〜
２３℃）（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）陰性
（６）スターチの加水分解　　　　　　　　陽性（７）
脱脂乳の凝固（３７℃）　　　　　　陰性（８）脱脂乳
のベプトン化（３７℃）　　　陽性（９）生育温度範囲
　　　　　　　１５〜３７℃（ＩＩ炭素源の利用性（プ
リーダム・ゴトリーブ寒天培地） 利用する；グルコース、キシロース、ラフイノース、メ
リビオース、マンニトール、フルクトース、シェークロ
ス 利用しない；アラビノース、ラムノース、イノシトール αυセルロースの分解　　　　　　　　　陰性（ＩＶ）
細胞壁ｍ或 細胞壁のジアξノビメリン酸はＬＬ型である。

以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである
。細胞壁中のジアミノビメリン酸はＬＬ型である。気菌
糸の形態は直線状で、長い胞子鎖を形或する。胞子の表
面はしわ状である。培養状の諸性質としては、栄養菌糸
はイエローあるいはブラウンの色調を呈し、気菌糸はホ
ワイトあるいは゛グレ一系の色調を呈する。可溶性色素
は産生しない。

これらの結果から、本菌株はストレプトマイセス属に属
する菌種であり、ブリドハムとトレスナーの分類（バー
ジズ・マニュアル・オブ・デターミネーティプ・バクテ
リオロジー、第８版、７４８〜８２９頁、１９７４年）
によるグレイシリーズに属する菌種であると考えられる
が、取敢えず、ストレプトマイセス・エスピー・　（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ　ｐ．　ＯＭ−６　５　１　
９）と命名した。本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１０８７０号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
１０８７０）として寄託されている。

以上、ＯＭ−６５１９物質の生産菌について説明したが
、放線菌の一般的性状として菌学士の性状は極めて変異
し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常
行われる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導剤などを
用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実
であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も
含め、ストレプトマイセス属に属し、ＯＭ−６５１９物
質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用す
ることができる。

本発明においては、先ずストレプトマイセス属に属する
ＯＭ−６５１９物質を生産する能力を有する微生物が適
当な培地に培養される。培地としては、通常の放線菌の
培養に適する炭素源、窒素源および無機物、さらに必要
に応じてその他の栄養物をほどよく含有する合威培地ま
たは天然培地を使用することができる。

培地に使用される炭素源および窒素源は、使用菌株の利
用可能なものならばいずれの種類でもよい。

すなわち、炭素源としては、たとえばグルコース、グリ
セロール、フラクトース、マルトース、マンニット、キ
シロース、ガラクトース、リポース、澱粉またはその加
水分解物等の種々の炭水化物が使用できる。その濃度は
通常、培地に対して０．１〜５％が好ましい。またグル
コン酸、ビルビン酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸、グリ
シン、グルタミン酸、アラニン酸等の各種アミノ酸、さ
らにはメタノール、エタノール等のアルコール類やノル
マルパラフィン等の各種の非芳香属系炭化水素、あるい
は植物もしくは動物性の各種油脂等も使用可能である。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム
、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム等の各種の無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩
類、尿素、ベプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エ
キス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、フィッシュミールあるいはその消化物、大豆粉
あるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物、加
水分解物などの含窒素有機物質、さらにはグリシン、グ
ルタξン酸、アラニン等の各種アミノ酸が使用可能であ
る。

無機物としては、例えば各種リン酸塩、硫酸マグネシュ
ウム、食塩、さらに微量の重金属塩が使用される。

また栄養要求性を示す変異株を用いる場合には、当然そ
の栄養要求を満足させる物質を培地に加えなければなら
ないが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用す
る場合にはとくに添加を必要としない場合がある。

培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行うのがよい。実用的には、深部通気攪拌培養が
好ましい。培地のｐＨはたとえば５．０〜８．０である
が、中性付近が好ましい。培養温度は例えば２０〜４０
℃であるが、通常はたとえば２６〜３２℃（好ましくは
２７℃付近）とする。培養時間は、液体培養の場合、通
常３〜６日培養を行い培養物中のＯＭ−６５１９物質蓄
積量が最大に達したときに培養を終了する。これらの培
地組或、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量等の
培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件等に応じて
好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されるこ
とはいうまでもない。液体培養において発泡があるとき
は、シリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤が適
宜使用される。

このようにして得られた培養物中に蓄積されたＯＭ−６
５１９物質は、通常は培養濾液中に生成される。

焙養濾液からＯＭ−６５１９物質を採取するには、通常
微生物の培養物から代謝物を採取するのに用いられる手
段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反
復して用いられる。すなわち例えば、濾過、遠心分離、
透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対す
る溶解度の差を利用する方法（例えば、沈澱、結晶化、
再結晶、転溶、向流分配等）、クロマトグラフイー等の
手段が用いられる。ＯＭ−６５１９物質は、主として培
養濾液に生或蓄積されるので、本化合物を分離採取する
には、培養液から菌体を除去した培養濾液から採取すれ
ばよい。

例えば培養物から菌体その他を除去した培養濾液から、
活性炭などに本物質を吸着させ含水アセトン等で溶出す
る。溶出液を濃縮した後セルロース力ラムクロマトグラ
フイー、セファデソクスＬＨ−２０、シリカゲルカラム
クロマトグラフイー等によって本物質を単離することが
できる。

このようにして得られたＯＭ−６５１９物質は弱酸性物
質であるから、公知の方法により塩を形成し得る。

このような塩としては、医薬的に許容し得る非毒性塩が
挙げられる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのア
ルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのア
ルカリ金属塩、公知の有機アミン、塩基性アξン酸など
の塩が挙げられる。

次に、本ＯＭ−６５１９物質の理化学的性質について述
べる。

■元素分析；Ｃ＝４５．５６％ｉＨ＝６．２７％．Ｎ＝
６．８９％．Ｓ＝７．６５％；Ｏ＝３３．６３％ ■分子量および分子式；３７６　（ファーストアトムボ
ンバードメント質量分析による、Ｍ　＋１　％　ｍ　／
ｚ＝３７７）が求められ、さらに高分解能ファーストア
トムボンバードメント　（ＨＲ　−　ＦＡＢ）　質量分
析および元素分析値から分子式Ｃ　＋　ｓ　Ｈ　ｔ　４
　Ｎ　ｔ　Ｏ　？Ｓが与えられる。

■融点　；２２５〜２３０℃ ■比旋光度；＋７１．　　３′ｌ　　（Ｃ＝１、メタノ
ール）［５］紫外線吸収スペクトル；第１図の通りであ
る。

■赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）；第２図の通りで
あり、３３ｌＯ、２９５５、ｌ６８５、ｌ６６５、１６
１０、１５６５、１４５５、１４００、１３８０、１２
５０、１）４０ｃｍ−’付近に特徴的な吸収帯を有する ■溶剤に対する溶解性；水、メタノール、ピリジン、ジ
メチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム
、ベンゼン、石油エーテル、ｎ−へキサンに不溶、 ■呈色反応；アニスルアルデヒド硫酸、モリブデン酸反
応およびニンヒドリン反応に陽性■塩基性、酸性、中性
の区別；弱酸性 ＠ｌ物質の色：白色粉末 ■プロトン核磁気共鳴スペクトル（バリアンＸＬ一４０
０、４００ＭＨｚ、＊測定溶媒重ピリジンンの吸収）；
第３図の通り。

〔作用〕

次に、本ＯＭ−６５１９物質のＰＣ−１２細胞に対する
神経様突起伸長作用について述べる。

グリーン（Ｇｒｅｅｎ）らの方法（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．，３巻、３５３頁（１９８０年））に
準じて形態変化により判定した。

その結果、ＯＭ−６５１９物質のＰＣ−１２細胞に対す
る神経様突起伸長をひき起こす最小有効濃度は、０．８
μｇ　／　ｍ　ｌであった。対照として同様の作用を示
すスタウロスボリンの活性を上記の方法と同様に測定し
たところ、５０μＭで突起伸長が認められたが、添加２
日後に細胞毒性により細胞は死滅した。

〔発明の効果〕

上記の通り、本ＯＭ−６５１９物質はＰＣ−１２細胞の
突起伸長促進活性を有し、かつ倣生物由来のスタウロス
ボリンより低毒性であることから、神経障害の治療剤、
例えば抗痴呆薬として有用であると考えられる． 〔実施例〕 以下に本発明を実施例により説明するが、これにより限
定されるものではない。

夫麓礼−上 ５００ｍｌ！容坂口フラスコに、グルコース０．　　１
％、馬鈴薯デンブン２．４％、ペプトン０．３％、肉エ
キス０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸カルシウム０
．４％を含む液体培地（ｐＨ７，Ｏ）１００　ｍ　ｌを
分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌し、これにグリセ
ロール１．０％、カゼイン０．０３％、硝酸カリウム０
．２％、塩化ナトリウム０．２％、燐酸二カリウム０．
２％、硫酸マグネシウム０．００５％、炭酸カルシウム
０．００２％、硫酸第二鉄０．００１％、寒天１．８％
を含む寒天斜面培地上で２７℃で培養したストレプトマ
イセス・エスピー・ＯＭ−６５１９株の斜面培養から１
白金耳づつ接種し、回転式振とう機を用い２７℃で３日
間振とう培養し、種母を得た。

３０ｆ容ジャー・ファーメンタ−１基にオートミール２
．０を含む液体培地（ｐＨ７．０）１５ｊ！をそれぞれ
仕込み、１２１℃で３０分間蒸気滅菌した．これに蒸気
の種母６本分をそれぞれ移植し、撹拌速度２５０ｒｐｍ
通気量１５１２７分条件下で２７℃で９２時間通気攪拌
した。

培養液をシャープレス型遠心分離機で遠心分離（１０．
０００ｒｐｍ）Ｌて菌体と培養液上清に分別した。

上清を活性炭カラム５Ａに通した。１０ｉｌの脱イオン
水で洗浄後、５０％アセトン水で溶出した。各フラクシ
ョンをＰＣ−１２ｔＲ胞を用いる生物検定法によって追
跡し、活性画分を集め、減圧濃縮し、粗物質５ｇを得た
。これを活性炭カラムに通し、３０％アセトン水にて溶
出した。活性を有する両分をあわせ、減圧濃縮し、粗物
質５　０　０ｍｇを得た。これをできるだけ少量のメタ
ノールに溶し、１／１　０ｆｆｉづつを高速液体クロマ
トグラフイー用分取逆相カラム（山村化学研究所製：Ａ
Ｍ　　５２４　（ｏｂｓ）：１０Ｘ３００ｍｍ）に供し
、６％アセトニトリル水０．５％酢酸で溶出（流速：　
５ｍＪ／ｍｉｎｓ，）した． 保持時間２８．５分のピークを示す活性画分を集め、減
圧乾固し、○Ｍ−６５１９物質２　０ｍｇ得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生理活性物質ＯＭ−６５１９の紫外線
吸収スペクトルを示し、 第２図は同物質の赤外線吸収スペクトルを示し、第３図
は同物質のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示すもので
ある。 第１図 ２００．０

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の理化学的性質を有する生理活生物質ＯＭ−６
   ５１９。 ［１］元素分析；Ｃ＝４５．５６％、Ｈ＝６．２７％、
   Ｎ＝６．８９％、Ｓ＝７．６５％、 Ｏ＝３３．６３％ ［２］分子量；３７６（ファーストアトムボンバードメ
   ント質量分析でＭ＋１、 ｍ／ｚ３７７による） ［３］融点；２２５〜２３０℃（分解） ［４］比旋光度；＋７１．３゜（Ｃ＝１、メタノール）
   ［５］紫外線吸収スペクトル（水中） ；第１図の通り ［６］赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法） ；第２図に示す通り ［７］溶剤に対する溶解性 ；水、メタノール、ピリジン、ジメチ ルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、 クロロホルム、ベンゼン、石油エー テル、ｎ−ヘキサンに不溶 ［８］呈色反応；アニスアルデヒド硫酸、モリブデン酸
   反応およびニンヒドリン反応に陽 性 ［１０］塩基性、酸性、中性の区別 ；弱酸性
2. （２）ストレプトマイセス属に属する生理活性物質ＯＭ
   −６５１９生産菌を培地に培養し、得られた培養物から
   生理活性物質ＯＭ−６５１９を採取することを特徴とす
   る新規生理活性物質ＯＭ−６５１９またはその塩の製造
   法。
3. （３）ストレプトマイセス属に属する生理活性物質ＯＭ
   −６５１９生産菌がストレプトマイセス・エスピー・Ｏ
   Ｍ−６５１９（ＦＥＲＭＰ−１０８７０）である特許請
   求の範囲第２項記載の製造法。