JPS62190193A - 新規血小板凝集抑制物質アグリセリドａ，ｂ，ｃそれらの製造法およびそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は新規血小板凝集抑制物質アグリセリドＡ、Ｂま
たはＣ１それらの製造法または血圧低下剤あるいは血栓
症治療剤としての用途に関する。

〔従来の技術〕

従来、抗血小板活性物質は化学合成物質に限られており
、ストレプトマイセス属の微生物が血小板凝集抑制物質
を産生ずることは知られていなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

近年、微生物の代謝産物から有効な物質のスクリーニン
グが活発に行われている。本発明者らは、新規な抗血小
板活性物質の探索を目的として種々の土壌から菌株を分
離し、その生産する代謝産物について研究を続けた結果
、放線菌ＯＭ−３２０９株の培養物中に血小板凝集抑制
活性を有する物質が産生されることを艶出した。そこで
、該培養物から該有効物質を分離、精製し、その理化学
的性質を調べた結果、新規物質であることが判明したの
でｍ物質をアグリセリド（八ｇｇｒｅｃｅｒｉｄｅ）と
命名した。本発明は係る知見に基いて完成されたもので
ある。

〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、後記の理化学的性質を有する血小板凝集抑制
物質アグリセリドＡ、、ＢまたはＣおよびストレプトマ
イセス属に属し、血小板凝集抑制物質アグリセリドＡ、
ＢまたはＣを生産する微生物を培地に培養して該培養物
中に血小板凝集抑制物質アグリセリドＡ、ＢまたはＣを
生産蓄積させ、その培養物から該血小板凝集抑制物質ア
グリセリドＡ、ＢまたはＣを採取することを特徴とする
特脱血小板凝集抑制物質アグリセリドＡ、あたはＣの製
造法ならびに血小板凝集抑制物質ＯＭ−３２０９Ａ、Ｂ
またはＣの少なくとも１種を有効成分とする血小板凝集
抑制剤である。

本発明の血小板凝集抑制物質°アグリセリドＡ、Ｂまた
はＣ（以下総称して云う場合は、単にアグリセリドとい
う）を生産する微生物は、ストレプトマイセス属に属す
るが、例えば本発明者らが土壌から分離したストレプト
マイセス属に属するＯＭ−３２０９株は、本発明に最も
有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的
性質を示すと次の通りである。

（ａ）形態的性質 栄養菌糸は、各種東天培地上でよく発達し、通常は隔壁
を有しない。気菌糸は、顕微鏡下の観察では胞子柄はら
線状を呈し、２０ケ以上の胞子の連鎖が認められる。胞
子の大きさは０．５×１．０μｍで円柱状である。胞子
の表面はトゲ状である。菌核、胞子のうおよび遊走子は
見出されない。

（ｂ）次の各培地上での性状 イー・ビー・シャーリング（ＩＥ、　Ｂ、　Ｓｈｉｒｉ
ｎｇ）とディー・ゴツトリーブ（Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｉｅ
ｂ　）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ
・システィマチック・バクテリオロジー、１６巻、３１
３頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の墳養性状
を次表に示す。色調は標準色として、カラーハーモニー
・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・
オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し
、色票名ともに括弧内にそのコードを併せて記した。以
下は特記しない限り２７°Ｃ１２週間目の各培地におけ
る観察の結果は第１表の通りである。

第１表 ＩＳＰ：インターナショナル・ストレプトマイセス・プ
ロジェクト選定の培地。

（Ｃ）次の各生理学的諸性質 （１）メラニン色素の形成 （イ）チロシン寒天　　　　　陽性 （ロ）ペプトン・イースト 鉄寒天　　　　　　　　陽性 （ハ）グルコース・ペプトン・ セラチン培地 穿刺（２１−２３’Ｃ）陽性 （ニ）トリプトン・イースト 液　　　　　　　　　　陽性 （２）チロシナーゼ反応　　　　　陽性（３）硝酸塩の
還元　　　　　　　陰性（４）ゼラチンの液化（２１− ２３’Ｃ） （グルコース・ペプトン・ ゼラチン培地）　　　　　陽性 （５）スターチの加水分解　　　　陽性（６）脱脂乳の
凝固（３７”Ｃ）　　陰性（７）脱脂乳のペプトン化 （３７°Ｃ）　　　　　　　陽性 （８）生育温度範囲　　　Ｌ５−４２　°Ｃ（ｄ）次の
炭素源の同化性 （プリドハム・ゴドリーブ 寒天培地） 利用する；Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キ
シロース、ラフィ ノース、メリビオース、Ｄ−マ ンニトール、Ｄフラクトース、 Ｌ−ラムノース、ｉ−イノシト ール、シュークロース 利用しない；セルロース （ｅ）細胞壁の組成 ジアミノピメリン酸はＬＬ型であり、アラビノース、ガ
ラクトースは認められない。以上、木菌の菌学的性状を
要約すると次の通りになる。

細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。

また形態的には、ら線状の長い胞子鎖を形成し、胞子の
表面はトゲ状である。培養上の諸性質としては、栄誉菌
糸はヘージュ系の色誹１を星し、気菌糸はグレイ系ある
いはシェルピンクの色調を呈する。可溶性色素として、
メラニン色素を生産する以−ヒの菌学的性質から、零〇
Ｍ−３２０９株はストレプトマイセス属に属する菌株で
あり、ブリドハムとトレスナーの分類（バーシズ・マニ
ュアル・オプ・デタミネーティブ・ハタテリオロジー第
８版、７４８−８２９頁、１９７４年）によるグレイあ
るいはレットシリーズに属する菌種と考えられる。しか
しながら、どの種に属するかは明らかに出来ないので、
取りあえず本菌株をストレプトマイセス　スピーシーズ
　ＯＭ−３２０９と命名することにする。なお、本菌株
は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番号「微工研
菌寄第８４２７Ｊ　（ＦＥＲＭ−Ｐ　　Ｎｏ、　８４２
７）として寄託されている。

以上、アグリセリド生産菌について説明したが、放線菌
の一般的性状として蘭学上の性状は極めて変異し易く、
一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる
紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導剤例えばＮ−メチ
ル−Ｎ−二トローＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタ
ンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異
することは周知の事実であり、このような人工的変異株
は勿論、自然変異株も含め、ストレプトマイセス属に属
し、アグリセリドを生産する能力を有する菌株はすべて
本発明に使用することができる。

本発明においては、先ずストレプトマイセス属に属する
アグリセリド生産菌が適当な培地に培養される。木閑の
培養におい”Ｃは、通常放線菌の培養が一般に用いられ
る。培地としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し
得る窒素源、さらには必要に応じ無機塩などを含有させ
た栄養培地が培養される。同化し得る炭素源としては、
ブドウ糖、ｔｅｌ？、　蜜、澱粉、デキストリン、セル
ロース、コーン・ステイープ・リカー、グリセリン、有
機酸などが単独または組み合わせて用いられる。消化し
得る窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス
、乾燥酵母、大豆粉、コーン・ステイープ・リカー、綿
実粕、カゼイン、大豆蛋白分解物、アミノ酸、尿素など
の有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素
化合物が単独または組み合わせて用いられる。その他、
必要に応じナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、
マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が添加される
。

さらに、培地には、必要に応じて、本菌の生育やアグリ
セリドの生産を促進する微量栄養素、発育促進物質、前
駆物質を適当に添加してもよい。

培地は通常、振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条
件丁で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好
ましい。培地のｐ　Ｈはやや酸性ないし中性付近で行う
のが好ましい。培養温度は２０−４０’Ｃの範囲である
が、通常は２４−３０″Ｃ１好ましくは２７＠Ｃ付近に
保つのがよい。

培養時間は、液体培をの場合、通常１−８日でよいが、
好ましくは血小板凝集抑制物質の培養中の蓄積量が最大
に達した時に培養を終了させる。培地組成、培地の液性
、培地温度、攪拌速度、通気＋ｉ十などの培交条件は、
使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい
結果が得られるよう適宜調節選択されることはいうまで
もない。液体において発泡があるときは、シリコン油、
植物油、界面活性剤などの消泡剤が適宜使用される。

このようにして得られた培養物中に蓄積された血小机凝
集抑制物箕アグリセリドは菌体内および培在濾液中に含
有されるので、遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し
、各々から本血小板凝集抑１１−１物質を採取するのが
有利である。

培養沖゛液から木血小キム凝集抑制物質゛ｒクリセリド
を採取するには、培養濾液を酢酸エチル、ベンゼンなど
の非親水性有ａ溶媒で抽出する。得られた抽出液または
溶出液を減圧濃縮し、得られる粗物質はさらに脂溶性物
質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカゲ
ル、アルミナなどの担体を用いるカラムクロマトグラフ
ィーによりアグリセリドΔ、ＢおよびＣを各々分離精製
することができる。

菌体から本血小板凝集抑制物管アグリセリドを採取する
には、菌体を含水７セトンや含水メタノールなどの含水
親水性有ａ、溶媒で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮
し、そのγＭ縮物を酢酸エチルで抽出し、この酢酸エチ
ル抽出液は、前記の培養７１心液から得た酢酸エチル抽
出液と合わせて分割精製するか、あイ、いは前記と同し
方法で分離精製することができる。次に、本皿小板凝集
抑制物質アグリセリドの理化学的性質について述べる。

〔１］血小板顔集抑制物質アクリセリド（１）分子式；
　Ｃ１，１Ｈ３６０ａ　　（ｌ′、−；＋分解能マスス
ペクトルによ る） （２）分子：’ｉｌ；３１６　　（ＧＣ−マススペクト
ルによる　）、 ２１　　　　　。

（３）比旋光度；〔α）、　＋９．　７　　　（Ｃ＝０
゜０３、クロロホルム）、 （４）紫外線吸収スペクトル；特徴的な吸収を示さない
、 （５）赤外線吸収スペクトル（クロロホルム中；第１図
の通り、 （６）溶剤に対する溶解性　；アセトン、メタノール、
エタノ ール、酢酸エチ ル、クロロホル ム、ベンゼンに 可溶、水に　不 溶 （７）塩基性、酸性、中性の 区別　　　　　　　　；中性脂溶性モノグリセライド、 （８）物質の色　　　　　　；無色、 （９）ブト１ント核磁気共鳴スペクトル；第２図の通り
、 （１０）質量分析　　　　　；ガスクロマド−マススペ
クトル ；第３図の通り、 （１２）化学構造 ＣＩ’＋３ ＣＴｏＯＣＯＣＨｚ（ＣＨｚ）＊Ｃ）ｌｃ８２ｃｌｌｓ
ＣＩＩＯ）ｌ Ｈｚ０１１ 〔２〕血小板凝集抑制物質アグリセリドＢ（１）分子式
；Ｃ１ｇＨｚｓＯａ　　（高分解能マススペクトルによ
る ）、 （２）分子量；３３０（ＧＣ−マススペクトルによる）
、 （３）比旋光度；　〔α）２５＋８．０゜（Ｃ＝０．０
５．クロロホル ム）、 （４）紫外線吸収スペクトル；特徴的な吸収を示さない
、 （５）赤外線吸収スペクトル（クロロホルム中；アグリ
セリド Ａに同し、 （６）溶剤に対する溶解性　；アセトン、メタノール、
エタノ ール、酢酸エチ ル、クロロホル ム、ベンゼンに 可溶、水に不溶 （７）塩基性、酸性、中性の 区別　　　　　　　　；中性脂溶性モノグリセライド （８）物′αの色　　　　　　；無色、（９）アグリセ
リドＡの構造において脂肪酸アルキル側鎖の炭素数が異
なる類似物質である。

〔３〕皿小板凝集抑制物質アグリセリドＣ０（１）分子
式；　Ｃ２０Ｈ４００４Ｃ８ｓ分解能マススペクトルに
よる ）、 （２）分子量、３４４（低分解能ＧＣ−マススペクトル
による）、 （３）紫外線吸収スペクトル；特徴的な吸収を示さない
、 （４）赤外線吸収スペクトル；了グリセリドΔに同じ、
） （５）溶剤に対する溶解性　；アセトン、メタノール、
エタノ ール、酢酸エチ ル、クロロホル ム、ベンゼンに 用液、水に不溶 （６）塩基性、酸性、中性の 区別　　　　　　　　；中性脂溶性モノグリセライド、 （７）物質の色　　　　　　；無色、 （８）アグリセリト°Ａの構造において、脂肪酸アルキ
ル側鎖の炭素数が異なる類似物質である。

黄明の少魁閃 次に、本発明の血小板凝集抑制物質アグリセリトの生物
学的性質について述べる。

（１）血小板凝集抑制作用 アグリセリドの家兎由来の血小板’４１　”ＪＳ抑制作
用は以下の方法により求められる。

家兎由来の血液から調製した洗浄血小板（２５０ｐｌ）
をキュベツトに入れ、これにアグリセリト　（１００μ
ｍ）を添加し、３７’Ｃで１０分間インキュベーション
を行う。次いで、ｒｈｔ小板凝集剤として１−ロンビン
（’ｌ　Ｕ　／　ｒｎ　（！　、　５０１１　／！　）
を加え、反応液を１０分間インキュベーションし、アグ
リコメーターで血小板凝集抑制度を調べた。

アグリセリドの血小板凝集抑制率（％）は５０μｇ　／
　ｍ　ｅで９２％、２５μＨ／　ｍ　７！の濃度で８１
％であった。尚級脂肪酸からなるモノグリセリドがこの
ように強い血小板凝集抑制作Ｊｔ１を有することは初め
ての知見である。生体内に存在するモノグリセリド、１
−モノミリスチルグリセロール、■−モノバルミチルグ
リセロール、１−モノステアリールグリセロール等にも
アグリセリドと比較して弱いが血小板凝集抑制作用が認
められた。これらモノグリセラドが血小板凝集抑制作用
を示すという知見は今回初めて見出されたものである。

なお、アグリセリドは１０００μｇ　／　ｍ　１の濃度
においても全（抗菌活性を示さない。

（２）毒性 本杭血小板凝集抑制物質アグリセリドを２００ｍｇ／ｋ
ｇマウス腹腔内に投与したが、なんら毒性は認められな
かった。

上記の通り、本杭血小板凝集抑制物質アグリセリドは毒
性が極めて低く、トロンビン、ＡＤＰなどの血小板凝集
剤に対し著しい凝集抑制率を示すことから、ヒトの血圧
低下作用ならびに血栓症の予防薬として有用である。

来貢± 次に、実施例により本発明を具体的に示すが、これによ
り本発明が限定されるものではない。

実施例 ５００ｍ＃容三角フラスコにグルコース０．１％、澱粉
２．４％、ペプトン０．３％、肉エキス０．３％、酵母
エキス０．５％、炭酸カルシウム０．４％を含む液体培
地（ｐＨ７，０＞１００ｍｐを分注し、１２１　°Ｃで
１５分間蒸気滅菌し、これらにグリセロール１．０％、
リンゴ酸カルシウム１．０％、塩化アンモノ０．０５％
、リン酸二カリウム０．０５％、酵母エキス０．１％に
寒天１．５％を含む寒天斜面培地上で２７°Ｃで培養し
たストレプトマイセスＯＭ−３２０９株の斜面培養から
１白金耳ずつ接種し、回転大振とう機を用い、２７°Ｃ
にて２日間振とう培養し、種母を得た。

５０Ｉ！容ジャーファーメンタ−にグルコース０．１％
、澱粉２．４％、ペプトン０．３％、肉エキス０．３％
、酵母エキス０．５％、炭酸カルシウム０．４％、寒天
０．１％、塩化コバルト２０ｍ　１ｚ、　／　ｉ！を含
む液体培地（ｐＨ７，０）３０ｆｆを仕込み、１２１”
Ｃで１５分間蒸気滅菌した。これに上記の種母９本分を
移植し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、ｉｌ気＋Ｂ：　１５　
（！　／　ｍ　ｉ　ｎの条件下で、２７６Ｃで７０時間
通気攪拌培介した。培養液をシャープレス型遠心機で遠
心分１１１１（１００００ｒ　ｐ　ｍ）して、菌体と培
養液上清に分別した。

得られた上清に酢酸エチル１０１を加え攪拌し抽出した
。酢酸エチル層を分取し、減圧−ト流縮することによっ
て暗褐色油状物質約６ｇを得た。

なお、菌体中にも若干の抗血小板凝集抑制物質アグリセ
リドが蓄積されるが上清中にＨｆｎされる計と比較する
と少ない。

油状物質６ｇをｋｉｓｅ１４ｅｌ　６０シリカゲル（１
６０ｇ）を用い、カラムクロマトグラフィーを行った。

展開溶媒クロロホルム：メタノール（１００：１）にて
まず油状物を溶出させ、次いで、クロロホルムメタノー
ル（５０：　１−２０　：　ｌ）にて展開させ、アグリ
セリドを含む両分を集め、減圧下淵縮乾固し、粗製物質
６５０ｍｇを得た。これを出来るだけ少量のクロロホル
１、に溶解し、ｋｉｅｓｅ１４ｅｌ　６０Ｆ２５４シリ
力ゲル薄層プレート上にチャージし、展開溶媒ベンゼン
対アセトン（３：１）にて展開させ、Ｒｒ研０．４の部
分（４０％Ｈ，Ｓｏ、水溶液をプレート上に噴霧し、わ
ずかに茶色に呈色する）をかきとった。アグリセリドを
含むシリカゲル粉末をカラムに詰め、溶出溶媒クロロホ
ルム：メタノール（３：１）を用いて、活性物質を？容
出させ、減）王濃縮し、アグリセリド（主成分Ａの他微
量成分Ｉ３およびＣを含む）７５ｍｇを白色粉末として
得た。

本粉末からの主成分Ａおよび微量成分Ｂ、Ｃの分離は、
高速液体クロマトグラフィー（ｔＪＶ２１０ｎｍ、展開
溶媒；４０％アセトニル、カラム１０ＤＳ）にて行い、
白色粉末としてＡ３２．１ｍｇ、８４．５ｍｇ、Ｃ２，
１ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は血小板凝集抑制物質アグリセリドＡの赤外線吸
収スペクトル、第２図は血小板凝集抑制物質アグリセリ
ドＡのプロトン核磁気共鳴スペクトル、第３図は血小板
凝集抑制物質γグリセリドＡのガスクロマド−マススペ
クトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有する血小板凝集抑制物質アグ
   リセリドＡ。 （１）分子式；Ｃ＿１＿８Ｈ＿３＿６Ｏ＿４（高分解能
   マススペクトルによる）、 （２）分子量；３１６（ＧＣ−マススペクトルによる）
   、 （３）比旋光度；〔α〕＾２＾１＿Ｄ＋９．７°（Ｃ＝
   ０．０３，クロロホルム） （４）紫外線吸収スペクトル；特徴的な吸収を示さない
   、 （５）赤外線吸収スペクトル（クロロホルム中）；第１
   図の通り、 （６）溶剤に対する溶解性；アセトン、メタノール、エ
   タノール 、酢酸エチル、ク ロロホルム、ベン ゼンに可溶、水に 不溶、 （７）塩基性、酸性、中性の 区別；中性脂溶性モノグ リセライド （８）物質の色；無色、 ２、次の理化学的性質を有する血小板凝集抑制物質アグ
   リセリドＢ。 （１）分子式；Ｃ＿１＿９Ｈ＿３＿８Ｏ＿４（高分解能
   マススペクトルによる）、 （２）分子量；３３０（低分解能ＧＣ−マススペペクト
   ルによる）、 （３）比旋光度；〔α〕＾２＾５＿Ｄ＋８．０°（Ｃ＝
   ０．５，クロロホルム） （４）紫外線吸収スペクトル；特徴的な吸収を示さない
   、 （５）赤外線吸収スペクトル；アグリセリドＡに同じ、 （６）溶剤に対する溶解性；アセトン、メタノール、エ
   タノール 、酢酸エチル、ク ロロホルム、ベン ゼンに可溶、水に 不溶、 （７）塩基性、酸性、中性の 区別；中性脂溶性モノグ リセライド （８）物質の色；無色、 ３、次の理化学的性質を有する血小板凝集抑制物質アグ
   リセリドＣ。 （１）分子式；Ｃ＿４＿０Ｈ＿２＿０Ｏ＿４（高分解能
   マススペクトルによる）、 （２）分子量；３４４（ＧＣ−マススペクトルによる）
   、 （３）紫外線吸収スペクトル；特徴的な吸収を示さない
   、 （４）赤外線吸収スペクトル（クロロホルム中）；アグ
   リセリドＡに 同じ、 （５）溶剤に対する溶解性；アセトン、メタノール、エ
   タノール 、酢酸エチル、ク ロロホルム、ベン ゼンに可溶、水に 不溶、 （６）塩基性、酸性、中性の 区別；中性脂溶性モノグ リセライド （７）物質の色；無色、 ４、ストレプトマイセス属に属し、血小板凝集抑制物質
   アグリセリドＡ、ＢまたはＣを生産する微生物を培地に
   培養して、該培養物中に血小板凝集抑制物質アグリセリ
   ドＡ、ＢまたはＣを生産蓄積させ、その培養物から該血
   小板凝集抑制物質アグリセリドＡ、ＢまたはＣを採取す
   ることを特徴とする新規血小板凝集抑制物質アグリセリ
   ドＡ、ＢまたはＣの製造法。 ５、血小板凝集抑制物質アグリセリドＡ、ＢまたはＣを
   生産する微生物がストレプトマイセススピーシーズ　Ｏ
   Ｍ−３２０９（ＦＥＲＭ−ＰＮｏ８４２７）である特許
   請求の範囲第４項記載の製造法。 ６、血小板凝集抑制物質アグリセリドＡ、ＢまたはＣの
   少なくとも１種を有効成分とする血小板凝集抑制剤。