JPH02124883A

JPH02124883A - 抗酸化作用を有するイソフラボン誘導体およびその製造法

Info

Publication number: JPH02124883A
Application number: JP27878088A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Omura; 智大村; Hiroki Komiyama; 小見山　寛機; Shinji Funayama; 信次船山
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1988-11-04
Filing date: 1988-11-04
Publication date: 1990-05-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、抗酸化剤として有用なイソフラボン誘導体お
よびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、天然物由来の抗酸化活性を有する物質としては、
α−トコトリエノール、γ−トコフェロール、ビタミン
Ｅ、イソフラボン誘導体などが知られている。

イソフラボン誘導体は、植物由来または化学合成により
得られることが知られている（Ａｎ、Ａｃａｄｅ、Ｂｒ
ａｓ　ｉ　１．Ｃ１ｅｎｃ、↓立、１４７−１５０　　
（１９６８）　、Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、３２　　（６）、７４０〜７４６　　（１
９６Ｂ）　、Ｊ、Ａｇｒ、Ｆｏｏｄ、Ｃｈｅｍ、。

１↓、１１７４〜１１７７　（１９７６）　、米国特許
第４，１５７，９８４　（１９７９）、米国特許第４，
２６４，５０９　（１９８１））が挙げられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、微生物の産生ずる抗酸化活性物質を得ること
を目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、有用な生理活性物質を得ることを目的と
して、種々の放線菌を分離し、その生産物について研究
を行った結果、東京都奥武蔵の土壌から新たに分離した
放線菌が、その培養物中に抗酸化活性を有するイソフラ
ノイド誘導体を生産することを見出し、本発明を完成し
たものである。

即ち、本発明は、−飲代（式中、二重は一重拮合または二重結合、Ｘは０または
Ｒ２、Ｒ，〜Ｒ１は各々Ｈ，ＯＴ（、メトキシ、メチル
チオ、エトキシ、カルボン酸またはハロゲン原子を示す
か、あるいはＲ１とＲ，、Ｒ。

とＲ３、Ｒ，とＲ４、ＲｓとＲｈ、ＲｈとＲ７、Ｒ１と
Ｒ６およびＲ８とＲ１のいずれか１つまたは２つ以上の
メチレンジオキシ基を形成してもよい）で表されるイソ
フラボン誘導体またはその塩およびその製造法である。

上記の塩としては、薬学的に許容し得る塩が好ましい。

例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩など
が挙げられる。

本発明のイソフラボン誘導体を生産する能力を有する微
生物は、ストレプトマイセス属に属するが、例えば本発
明者らが分離したストレプトマイセス属に属する菌株０
Ｈ−１０４９は、本発明に最も有効に使用される菌株の
一例であって、本菌株０Ｈ−１０４９の菌学的性質を示
すと次の通りである。

（Ｉ）形態的性質栄養菌糸は、各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察
されない。気菌糸はスターチ無機塩寒天培地等で豊富に
着生し、灰色を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸は
直線状を呈し、２０ケ以上の胞子の連鎖が認められる。

胞子の大きさは１゜ＩＸｏ、７μｍで、卵型である。胞
子の表面は平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は
見出されない。

（ＩＩ）各種培地上での性状イー・ビー・シャーリング（Ｅ、Ｂ、ｓｈｉｒｌｉｎｇ
）とデー・ゴツトリーブ（Ｄ、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方
法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィ
マチイック・バクテリオロジ−１６巻、３１３頁、１９
６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示
す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュ
アル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・ア
メリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色票名
とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特
記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察
の結果である。

（ＩＩＩ）生理学的諸性質（１）メラニン色素の生成（イ）チロシン寒天（ロ）ペプトン・イースト鉄寒天（ハ）グルコース・ペプトン・ゼ陰性陰性ラテン培地（２１〜２３℃）　　陰性（ニ）トリプトン・イースト液　　　　陰性（２）チロ
シナーゼ反応　　　　　　　　　陰性（３）硫化水素の
生産　　　　　　　　　　陰性（４）硝酸塩の還元　　
　　　　　　　　　陰性（５）ゼラチンの液化（２１〜
２３℃）（クルコース・ペプトン・ゼラチン培地）　　　　　　　　　　　　　　擬陽性（６）スタ
ーチの加水分解　　　　　　　　陽性（７）脱脂乳の凝
固（３７°Ｃ）　　　　　　陰性（８）脱脂乳のペプト
ン化（３７℃）　　　陽性（９）生育温度範囲　　　　
　　（１０〜３７℃）００１炭素源の利用性（プリーダム・ゴトリーブ寒天培地）利用する　　；グルコース、マンノース、キシロース、
フラクトース、アラビノースやや利用する；シュークロース利用しない　；ラフィノース、イノシトール、ラムノー
ス、メリビオースセルロース αＢセルロースの分解　　　　　　　　　陰性（ＩＶ）
細胞壁組成細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。

以上、本閑の菌学的性状を要約すると次の通りである。

気菌糸の形態は直線状で、長い胞子鎖を形成する。胞子
の表面は平滑である。培養状の諸性質としては、栄養菌
糸はアイポリ−系の色調を呈し、気菌糸は灰色系の色調
を呈する。可溶性色素は生産しない。これらの結果から
、本菌株はストレプトミセス属に属する菌種であり、プ
リドハムとトレスナーの分類（バージズ・マニュアル・
オブ・デターミネーティブ・バクテリオロジー第８版、
７４８〜８２９頁、１９７４年）によるグレイシリーズ
に属する菌種であると考えられる。

なお、本菌株はストレプトマイセス　エスピー−０Ｈ−
１０４９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ　ｐ、　０Ｈ−
１０４９）と称することとした（工業技術院微生物工業
技術研究所、受託書「徹工研菌寄託第９８５８、ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−９８５８Ｊ）。

以上、イソフラボン誘導体生産菌について説明したが、
放線菌の一般的性状として蘭学上の性質は極めて変位し
易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行
われる紫外線照射、Ｘ線照射あるいは変位誘導剤などを
用いる人工的変位手段により変位することは周知の事実
であり、このような人工的変位株は勿論、自然変位株も
含め、ストレプトマイセス属に属し、イソフラボン誘導
体を生産する能力を存する菌株は、すべて本発明に使用
することができる。

本発明においては、先ずストレプトマイセス属に属し、
イソフラボン誘導体を生産する能力を有する微生物が適
当な培地に培養される。本微生物の培養においては、通
常放線菌を培養する方法が一般に用いられる。培地とし
ては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、
さらには必要に応じ無機塩などを含有させた栄養培地が
使用される。同化し得る炭素源としては、グルコース、
フラクトース、マルトース、キシロース、マンニット、
グリセリン、糖蜜、澱粉、デギストリン、コーン・スチ
ープ・リカーなどの炭水化物が単独または組み合わせて
用いられる。消化し得る窒素源としては、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、大豆蛋白分解
物、カゼイン、アミノ酸、尿素、ＮＺ−アミン、コーン
・スチープ・リカー、フィッシュ・ミールなどの有機窒
素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物が
単独または組み合わせて用いられる。その他、必要に応
じナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩、リン酸塩等の無機塩類が添加される。さらに必
要に応じ、本菌株の生育やイソフラボン誘導体の生育を
促進する重金属、微量栄養源、発育促進物質、前駆物質
などを適当に添加してもよい。

培養は通常漫とうまたは通気撹拌培養などの好気的条件
下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ま
しい。培養温度は２０〜４０℃でも行い得るが、通常は
２４〜３０℃で行うのが好ましい。培養時間は、液体培
養の場合、通常１〜８日培養を行えばよいが、好ましく
はイソフラボン誘導体の培養物中の蓄積量が増大に達し
た時に培養を終了すればよい。これらの培地組成、培地
の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は
使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい
結果が得られるよう適宜調節、選択されることは言うま
でもない。液体培養において発泡があるときは、シリコ
ン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用され
る。

このようにして得られた培養物中に蓄積されたイソフラ
ボン誘導体は菌体内および培養濾液中に含有されるので
、遠心分離して培養ろ液と菌体とに分離し、各々からイ
ソフラボン誘導体を採取するのが有利である。

培養ろ液からイソフラボン誘導体を採取するには、培養
ろ液を酢酸エチル等の非親水性有機溶媒で抽出するか、
あるいは培養ろ液を活性炭、アルミナ、多孔性合成高分
子樹脂、イオン交換樹脂などに吸着させ、酢酸エチルな
どの溶出溶媒で溶出し、得られた抽出液または溶出液を
減圧濃縮するか、またはヘキサンなどの有機溶媒を加え
て沈澱させればよい。得られた粗動質は、さらに脂溶性
物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカ
ゲル、アルミナなどの担体を用いるカラムクロマトグラ
フィーにより精製することができる。

菌体からイソフラボン誘導体を採取するには、菌体を含
水アセトンなどの含水親水性有機溶媒で抽出し、得られ
た抽出液を減圧濃縮し、その濃縮物を酢酸エチルで抽出
し、この酢酸エチル抽出液は、前記の培養ろ液から得た
酢酸エチル抽出液と合わせて分離精製するか、あるいは
前記と同じ方法で分離精製することができる。

このようにして得られたイソフラボン誘導体としては、
例えば第１表に記載の０Ｈ−１０４９Ｐ物質、０Ｈ−１
０４９Ｑ物質、０Ｈ−１０４９Ｒ物質が挙げられる。

第１表次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

〔実施例〕

実施例１０Ｈ−１０４９Ｐ、、Ｑ、Ｒ生　　の５００ｍｌ容坂ロフラスコに食塩０．３％、きな粉２．
０％、グリセロール２．０％を含む液体培地（ｐＨ７，
０）（Ａ培地］１００ｍｆを滅菌し、これにグルコース
１．０％、ペプトン０．　５％、肉エキス０，５％、食
塩０．３％、寒天１゜２％を含む寒天斜面培地上に２７
°Ｃで１４日間、培養したストレプトマイセス　エスピ
ー・０Ｈ−１０４９の斜面培養から１白金耳を接種し、
振幅１７ｃｍ、毎分１２０回往復するレシプロカル・シ
ェーカーで、２７℃で７２時間振とう培養して種母を得
た。

次に３０Ｊ容ジヤー・ファーメンタ−にＡ培地２０７！
を仕込み滅菌した後、上記方法で得られた種母１１を無
菌的に移植し、２８℃で毎分１５０１の空気を通気し、
攪拌しながら３日間培養して、培養液約２０Ｊを得た。

実施例２からの０Ｈ−１０４９Ｐ、Ｑ、Ｒの実施例１で得られた培養液に約１ｋｇのハイフロース−
パーセルを加え吸引濾過し、その培養濾液約２０Ｊに２
（ｌの酢酸エチルを加え攪拌・抽出した。水層と酢酸エ
チル層とを分液後、水層に再びＩＯｌの酢酸エチルを加
え、攪拌・抽出した。

水層と酢酸エチル層とを分液後、両酢酸エチル層を合わ
せ、約２１になるまで減圧濃縮し、濃縮液を約１１の脱
イオン水で洗浄した後、有機溶媒層を無水硫酸ナトリウ
ムで処理して脱水し、溶媒を減圧下で留去した。このよ
うにして、０Ｈ−１０４９Ｐ、ＱおよびＲ物質を含有す
る油状物質を得た。

実施例３実施例２で得られた油状物質を、予めクロロホルムを用
いて充填された内径７０ｍｍ、長さ３０Ｑｍｍのシリカ
ゲル６０（Ｍｅｒｃｋ社製）カラムに吸着せしめ、クロ
ロホルムからメタノールに連続的に変化させる溶出溶媒
を用いてクロマトグラフィーを行った。溶出液のうち、
抗酸化活性のあるフラクションを集め、減圧濃縮し、純
度約１０％程度のＯＨ−１０４９Ｐ１．Ｑ、Ｒ物質含有
画分を得た。

実施例４実施例３で得た０Ｈ−１０４９Ｐ、Ｑ、Ｒ物質含有画分
から０Ｈ−１０４９Ｐ、Ｑ、Ｒの純品を得るために次の
高速クロマトグラフィーにより分離精製した。

高速液体クロマトグラフィーは、送液ポンプとしてＴＯ
ＲＩＲＯＴＡＲＹ−Ｖ　（日本分光型）、検出器として
ＵＶＩＤＥｃ−１００−Ｖ　（日本分光型）、カラムは
、オクタデシルシラン化シリカゲルのＹＭＣＤ−ＯＤＳ
−５、内径２０ｍｍｘ長さ２５０ｍｍ（山村化学研究所
型）を用いた。実施例３で得た０Ｈ−１０４９Ｐ、Ｑ、
Ｒ粗生成物約１ｍｇを１０μｌに溶解させたサンプルを
注入し、展開溶出溶媒としてメタノール−水（１：１）
混合溶媒を用い、波長２７０ｎｍの紫外部吸収で０Ｈ−
１０４９ＰＳＱ、Ｒ物質に該当するピークを集めた。こ
の両分を減圧濃縮して抗０Ｈ１０４９Ｐ、、Ｑ、Ｒの純
品をそれぞれ約０．１ｍｇを得た。

実施例５分取薄層クロマトグラフィーは、薄層クロマトグラフィ
ー用プレートどしては、シリカゲル６０ＦＺＳ４．２０
Ｘ２０ｃｍ　（Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、実施例３で得
た０Ｈ−１０４９Ｐ、Ｑ、Ｒ粗生成物２０ｍｇを少量の
クロロホルムに溶かし、これをシリカゲルプレートに帯
状にスポットした。

この薄層板をクロロホルム−メタノール（９：ｌ）混合
溶媒で展開し、ＵＶランプ（２５４ｎｍ）下で検出され
得るＯＨ−１０４，９Ｐ、Ｑ、Ｒを含有する帯を掻き取
られたシリカゲルを、アセトンを用いて０Ｈ−１０４９
Ｐ、Ｑを抽出することにより、０Ｈ−１０４９Ｐ、Ｑ、
Ｒ１７１質の純品各々約１．５ｍｇを得た。

〔発明の効果〕

本発明のイソフラボン誘導体は抗酸化剤として有用であ
る。活性酵素定量法（Ｕｃｈｉｙａｍａら、Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、８６，２７１〜２７８）により、そ
の抗酸化活性を試験した。

その結果は第２表の通りである。

第２表用訂Ｕ」七玉＊＊コントロールに対するＭＤＡ　（マロンジアルデヒド
）生成の抑制率（％）一：未試験

【図面の簡単な説明】

第１図は０Ｈ−１０４９Ｐ物質の紫外線吸収スペクトル
、第２図は○Ｈ−１０４９Ｑ物質の紫外線吸収スペクト
ル、第３図は０Ｈ−１０４９Ｒ物質の紫外線吸収スペク
トル、第４図はＯＨ−１０４９Ｐ物質の赤外線吸収スペ
クトル、第５図は０Ｈ−１０４９Ｑ吻質の赤外線吸収ス
ペクトル、第６図は０Ｈ−１０４９Ｒ物質の赤外線吸収
スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、▲数式、化学式、表等があります▼は一重結合
または二重結合、ＸはＯまたはＨ＿２、Ｒ＿１〜Ｒ＿９
は各々Ｈ、ＯＨ、メトキシ、エトキシ、メチルチオ、カ
ルボン酸またはハロゲン原子を示すか、あるいはＲ＿１
とＲ＿２、Ｒ＿２とＲ＿３、Ｒ＿３とＲ＿４、Ｒ＿５と
Ｒ＿６、Ｒ＿６とＲ＿７、Ｒ＿７とＲ＿８およびＲ＿８
とＲ＿９のいずれか１つまたは２つ以上のメチレンジオ
キシ基を形成していてもよい）で表されるイソフラボン
誘導体またはその塩。
（２）、ストレプトマイセス属に属し、一般式▲数式、
化学式、表等があります▼ （式中、▲数式、化学式、表等があります▼は一重結合
または二重結合、ＸはＯまたはＨ＿２、Ｒ＿１〜Ｒ＿９
は各々Ｈ、ＯＨ、メトキシ、メチルチオ、エトキシ、カ
ルボン酸またはハロゲン原子を示すか、あるいはＲ＿１
とＲ＿２、Ｒ＿２とＲ＿３、Ｒ＿３とＲ＿４、Ｒ＿５と
Ｒ＿６、Ｒ＿６とＲ＿７、Ｒ＿７とＲ＿８およびＲ＿８
とＲ＿９のいずれか１つまたは２つ以上のメチレンジオ
キシ基を形成してもよい）で表されるイソフラボン誘導
体を生産する能力を有する微生物を培地に培養して該イ
ソフラボン誘導体を生産蓄積せしめ、得られた培養物か
ら該イソフラボン誘導体を採取することを特徴とする上
記一般式で表されるイソフラボン誘導体またはその塩の
製造法。