JPS59173089A - Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の
製造法に関する。Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラ
ギン酸はそれ自体抗菌活性を有する。即ちバチルス−ズ
ブチリス　（Ｅａｃｉｌｌｕｓ　ａｕｂｔｉｌｉｓ　）
　。

細菌に有効であることが知られている（参考文献１、工
ｓｈ１ｙａｍａ　等、　、Ｔｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　、　　２５巻、８２１頁、１９７
５年）。

一方、本物質は生体で重要な役割を演するアミノ酸の一
種であるＬ−アスパラギン酸の類縁体と見做すことが出
来、生体酵素系に関与して重要な生理活性を有すること
が知られている。例えばＬ−アスパルテートβ−デカー
ボキシラーゼ（Ｌ−Ａｓｐａｒｔａｔｅβ−ｄｅｃａｒ
ｂｏｒｙｌａｓｅ　）の阻害剤であることが知られてい
る（参考文献２．　Ｅ、ＷｌＭｉｌｅｓ　ａｎｄ　Ａ、
　Ｍｏ１ｓｔｅｒ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６巻、１７３４頁、１９６
７年）。また、脳の興奮刺激剤アミノ酸であるＮ−メチ
ル−Ｄ−アスパラギン酸の大脳皮質での吸収をＬ−スレ
オ−β−ヒドロキシアスパラギン酸が抑制することも報
告されている（参考文献１　、Ｔ、　ＨｌＳｋｅｒｒｉ
ｔｔ　ａｎｄＧ、Ａ、Ｒ，、Ｔｏｈｎｓｔｏｎ　、　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
、　５６巻。

８８１頁、１９８１年）。

以上の如く、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン
酸は抗菌剤並びに生理活性物質としてそれ自体有用であ
るのみならず、一種のアミノ酸として安価に供給出来れ
ば医薬やその他工業的に有用な化合物の合成原料または
素材として用いられる可能性が高い。

本物質の製造に当っては動植物体から抽出精製する方法
は可能であるが、原料の制限及び含有量の少ないことか
ら工業的に不利である。合成による方法は可能であり色
々な方法が知られているが、β−ヒドロキシアスパラギ
〉酸には４種の立体異性体、即ちスレオ型とエリスロ型
及びそれらのＤ及び一体の計４種の異性体を生じ、Ｌ−
スレオ体のみを単離する必要があシ、必ずしも工業的に
有利な方法とは云えない。これらの方法に対し微生物を
用いる醗酵法は、立体異性体の特定のもののみに限定さ
れた化合物のみを効率的に生産出来るので工業的に極め
て有利な製造法であると云える。

Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸を醗酵生産
する微生物としてカビの一種であるアースリニウム・フ
エオスパーマム（Ａｒｔｈｒｉｎｕｍｐｈａｅｏｓｐｅ
ｒ？ｎｕｍ　）及び放線菌であるストレプトミセス属（
ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｏθＢ）の１菌株が知られているに
過ぎない（参考文献１）。本発明者らは放線菌であるダ
クチロスポランギウム属（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎ
ｇｉｕｍ　）の１菌株がＬ−スレオ−β−ヒドロキシア
スパラギン酸の醗酵生産能を有し、しかもその培養液中
に効率よく高濃度に生産蓄積することを発見し、本発明
を完成するに至った。以下にその方法を説明する。

本発明に用いる微生物菌株の１例として、本発明者らが
京都市内の土壌より分離したダクチロスごランギウム属
に属する５Ｆ−２２５３株がある。５ＩＦ−２２５３株
の菌学的性状は下記に記述する通シである。観察は主と
してＨ，Ｂ、　Ｓｈｉｒｌｉｎｇとり、　Ｇｏｔｔｌｉ
ｅｂの方法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ。

１６巻、３１５〜３４０頁、１９６６年）に従って実施
した。

■　形態 基生菌糸はよく分枝して波状に伸長し、直径は０．５〜
０．６ミクロンである。寒天培地及び液体培地のいずれ
においても基生菌糸の分断は観察されない。気菌糸はほ
とんど見られず、事実上形成しないと思われる。１９Ｆ
−２２５３株は寒天培地の表面に胞子のうを１個あるい
はタフト状に形成する。胞子のりは、スターチ寒天培地
上で比較的多く認められる。胞子のうは指状で、大きさ
はおよそ０．７〜１．　ＯＸ　２．　Ｏ〜４．０ミクロ
ンである。各胞子のうけ中に１列に通常３〜４個の胞子
を持つ。胞子は大部分が円筒形ないし卵形で表面はなめ
らか、大きさはおよそ０．６〜α９Ｘ［１９〜１．８ミ
クロンである。胞子はたとえば土壌抽出液などに懸濁し
、１５〜３０分放置した後検鏡すると運動性が認められ
た。

■　各種培地上の生育状態 ５Ｆ−２２５３株の各種培地上の生育状態は次表に示す
通シである。色の記載において〔〕内に示す標準はコン
テナー・コーポレーション・オブ・アメリカ社製の［カ
ラー・ハーモニー・マニュアル」に記載されたものを用
いた。観察は２８°Ｃで１４〜２８日培養後に行なった
。

第　　１　　表 ■　生理的性質 （１）生育温度範囲：スターチ寒天において１５〜４０
°Ｃの温度範囲で生育し、２５〜３７℃で良好に生育す
る。

（２）ゼラチンの液化：陰性 （３）スターチの加水分解：陽性 （４）硝酸塩の還元：陰性 （５）脱脂乳の凝固：陰性 脱脂乳のペプトン化：陰性 （６）メラニン様色素の生成：陰性 （７）耐塩性：１．５％では生育するが、′５．０％以
上では生育しない。

■　炭素源の利用性 Ｄ−グルコース　　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　　＋ Ｄ−７ラクトース　　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　＋ Ｌ−アラビノース　　　　　＋ Ｌ−ラムノース　　　　　　士 １−イノシトール　　　　　− シュクロース　　　　　　　＋ ラフィノース　　　　　　　＋ （基礎培地はＰＲよりＨＡＭとＣ）ＯＴＴＬｌｌＣＢ　
ノ培地を用いた）■　細胞壁組成 ベラカー等の方法（Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
　１３　：　２３６（１９６５）参照）により分析した
結果、細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸は主にと
ド四キシ型であった・ 以上の性状よりＳｌｌ’−２２５！１株は放線菌の中で
ダクチロスポランギウム属に属する菌株であるが、ダク
チロスポランギウム属に属する菌株がＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアスパラギン酸酸化生産ることは知られてい
ない。

従って、本発明者等はＳＩＴ’−２２５３株をダクチロ
スポランギウムΦエスピー−５ＩＰ−２２５５ト命名し
た。なお、ダクチロスポランギウム・エスピー・５Ｆ−
２２５３株は工業技術院微生物工業研究所に受託番号、
微工研菌寄第６８５８号として寄託されている。

上記にその性状が明らかとなったＦ３’？−２２５３株
を用いＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸を生
産するに’！ｆり、以下にその概要を説明する。

ダクチロスポランギウムやエスピー８７−２２５３株は
、他の放線菌の場合にみられるように、その性状が変化
しやすく、例えば紫外線、エックス線放射線、薬品等を
用いる人工的変異手段で変異しうるものであり、このよ
うな変異株であってもＬ−スレオ−β−ヒドロキシアス
パラギン酸の生産能を有するダクチロスポランギウム属
の菌はすべて本発明の方法に使用することができる。

本発明の方法では、ＳＩＦ　−２２５５株を通常微生物
が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。例えば
炭素源としてグルコース、シュクロース、デキス）　Ｉ
Ｊン、澱粉、水あめ、糖みつ、大豆油等を使用しうる。

まだ、窒素源として大豆粉、小麦胚芽、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、コーンステイープリカー、硝酸ナト
リウム、硫酸アンモニウム等を使用しうる。その他必要
に応じて炭酸カルシウム、塩化カリウム、燐酸塩等の無
機塩類を添加するほか菌の発育を助け、Ｌ−スレオ−β
−ヒドロキシアスパラギン酸の生産を促進するような有
機物及び無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、一般の微生物の培養方法と同じく液体
培養法、特に深部攪拌培養法が最も適している。培養は
好気的条件下で行なわれ、培養に適した温度は２５℃〜
４０℃であるが、通常３０°Ｃ付近で培養し、ｐＨは中
性〜弱アルカリ性が望ましい。液体培養法で通常３〜１
０日間培養を行なうと、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシア
スパラギン酸が培養液中に生成蓄積される。

Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の検定方法
は本物質が抗菌活性を有するので一般に抗生物質の検定
に用いられるバイオアッセイ法が適用出来る。即ち検定
菌としてバチルス・ズブチリスＰＯニー２１９　（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）を用いペプトン０
．５％と寒天１．５％（殺菌前ｐＨ７）から成る検定シ
ャーレを作成し、被検液を浸種したペーパーディスク（
直径８ｍ）を検定シャーレ上に置き３７℃、１７時間培
養すると、被検体の濃度に応じた発育阻止円が見られる
。阻止円径とＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン
酸の濃度の対数が一定の範囲で直線的相関関係にあり、
この場合１０Ｑμｆ／ｍｌ〜２０００μＩＦ／ｍ／の濃
度範囲で定量出来る。

培養液内に生産、蓄積された０Ｆ−２２５３物質を単離
精製するには、水溶性酸性物質の精製に通常用いられる
手段を適宜利用することが出来る。即ち、ダイヤイオン
ＨＰ−２０（三菱化成製）、ア〉パーライトＸＡＤ−２
（ロームアンドハース社製）。

炭末等の吸着剤；セファデックスＧ−１ｒｌ（ファルマ
シア製）　、　　）ヨパールＨＷ−４０（東洋ソーダ社
製）等のゲル濾過剤；ダウエックス１×２（ダウケミカ
ル社製）、ダイヤイオンＦＡ−３０６（三菱化成製）　
、　：ｔｎｃＡｘ−セファデックス（ファルマシア製）
等の陰イオン交換樹脂等によるクロマトグラフィーが使
用されるが、以下による精製方法が効率的である。

５Ｆ−２２ｓｓ株ノｔｆＮｉＨ＆ヲハイ７０スーパーセ
ル等の濾過助剤を用いて菌体その他の固型物を除去し、
次いで濾液中の有効成分をダウエックス１×２（Ｏ４−
）に吸着させ、０．２　Ｍ　ＮａＣ１水で溶出させる。

この溶離液をセルロースカラム、セファデックスＧ−１
０等のカラムクロマトグラフィー；メタノール、エタノ
ール等の有機溶剤による沈澱等を適宜組み合わせること
により高純度の５Ｆ−２２５３物質を得ることができる
。

以下に本発明によって得られたＬ−スレオ−β−ヒドロ
キシアスパラギン酸の理化学的性状を示す。

（１）外観：白色針状結晶 （２）融点：２００°Ｃ付近より徐々に褐変する。

（３）元素分析値：　０３３．３６％、　Ｈ４，６９％
、ｌＪ９．１３％。

０５２．８２％ （４）　Ｂ子［ｉ　：　１４９　　（ＦＤマススペクト
ルによる）（５）紫外部吸収スペクトル：　２２０　ｕ
ｍ〜３７０　ｍｍに特徴的な吸収極大がない。

（６）赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）：第１
図に示す。

１７２５、１６６０．１５００．１’１６０．１１　ｎ
ｏ。

１０４０及び９７０　ｃｉ−１に特徴的吸収が見られる
。

（７）溶解性 アルカリ性または酸性水及び温水に良く溶け、水ニ可溶
、メタノール、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、
ベンゼン、エーテル等の有機溶剤に実質的に不溶である
。

（８）安定性 酸性、中性、アルカリ性いずれにおいても安定である。

（９）シリカゲル薄層クロマトグラフィーのＲｆ値ｎ−
プロパノ−ルービリジシー酢酸−＃（１５：１０：３：
１２）　　　　　０．５エタノール−水 （７：３）　　　　　　　　　　　　　ｏ、３αＱペー
パークロマトグラフイーのＲｆ値（上昇法）ｎ−プロパ
ノ−ルーピリジン−酢Ｓ−水（１５：１ｏ：３：１２）
　　　　　０．２２ｎ−ブタノール−酢酸−水 （２：１：１）　　　　　　　　　　α１４ａｎ呈色反
応 陽性コニ〉ヒドリン、レミュー、ヨウ素反応陰性：硫酸
、坂口反応 ＋１３高圧濾紙電気泳動（３５００Ｖ、２０分）ギ酸−
酢酸一水（ｐＨ１，９）　　Ｒｍ（Ｌｙｓ）　ｆｌ、１
９（２０：　８０　：　９００．Ｖ／Ｖ）ピリジン−酢
酸−水（ｐＨ＆４）　　Ｒｍ（Ｇｌｕ）１．１４（２０
０：８　：　２８９０．Ｖ／Ｖ）ａＳ比旋光度 Ｃα）ｓｅｗ　＋　３ａ　Ｏ’　（００，５，ＩＮＨＯ
ｔ）１重水中で測定した水素核磁気共鳴スペクトル（１
００ＭＨ２＋　ＴＭＳ外部標準）では４．０７（ＩＨｄ
。

、ｒ＝２Ｈｚ）及び４．５５ｐ％　（ＩＨｄ、　、Ｔ−
２Ｈ２）　Ｋシグナルが見られる。

（ｌ！９重水中で測定した炭素核磁気共鳴スペクトル（
２５ＭＨｚ　、　ｄｉｏｘａｎｅ外部標準）では５７．
８　（ｄ）　。

７１、５（ｄ）、　１７５．０　（ｓ）及び１７　Ｚ　
２　（８）　Ｋシグナルが見られる。

以下に本発明の方法にっき実施例にもとすき説明する。

実施例１ 種培地としてスターチ２．０％、グルコース１．０％、
小麦胚芽０．６％、ペプトン０．５％、イーストエキス
トラクト０．３％、大豆粉０．２％および炭酸カルシウ
ム０１％を含む培地を用いた。まだ、生産培地として水
飴２．０％、大豆油０１５％、大豆粉１，０％、「サン
グレイ〉」（サントリー社製）α２５％、綿実粕０．５
％、炭酸カルシウム０．１％。

硫酸第一鉄０．　ＯＯ０５％、塩化ニッケル［１，００
００５％および塩化コバルト０．００００５％を含む培
地を用いた。殺菌前の培地のｐＨは全て７に調節し実施
した。

イーストエキストラクト・マルトエキストラクト寒天ス
ラントに十分生育したダクチロスポランギウム中エスピ
ー５ｙ−２２５３株（微工研菌寄第６８５８号）を上記
殺菌種培地２０１を含む１００ＩＩ／容三角フラスコ２
本に６〜７白金白金耳上、２８°Ｃで６日間培養し、第
１種培養液とした。次いで、殺菌種培地１００ｄを含む
５００ｄ容の三角フラスコ２本に前記の第１種培養液４
Ｍｌずつを接種し、２８°Ｃで２日間振盪培養し、これ
を第２種培養液とした。次いで、殺菌種培地１ｔを含む
５を容の三角フラスコ２本に前記の第２種培養液５０ｍ
／ずつを接種し、２８°Ｃで２日間振盪培養し、これを
第３種培養液とした。次いで、この第３種培養液をＳ５
ｔの殺菌生産培地を含む５０を容のジャーファーメンタ
−２基に接種し、２８℃で５日間通気、攪拌培養した（
回転数２７Ｏｒｐｍ、通気量３５Ｌ　／　ｍｉｎ　）。

培養終了後、ケイソウ土を助剤に用いて濾過し、培養濾
液４０１を得だ。ノ（イオアツセイによるＬ−スレオ−
β−ヒドロキシアスパラギン酸の生産量は１１００μｍ
％／ｍ／であった。

実施例２ 実施例１で得た培養濾液４０１をｐＨ２に調整後、活性
炭４ｔを充填した塔に通した。その通過液をダウエック
スＩＸ２　（０／！、’−）　　（ダウケミカル社製）
４ｔを充填した塔に通し有効成分を吸着させた。

吸着後、この塔を１２ｔの水で洗浄し、α２Ｍ塩化ナト
リウム溶液で溶離すると、５を分画でフラクションＡ１
及び２に有効成分が溶出された。この７ラクシヨンを約
３０−になるまで減圧濃縮した。このとき析出した塩化
ナトリウムの結晶は濾過して除き、濾液をセファデック
スＧ−１０（ファルマシア社製）１．２７！、を充填し
た塔に付し水で展開すると、フラクションＡ２７〜４９
（１８ｍ／分画）にかけて有効物質が溶出された。

活性フラクション６６０ゴを集め、減圧濃縮して凍結乾
燥したところ、淡黄色のＬ−スレオ−β−ヒドロキシア
スパラギン酸ナトリウムの粗粉末が３１．５７得られた
。

次いで、この粗粉末を５０％含水エタノールで溶解後、
あらかじめ９０％エタノール水で洗浄し九カラムクロマ
ト用セルロース（ワットマン社製）１ｔを充填した塔に
つけ、９０％エタノール水１ｔで洗浄後、７０％エタノ
ール水五５ｔ及び５０％エタノール水２ｔで各々展開す
ると、フラクションＡＩ　３７〜２７Ｂ　（１８１ａ１
分画）にかけて有効物質が溶出された。この活性７ラク
シヨン２．５ｔを減圧濃縮し凍結乾燥することによシ淡
黄色のＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸ナト
リウムの精製粉末が１４．８Ｆ得られた。

次に、このうちのＳ５ｔを水５−に溶解させ、ｐＨ２に
調整後、エタノール５０１／を加えると沈澱が２．７２
７生成した。この沈澱を温水２０１１Ｌｌに加え塩酸で
ｐＨｒＡ節し溶解させた。この溶液が少し白く濁るまで
エタノールを加え、５°Ｃで一晩静置するとＬ−スレオ
−β−ヒドロキシアスパラギン酸の白色結晶が析出し、
これを濾別し減圧下に乾燥して白色針状結晶ｚ４１１を
得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の
臭化カリウム錠剤での赤外部吸収スペクトルである。 特許出願人　明治製菓株式会社 疲数ｃｃｍ＝）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ダクチロスポランギウム属に属し、Ｌ−スレ
   オ−β−ヒドロ、キシアスパラギン酸生産能を有する菌
   株を栄養培地中に培養し、培養物よシＬ−スレオーβ−
   ヒドロキシアスパラギン酸を採取することを傷゛徴とす
   るＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の製造法
   。
2. （２）　　ズブチリスごランギウム属に属し、Ｌ−スレ
   オ−β−ヒドロキシアスパラギン酸生産能を有する菌株
   がダクチロスポランギウム・エスピー　５ｙＩ−２２５
   ３株（ＦＥＲＭ　ｙｚ−６８５８）である特許請求の範
   囲第１項記載の製造法。