JPS60224493A - 新抗生物質ｓｆ−２３１２物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規抗生物質８Ｆ　−２３１２物質及びその製
造法に関する・更に詳しく述べれば、放線菌を培養する
ことＫより得られる新抗生物質５Ｆ−２３１２物質又は
その塩及びそれらの製造法に関するものである・ 発明に到る経緯 本発明者らは種々のダラム陽性菌及び陰性＠ＴＩＣ抗菌
活性を有する新規かつ有用な抗生物質を探索した結果、
ミクロモノスポーラ属に属する放線菌を栄養培地中に培
養することによって新抗生物質８Ｆ　−２３１２物質が
発酵的に生産されることを見い出し、８Ｆ’　−２３１
２物質を単離し・その理化学的性状、生物学的性状を確
定した。さらには本菌を培養する際に培地中にビタミン
Ｂ１□を添加することＫよりｓＦ　−２３１２物質の生
産を著しく増大させることを見い出した。本発明は上記
の知見に基づいて完成されたものである。

発明の要旨 したがって第一の本発明は、水浴性酸性の抗菌物質であ
り、ナトリウム塩として重量比で炭素２１．１２　％、
水素３．３８１窒素５．９７−の元素組成を有し、分子
量は２１９（質量分析から）、分子式はＣ４Ｈ，Ｎｏ６
Ｐ　Ｎａであり、水溶液中での紫外部吸収スはクトルは
２２０　ｎｍ〜３７０　ｎｍに特徴的吸収がなく、第１
図に示すような赤外部吸収スペクトルを示し、外観は白
色粉末であり、水に可溶、メタノール、酢酸エチル、ベ
ンゼン、クロロホルム等の有機溶媒に難溶又は不溶であ
り・シリカビル薄層クロマトグラムのＲｆ　値は展開溶
媒が７０憾エタノール水で０．３２、ｎ−プロア４′ノ
ール−ピリジン−酢酸−水（＋５：１０：３：１２）で
０．５８　ｔ−示し、レミュー、硫酸、塩化第二鉄、塩
化第二鉄−スルホサリチル酸試薬に陽性、ニンヒドリン
試薬には陰性であり、水溶液中での比論光０ 度は〔α］ｏ　＝＝＋１２°（ＣＩ、水）であり、ｐＨ
６，４のピリジン−酢酸緩衝液を用いた高電圧Ｐ紙電気
泳動（３５００Ｖ、１５分）は陽極側に９．５釧泳動し
、そのＲｍ値（グルタミン酸）は１．０７であることを
特徴とする新抗生物質８Ｆ’　−２３１２物質及びその
塩を提供するものである。

さらに第二の本発明は、ミクロモノスポーラ属に属する
８Ｆ’　−２３１２物質生産菌を培養し・培養物から８
Ｆ　−２３１２物質又はその塩を採取することを特徴と
する新抗生物質ＳＦ　−２３１２物質又はその塩の製造
法を提供する・ 本発明の方法で使用される新抗生物質８Ｆ−２３１２物
質生産菌の一例としては、本発明者らにより静岡県清水
市の土壌より新たに分離されたＳｔ’−２３１２株があ
る。ＥＩ　Ｆ　−２３１２株の菌学的性状は下記のとお
りである。

■・形態 基生菌糸は長く伸長、分枝し、その直径は約０．５＃１
である・気菌糸は通常放線菌の培養に用いられている各
種の寒天培地上で形成されない。

まれに・胞子と思われる形態が基生菌糸上に１個ずつ観
察されるが（光学顕微鏡観察）、その形成は寒天培養、
振盪培養のいずれにおいても極めて貧弱であり、現在ま
でのところ、それを電子顕微鏡で確認するに至っていな
い。胞子のう、鞭毛胞子、菌核は調べた範囲では観察さ
れない。

■・　各種培地上の生育状態 ８Ｆ　−２３ｔ２株の各種寒天培地上の生育状態は次表
に示すとおりである０色の記載について〔〕内に示す標
準はＣｏｎｔａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　Ａｒｎｅｒｉ−ｅｌｌ　社製のｒ　Ｃｏ１ｏｒ　Ｈ
ａｒｍｏｎｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊ　を用いた０観察は２
８°Ｃ１１４〜２１日培養後に行った。

■、生理的性質 （１＋　生育温度：１５〜３８°Ｃの温度範囲で生育Ｌ
・・全適温度は２６〜３０８Ｃである。

（２）　ゼラチンの液化：陽性 （３）　スターチの加水分解：陽性 （４）硝酸塩の還元：陰性 （５）脱脂乳のペプトン化二隘性 Ｉ　の凝固：陰性 （６）　耐塩性：１．５％の食塩存在下で生育するが、
３．０％以上では生育しない。

（７）　メラニン様色素の生成：陰性 ■・　炭素源の利用性 ｆｌ）　利用する：Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、
グリセロール （２）　利用しない：Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノー
ス、ｉ−イノシトール。

＋ａｌ　利用が疑わしい＝Ｄ−フラクトース、Ｄ−マン
ニトール、シュクロース、ラフィ ノース ■・　細胞壁組成 Ｌｅｃｈｓｆｖａｌｉｅｒら（Ｉｎｔｅｒｎ、Ｊ、８ｙ
ｓｔ、Ｂａｃｔ、　２０　：４３５〜４４３．　＋９７
ｏ）の分類によると、８Ｆ−２３１２株の細胞壁組成は
■型で糖・９ターンＦｉＤ型である。

以上より、８Ｆ−２３１２株は細胞壁組成が■型。

糖・々ターンがＤ型の放線菌であり・中温菌で気菌糸を
形成せず、基生菌糸に胞子を１個ずつ形成することから
、Ｍｔｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　属に属すると思われ
るりしかしながら、胞子形成が貧弱なため、電子顕微鏡
による胞子の確認はまだなされていない。

従って、属の決定にはさらに検討が必要であるが、現時
点では１本菌’Ｔｈミクロモノスポラ・エスピーと称す
ることにした＠ 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に１９８４年
３月２日以来、微工研菌寄第７４９２号（Ｆｌｉｌ：Ｒ
Ｍ−Ｐ　７４９２　’）として受託されている。

他の微生物の場合と同様、抗生物質ＳＦ　−２３１２を
生産する菌株、　８Ｆ　−２３１２株はその性質が変化
しやすい。例えば８１’　−２３１２株の、またはこの
株に由来する、突然変異株（自然発生または誘発性）、
形質接合体または遺伝子組換え体であっても抗生物質８
Ｆ　−２３１２を生産するものはすべて本発明に使用で
きる◎ 本発明の方法では紬記菌株を通常の微生物が利用しうる
栄養物を含有する培地で培養する０栄養源としては、従
来放線菌の培養に利用されている公知のものが使用でき
る＠例えば、炭素源としてグルコース、グリセロール、
＃粉、水あめ、シュクロース、デキストリン、糖みつ、
植物油、動物油尋が使用できる。又、窒素源としては、
大豆粉。

小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、イーストエ牟ス。

コーンステイープリカー、綿実かす、魚粉、硫安。

硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他・必要に応じ
て、ナトリウム、カリウム、マグネシウム。

カルシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他
のイオンを生成することができる町Ｗｊ性無機塩類を添
加することは有効である。

さらに・菌の発育を助け、抗生物質８Ｆ　−２３１２の
生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加する
ことができる。例えば、ビタミンＢ１２は８Ｆ　−２３
１２株の生育を促進し、抗生物質８Ｆ−２３１２の生産
を著しく高めるのに極めて有効であるＯ培養法としては
好気的条件下での培養法、特に深部培養法が最も適して
いる。培養に適当な温度は１５〜３　ｇ’Ｃであるが、
多くの場合・　２６〜３００Ｃ付近で培養するＯ抗生物
質８Ｆ　−２３１２の生産は培地や培養条件により異な
るが、振盪培養、タンク培養ともに通常２〜１０日の間
でその蓄積が最高圧達する。

８Ｆ　−２３１２物質の検定にあたっては、次の方法が
用いられる・検定用培地としてマイシン寒天を用いる。

検定菌としてはセラチア・マルセッセンス（５ｅｒｒａ
ｔｔａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）を用いる６８Ｆ−２
３１２物質はこれを用いた検定においテ１０００μｔ／
−〜２５０μｔ／−において濃度の対数と阻止円径との
関係は直線関係を示し、それぞれ２３．２〜１５．６目
の阻止円径を与える（　ヘａ４−ディスク平板法）。

本発明により得られるＳＦ　−２３１２物質は水溶性酸
性物質である。これを培養物より採取するに当ってその
抽出精製には炭末、ダイヤイオンＨＰ−２０等の吸着剤
、ダイヤイオンＷＡ−１０．ダウエックス１×２等の陰
イオン交換樹脂、セファデックスＧ−１０等のゲル濾過
剤勢によるクロマトグラフィーが使用されるが以下に示
す採取方法が効率的である。

すなわち培養液より菌体その他の固形物を珪藻土等の濾
過助剤を用いて戸別し、次いでｐ液中の有効成分をダイ
ヤイオンＷＡ−１０に吸着させる〇樹脂部を水洗後、１
規定アンモニア水で溶出させる。この溶出液を減圧濃縮
し、さらに炭末、ダウエックス５０ｗｘ２（）Ｉ）、セ
ファデックスＧ−１０等のカラムクロマトグラフィーを
適宜組み合わせることにより高純度のＳＦ　−２３１２
物質を遊離酸又はＮ、塩として得ることができる。８Ｆ
−２３１２物質Ｎ、塩は温和な条件下に酸で加水分解す
ると、遊離酸として収得できる◎常法で塩基と反応させ
ると、８Ｆ　−２３１２物質の塩が得られる。この塩と
しては、例えば、アルカリ金属塩、アンモニウム塩・ア
ルカリ土類金属塩がある・ 以下にＳＦ　−２３１２物質（Ｎａ塩）の理化学的性状
を示すり １、外　観　白色の無定形粉末 ２・　融　点　１６０°Ｃ付近より徐々に褐変するが、
明瞭な融点を示さない。

８・　元素分析値　Ｃ２１，１２％　、Ｈ３，３８嗟　
。

Ｎ　５．９７チ ４・　紫外部吸収スペクトル ２２０　ｎｍ　〜３７０　ｎｍで％徴的吸収を示さない
。

５、　赤外部吸収スペクトル 臭化カリウム錠中で測定したスペク トルを第１図に示す。

６・　分子量　質量分析（８Ｉ−ＭＳ）より８Ｆ’−２
３１２物質（Ｎａ塩）の分子量は２：９で ある＠ ７・　分子式　核磁気共鳴スはクトル、質量分析。

元素分析値による分−ト式は Ｃ４１（、Ｎ０６Ｐ　Ｎａである。

８・　水素核核磁気共１１％スペクトルＳＦ−２３１２
物質（遊離酸）の重水中で測定した４　００　ＭＨｚ　
、ＦＩ　ＮＭＲのスペクトルを第２図ｖこ示す◎ ９・　比旋光度 〔α］。＝＋１２°（ｃｌ、Ｈ２Ｏ） ｌｏ４３解性　水に可溶であるが、ベンゼン、アルコ−
／ｌ／、　酢酸：ｒ−ｆル、クロロホルム等の有機溶媒
にけ難溶又は不溶であ る０ １１・呈色反応 陽性ニレミュー、硫酸、塩化第二鉄、塩化絹二鉄−スル
ホサリチル酸試薬 陽性：ニンヒドリン試薬 １２、　シリカゲル薄７ｍクロマトグラソイ−のＲｆ値
（メルク社製Ｆ２５４） ｆ ７０％エタノール水　ｏ、３２ ｎ−プロノ臂ノールーピリジンー酢酸−水（＋５：１０
：３：＋２）０．５８ アセトニトリル−水（７：　３　）　０．２６１８・高
電圧１紙電気泳動のＲｍ値 Ｒｍ（グルタミン酸）　１．０７ ｎｍ（フオスフォマイシン）　０．７４■４・安定性　
酸性、中性及びアルカリ性条件下において比較的安定で
ある。

次に８Ｆ　−２３１２物質（Ｎａ塩）の各種微生物に対
する抗菌活性を第１表に示す。

第１表　５Ｆ−２３１２物質の抗菌スペクトル寒天希釈
法 培地二ニュートリエンドアガー（Ｎｕｔｒｉｅｎｔａｇ
ａｒ　） 第１表に示すごとく、８Ｆ　−２３１２物質はグラム陰
性菌に抗菌力を有している。

以上の理化学的、生物学的性状を有する８Ｆ　−２３１
２物質は文献上、これに該当するものがなく新規物質と
判定するに至った０ すなわち、りんを含む水溶性酸性物質の抗生物質として
はフオスフォマイシン（Ｐｈｏｓｐｈｏｍｙｃｉｎ　）
（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃｓ　２３　：　３３６〜３４７゜１９７０　）、ｙ　
オス７オノクロリン（Ｆｏｓｆｏｎｏｃｈｌ−ｏｒｉｎ
）（特開昭５８−２０９９８６号公報）、ＦＲ−３１５
６４（Ｆｏａｍｔｄｏｍｙｃｌｎ　）　（Ｔｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｌｉｂｉｏｔｔｃａ　３３　：　
２４〜３５＋　１９８０　）　等が報告さレテイるが、
ＳＦ−２３１２物質はこれらのいずれとも異なり、新規
抗生物質であることが明白となった口 実施例 以下に本発明の実施例を示すがこれらは単なるー例示で
あって本発明を限定するものではない。

実施例１ イースト麦芽寒天スラン）Ｋ充分生育したミクロモノス
ポラ・エスピー・５ｉｒ−２３＋２株（ＩＩ工研菌寄＠
　７４９２号）ｆ、グルコース１．ｏｉスターチ１．０
慢、ポリはプトン０．５％、肉エキス０．２％。

イーストエキス０．３１大豆粉０．２’１．炭酸カルシ
ウム帆２　ｑｂ、　ｐｔｉ　７．０　（殺菌前）の鵡成
カラナル種培地２０Ｉ！！１！（１００ｍｇ容三角フラ
スコ使用）に３白金耳接種し、２８°Ｃで５日間振盪培
養し、こｉｌを踵培養とした〇 生産培地として、水あめ２．０９ｆｔ、大豆油０．１５
俤、大豆＠１．ｏ％、綿実かす０．５％、デイステイラ
ーズ・ソリエーブル０．２５９Ｇ、炭酸カルシウム０．
１チ、硫ｌＪ！第１鉄０　、０００５チ、　塩化コバル
ト０．００００５　％　、塩化ニッケル０．００００５
チ、ｐＨ７，Ｑ（殺菌前）の組成の培地を用い九〇 この生産培地８０＋ｄ（５００ｍ容三角フラスコ使用）
に別殺菌したビタミンＢ１２を濃度を変えて無菌的に添
加し、そこへ前述の種培賛を５−の割合で接種し、２８
″′Ｃで６日間振盪培養した。その結果は次表のとおり
である〇 以上の結果より、ビタミンＢ１２がＳＦ　−２３１２株
の抗生物質ＳＦ’　−２３１２生産を著しく高めること
は明らかである＠ 実施例２ 種培地としてスターチ２．０１！、グルコース１．０憾
、小麦胚芽０．６％、はプトン０．５１　イーストエキ
ス０．３９６．大豆粉０．２９に、炭酸カルシウム０．
１憾を含む培地を用いた□また生産培地として水飴２．
０％、小麦胚芽１．３１１．綿実粕０．７５俤。

コーンスチープリ力−１．０％、ビタミンＢ、□０・０
００１％（別殺菌）を含む培地を用いた。殺菌ＭｐＨは
種培地に１．ｏ、生産培地’ｉｉ７，５Ｋｆｉ節し。

使用した◎ イースト・４２刃４人スラン１−に充分生育したミクロ
モノスポラ・エスピー・ＳＦ　−２３１２株（微工研菌
寄第７４９２号）を前記殺１済の種培地２０＋、Ｉ７！
ずつを分注した１０〇−容三角フラヌコ２本に３〜４白
金耳接移［７，２８°Ｃで４日間培養し、第一種培養と
した。ついで、わ１１培地８０幻２ずつを分注した５０
０−容の三角フラスコ２本に前記り）第一種培養４．―
ずりを接種し、２８°Ｃで３日間振Ω培養し、こ１Ｌｆ
３：第二種培養とし九〇ついで、種培朋１ｔずつを分注
した５を容の三角フラスコ２本に前記の第二種培養ＢＯ
ｍｔずつを接種し、２８°Ｃで２日間振盪培養し、これ
を第三種培養とした・ ついで、この第三種培養を３５／、の殺菌済生産培地を
含む５０を容のジャーファーメンタ−２基に接種し、２
８８Ｃで７日間通気、攪拌培養した（通気ｉｋ３５　Ｌ
／　ｍｉｎ　％回転数は初期３００ｒｐｍ。

４１時間目から５０　Ｏｒｐｍ　）　。

培養終ｒ後、珪藻土を用いてｐ過し・培−１ＩＰ液５２
ｔを得た〇 実施例３　８Ｆ’−２３１２物質の採取実施例２で得ら
れた培養い液５２ｔｆダイヤイオンＷＡ−１０（ＯＨ−
）　（三菱化成社製）５ｚの塔に通し有効成分を吸着さ
せる。２０１の水で洗浄後・　１規定アンモニア水で溶
離すると、２１分画でフラクション１〜３に活性物質が
溶出されてくる。この活性画分ｂｔ’ｇ（濃縮して１ｔ
とし、次に炭末１ｔの塔に通し、有効成分を通過させる
・この通過液を減圧下で濃縮して凍結乾燥すると５Ｆ−
２３１２物質の粗粉末が３２１得られた。次にとの粗粉
末の１６ｆ’ｉ予め９０−エタノール水で充填したシリ
カゲルＣ−２００（和光紬薬製）＋ｔＯ塔に付し・９０
チエタノール水２ｔで洗浄した後・６０係エタノール水
で溶離すると８０−分画でフラクション４〜１２に活性
画分が得られた。

こ？Ｌ２減圧下で濃縮し、凍結乾燥すると５Ｆ−２３１
２物質の粗粉末が５．６２得られた０次にこの粗粉末５
．６ｆを５−の水に溶解させ、塩酸にてｐＨ２，０に調
整し、予め水で充填した炭末７００＋ｄの塔に付し、１
．２ｔの水で洗浄後、１規定アン−Ｔ−＝ア水ζとアセ
トン（１：ｌ）の溶媒で展開すると・６〇−分画でフラ
クション８〜！４に活性画分がも１られ、これを減圧下
で濃縮し、凍結乾燥してＳＦ　−２３１２物質の粗粉末
１．２ｆ（純度約２０チ）を得たＯ さらにこの粗粉末１．２ｆを少量の水で溶解１ノだ後、
予め水で充填したセファデックスＧ　−１０（ファルマ
シア社製）　（ｇ　ｏ　ｏ　ｍｔ　）の塔に付し水で展
開すると、２〇−分画でフラクション１８〜２４に活性
画分を得、これを減圧下で濃縮凍結乾燥して５２０ｑの
粗粉末な得た０次に、との粗粉末５２０ηを少量の水に
溶解し、予め水で充填したダウエックス５０ＷＸ２（Ｈ
，１００〜２００メツシユ、５００ｍｅ）（ダウケミカ
ル社Ｍ）の塔に付し水で展開すると、１０−分画でフラ
クション２１〜２５に活性画分を得、これを２規定苛性
ソーダでｐＨ６，２に調整後、減圧下で濃縮凍結乾燥す
ることによりＢＥ；’　−２３１２物質のナトリウム塩
１２０キが得られた。このものは前記薄層クロマトグラ
フィーで単一のスポットを与えた◎

【図面の簡単な説明】

第１図はｓＦ　−２３１２物質ナトリウム塩のＫＢｒ錠
中で測定した赤外部吸収スペクトルである。 第２図は重水中で測定したＳＦ　−２３１２物質遊離酸
の４００　ＭＨｚ水素核核磁気共鳴スペクトルであるＯ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ・　水溶性酸性の抗菌物質であって、そのナトリウム
   塩は重量比で炭素２１・１２１、水素３．３８％、窒素
   ５．９７−の元素組成を有し・分子量は２１９（質量分
   析から）、分子式はＣ４Ｈ，Ｎｏ６ＰＮａであり、水溶
   液中での紫外部吸収スペクトルは２２０　ｎｍ〜３７０
   ｎｍＫ特徴的吸収がなく、第１図に示すような光外部吸
   収スペクトルを示し、外観は白色粉末であり、水に５Ｔ
   溶、メタノール、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム
   等の有機溶媒に難溶又は不溶であり、シリカゲル薄層ク
   ロマトグラムのＲｆ値は展開溶媒が７０ｒＩｂエタノー
   ル水で０．３２、ｎ−プロパノ−ルーピリジン−酢酸−
   水（＋　５：　１０：３：１２）で０．５８を示し、レ
   ミュー、硫酸、塩化第二鉄、塩化第二鉄−スルホサリチ
   ル酸試薬に陽性・ニンヒドリン試薬には陰性であり、水
   溶液中での比旋光度は〔α］’、７＝＋１２°（ｃｌ、
   水）であシ・ｐＨ６，４のピリジン−酢酸緩衝液を用い
   た亮電圧Ｖ紙電気泳動（３５００Ｖ、ｌ　５分）は陽極
   側に９．５副泳動し、そのＲｔｎ値（グルタミン酸）は
   １．０７であることを特徴とする新抗生物質８Ｆ−２３
   １２物質及びその塩。 ２、ミクロモノスポーラ属に属する８Ｆ　−２３１２物
   質生産菌を培養し、培養物から８Ｆ’　−２３１２物質
   又はその塩を採取することを特徴とする新抗生物質８Ｆ
   　−２３１２物質又はその塩の製造法。