JPS5922514B2 - 新規抗生物質ｘｋ−２０１−４およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規抗生物質およびその製造法に関する。

さらに詳しくは本発明はグラム陽性菌や陰性菌に対して
抗菌力を有し、後述の理化学的性質を有する新規抗生物
質Ｘに−２０１−■に関する。また本発明はストレプト
マイセス属に属する抗生物質Ｘに−２０１−■生産菌を
栄養培地に培養して、培養物中にＸに−２０１−■を蓄
積せしめ、ついで該培養物からＸに−２０１−■を採取
することを特徴とするＸＫ−２０１−■の製造法に関す
る。本発明者らは新規な抗生物質を開発する目的で、天
然界より数多くの微生物を入手して抗生物質の生産住を
調べた。

その結果、広島市の土壌から分離した菌株（ＭＫ−２０
１株と称する）を培地に培養すると培養物中に新規な抗
生物質（抗生物質ＸＫ−２０１−■と称する）を生産す
る事実を見い出した。抗生物質Ｘに−２０１−■は後記
するごとくセフアロスポリン系抗生物質に属し、グラム
陽性菌、グラム陰性菌に対して抗菌スペクトルを有する
。したがつてＸに−２０１−■はこれらの菌を起災菌と
する感染症に対して治療効果を有するものと期待される
。Ｘに−２０１−■はまた有機化学的合成法により、他
の有用な半合成セフアロスポリン誘導体に導く原料とし
ても用い得るものである。次に本発明に係る抗生物質Ｘ
Ｋ−２０１−ＩＶの理化学的性質を示す。

１ 白色不定形粉末 ２ 水に易溶、メタノール、エタノールに難溶、その他
の有機溶媒にはほとんどとけない３ 融点 １４７℃で
分解 ４ 紫外部吸収スペクトル（水溶液中で測定）は第１図
に示すとおりであつて、２６５ｎｍに吸収極大を有する
。

５臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スベクトル
は第２図に示すとおりであつて、１２１０，１０２０，
６３５（：Ｕ−１に吸収を示す。

６〔α〕ヤ＝−１０゜（Ｃ＝０．１，Ｈ２０）７分子量
約４７０８元素分析値（アンモニウム塩） Ｃ：３５．９％，Ｈ：５．４％，Ｎ：１７．７（：Ｆ６
，Ｓ：２０．４％９ペーパークロマトグラフイ一のＲｆ
値を他の抗生物質もあわせ表１に示す。

４−パー：Ｗｈａｔｍａｎ滝１（Ｗ＆ＲＢａｌｓｔＯｎ
Ｌｔｄ）展開溶媒：ｎ−ＢｕＯＨ：酢酸：水＝２：１：
１（容量比）上昇法１８時間展開９Ｃ０ｍａｍ０ｎａｓ
１ｅｒｒｉｇｅｎａＫＹ４１７４株によるバイオオート
グラムで検出。

［相］ 薄層クロマトグラフイ一のＲｆ値を他の抗生物
質もあわせ表２に示す。薄層板：ＥａｓｔｍａｎＫＯｄ
ａｋＣＯ．製セルロース上昇法 ４時間展開，ＣＯｍａ
ｍＯｎａｓｔｅｒｒｉｇｅｎａＫＹ４ｌ７４株によるバ
イオオートグラムで検出＠ ニンヒドリン反応：陽団の
両団物質次に抗生物質ＸＫ−２０１−の各種細菌に対す
る抗菌活ｈを示すと表３のとおりである。

（寒天稀釈法によりＰＨ７．Ｏで測定した）以上の理化
学的囲質および生化学的注質から明らかなように抗生物
質ＸＫ−２０１−はセフアロスポリン系に属する抗生物
質であつて、これまで放線菌が生産すると報告されでい
るいずれのセフアロスポリン系抗生物質とも異なるもの
であることは明らかである。次に抗生物質ＸＫ−２０１
−の製法について説明する。

ＸＫ−２０１−はストレプトマイセス属に属するＸＫ−
２０１−生産菌を栄養培地に培養し、この培養物からＸ
Ｋ−２０１−を採取することによつて得ることができる
。本発明方法に使用する微生物はストレプトマイセス属
に属し、ＸＫ−２０１−生産能を有する微生物であれば
いずれの微生物も用いることができる。

好適な菌としては、前記ＭＫ−２０１株があげられる。
次にＭＫ−２０１株の菌学的囲質および同定について記
述する。

１．形態的特徴 本菌株は、オートミール寒天培地、スターチ無機塩寒天
培地上で比較的良好な生育を示し、その基生菌糸の色は
、無色ないし薄乳白色を示す。

一方、気中菌糸の着生は全般的に良好ではないが、白色
ないし薄クリーム色を呈する。気中菌糸を光学顕微鏡に
より観察すると、分枝法は単純分枝をなし、その先端に
多くの場合１０個以上の胞子を着生し、胞子柄の形態は
直鎖伏ないし屈曲伏である。胞子の形態は、楕円〜卵型
で大きさは（０．６〜０．８μ×０．８〜１．０μ）で
あり、電子顕微鏡観察による胞子の表面はスムーズであ
り、鞭毛を有さない。また胞子嚢の形成も認められない
。

．各種培地上での生育伏態 １．ツアペツク寒天培地 生育 ：普通 基生菌糸の色：無色〜薄乳白色（２ｃａ）気中菌糸の着
生：不良 気中菌糸の色：白色（ａ） 可溶匪色素：なし ２．グルコース・アスパラギン寒天培地 生育 ：やや不良 基生菌糸の色：無色 気中菌糸の着生：不良 気中菌糸の色：白色１ａ） 可溶注色素：なし ３，グリセロール・アスパラギン寒天培地生育 ：
やや不良 基生菌糸の色：無色 気中菌糸の着生二不能 気中菌糸の色：不明 可溶ｌ色素：なし ４．スターチ無機塩寒天培地 生育：良好 基生菌糸の色二無色 可溶跣色素：不明 以上は、３『Ｃ，２週間後の観察結果である。

また、色の表示は、ＣＯｌＯｒＨａｒｍＯｎｙＭａｎｕ
ａｌ（ＣＯｎｔａｉｎｅｒＣＯｒｐＯｒａｔｉＯｎＯｆ
Ａｍｅｒｉｃａ）による色の分類に従つたものである。
．生理的諸曲質 １，炭素源の資化注 Ｄ−グルコース，サツカロース，Ｄ−キシロース，Ｌ−
ラムノース，Ｄ−マンニトールおよびフラグドーズを資
化するが、ｉ−イノシトールおよびＤ−ラフイノースは
資化せず、Ｄ−アラビノースは非常に貧弱にしか資化し
ない。

２．ゼラチンの液化作用：殆ど認められない。

３．スターチの加水分解作用：あり ４．脱脂乳のペプトン化：あり ５．脱脂乳の凝固：あり ６．メラニン様色素の生成：あり ７．至適生育温度：２７成Ｃ〜３『Ｃ 以上は、３０℃，２週間後の観察結果である。

ただし、２のゼラチンの液化作用は２０あＣ，３週間後
、４．および５．の脱脂乳に対する作用については３０
℃，３週間後、７．の至適生育温度は５日後の結果であ
る。ＩＶ．同定 以上みたごとく本菌株ＭＫ−２０１は、寒天培地上で真
註気中菌糸を形成し、その分枝法は単純分枝をなすスト
レプトマイセス属に属する菌株である。

かくして本ＭＫ−２０１菌株をストレプトマイセス・Ｓ
Ｐ−ＭＫ−２０１と称することにした。ストレプトマイ
セス・ＳＰ−ＭＫ−２０１は、バージイズ・マニユアル
・オブ・デターミナイブ・バクテリオロジイ第８版７４
８頁〜の報告に従うと、各種寒天培地上での気中菌糸の
色から見て白色シリーズの菌株に属し、胞子柄の構造か
らＲｅｃｔｕｓｆｌｅｘｉｂｉｌｉｓ（ＲＦ）セクシヨ
ンに属する菌株である。

また本菌株は、その着生する胞子の表面がスムーズであ
り、メラニン様色素の生成が認められるクロモゲニツタ
イプの菌株である。公知の放線菌の中で白色シリーズ、
ＲＦセクシヨンに属し、スムーズな胞子表面を持ち、メ
ラニン様色素を生産する菌株は数種知られているが、何
れも炭素源の資化囲その他の特徴に明瞭な差異が認めら
れ、本ストレプトマイセス・ＳＰ−ＭＫ一）２０１菌株
と同様な菌株は見い出せない。

また本菌株はβ−ラクタム抗生物質を生産するが、類似
のβ−ラクタム抗生物質生産菌のうち本菌体と同じ白色
シリーズでＲＦ−セクシヨンに属すると考えられる菌株
は、ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓ゛．Ｃｌａｖｕｌｉｉｅ
ｒｕｓ（Ｃ−Ｅ．Ｈｉｇｇｅ；Ｎｓ＆Ｒ．Ｅ．Ｋａｓｔ
ｎｅｒインターナシヨナル ジヤーナル オブ システ
マテイツク バクテリオロジ一２１巻 ３２６頁、１９
７１年）およびＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓＳＰ．Ｐ６６
２ｌ（特開昭５１−１１００９７号公報）の２株がある
が、これらとは炭素源の資化曲における違いや各種培地
上での違いもさることながら分類上の大きなＫｅｙであ
るメラニン様色素の生成という点で大きく異なつてる。
即ち上記２株はノンクロモゲニツクタイプの菌株である
のに対し、本ストレプトマイセス・ＳＰ−ＭＫ−２０１
菌株は、クロモゲニツクタイプである。以上より、スト
レプトマイセス・ＳＰ−ＭＫ一２０１株は、公知の放線
菌で一致するものは見い出せず、新種と考えるのが妥当
と思われる。

なお、該菌株は、微工研菌寄第４４７８号として微工研
に寄託されている。本発明で使用するストレプトマイセ
ス属に属するＸＫ−２０１−生産菌の培養には通常の放
線菌の培養法が一般に用いられる。

培養のための培地としＣは本抗生物質生産菌が利用し得
る栄養源を含有する培地であれば天然培地、合成培地、
半合成培地のいずれでもよい。培地の組成は炭素源とし
てはブドウ糖、デキストリン、澱粉、シェークロース、
フラグドーズ、マンノース、糖蜜などが単独または組合
せて用いられる。さらに菌の資化曲によつては炭化水素
、アルコール類、糖アルコール類、有機酸などでも用い
得る。無機および有機窒素源としては塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ソ
ーダなどが、また天然窒素源としてはペプトン、肉工キ
ズ、酵母工キズ、乾燥酵母、コーンステイープリカ一、
大豆粉、綿実粕、カザミノ酸、ソリユプルベジタブルプ
ロテインなどが単独または組合せて用いられる。その他
必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシユーム、燐酸
塩などの無機塩類を加える他、本菌の生育や抗生物質Ｘ
Ｋ−２０１一の生産を捉進する有機物や無機物を適当に
添加することができる。培養法としては液体培養、特に
深部撹拌培養法が最も適している。

培養温度は２５〜４０℃、ＰＨは３〜１０の範囲内で培
養を行なうことが望ましい。液体培養で通常２〜７日培
養を行なうと抗生物質ＸＫ−２０１−が培養液中に生成
蓄積される。培養液中の蓄積量が最大に達したときに培
養を停止し、菌体を淵別して得られる培養液中より目的
物を単離精製する。培養淵液から本物質の単離精製には
微生物代謝生産物をその培養液から単離するために普通
用いられる分離精製の方法が利用される。

すなわち抗生物質ＸＫ−２０１−は水にく溶ける囲質を
もち主として培養液中に含有されるので、遠心分離また
は淵過により菌体を除去した後、淵液から目的物質の抽
出を行なう。すなわち適当な吸着剤に対する吸着親和囲
の差、適当な溶剤に対する溶解度の差、二種の液相間に
おける分配係数の差などを利用することにより精製標品
へと精製される。これらの方法は必要に応じて単独で用
いられ、あるいは組合せかつ反復して用い得る。次にそ
の一例を示す。すなわち、培養淵液を濃硫酸でＰＨ４．
Ｏに調整したあと活囲炭粉末を加え撹拌する。

抗生物質ＸＫ−２０１−は活囲炭に吸着するので８０％
（／Ｖ）アセトン水溶液中に懸濁して撹拌し活団物質を
抽出する。この抽出操作を数回繰り返し抽出画分を集め
て減圧下で濃縮する。この濃縮液をアニオン交換樹脂ダ
ウエツクス１×２（ＴｈｅＤＯｗＣｈｅｍｌｃａｌＣＯ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．）（Ｃｌ→に通すと活曲物質は樹脂に吸
着されるので、樹脂を水で洗滌したあと０．２モルの食
塩水で溶出する。この溶出画分には培養淵液中に副生し
ている抗生物質ＸＫ−２０１−以外の大部分の抗菌活ｌ
物質が溶出される。ついで同じカラムを１モルの食塩水
で溶出すると抗先物質ＸＫ−２０１−が溶出されてくる
。この活囲画分を集めＰＨ４，Ｏに調整したあと活囲炭
により脱塩を行なう。活囲炭からの溶出画分を濃縮し、
アンモニア水で中和したあとＤＥＡＥ−セフアデツクス
Ａ−２５（Ｐｈａｒｌ］］ＡＣｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉ
ｃａｌｓｌｎｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ）に通塔する。

ＤＥＡＥ−セフアデツクスＡ−２５はあらかじめ０．５
Ｍ一臭化アンモニウム一０．０５Ｍ一酢酸緩衝液に懸濁
しカラムに充填し、同一溶媒で溶出する。すると抗生物
質ＸＫ−２０１−は混在する他の抗菌活囲物質と分離し
て溶出されてくるので該当成分の含まれている画分を集
め濃縮する。濃縮液をあらかじめ５０％（ｖ／Ｖ）メタ
ノール水溶液で懸濁しカラムに充填したセフアデツクス
ＬＨ−２０（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎａＣｈｅｍｉｃ
ａｌｓｌｎｃ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に通し同一溶媒で溶出す
る。活団画分を集め減圧下で濃縮しついで水で懸濁じカ
ラムにつめたセフアデツクスＧ−１０（Ｐｈａｒｍａｃ
ｌａＦｉｍｅＣｈｅｍｉｃａｌｓｌｎｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
）に通し、水で溶出すると最終的に精製された抗生物質
ＸＫ−２０１−を含む画分を得ることができる。同画分
を集め濃縮後凍結乾燥により抗生物質ＸＫ−２０１−を
白色不定形粉末として得ることができる。上記単離精製
工程中の抗生物質ＸＫ−２０１−の動向はＷｈａｔｍａ
ｎ滝１沢紙によるペーパークロマトグラフイ一により追
跡する。展開溶媒としてはｎ−ブタノール：酢酸：水（
２：１：１、容量比）を用い室温で８時間展開したあと
ＣＯｍａｍＯｎａｓｔｅｒｒｇｅｎａＫＹ４ｌ７４株を
被検菌としてバイオオートグラフイ一を行なうとＲｆＯ
．ｌ８付近に抗生物質ＸＫ−２０１−の抗菌ゾーンが検
出される。以下本発明の実施例を示すが、これらは単な
る一例示であつて何等本発明を限定するものではない。

実施例 １ 種菌としてストレプトマイセス・ＳＰ−ＭＫ一２０１（
微工研菌寄第４４７８号）を用い、第一種培地としてグ
ルコース２ｋ９／Ｄｌ，可溶ｌ澱粉２９／Ｄｊ，酵母工
キズ０．２９／Ｄｌ，ポリペプトン１９／Ｄｌ，炭酸カ
ルシユーム０．１５ｆ！／ｄｌ（殺菌前ＰＨ７．２）の
培地を用いた。

種菌一白金耳を５０ｍ１容大型試験管に入れた上記種培
地１０ｍ１に植菌し、３０℃で３日間培養する。この種
培養液３ｍ１を２５０ｍ１容エルレンマイヤーフラスコ
に入つた３０ｍ１の第二種培地に移す。第二種培地の組
成は第一種培地の組成と同一である。

第二種培養は３０℃で２日間振盪培養する。この種培養
液３０ｍ１を２１容バツフル付エルレンマイヤーフラス
コに入つた３００ｍ１の第三種培地に移す。第三種培地
の組成は第一種培地と同一である。第三種培養は３０℃
で２日間振盪培養する。この第三種培養液９００ｍ１（
フラスコ３本分）を３０１容のステンレススチール製ジ
ヤーフアーメンタ一に入れた主醗酵培地１５２に移す。
主醗酵培地組成はソルブルベジタプルプロテイン２９／
Ｄｌ，乾燥酵母（エビオス）１９／Ｄｌ，ＫＨ２ＰＯ４
Ｏ．３９／Ｄｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４，ｌ２Ｈ２ＯＯ．２９
／Ｄｌ，グリセリン２ｆ！／Ｄｌ，ＭｙＣｌ２Ｏ．５９
／ｄｌ（殺菌前ＰＨ６．５）を用いる。この主醗酵培地
は３０℃で４日間通気撹拌方式（回転数３５０ｒ．ｐ．
ｍ．通気量１５２／Ｍｌｎ）により行なう。かくして得
られた醗酵液に済過助材としてラジオライト＃６００（
昭和化学工業（株））を約１１＜９加え菌体を済別する
。得られた戸液１３１に濃硫酸を加えてＰＨを４．０に
調整し、活注炭素（和光純薬工業（株））３００９を加
え３０分ほど撹拌する。その後活囲炭素を戸別し水でよ
く洗滌した後、８０％（Ｖ／Ｖ）アセトン水溶液２１の
中に懸濁しアンモニア水でＰＨを６．５に調節しながら
１５分ほど撹拌する。活曲炭素を戸別し、戸液を別にと
り再び活ｌ炭素を８０％（Ｖ／Ｖ）アセトン水溶液２２
に懸濁し活肚成分の抽出を行なう。この抽出操作を３回
繰り返すと活囲炭素に吸着されていた抗生物質ＸＫ−２
０１−はほとんどアセトン水中に溶離されてくる。得ら
れたアセトン抽出液を合し減圧下で約１１まで濃縮する
。アニオン交換樹脂ダウエツクス１Ｘ２（Ｃｌ一型）を
３００ＷＬｔ容のガラスカラムに充填し、これにアセト
ン抽出液の濃縮液を通したあと蒸留水約５００ｍ１で樹
脂を洗滌し、ついで０．２Ｍ一塩化ナトリウム水溶液約
１１で溶出を行なう。溶出画分には培養済液中に抗生物
質ＸＫ−２０１−とともに併産されている数種の副生物
が大部分溶出されてくる。ついで樹脂を１Ｍ一塩化ナト
リウム水溶液約１１で溶出すれば溶出液中に大部分の抗
生物質ＸＫ−２０１−ならびに僅かの副生物が溶出され
てくる。１Ｍ一塩化ナトリウム水溶液による溶出液の抗
菌活注を示す画分を合し減圧下で約５００ｍ１まで濃縮
し稀硫酸でＰＨ４，Ｏに調整する。

１００ｍ１容のガラスカラムに充填した活注炭素にこの
濃縮液を通し、３００ｍ１の水で洗滌した後、約３００
ｍ１の８０％（Ｖ／Ｖ）アセトン水溶液を流すと活囲物
質は溶出されてくる。

溶出液のうち抗菌活曲を示す画分を集めアンモニア水で
ＰＨ６．５に調整し後減圧下で約５０ｍ１まで濃縮する
。この濃縮液を、あらかじめ０．５Ｍ一臭１ヒアンモニ
ウム一０．０５Ｍ一酢酸の組成をもつ緩衝液に懸濁後ガ
ラスカラムに充填した［）ＥＡＥセフアデツクスＡ−２
５約゛３００ｄに通し同一緩衝液１１を流す。この工程
で抗生物質ＸＫ−２０１−は混在する他の副生物と分離
しペーパークロマトグラフイ一で一つの抗菌ゾーンを示
す単一成分として溶出されてくる。溶出液のうち抗菌活
囲を示す部分をペーパークロマトグラフイ一により検定
し抗生物質ＸＫ−２０１−成分のみを含む画分を合わせ
る。この画分を減圧下で濃縮し約２０ｍ１とした後、あ
らかじめ５０（Ｆ６（Ｖ／Ｖ）メタノール水溶液に懸濁
後カラムに充填したセフアデツクスＬＨ−２０２００ｍ
１に通す。このカラムを同じく５０（ｆｌ）（Ｖ／Ｖ）
メタノールで溶出すれば抗生物質ＸＫ−２０１−は塩と
分離して溶出されるので抗菌活踵を示す画分を集め減圧
下で濃縮した後、あらかじめ水に懸濁後ガラスカラムに
充填したセフアデツクスＧ−１０に通塔する。カラムを
水で溶出し抗菌活注を示す溶出液の画分を集めて減圧濃
縮後凍結乾燥することにより抗生物質ＸＫ−２０１−を
白色粉末として１５η得ることができる。このものの理
化学的注質は前記の通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質ＸＫ−２０１−の紫外部吸収スペクト
ルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有する抗生物質ＸＫ−２０１−
   IV［１］融点：１４７℃（分解） ［２］紫外部吸収スペクトル：第１図 ［３］赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤法）：
   第２図［４］分子量：約４７０ ［５］元素分析値（アンモニウム塩） Ｃ：３５．９％、Ｈ：５．４％、Ｎ：１７．７％Ｓ；２
   ０．４％［６］ニンヒドリン反応：陽性 ２ ストレプトマイセス属に属する抗生物質ＸＫ−２０
   １−IV生産菌を栄養培地に培養して、培養物中にＸＫ−
   ２０１−IVを蓄積せしめ、ついで該培養物からＸＫ−２
   ０１−IVを採取することを特徴とするＸＫ−２０１−I
   Vの製造法。