JPH04261180A - １３β−１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン−Ｂｌａ／Ｂｌｂアグリコンの微生物学的製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の製法により製造される化合物は、
米国特許４，５８７，２４７に開示された既知の化合物
である。その化合物は厳しい化学的エピマー化により製
造する事ができ、又、米国特許４，６６６，９３７に記
載されたごとく微生物学的に製造される。本製法は３種
の微生物のうちのいずれかひとつを用いて天然生成物１
３−α−化合物から直接的に１３−β化合物の新規製造
を提供するものである。尚、３つの微生物のうちの２つ
は新規のものである。

【０００２】本発明は、駆虫剤及び抗寄生虫剤として有
用であり、又、他の駆虫剤の製造の為の中間体としても
有用である、本化合物１３−β−２２，２３−ジヒドロ
アベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンの製造の為の
新規方法に関する。すなわち本発明の目的は、出発物質
１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン
Ｂ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンの生物的形質転換醗酵による
上記化合物の製造を開示する事にある。本発明の他の目
的は、醗酵ブロスから所望の生成物を単離する為に使用
される方法を開示する事にある。本発明の更に他の目的
は生物的形質転換反応を行いうる既知の微生物ストレプ
トマイセスラベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４
１５９に加えて２つの新規な微生物（ＭＡ−６７６２、
ＡＴＣＣ５５０６９）及び（ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０）を開示する事にある。本発明の更に他の目
的は以下の記載から明らかとなる。

【０００３】本発明の第一の局面は、以下の構造を有す
る化合物の製造方法にある：

【化１】 ここで、Ｒはエチル（ａ化合物）又はメチル（ｂ化合物
）である。化合物は１３−β−２２，２３−ジヒドロア
ベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンと呼ぶ。化合物
は１３−ヒドロキシ基をもたない類似化合物である１３
−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ１
ａ／Ｂ１ｂアグリコンから微生物学的形質転換反応によ
り製造される。加えて、生成物はアベルメクチン天然生
成物と比較して１３位での逆立体化学によりエピマー化
される。本製法は従って１３位での微生物学的酸化及び
エピマー化であることがいえる。

【０００４】微生物学的生物変換反応は、３つの微生物
のうちのいずれかひとつを用いて行われる。これらの微
生物のうち２つは新規であり、これらの微生物は、本発
明の第二の局面を形成する。第三の微生物は既知であり
、アメリカン　　タイプ　　カルチャー　　コレクショ
ン（ＡＴＣＣ）から公的に入手可能である。

【０００５】本発明によれば、微生物ストレプトマイセ
スグリセウス株を制御した条件下で増殖させ、１３−デ
オキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／
Ｂ１ｂアグリコン化合物である基質を醗酵ブロスに包含
させる事により上記化合物を製造する新規製法を開示す
るものである。これらの微生物は、メルクカルチャー　
　コレクション（Ｍｅｒｃｋ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ）　においてＭＡ−６７６２及びＭＡ−
６７６３として確認でき、これらは公にＡＴＣＣから入
手可能である。ＡＴＣＣにおける受託番号は、それぞれ
ＡＴＣＣ５５０６９及び５５０７０であり、ＡＴＣＣの
住所は、アメリカ合衆国、２０８５２メリーランド州、
ロックビル、パークラーンドライブ、１２３０１（１２
３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，ＭＤ２０８５２）である。

【０００６】ＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９及び
ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０の形態特性及び培
養特性については以下のごときである。以下は、ＭＡ−
６７６２及びＭＡ−６７６３株の一般的記載である。増
殖、一般的培養特性及び炭素源利用度についての観察は
、シャーリング及びゴットレイブ（インターナット．ジ
ェイ．システム．バクテリオル．（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ　
ａｎｄ　Ｇｏｔｔｌｅｉｄ　（Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．
Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．））１６：第３１
３−３４０頁）の方法に従って行った。細胞の化学的組
成については、レチェバリア及びレチェバリア（アクチ
ノマイセイト　　タクソノミー、エー．ディーツ及びデ
ィー．ダブリュー．セイヤー，イーゲィ．ソサイティ　
　フォー　　インダストリアル　　マイクロバイオロジ
ー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｃｈｅｖａ
ｌｉｅｒ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　Ｔａｘｏｎｏｍ
ｙ，　Ａ．　Ｄｉｅｔｚ　ａｎｄＤ．Ｗ．　Ｔｈａｙｅ
ｒ，　Ｅｄ．　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　）１９８０）
の方法を用いて決定した。培養物の着色については以下
のチャートにおける色見本との比較により決定した。（
インター−ソサィティ　　カラー　　カウンセル−ナシ
ョナル　　ブレゥオブ　　スタンダーズ　　セントロイ
ド　　カラー　　チャーツ（ユー．エス．デプト．オブ
　　コマース　　ナショナル　　ブレウ　　オブ　　ス
タンダーズ　　サプリメント　　トウ　　エヌビーエス
　　サーキュラー）（Ｉｎｔｅｒ−Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｃ
ｏｌｏｒ　Ｃｏｕｎｃｉｌ−Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｕｒ
ｅａｕ　ｏｆ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｃｅｎｔｒｏｉｄ
　Ｃｏｌｏｒ　Ｃｈａｒｔｓ（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．　ｏ
ｆ　Ｃｏｍｍｅｒｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｕｒｅａ
ｕ　ｏｆ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　ｔｏＮＢＳ　Ｃｉｒｃｕｌａｒ　５５３、１９８５）
）。

【０００７】寄託 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約に基づき１９９０年７月１１日においてＭＡ−
６７６２は、ＡＴＣＣ５５０６９として寄託され、ＭＡ
−６７６３はＡＴＣＣ５５０７０として寄託された。

【０００８】細胞壁組成物の分析 ＭＡ−６７６２ ペプチドグリカンはＬ−ジアミノピメリン酸を含み、完
全な細胞糖分析により、グルコース及び微量のキシロー
スを示す。 ＭＡ−６７６３ ペプチドグリカンはＬ−ジアミノピメリン酸を含み、完
全な細胞糖分析により、グルコースを示す。

【０００９】一般的増殖特性 ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７６３ いずれの株も、酵母麦芽エキス、グリセロールアスパラ
ギン、無機塩−でんぷん、オートミール、及びトリプチ
カーゼ　　ソイ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ）　寒
天上において充分に増殖する。増殖は２７℃及び３７℃
で生ずる。いずれの培養物も酵母デキストロースブロス
のごとき、液体培地中においても充分に増殖する。

【００１０】コロニーの形態（酵母麦芽エキス寒天Ｃ２
１ｄ上において） ＭＡ−６７６２ 基質菌糸体は、中程度のオリーブブラウン色（９５ｍ．
ＯｌＢｒ）　及びコロニーは不透明であり、起毛状であ
り繊維状であって、ゴムのごとき柔軟なものである。コ
ロニー表面は外見上つやがなく、ざらざらした形である
。気中菌糸は培養後４日後に出現し黄白色を有する（９
２ｙＷｈｉｔｅ）　。胞子集団はそれが存在する場合、
深い黄茶色である（７５ｄｅｅｐ　ｙＢｒ）　。 ＭＡ−６７６３ 基質菌糸体は、中程度の茶色がかった黒色（６５ｂｒＢ
ｌａｃｋ）であり、コロニーは不透明であり、起毛状で
あり繊維状であり、ゴム状である。コロニー表面は、ざ
らざらした形である。気中菌糸体は培養後４日後に出現
し黄白色である（９２ｙＷｈｉｔｅ）　。胞子集団は存
在する場合、黄白色である（９２ｙＷｈｉｔｅ）　。

【００１１】微小形態 ＭＡ−６７６２ 気中菌糸（０．７６μｍ　ｄｉａ．）は基質菌糸から発
生し、枝分れし屈曲している。分化培地においては、気
中菌糸は直鎖にて生ずる胞子の鎖にて終結する。 ＭＡ−６７６３ 気中菌糸（０．７６μｍ　ｄｉａ．）は基質菌糸から放
射状に発生し、直線状である。分化培地においては気中
菌糸は屈曲鎖で生ずる胞子の鎖にて終結する。

【００１２】種々の生理学的反応 ＭＡ−６７６２ トリプトン酵母エキスブロスにおける培養においては、
その中にメラニン色素を生ぜず、デンプンは加水分解さ
れ、Ｈ２　Ｓはペプトン−鉄寒天上に生成する。拡散性
黄色色素は１％セルビオース又はＤ−マンノースを補足
したプリドハム−ゴットリーブ（Ｐｒｉｄｈａｍ−Ｇｏ
ｔｔｌｉｅｂ）　基礎培地上に生じ、赤茶色拡散性色素
は１％Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ
−ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｌ
−ラムノースを補足したプリドハム−ゴットリーブ基礎
培地上に生じる。炭素源利用パターンは以下のごときで
ある。セロビオース、Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−ラク
トース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マ
ンニトール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キ
シロースを適量利用する。イノシトール、スクロースを
微量利用するＤ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−ラフィノース、Ｌ−キシロースを利用しない。 ＭＡ−６７６３ トリプトン酵母エキスブロス、酵母エキス寒天及びペプ
トン酵母エキス鉄寒天（２−７ｄ）における培養におい
ては、メラニン色素を生ずる。デンプンはわずかに加水
分解されＨ２　Ｓはペプトン−鉄寒天上に生成する。拡
散性紫色素は、１％セロビオース、Ｄ−フルクトース、
α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルト
ース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノ
ースを補足したプリドハム−ゴットリーブ基礎培地にお
いて生ずる。炭素源利用パターンは以下のごときである
。 セロビオース、Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−ラクトース
、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニト
ール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロー
スは適量の利用。Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース
、イノシトール、Ｄ−ラフィノース、スクロース、Ｌ−
キシロースは利用せず。ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７
６３についての炭水化物利用パターンは表１に要約し、
ＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７６３の培養特性は表２に
要約する。

【００１３】識別 これらの株の化学分類及び形態学的特性については、ス
トレプトマイセス属の公表されているメンバーと比較す
る。これらの株は互いに非常高い相同性を有し、ペプト
ン−鉄寒天上におけるメラニンの生成及び酵母麦芽エキ
ス、グルコースアスパラギン及び無機塩−デンプン寒天
上における拡散性紫色素の生成に関して主に異なる。ス
トレプトマイセス種に関する合法的に公表された記載に
よれば、これらの株の間には、非常高い相同性が認めら
れ、これらは共通して、ストレプトマイセスグリセウス
複合体として位置づけられる。従って、ＭＡ−６７６２
、及びＭＡ−６７６３は、いずれもストレプトマイセス
グリセウスの株として仮に認識される。

【００１４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　１２１日目でのＭＡ−６７６２及
び−ＭＡ−６７６３株の炭水化物利用パターン炭素源　
　　　　　　　　　　　　　ＭＡ−６７６２による利用
　　ＭＡ−６７６３による利用Ｄ−アラビノース　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０Ｌ−アラビノース　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０セロビオース　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｄ−フ
ルクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２イ
ノシトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　０α−Ｄ−ラクトース　　　　　　　　　　　　　
　　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２β−Ｄ−ラクトース　　　　　　　　　　　　
　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２Ｄ−マルトース　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２Ｄ−マンニトール　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２Ｄ−マンノース　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２Ｄ−ラフィノース　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０Ｌ−ラムノース　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２スクロース　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０Ｄ−
キシロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２Ｌ−キシロース　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０ａ−Ｄ−グルコース（コントロール）２　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　３
＝良好利用、２＝適度な利用、１＝わずかな利用、０＝
利用せず。

【００１５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　２　　　　　　　　　　２１日目
のＭＡ−６７６２及びＭＡ−６７６３の培養特性培地　
　　　　　生長度　　　　　　　　気中菌糸　　　　　
　　　可溶性色素　　　　　　　　基質菌糸　　　　　
　ＭＡ−６７６２　ＭＡ−６７６３　ＭＡ−６７６２　
ＭＡ−６７６３　ＭＡ−６７６２　ＭＡ−６７６３　Ｍ
Ａ−６７６２　ＭＡ−６７６３　酵母　　　　　　良　
　良　　　　　　黄白色　　　　黄白色　　　　否　　
紫色　　深茶黄色　　黒茶色エキス　　　　　　　　　
　　　　（９２，ｙＷｈｉｔｅ）（９２，ｙＷｈｉｔｅ
）　　　　　　　　　　（７５深ｙＢｒ）　（６５Ｂｒ
．Ｂｌ）麦芽　　　　　　　　　　　　　　担胞子体　
　　　担胞子体　　　　　　　　　　　　　　縁は暗茶
黄色　　エキス　　　　　　　　　　　　屈曲、群生　
　屈曲、群生　　　　　　　　　　　　（７８ｄ．ｙＢ
ｒ）　グルコ　　　　良　　良　　　　　　黄白色　　
　　黄白色　　　　否　　紫色　　淡オレン　　暗灰紫
色ース　　　　　　　　　　　　　　　（９２，ｙＷｈ
ｉｔｅ）（９２，ｙＷｈｉｔｅ）　　　　　　　　　　
　ジ黄色　　　（４７ｄ．ｇｙ．　アスパ　　　　　　
　　　　　　担胞子体　　　　担胞子体　　　　　　　
　　　　　　　（７３ｐ．ＯＹ）　　ｒＢｒ）ラギン　
　　　　　　　　　　　屈曲、群生　　屈曲、群生　　
無機塩　　　　良　　良　　　　　　黄白色　　　　黄
白色　　　　否　　紫色　　灰黄色　　　　暗オリーデ
ンプ　　　　　　　　　　　　　（９２，ｙＷｈｉｔｅ
）（９２，ｙＷｈｉｔｅ）　　　　　　　　　　　（９
０ｇ．Ｙ）　　　ブ茶色　　ン　　　　　　　　　　　
　　　　　コロニーの縁　　担胞子体　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　（９６ｄ．ＯｌＢｒ）　　　
　　　　　　　　　　　　　　　は灰−　緑黄色　　屈
曲、群生　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１０
５ｇｙ．ｇＹ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　担胞子体　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　屈曲、群生オート　　良　　　　良　　　　　　
黄白色　　　　黄白色　　　　否　　否　　　　灰黄色
　　　　灰黄色ミール　　　　　　　　　　　　（９２
，ｙＷｈｉｔｅ）　（９２，ｙＷｈｉｔｅ）　　　　　
　　　　　（９０ｇ．Ｙ）　　　（９０ｇ．Ｙ）　　　
　　　　　　　　　　　　　　　担胞子体　　　　担胞
子体　　　　　　　　　　　　　　　　　　屈曲、群生
　　屈曲、群生シグマ　　まば　　まば　　　　黄白色
　　非気中菌糸　　否　　否　　　　黄白色　　　　黄
白色水　　　　　　ら　　　　ら　（９２，ｙＷｈｉｔ
ｅ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（
９２ｙＷｈｉｔｅ）（９２ｙＷｈｉｔｅ）　　　　　　
　　　　　　　　　　　　担胞子体　　　　　　　　　
　　　　　　　　　屈曲、群生クザペ　　中良　　中良
　　　　黄白色　　　　白色　　　　　　否　　否　　
　　黄白色　　　　黄白色ック　　　　　　　　　　　
　　（９２，ｙＷｈｉｔｅ）　　（２６３Ｗｈｉｔｅ）
　　　　　　　　　　（９２ｙＷｈｉｔｅ）（９２ｙＷ
ｈｉｔｅ）（Ｃｚａｐｅｋ）　　　　　　　　　　担胞
子体　　　　担胞子体　　　　　　　　　　　　　　　
　　　屈曲、群生　　屈曲、群生ヘプト　　良　　　　
良　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　メラ
ニ　　メラニン鉄　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ン、陰　　ン、陽
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　性　　　　　　性　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｈ２Ｓ　、　　Ｈ２Ｓ　、　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　陽性　　　　陽性

【００１６】加え
て新規製法は、ストレプトマイセスラベンジュレとして
同定された既知の微生物株を制御した条件下で増殖させ
、上記基質を醗酵ブロス中に包含させることにより行わ
れる。この微生物は、ＭＡ−６５５５としてメルクカル
チャーコレクションにおいて確認でき、ＡＴＣＣ（アメ
リカ合衆国、２０８５２メリーランド州、ロックビル、
パークラーンドライブ、１２３０１、受託番号ＡＴＣＣ
１４１５９）から公に入手可能である。培養物ストレプ
トマイセスラベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４
１５９については、ジャーナル　　オブザ　　アメリカ
ン　　ケミカル　　ソサィティー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓ
ｏｃｉｅｔｙ）　第７５巻、第５７６４頁（１９５３年
）に記載されている。

【００１７】ストレプトマイセスラベンジュレＡＴＣＣ
１４１５９の公に入手可能な寄託に関しては、特許の全
存続期間について入手可能であることを保証する旨が、
補足されている。

【００１８】本化合物は、以下に記載される条件下で、
適切な水性栄養培地の好気的醗酵の際に、ＭＡ−６７６
２、ＡＴＣＣ５５０６９又はＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０の生成株と共に、又、ストレプトマイセスラ
ベンジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９と共に
生成される。多くの抗生物質の生成の為に使用される水
性培地は、酸化されたエピマー化大環状化合物の製法に
おいて使用することが適している。

【００１９】このような栄養培地は、微生物により同化
される炭素及び窒素源を含み、一般的に低レベルの無機
塩を含む。加えて醗酵培地は、微生物の増殖の為に必要
な微量の金属を含み、所望の化合物の生成物を含む。こ
れらは栄養源として使用でき、又もちろん必要な場合に
培地へ分離して加えることができ、炭素及び窒素源の複
合体の充分な濃度で通常存在する。

【００２０】一般的に、デキストロース、スクロース、
マルトース、ラクトース、デキストラン、セレロース（
ｃｅｒｅｌｏｓｅ）　、コーンミール、オート麦粉のご
とき糖のような炭水化物及びデンプンは栄養培地におけ
る同化可能な炭素源に適している。培地において利用さ
れる炭素源の適切な量は、ひとつには培地中の他の成分
に依存するが、通常培地中において炭水化物１及び１０
ｇ／リットルの間が適量であることがわかる。これらの
炭素源は独立に使用することもできるが、種々のそのよ
うな炭素源を同一の培地中に合せることもできる。

【００２１】酵母水解物、酵母自己分解物質、酵母細胞
、トマトペースト、コーンミール、オート麦粉、大豆ミ
ール、カゼイン水解物、酵母エキス、コーン浸漬リキュ
ール、ディスティラーズ　　ソリューブルズ（ｄｉｓｔ
ｉｌｌｅｒｓ　ｓｏｌｕｂｌｅｓ）、綿実ミール、肉エ
キス等の種々の炭素源は、本化合物の生成の際にＭＡ−
６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６５、ＡＴ
ＣＣ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭ
Ａ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９により容易に同化さ
れる。種々の窒素源は単独で又は組み合わせて、培地中
１〜５ｇ／リットルの範囲の量で使用することができる
。

【００２２】培養培地に包含させることができる栄養無
機塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモ
ニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸
塩などのイオンを生ぜしめることができる通常の塩であ
る。又、包含させることができる物としては、コバルト
、マンガン等の微量金属もあげられる。

【００２３】以下の記載及び実施例中の記載における培
地は、使用できる広い範囲の培地の例示にすぎず、限定
されるものではない。

【００２４】以下は、ＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０
６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０又はストレ
プトマイセスラベンジュレ、ＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ
１４１５９の株の増殖に適した培地の例である。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　培地の組成　　培地１ デキストロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２０ｇ．ペプトン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ．肉エキス　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５ｇ．一次酵母　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　３ｇ．ＮａＣｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
．ＣａＣＯ３　（ｐＨ調整後）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３ｇ．蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１０００ｍｌ．ｐＨ７．０ 　　培地２ トマトペースト　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２０ｇ．改質デンプン（ＣＰＣ）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２０ｇ．一次酵母　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ．ＣｏＣｌ２
　６Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００５ｇ．蒸
留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０００ｍｌ．ｐＨ７．２−７．４ 　　培地３（斜面培地） デキストロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０．０ｇ．バクトアスパラギン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．５ｇ．Ｋ２　ＨＰＯ４　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ．バクト寒天　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０ｇ．
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１０００ｍｌ．ｐＨ７．０ 　　培地４（シード培地） 可溶性デンプン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０．０ｇ．アルダミン（Ａｒｄａｍｉｎｅ）　ｐＨ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５．０ｇ．ＮＺアミンＥ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　５．０ｇ．ビーフエキス　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０ｇ．Ｍ
ｇＳＯ４　７Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．５ｇ．セレロース　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１．０ｇ．Ｎａ２　ＨＰＯ４　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．１９０ｇ．ＫＨ２　ＰＯ
４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１８２ｇ
．ＣａＣＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．５ｇ．蒸留水　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ．ｐＨ７．０
−７．２ 　　培地５ トマトペースト　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
０．０ｇ．オート麦粉　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０．０ｇ．セレロース　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１０．０ｇ．コーン浸漬リ
キュール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ．微量元
素混合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
ｍｌ．蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０００ｍｌ．ｐＨ６．８　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ．微量元素
混合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍ
ｌ．ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０００ｍｇ．ＭｎＳＯ４　・４Ｈ２　Ｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１０００ｍｇ．ＣｕＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２５．０ｇ．ＣａＣｌ２　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０ｍｇ．Ｈ
２　ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５６．０ｍｇ．（ＮＨ４　）２　ＭｏＯ４　・４Ｈ
２　Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０．０ｍｇ．ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２００．０ｍｇ．蒸留水　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ．
ｐＨ 　　培地６ ＣＰＣ工業用改質デンプン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０．０ｇ．
（ＣＰＣ社から入手） ディスティラーズソルューブルズ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．０ｇ．自己
分解酵母　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５．０ｇ．（イーストプロダクツ社から入手可能なアル
ダミンｐＨ．）ＣｏＣｌ２　・６Ｈ２　Ｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５０．０ｍｇ．蒸留水　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ．ｐＨ７
．３

【００２５】ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６７
６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ
５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−
６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９を用いる醗酵は、約２０
℃から約４０℃の温度範囲で行うことができる。最良の
結果を得る為には約２４℃から約３０℃の範囲の温度で
、これらの醗酵を行うことが最も都合がよい。約２７℃
〜２８℃の温度が最も好ましい。本化合物を生成する為
に適した栄養培地のｐＨは約５．０から８．５の範囲で
、変化させることができ、約６．０から７．５の範囲が
、好ましい。

【００２６】基質化合物を醗酵培地１ｍｌ当り０．０１
〜１．０ｍｇの量でストレプトマイセスグリセウスＭＡ
−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、Ａ
ＴＣＣ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレ
ＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の醗酵物へ加える
。ｍｌ当り０．０５〜０．５ｍｇを用いることが好まし
い。基質化合物は醗酵サイクルのいずれの時においても
加えうる。化合物は培養物が加えられ、醗酵が開始する
前に、培地成分へ加えられるか、又はそれらは醗酵の進
行過程において加えられうる。充分な時間培養を行うこ
とにより、生物的形質転換がなされる為には、サイクル
の５０％が完了する前、好ましくはサイクルの２５％が
完了する前に基質化合物を醗酵物へ加えることが望まし
い。

【００２７】少量での醗酵は、以下の手段により都合よ
く行なわれる。まず既知の無菌技術を用いてフラスコに
適量の栄養培地を加えストレプトマイセスグリセウスＭ
Ａ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、
ＡＴＣＣ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュ
レＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の増殖的細胞生
長物又は胞子をフラスコに接種し、次いで綿でフラスコ
をゆるく栓をし醗酵を約２〜１０日間、９５〜３００ｒ
ｐｍで回転シェーカー上で約２８℃の一定の室温におい
て進行させる。大量に行う場合は、攪拌機及び醗酵培地
に通気させる為の手段を有する適切なタンクにおいて醗
酵を行うことが好ましい。栄養培地をタンク中で構成し
、無菌処理の後ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６
７６２、ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣ
Ｃ５５０７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ
−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９の増殖的細胞生長物の
源を植えつける。醗酵は約２４℃〜３７℃の範囲の温度
で、栄養培地を攪拌及び／又は通気しながら１〜８日継
続して行なわれる。通気の程度は、培養槽の大きさ、通
気速度などの種々のファクターに依存する。一般的に大
規模な醗酵の場合には、約９５〜３００ｒｐｍで攪拌し
、通気は１分当り約５０〜５００リッター（ＬＰＭ）で
行なわれる。

【００２８】全醗酵ブロスからのエピマー化化合物の分
離及び該化合物の回収は、溶媒抽出及び種々のクロマト
グラフィー技術及び溶媒システムを用いるクロマトグラ
フィーによる分画化の適用により行なわれる。

【００２９】本化合物は、水に対しては、わずかな溶解
性しか示さないが、有機溶媒においては可溶である。こ
の特性は、醗酵ブロスから化合物を回収する為に都合よ
く利用される。従って、一つの回収法においては、全醗
酵ブロスは、おおよそ等量の有機溶媒と混合される。い
ずれの有機溶媒も使用しうるが、酢酸エチル、塩化メチ
レン、クロロホルムなどの水に不溶の溶媒を用いること
が好ましい。一般的に数回の抽出は最大の回収率を達成
するために望ましい。溶媒は本化合物と共に本化合物の
抗寄生虫活性を失わせる他の物質をも取り除く。溶媒が
水と混和しない物である場合には、層を分離し有機溶媒
は減圧下で蒸発させられる。残渣を好ましくはシリカゲ
ルを含むクロマトグラフィーカラムに置く。カラムは所
望の生成物、及びいくらかの不純物を残すが、多くの不
純物、特に非極性不純物は通過する。カラムを塩化メチ
レン又はクロロホルムのごとき適度な極性を有する有機
溶媒で洗浄し、さらに不純物を除去し次いで塩化メチレ
ン、又はクロロホルムと、好ましくはアセトン、メタノ
ール及びエタノール等の有機溶媒との混合物で洗浄する
。溶媒を蒸発させ、残渣を更に、クロマトグラフィー媒
介としてシリカゲル、酸化アルミニウム、イオン交換樹
脂、デキストランゲルなどを用い、溶離剤として種々の
溶媒及び溶媒の混合物を用いるカラムクロマトグラフィ
ー、薄層クロマトグラフィー、分析的薄層クロマトグラ
フィー、高圧液体クロマトグラフィーなどを用いてクロ
マトグラフィー分離する。薄層、高圧、液体及び分析的
層クロマトグラフィーは、本化合物の存在を検出する為
及び単離する為に使用しうる。上記技術に加え、当業者
に既知の他の技術を用いることにより、本化合物を含む
精製された組成物をうることができる。所望の化合物の
存在は、物理化学的特性の生物学的活性について、それ
ぞれのクロマトグラフィー分画を解析することにより決
定される。本化合物の構造は、化合物の種々のスペクト
ル特性、特に、核磁気共鳴、質量、紫外線、赤外線スペ
クトルを分析することによって詳細に決定される。

【００３０】本発明の酸化及びエピマー化化合物は、ヒ
ト及び動物において及び農業において駆虫薬、殺虫薬、
及びダニ駆除薬として充分な駆虫活性を有する。加えて
１３−酸化されたエピマー化化合物は、１３−β−置換
−１３−デオキシアベルメクチン化合物を製造する為の
出発物質として使用できる。アベルメクチン化合物の１
３位での置換方法は当業者に既知である。

【００３１】以下の実施例は、本発明を更に説明する為
のものであって、発明を限定するものではない。

【００３２】実施例１ 形質転換 選択培養のＬ−チューブを２５０ｍｌバッフル付エルレ
ンメイヤーフラスコ中の培地Ａ３０ｍｌに無菌的に移す
。シードフラスコをシードが発育するまで２７℃で回転
シェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養する。このシード
１ｍｌを１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベル
メクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコン０．０５ｍｇ／ｍｌ
を含む培地Ｂ１０ｍｌに植えつける。 培地Ａ デキストロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ／
リッターデキストリン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
．０ビーフエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．
０アルダミン（Ａｒｄａｍｉｎ）ｐＨ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ＮＺ
　　アミン　　タイプＥ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ＭｇＳＯ４　
・７Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．０５Ｋ２　ＨＰＯ４　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．３ｐＨ　　７．１
に調整 ＣａＣＯ３　添加　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５培
地Ｂ グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｇ
／リッターヒカーゼ（Ｈｙｃａｓｅ）　ＳＦ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．
０ビーフエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０
コーン浸漬リキュール　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０ｐＨ７．０
に調整 チューブを７日間回転シェーカー（２２０ｒｐｍ）上で
２７℃で培養し、全ブロスを等量の塩化メチレンで抽出
する。抽出物を乾燥させ、残渣を既知の量のメタノール
に溶解する。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）により、アッセイを行なう。

【００３３】実施例２ アッセイ ＨＰＬＣ分析を、６０℃において、メタノール：水（８
０：２０）を１分当り１ｍｌで溶出する分析的デュポン
　　ソルバックス（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｓｏｒｂａｘ）ＯＤ
Ｓ４．６ｍｍ×２５ｃｍカラム上で行なった。アベルメ
クチン生成物の存在を確認する為にカラムを２４３ｎｍ
の紫外線でモニターした。

【００３４】実施例３ 生成 培養物ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−６７６２、
ＡＴＣＣ５５０６９、ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０
７０又はストレプトマイセスラベンジュレＭＡ−６５５
５、ＡＴＣＣ１４１５９の凍結バイアル（２ｍｌ）を培
地Ａ５０ｍｌを含む２５０ｍｌバッフル付エルレンメイ
ヤーフラスコに接種した。シードフラスコを２４時間２
７℃で回転シェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養した。 発育したシード５ｍｌを形質転換培地Ｂ５０ｍｌを含む
２５０ｍｌエルレンメイヤーフラスコに植えつけた。メ
タノールに溶解した１３−デオキシ−２２，２３−ジヒ
ドロアベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコンを最終濃
度０．０５ｍｇ／ｍｌになるまで０時間で形質転換物へ
加えた。形質転換フラスコ（５）を５日間２７℃で培養
し、実施例４に記載されるごとく抽出した。

【００３５】実施例４ 分離及び精製 各媒養物のプールされた全ブロス（２５０ｍｌ）を遠心
し、清澄化されたブロスを塩化メチレンで３回（３×１
００ｍｌ）抽出した。細胞集団をアセトンで３回（３×
１００ｍｌ）抽出した。抽出物を合わせ真空下、乾燥さ
せ、油状残渣をメタノールに溶解し、ＨＰＬＣを行なっ
た。 ＨＰＬＣをワットマン　　パーティシル（Ｗｈａｔｍａ
ｎ　Ｐａｒｔｉｓｉｌ）　１０ＯＤＳ−３、９．４ｍｍ
×２５ｃｍ上において６０℃で行い、２４３ｎｍの紫外
線でモニターした。カラムはメタノール：水（８０：２
０）を１分当り３ｍｌで２０分間展開させた。化合物を
上記抽出物をくり返して注入する間に集めた。７．６分
でのフラクションをプールし、溶媒を蒸発乾固させた。

【００３６】実施例５ 特性 上記醗酵により得られた生成物を核磁気共鳴により、そ
して正確なサンプルとの比較により１３−β−２２，２
３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／Ｂ１ｂアグリコン
として特定した。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ストレプトマイセスグリセウスＭＡ−
   ６７６２、ＭＡ−６７６３、又はストレプトマイセスラ
   ベンジュレＭＡ−６５５５の培養物及び加えられた化合
   物１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチ
   ンＢ１ａ／Ｂ１ｂを炭素、窒素及び無機塩の同化可能な
   源と共に水性栄養培地中で醗酵させることよりなる１３
   −β−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢ１ａ／Ｂ
   １ｂアグリコンの製造方法。
2. 【請求項２】　　微生物が、ストレプトマイセスグリセ
   ウスＭＡ−６７６２である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　微生物が、ストレプトマイセスグリセ
   ウスＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６９である請求項
   ２記載の方法。
4. 【請求項４】　　微生物が、ストレプトマイセスグリセ
   ウスＭＡ−６７６３である請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】　　微生物が、ストレプトマイセスグリセ
   ウスＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７０である請求項
   ４記載の方法。
6. 【請求項６】　　微生物が、ストレプトマイセスラベン
   ジュレＭＡ−６５５５、ＡＴＣＣ１４１５９である請求
   項１記載の方法。
7. 【請求項７】　　当該加えられた化合物が醗酵培地１ｍ
   ｌ当り０．０１〜１．０ｍｇの範囲で添加される請求項
   １記載の方法。
8. 【請求項８】　　当該加えられた化合物が醗酵培地１ｍ
   ｌ当り０．０５〜０．５ｍｇの範囲で添加される請求項
   １記載の方法。
9. 【請求項９】　　炭素源が炭水化物の形で存在する請求
   項１記載の方法。
10. 【請求項１０】　　炭水化物源が醗酵培地１リッター当
    り１〜１０ｇの範囲で存在する請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】　　窒素源が醗酵培地１リッター当り５
    〜１０ｇの範囲で存在する請求項１記載の方法。
12. 【請求項１２】　　醗酵が２０℃〜４０℃で及びｐＨ５
    ．０〜０．５で行なわれる請求項１記載の方法。
13. 【請求項１３】　　醗酵が２４℃〜３０℃で及びｐＨ６
    ．０〜７．５で行なわれる請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】　　醗酵が２７℃〜２８℃で行なわれる
    請求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】　　当該加えられた化合物が、醗酵サイ
    クルの５０％が完了する前に醗酵ブロスへ添加される請
    求項１記載の方法。
16. 【請求項１６】　　当該加えられた化合物が、醗酵サイ
    クルの２５％が完了する前に醗酵ブロスへ加えられる請
    求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】　　培養物ストレプトマイセスグリセウ
    スＭＡ−６７６２。
18. 【請求項１８】　　ＭＡ−６７６２、ＡＴＣＣ５５０６
    ９である請求項１７記載の培養物。
19. 【請求項１９】　　培養物ストレプトマイセスグリセウ
    スＭＡ−６７６３。
20. 【請求項２０】　　ＭＡ−６７６３、ＡＴＣＣ５５０７
    ０である請求項１９記載の培養物。