JPH0547560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規抗生物質及びその製造法に関す
る。

〔発明の背景〕

本発明者は、新規抗生物質の探索を目的として
多数の土壌中から微生物を分離し、その産生する
抗生物質を分離探索し、ストレプトミセス属に属
する微生物の培養液及び培養菌体に文献未載の新
規抗生物質RK−1061A、RK−1061B及びRK−
1061Cが産生、蓄積されることの新たな知見を得
た（特開昭61−282088号公報参照）。本発明者は、
上記微生物の産生物につき更に研究を行つた結
果、上記RK−1061A、RK−1061B、RK−1061C
とは異なる新規抗生物質を見出し、本発明を完成
するに至つた。

〔本発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、新規抗生物質及びその製造法
を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の新規抗生物質は、ストレプトミセス属
に属する抗生物質RK−1061G及びRK−1061H生
産菌を培養し、その培養物から分離採取される、
以下の構造式と後述の理化学的性質及び生物学的
性質を有する抗生物質RK−1061GとRK−1061H
を包含する。

（発明の構成） ＜使用する微生物＞ まず、本発明において用いる微生物は、抗生物
質RK−1061G及びRK−1061Hの生産能を有する
ものであり、ストレプトミセス属に属する菌種で
ある。

その一例として、ストレプトミセス・エスピ
ー・RK−1061（Streptomyces Sp.RK−1061（以
下“RK−1061株”という）と呼称される微生物
は上記の特性を有し、本発明の抗生物質RK−
1061G及びRK−1061Hを有利に生産するもので
あり、本発明方法に有効に利用し得るものであ
る。

また、上記RK−1061株の自然的及び人工的変
異株は勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で
後述の抗生物質RK−1061G及びRK−1061Hの生
産能を有する微生物はすべて本発明方法において
使用することができる。

上記RK−1061株は、本発明者により山梨県御
坂町で採取された土壌中より発見された土壌放射
菌であり、工業技術院微生物工業技術研究所に昭
和60年５月29日付寄託され、その微生物受託番号
は、微工研菌寄第8278号（FERM Ｐ−8278）で
ある。

RK−1061株は、次の菌学的性質を有する。

形態 RK−1061株は山梨県御坂町で採取した土壌
より分離した放線菌で全細胞の塩酸加水分解物
のペーパークロマトグラフではＬ，Ｌ−ジアミ
ノピメリン酸だけを検出し、メソ−ジアミノピ
メリン酸は検出されない。各種寒天培地上での
生育試験では、試験した10種の全ての培地上に
発育するが、スターチ・イーストエキス寒天培
地上での発育は良好で気中菌糸と胞子の着生は
豊富だが、これ以外の寒天培地上での気中菌糸
と胞子の着生は良好でない。11種の糖を炭素源
とする利用試験に於ては、本菌は全ての糖を利
用し発育する。本菌の気中菌糸は灰色系であ
り、裏面は淡褐色系であつて特徴はない。脱脂
牛乳中での発育では始めに凝固を起すが後にペ
プトン化し茶色の透明液を与える。澱粉を加水
分解するが、ゼラチンを液化しない。ペプト
ン・イーストエキス・鉄寒天培地およびチロシ
ン寒天培地上でメラニン色素の生成が認められ
るが可溶性色素は淡褐色ないし灰色で特徴ある
色素の生成は認められない。電子顕微鏡の観察
によると気中菌糸は直状柔性であり、オートミ
ール・硝酸塩寒天培地およびポテトエキストラ
クト・イーストエキストラクト硝酸塩寒天培地
上では３〜５回のらせん状菌糸がみられ、前者
培地では密ならせん状であるが後者ではオープ
ンスパイラルである。一方イーストエキス、モ
ルトエキス寒天培地上に発育したものではらせ
ん菌糸は認め難い。本菌の胞子は菌糸先端より
多数連なつて形成されらせん菌糸部分は胞子化
する。胞子表面は平滑であるがしわ状である。
胞子の大きさは長さ0.5〜1.0マイクロメータ
ー、巾0.5〜0.7マイクロメーターである。スポ
ランギアおよび運動性胞子は観察されなかつ
た。

各種培地上における生育状態 （27℃３週間培養） 色調の記載はデイスクリテイブ・カラー・ネ
イムズ・デイクシヨナリー（Descriptive
color names dictionary）第４版の色名記号
による。

１ シユクロース・硝酸塩寒天培地 発育：普通 気菌糸：なし 裏面：2ba（パール） 可溶性色素：なし ２ グルコース・アスパラギン寒天培地 発育：普通 気菌糸：なし 裏面：2ba（パール） 可溶性色素：なし ３ グリセロール・アスパラギン寒天培地 発育：普通 気菌糸：なし 裏面：2ba（パール） 可溶性色素：なし ４ スターチ・無機塩寒天培地 発育：普通 気菌糸：なし 裏面：2ba（パール） 可溶性色素：なし ５ チロシン寒天培地 発育：普通 気菌糸：少量ｂ＋3ni＋4ni （オイスターホワイト＋コバートブラウン＋チエ
ストナツプブラウン） 裏面：3pn（ダークブラウン） 可溶性色素：3pl（デイープブラウン） ６ 栄養寒天培地 発育：不良 気菌糸：なし 裏面：3ng（イエローメイプル） 可溶性色素：3ng（イエローメイプル） ７ イーストエキス・モルトエキス寒天培地 発育：普通 気菌糸：豊富ｅ（グレー） 裏面：3pi（ゴールドブラウン） 可溶性色素：3pn（ダークブラウン） ８ オートミル寒天培地 発育：普通 気菌糸：普通5ge（ローズウツド） 裏面：4ge（ローズベイジユ） 可溶性色素：なし ９ ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地 発育：不良 気菌糸：なし 裏面：2ba（パール） 可溶性色素：5pn（ダークブラウン） 10 スターチ・イーストエキス寒天培地 発育：良好 気菌糸：豊富4ge＋4li（ローズベイジユ＋ビ
ーバー） 裏面：4ge（ローズベイジユ） 可溶性色素：1ih（オリーブグレー） 炭素源の資化性（プリドハム・ゴツトリーブ
寒天培地）（27℃培養） 発育状況 １ Ｌ−アラビノース ＋＋ ２ Ｄ−キシロース ＋＋＋ ３ Ｄ−グルコース ＋＋ ４ Ｄ−フルクトース ＋ ５ シユクロース ＋ ６ イノシトール ＋ ７ Ｌ−ラムノース ＋ ８ ラフイノース ＋ ９ Ｄ−マンニトール ＋ 10 ラクトース ＋＋＋ 11 メリビオース ＋＋ ＋：発育する ＋＋：良く発育する ＋＋＋：非常に良く発育する その他の生理的性質（27℃培養） １ ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地） 液化しない。

２ スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒
天培地） 加水分解する。

３ 脱脂牛乳の凝固とペプトン化 凝固しペプトン化する。

４ メラニン様色素の形成 チロシン寒天培地、ペプトン・イースト鉄
寒天培地上での色素の生成がある。

５ 生育温度 20〜35℃ 上記の諸性質を有するストレプトミセス属、す
なわち、灰色系でスパイラル菌糸を有し、メラノ
イド様色素を生成し、胞子平面が平滑であり、前
記記載の糖を利用する種をバージエイズ・マニユ
アル・オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロ
ジー・第８版（Bergey's Mannual of
Determinative Bacteriology、8th edition
（1974））により調べた。その結果、本菌は、スト
レプトミセス・グリゼオスポレウス
（Streptomyces griseosporeus）か、これに極め
て近縁の種と推定される。

（培養法及び精製法） 本発明の抗生物質RK−1061G及びRK−1061H
を得るに当つては、ストレプトミセス属に属する
上記抗生物質生産菌を、抗生物質を生産する通常
の方法で培養することができる。培養の形態は、
液体培養でも固体培養でもよく、工業的に有利に
培養するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又は
培養液を培地に接種し、通気撹拌培養を行えばよ
い。

培地の栄養源としては特に限定されることはな
く、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素
源その他を培地中に含有させることができる。炭
素源としては、澱粉、デキストリン、グリセリ
ン、グルコース、シユクロース、ガラクトース、
イノシトール、マンニトールなどが、また窒素源
としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、米ぬ
か、麸、尿素、コーンステイープリカー、アンモ
ニウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒
素化合物が用いられる。その他、無機塩類、たと
えば食塩、燐酸塩類、カリウム、カルシウム、亜
鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加し
てもよく、必要に応じて消泡剤として、動、植、
鉱物油等を添加してもよい。培養温度、培養時間
等の培養条件は使用菌の発育に適し、しかもRK
−1061G及びRK−1061Hの生産が最高となるよ
うな条件が選ばれる。たとえば、培地のPHは４〜
９、特に６〜７付近がよく、培養の適温は25〜35
℃程度がよい。しかし、これらの培養組成物、培
地の水素イオン濃度、培養温度、攪拌条件などの
培養条件は使用する菌株の種類や、外部の条件な
どに応じて好ましい結果が得られるように適宜調
節されるべきであることはいうまでもない。この
ようにして得られる培養物から、RK−1061G及
びRK−1061Hを得るには、代謝産物を採取する
のに通常用いられる手段を適宜に利用して採取し
得る。たとえば、RK−1061G及びRK−1061Hと
不純物との溶解度差を利用する手段、イオン結合
力の差を利用する手段、吸着親和力の差を利用す
る手段、分子量の差を利用する手段のいずれも、
それぞれ単独、又は、適宜組合わせて、あるいは
反復して使用される。具体的には、RK−1061G
及びRK−1061Hは、大部分が、その培養濾液に
存在するが、菌体中に存在する活性区分は、含水
アセトン抽出後アセトンを留去して得られる。こ
れを、前記培養濾液と合わせ、吸着クロマトグラ
フイー、シリカゲルクロマトグラフイー、液体ク
ロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイ
ー、ゲル濾過クロマトグラフイー等を組合せて精
製すると、RK−1061G及びRK−1061H及びその
他の活性成分を含んだ複合体（RK−1061複合
体）を得る。吸着クロマトグラフイーの担体とし
ては、ダイヤイオンHP−10が、液体クロマトグ
ラフイーの担体としては、MCI GEL CHP−
20Pが、イオン交換クロマトグラフイーの担体と
しては、ダウエツクス（Dowex）50WX4が、ま
たゲル濾過クロマトグラフイーの担体としては、
セフアデツクスLH−20等が好適である。

得られたRK−1061複合体を、高速液体クロマ
トグラフイーに付すと、多成分のピークに分れ
る。使用カラムは、逆相分配型のものが有利であ
る。

得られたピークのうち、RK−1061G及びRK−
1061Hに相当するピークを、それぞれ分取し、濃
縮、凍結乾燥することにより、純粋なRK−
1061G及びRK−1061Hを、それぞれ得る。

〔RK−1061G及びRK−1061Hの理化学的性質、
生物学的性質〕 (1) 形状：RK−1061G及びRK−1061Hのいずれ
も白色粉末である。

(2) 融点：RK−1061G及びRK−1061Hのいずれ
も190℃以上で分解する。

(3) 分子量：FAB・マススペクトルによる。

RK−1061G：MH⁺1036（分子式
C₄₄H₆₉N₅O₂₁S） RK−1061H：MH⁺1024（分子式
C₄₃H₆₉N₅O₂₁S） (4) 溶解性： RK−1061G： RK−1061H： 水、ジメチルスルホキシドに 易溶、メタノール、エタノー ルに可溶、アセトン、酢酸エ チル、クロロホルムに不溶で ある。

(5) 核磁気共鳴スペクトル： 400MHz、溶媒CD₃OD、標準TMS RK−1061：第１図のとおり。

RK−1061：第２図のとおり。

(6) Rf値（シリカゲル薄層クロマトグラフイ
ー）： 溶 媒 Rf値 RK−1061：ブタノール−メタノール水（４：
１：２） 0.36 クロロホルム−メタノール（１：３） 0.68 水飽和ブタノール 0.04 RK−1061H：同上 同上 (7) 呈色反応： RK−1061G及びRK−1061Hのいずれも過マン
ガン酸カリウム溶液を脱色し、アニスアルデヒ
ド−硫酸試薬、アントロン試薬、ニンヒドリン
試薬に陽性である。

(8) 塩基性、酸性、中性の区別： RK−1061G及びRK−1061Hのいずれも濾紙
電気泳動法による区別では、両性物質である。

(9) ペプチドグリカン合成酵素阻害活性： 大腸菌より調製したペプチドグリカン合成酵
素の粗酵素を用い基質であるUDP−〔Ｕ−¹⁴C〕
−Ｎ−アセチルグリコサミンのペプチドグリカ
ン画分への取りこみを測定したところ、ペプチ
ドグリカン合成酵素阻害活性が認められた。

以上、本発明の抗生物質RK−1061G及びRK−
1061Hの理化学的性質及び生物学的性質を、既知
の抗生物質と比較し、新規物質であると結論し
た。

本発明のRK−1061G及びRK−1061Hは、各種
細菌に対して類縁の既知物質RK−1061A、RK−
1061Bと同等な抗菌活性を有することが期待で
き、ペプチドグリカン合成酵素阻害活性を有する
ことから、抗菌剤としての利用が期待される。

以下に、本発明を実施例によつて説明する。

＜実施例＞ 30容積のジヤーフアーメンターに入れたグル
コース２％、可溶性澱粉１％、肉エキス0.1％、
酵母0.4％、大豆粉2.5％、食塩0.2％、第二燐酸カ
リ0.005％の組成よりなる培地18に、あらかじ
め同一培地に、前記RK−1061株（微工研菌寄第
8278号）を接種して48〜72時間28℃で振盪培養し
た培養液140mlを接種して28℃で65〜70時間、PH
が8.4を越えるまで通気攪拌培養を行う。このと
きの通気量は毎分18、攪拌回転数は350rpmで
ある。

培養終了後、培養液に濾過助剤セライトを加え
て遠心濾過し菌体と濾液とに分ける。菌体は80％
アセトン15を用いて抽出し、これを減圧濃縮し
てアセトンを溜去し2.5の水溶液を得る。濾液
75（ジヤーフアーメンター６基分）を、HClで
PH7.0に調整した後、先に得られた菌体抽出水溶
液と共にダイヤイオンHP−10 ７の樹脂塔に
通過し、吸着させる。20の水を用いて洗浄後、
30％含水メタノール20を用いて溶出を行なう
と、不純物が溶出される。次いで、50％含水アセ
トン40を用いて溶出を行うと、活性部分が溶出
される。これを減圧下に濃縮し、濃縮液６を得
る。これに３のｎ−ブタノールを加えてブタノ
ール抽出を行なう。この操作を３回繰り返し活性
成分を含むブタノール層10を得る。ブタノール
層を減圧濃縮し、凍結乾燥すると27.9ｇのRK−
1061複合体の粗粉末を得る。この粗粉末をクロロ
ホルム−メタノールの溶剤系を用いてシリカゲル
のカラム（6.0×65cm）によりクロマトグラフイ
ーを行なう。活性はクロロホルム−メタノール
（１：２）より（１：３）の溶出区分に現われる。
活性画分を減圧濃縮し、凍結乾燥すると16.0ｇの
粗粉末が得られる。

この粗粉末を少量の10％含水アセトンに溶解
し、予め同一溶液で調製したMCI−ゲルのカラ
ム（3.0×75cm）にチヤージして、10％含水アセ
トンで十分洗浄の後、50％含水アセトンにて活性
成分を溶出する。活性部分を集めて減圧濃縮し、
凍結乾燥すると2.5ｇの粗粉末が得られる。水に
不溶の不純物を除くために、水に溶解後室温で
2800rpm10分間の遠心を行なう。上清を減圧濃縮
し、凍結乾燥すると1.2ｇの粗粉末が得られる。

この粗粉末を少量の0.1Mピリジン−酢酸（PH
4.0）の緩衝液に溶解し、予め同一緩衝液で調製
した陽イオン交換樹脂Dowex50W×４（100〜
200mesh）カラム（3.0×80cm）を通過させる。
同一緩衝液にて素通りしてきた活性部分を減圧濃
縮し、凍結乾燥すると620mgの粗粉末が得られる。

さらに、これをセフアデツクスLH−20カラム
（2.2×72cm）にかけ、30％含水メタノールにて展
開し、活性部分を減圧濃縮し、凍結乾燥すること
によりRK−1061複合体粉末320mgを得る。

このRK−1061複合体の精製は、逆相カラム
（ヌクレオジル5C₁₈、φ8×250mm）を用いた高速
液体クロマトグラフイーを、アセトニトリル−
0.1％ジエチルアミン・炭酸（34：66）の溶媒系
で流速２ml／分にて行なうと公知のRK−1061A
及びRK−1061Bのピークを含む多成分のピーク
に分かれる（第３図参照）。この溶媒系で、保持
時間15分付近のピークを分取し、アセトニトリル
を除去後、混在する塩を除くために繰り返し凍結
乾燥することによりRK−1061Gの白色粉末２mg
が得られる。

同様の方法にて、保持時間16分付近のピークを
分取することにより、RK−1061H2mgが得られ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は、それぞれ、RK−1061、
RK−1061Hの核磁気共鳴スペクトルを示す図面
であり、第３図は、高速液体クロマトグラフイー
によるRK−1061G及びRK−1061Hのピークを示
すクロマトグラムである。第２図中、ＡはRK−
1061A、ＢはRK−1061B、ＧはRK−1061G、Ｈ
はRK−1061H由来のピークを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の式で表される抗生物質RK−1061G及
   びRK−1061H。 ２ ストレプトミセス（Streptomyces）属に属
   する抗生物質RK−1061G及びRK−1061H生産菌
   を培養し、その培養物から抗生物質RK−1061G
   及びRK−1061Hをそれぞれ分離採取することを
   特徴とする抗生物質RK−1061G及びRK−1061H
   の製造法。 ３ 抗生物質RK−1061G及びRK−1061H生産菌
   がストレプトミセス・エスピー・RK−1061
   （Streptomyces Sp.RK−1061）である請求項２
   記載の製造法。