JPH0411556B2

JPH0411556B2 -

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Publication number: JPH0411556B2
Application number: JP62088530A
Authority: JP
Priority date: 1987-04-10
Filing date: 1987-04-10
Publication date: 1992-02-28
Also published as: JPS63255292A

Description

【発明の詳細な説明】（発明の技術分野）本発明は、抗生物質RK−16及びその製造法に
関するものである。本発明のRK−16は、ストレ
プトミセス（Streptomyces）属に属する抗生物
質RK−16生産菌を培養して、その培養物中から
分離採取される文献未載の新規抗生物質である。

（発明の背景）抗生物質は、医療用のみならず農薬用としても
利用しうるものが現在までに数多く見出されてい
る。

本発明者らは、従来より上記の如き有用な抗生
物質の探索を目的として、多数の土壌中から微生
物を分離し、その産出する抗生物質について、精
製、同定及び用途の開発を行つてきた。

その結果、ストレプトミセス（Streptomyces）
属に属する微生物の培養物中に文献未載の新規抗
生物質が産出、蓄積されることの知見を得、その
単離、精製に成功した。

（発明の目的）本発明の目的は、新規な抗生物質および該抗生
物質を放射菌ストレプトミセス属に属する微生物
から分離・採取する方法を提供することにある。

（発明の構成）＜使用する微生物＞まず、本発明において用いる微生物は、抗生物
質RK−16の生産能を有するものであり、ストレ
プトミセス属に属する菌種である。

その一例として、ストレプトミセス・エスピ
ー・No.16（Streptomyces sp.No.16）（以下“No.16
株”という）と呼称される微生物は上記の特性を
有し、本発明の抗生物質RK−16を有利に生産す
るものであり、本発明方法に有効に利用し得るも
のである。

また、上記No.16株の自然的及び人工的変異株は
勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で後述す
る抗生物質RK−16の生産能を有する微生物はす
べて本発明方法において使用することができる。

上記No.16株は、本発明者により和歌山県伊都群
高野町で採取された土壌中より発見された土壌放
射菌であり、工業技術院微生物工業技術研究所に
昭和62年２月12日付受託され、その微生物受託番
号は、微工研菌寄第9196号（FERM Ｐ−9196）
である。

上記No.16株は、次の菌学的性質を有する。

１形態的特徴本菌株は和歌山県伊都群高野町に於て採集し
た土壌より分離されたもので、本菌株の菌体塩
酸加水分解物はＬ，Ｌ−ジアミノピメリン酸を
与える。本菌株は寒天培地上にて発育したもの
は、螺旋状の気菌糸を豊富にもち長い胞子鎖を
形成する。胞子は長円形のスピニーであり、メ
ラノイド色素を形成し、キサンチンと澱粉を利
用し、脱脂乳をペプトン化するが、硝酸を還元
せずゼラチン、セルローズを利用しない。以上
のことから本菌株はストレプトミセスに属す
る。本菌株を各種寒天培地上で27℃３週間培養
したものの生育状態は次の様である。（Ｇ：発
育、AM：気菌糸の着生と色調、Ｒ：裏面の色
調、SP：可溶性色素の生成、色調はデイスク
リテイブ・カラー・ネームズ・デイクシヨナリ
による。）２各種培地での生育状態 (1) スターチ・イースト寒天培地Ｇ：良好 AM：豊富、3lg＋ｇ＝ライト・ブラウン＋
グレイＲ：3nl＝ダーク・ブラウン SP：なし (2) イーストエキス・マルツエキス寒天培地Ｇ：良好 AM：豊富、ｃ＝ライト・グレイＲ：3pg＝ゴールデンブラウン SP：なし (3) オートミール寒天培地Ｇ：不良 AM：貧弱ｆ＝グレイＲ：ｃ＝ライト・グレイ SP：なし (4) スターチ無機塩寒天培地Ｇ：良好 AM：貧弱Ｒ：la＋ｂ＝ブライト・イエロー＋グレイ SP：なし (5) チロシン寒天培地Ｇ：良好 AM：貧弱Ｒ：ｐ＝ブラツク SP：メラノイド色素多量 (6) シユクロース・硝酸塩寒天培地Ｇ：不良 AM：貧弱ｃ＝ライト・グレイＲ：ａ＝ホワイト SP：なし (7) グルコース・アスパラギン寒天培地Ｇ：普通 AM：貧弱 ca＋ｃ＝クリーム＋ライト・グ
レイＲ：ca＋ｃ＝クリーム＋ライト・グレイ SP：なし (8) グリセロール・アスパラギン寒天培地Ｇ：良好 AM：普通 ca＋ｃ＝クリーム＋ライト・グ
レイＲ：ca＋ｃ＝クリーム＋ホワイト SP：なし (9) 栄養寒天培地Ｇ：不良 AM：貧弱Ｒ：lc＝ゴールド SP：なし (10) ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地Ｇ：不良 AM：貧弱Ｒ：pe＝アンテイーク・ゴールド SP：メラノイド色素多量３炭素源の利用利用Ｌ−アラビノース＋Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース − シユクロース＋イノシトール＋Ｌ−ラムノース＋ラフイノース＋Ｄ−マンニトール＋＋…生育する −…生育しない以上の性質を有する灰色系ストレプトミセス属
のものはS.durhamensis（ストレプトミセスデ
ユルハメンシス）が最も近縁のものである。
（Bergey′s Determinative Bacteriology8 th Ed
による。

（培養法及び精製法）本発明の抗生物質RK−16を得るに当つては、
ストレプトミセス属に属する上記抗生物質生産菌
を、抗生物質を生産する通常の方法で培養すれば
よい。培養の形態は、液体培養でも固体培養でも
よく、工業的に有利に培養するためには、前記生
産菌の胞子懸濁液又は培養液を培地に接種し、通
気撹拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはな
く、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素
源その他を培地中に含有させることができる。炭
素源としては、澱粉、デキストリン、グリセリ
ン、グルコース、シユクロース、ガラクトース、
イノシトール、マンニトールなどが、また窒素源
としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、米ぬ
か、麸、尿素、コーンステイープリカー、アンモ
ニア塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒素
化合物が用いられる。その他、無機塩類、たとえ
ば食塩、燐酸塩類、カリウム、カルシウム、亜
鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加し
てもよく、必要に応じて消泡剤として、動、植、
鉱物油等を添加してもよい。培養温度、培養時間
等の培養条件は使用菌の発育に適し、しかもRK
−16の生産が最高となるような条件が選ばれる。
たとえば、培地のPHは４〜９、特に7.3〜7.5付近
がよく、培養の適温は25〜35℃程度がよい。しか
し、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃
度、培地温度、撹拌条件などの培養条件は使用す
る菌株の種類や、外部の条件などに応じて好まし
い結果が得られるように適宜調節されるべきであ
ることはいうまでもない。このようにして得られ
る培養物から、RK−16を得るには、代謝産物を
採取するのに通常用いられる手段を適宜に利用し
て採取し得る。たとえば、RK−16と不純物との
溶解度差を利用する手段、イオン結合力の差を利
用する手段、吸着親和力の差を利用する手段、分
子量の差を利用する手段のいずれも、それぞれ単
独、又は適宜組合わせて、あるいは反復して使用
される。具体的には、RK−16は、培養瀘液にそ
の大部分が存在する。その遠心瀘液を陽イオン交
換クロマトグラフイー（例えば、ダウエツクス
（Dowex）50W、溶出液：0.5Nアンモニア水）に
付し、更に溶出液を中和後吸着クロマトグラフイ
ー（例えば、ダイヤイオンHP−20、溶出液：含
水メタノール）に付した後、溶出液を減圧濃縮、
凍結乾燥すると、RK−16の粗粉末を得る。得ら
れた粗粉末の水溶液を活性炭カラムを通過させ、
含水アセトンで溶出し、活性区分を集め濃縮、凍
結乾燥する。得られた粉末を、ブタノール−メタ
ノール−水混合溶液に溶かし、セルロース粉末の
カラムに乗せ、同じ溶媒で展開する。活性区分を
濃縮、凍結乾燥すると活性物質の粗粉末が得られ
る。このものを、更に次の方法によつて精製す
る。すなわち、上記粗粉末の水溶液をゲル濾過ク
ロマトグラフイー（例えば、セフアデツクス
（Sephadex）LH−20、溶出液：含水メタノー
ル）に付し、活性区分を集めて、減圧濃縮、凍結
乾燥及び再結晶化を行うと、RK−16の純品が得
られる。

かくして得られたRK−16の理化学的性質及び
生物学的性質は、次のとおりである。

〔RK−16の理化学的性質及び生物学的性質〕 (1) 形状：無色粉末 (2) 融点：230℃以上（分解） (3) 分子式：C₁₆H₂₄N₇O₈P・H₂O (4) 元素分析：炭素39.22％、水素4.90％、窒素
19.94％ (5) 比旋光度：〔α〕²⁰ _D−19.6°（H₂O） (6) 紫外部吸収スペクトル：λ_naxnm（Ｅ１％１cm）第１図のとおり酸性：0.1N−HCl 264nｍ（261）中性：H₂O 269nｍ（311）、255nｍ（sh）塩基性：0.1N−NaOH 280nｍ（355） (7) 赤外部吸収スペクトル：ν^KBr _nax 第２図のとおり 3400、1720、1660、1590、1400 1370、1340、1200、1110、1040cm^-1 (8) 核磁気共鳴スペクトル：（ ³¹P NMR）δ_P
10.5ppm (9) 分子量：（FAB−MS）MH⁺m／z474.1493 (10) 溶解性：水の可溶、メタノールに難溶、酢酸
エチル、クロロホルム、ベンゼン、エーテル、
ヘキサン、アセトンに不溶。

(11) 呈色反応：ニンヒドリン（Ninhydrin）反
応……陽性レミユー（Lemieux）試薬……陽性 (12) Rf値：シリカゲル薄層クロマトグラフイー
（Merck F₂₅₄）溶媒系 Rf値ブタノール−メタノール−水（４：１：２）
0.27 ブタノール−酢酸−水（４：１：２） 0.48 プロパノール−1N・NH₄OH（７：３） 0.22 (13) 塩基性、酸性、中性の区別：両性物質（pKa：4.4、8.9） (14) 抗菌スペクトル：寒天平板希釈法による検
定を行い、胞子形成阻害の最低濃度を求めた供試菌胞子形成阻害最低濃度（μｇ／ml） Γ ボトリチス・シネリア（Botrytis
cinerea） 0.25 Γ アスパジラス・ニガー（Aspergillus
niger） 1.0 (15) 構造式（他物質との比較）本物質は特徴的な抗菌スペクトルを示し、植物
病原性糸状菌のうちボトリチスシネレア
（Botrytis cinerea）に対し、特徴的に活性が認
められる。これまでに、B.シネレア（B.cinerea）
に選択的に抗菌作用を有する抗生物質として、プ
ルマイシン（prumycin）、エゾマイシン
（ezomycin）が見出されているが、本物質と比較
すると、薄層クロマトグラフイーでRf値は著し
く異なり、また紫外部吸収極大にも大きな相違が
認められ、明らかに異なる物質である。その紫外
部吸収スペクトルを既知抗生物質と比較したが、
一致するものはなく、本物質を新規抗生物質であ
ると結論し、フオスミドシン（Phosmidosine）
と命名した。

（有用性） RK−16は、上記の如く植物病原性の糸状菌に
対し、生育阻害作用を示すことから農業用抗生物
質としての利用が期待される。

実施例放線菌No.RK−16株を、グルコース２％、可溶
性デンプン１％、肉エキス0.1％、酵母0.4％、大
豆粉2.5％、食塩0.2％、第二燐酸カリウム0.005％
の組成の液体培地、18を含む30容ジヤー・フ
アーメンター中に接種し、27℃、72時間、
350rpm、通気量18／minで通気撹拌培養を行
つた。培養液の最終PH値は7.3〜7.5であつた。ジ
ヤーフアーメンター４基分の培養液に濾過助剤セ
ライトを加えて遠心濾過し菌体と瀘液とに分け
た。瀘液（40）を陽イオン交換樹脂
Dowex50W×８（10）のカラムに通過させ、カ
ラムを水40で洗條した後、0.5Nアンモニア水
を用いて活性物質を溶出した。溶出液（40）を
3N・塩酸によつて中和し、溶液をダイヤイオン
HP−20（10）のカラムに通過させ、カラムを
水10で洗滌した。次いで：活性成分を60％含水
メタノール20を用いて溶出した。溶出液を減圧
濃縮し少量（300ml）にして凍結乾燥することに
よつて、8.3ｇの粗粉末を得た。この粉末を200ml
の水に溶解して活性炭のカラム（250ml）を通過
させた。カラムを水１で洗滌後、70％含水メタ
ノール１で更に洗滌した。次いで、50％含水ア
セトンを用いて溶出し、溶出液は50mlづつ分別し
た。寒天プレート法によつて、ボトリチスシネ
リア（Botrytis cinerea）に阻害活性を示す画分
を集めて濃縮し、得られる水溶液50mlを凍結乾燥
すると、粉末1.06ｇが得られた。この粉末500mg
を５mlの溶媒系、ブタノール：メタノール：水＝
４：１：２に溶かし、同じ溶媒系でつめたセルロ
ース粉末のカラム（33mmφ×100cm）に乗せた。
同じ溶媒系で試料を展開し、フラクシヨン、コレ
クターによつて20mlづつ分画した。およそ200番
から300番の間の試験管に活性物質が溶出された。
有効部分を集めて濃縮し、約15mlの水溶液にし
た。これを凍結乾燥すると55mgの活性物質の粗粉
末が得られた。この粉末を２mlの水に溶解し、セ
フアデツクスLH20のカラム（26mmφ×70cm）に
乗せた。カラムを30％含水メタノールで展開し、
フラクシヨンコレクターによつて10mlづつ分画し
た。ボトリチチスシネリア（Botrytis cinerea）
に対し阻害活性を示す15番目から35番目の試験管
のうち強い活性画分を集めて減圧濃縮し、10mlの
水溶液を得た。これを凍結乾燥し、得られる粉末
（40mg）を水−エタノールによつて再結晶し、濾
過乾燥することによつて、30mgのRK−16物質が
純品とし得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、RK−16の紫外線吸収スペクトルを
示す図であり、第２図は、RK−16の赤外線吸収
スペクトルを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の構造式で表される抗生物質RK−16。２ストレプトミセス層（Streptomyces）属に
属する抗生物質RK−16生産菌を培養し、その培
養物から抗生物質RK−16を分離採取することを
特徴とする抗生物質RK−16の製造法。３抗生物質RK−16生産菌が、ストレプトミセ
ス・エスピー・No.16（Streptomyces sp.No.16）で
ある特許請求の範囲第２項記載の製造法。