JPS63255292A - 抗生物質ｒｋ−１６及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は、抗生物質ＲＫ−１６及びその製造法に関する
ものである。本発明のＲＫ−１６は、ストレプトミセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する抗生物質ＲＫ
−１６生産菌を培養して、その培養物中から分離採取さ
れる文献未載の新規抗生物質である。

（発明の背景） 抗生物質は、医療用のみならず農薬用としても利用しう
るちのが現在までに数多く見出されている。

本発明者らは、従来より上記の如き有用な抗生物質の探
索を目的として、多数の土壌中から微生物を分離し、そ
の産出する抗生物質について、精製、同定及び用途の開
発を行ってきた。

その結果、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属する微生物の培養物中に文献未載の新規抗生
物質が産出、蓄積されることの知見を得、その単離、精
製に成功した。

（発明の目的） 本発明の目的は、新規な抗生物質および該抗生物質を放
射菌ストレプトミセス属に属する微生物から分離・採取
する方法を提供することにある。

（発明の構成） く使用する微生物〉 まず、本発明において用いる微生物は、抗生物質ＲＫ−
１°６の生産能を有するものであり、ストレプトミセス
属に属する菌種である。

その−例として、ストレプトミセス・エスピー・Ｎａ　
１６　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　Ｎ（１０
）６　）　　（以下“Ｎ（１０）６株”という）と呼称
される微生物は上記の特性を有し、本発明の抗生物質Ｒ
Ｋ−１６を有利に生産するものであり、本発明方法に有
効に利用し得るものである。

また、上記に１６株の自然的及び人工的変異株は勿論、
ストレプトミセス属に属する菌種で後述の抗生物質ＲＫ
−１６の生産能を有する微生物はすべて本発明方法にお
いて使用することができる。

上記Ｎ（１０）６株は、本発明者により和歌山県伊都郡
高野町で採取された土壌中より発見された土壌放射菌で
あり、工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６２年２
月１２日付受託され、その微生物受託番号は、微工研菌
寄第９１９６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１９６）である。

上記Ｎ（１０）６株は、次の菌学的性質を有する。

１、形態的特徴 本菌株は和歌山県伊都郡高野町に於て採集した土壌より
分離されたもので、本菌株の菌体塩酸加水分解物はり、
　　Ｌ−ジアミノピメリン酸を与える。

本菌株を寒天培地上にて発育したものは、螺旋状の気菌
糸を豊富にもち長い胞子鎖を形成する。胞子は長円形の
スビニーであり、メラノイド色素を形成し、キサンチン
と澱粉を利用し、脱脂乳をペプトン化するが、硝酸を還
元せずゼラチン、セルローズを利用しない。以上のこと
から本菌株はストレプトミセスに属する。本菌株を各種
寒天培地上で２７℃３週間培養したものの生育状態は次
の様である。（Ｇ：発育、ＡＭ：気菌糸の着生と色調、
Ｒ：裏面の色調、ＳＰ：可溶性色素の生成、色調はディ
スクリティプ・カラー・ネームズ・ディクショナリによ
る。） ２、各種培地での生育状態 １）スターチ・イースト寒天培地 Ｇ　：良好 ＡＭ　　：　豊富、　３　　ｆｇ　　＋ｇ＝ライト・ブ
ラウン＋グレイＲ：３ｎｌ＝ダーク・ブラウン ＳＰ：なし ２）イーストエキス拳マルツェキス寒天培地Ｇ　：良好 ＡＭ＝豊富、Ｃ＝ニライトグレイ Ｒ：３ｐｇ＝ゴールデンブラウン ＳＰ：なし ３）オートミール寒天培地 Ｇ　：不良 へＭ：貧弱　ｆ＝ニブレ イ：ｃ＝ニライトグレイ ＳＰ：なし ４）スターチ無機塩寒天培地 Ｇ　：良好 へＭ：貧弱 Ｒ：ｊ７ａ＋ｂ＝ブライト・イエロー＋グレイＳＰ：な
し ５）チロシン寒天培地 Ｇ　：良好 へＭ二貧弱 Ｒ：ｐ＝ニブラッ クＰ：メラノイド色素多量 ６）シュクロース・硝酸塩寒天培地 Ｇ　：不良 ＡＭ：貧弱　Ｃ＝ニライトグレイ Ｒ：ａ＝ホワイト ＳＰ：なし ７）グルコース・アスパラギン寒天培地Ｇ　：普通 ＡＭ：　　貧Ｗｊｔ　　　ｃａ＋ｃ＝クリーム＋ライト
・プレイＲ：ｃａ＋ｃ＝クリーム＋ライト・グレイＳＰ
：なし ８）クリセロール・アスパラギン寒天培地Ｇ　：良好 ＡＭ：　　普通　　ｃａ＋ｃ＝クリーム＋ライト・グレ
イＲ：ｃａ＋ｃ＝クリーム＋ホワイト ＳＰ：なし ９）栄養寒天培地 Ｇ　：不良 へＭ：貧弱 Ｒ：ｆｃ＝ゴールド ＳＰ：なし １０）ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地Ｇ　：不
良 へＭ二貧弱 Ｒ：ｐｅ＝アンティーク・ゴールド ＳＰ：メラノイド色素多量 ３、炭素源の利用 利用 Ｌ−アラビノース　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　＋ Ｄ−グルコース　　　　　＋ Ｄ−フラクトース　　　　− シュクロース　　　　　　＋ イノシトール　　　　　＋。

Ｌ−ラムノース　　　　　＋ ラフィノース　　　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　＋ ＋・　生育する　　−・・・・生育しない以上の性質を
有する灰色系ストレプトミセス属のものはＳ、　ｄｕｒ
ｈａｍｅｎｓｉｓ　（ストレプ゛トミセステニルハメン
シス）が最も近縁のものである。（Ｂｅｒｇｅｙ′ＳＤ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
　３　ｔｈεｄによる。）（培養法及び精製法） 本発明の抗生物質ＲＫ−１６を得るに当っては、ストレ
プトミセス属に属する上記抗生物質生産菌を、抗生物質
を生産する通常の方法で培養すればよい。培養の形態は
、液体培養でも固体培養でもよく、工業的に有利に培養
するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又は培養液を培
地に接種し、通気撹拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。炭素源としては、澱粉、
デキストリン、グリセリン、グルコース、シュクロース
、カラクトース、イノシトール、マンニトールなどが、
また窒素源としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、米
ぬか、麩、尿素、コーンステイープリカー、アンモニウ
ム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒素化合物が
用いられる。その他、無機塩類、たとえば食塩、燐酸塩
類、カリウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金
属塩類等を適宜に添加してもよく、必要に応じて消泡剤
として、動、植、鉱物油等を添加してもよい。培養温度
、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、しかも
ＲＫ−１６の生産が最高となるような条件が選ばれる。

たとえば、培地のｐＨは４〜９、特に７．３〜７．５付
近がよく、培養の適温は２５〜３５℃程度がよい。しか
し、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、培養
温度、撹拌条件などの培養条件は使用する菌株の種類や
、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるよう
に適宜調節されるべきであることはいうまでもない。こ
のようにして得られる培養物から、ＲＫ−１６を得るに
は、代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜
に利用して採取し得る。たとえば、ＲＫ−１６と不純物
との溶解度差を利用する手段、イオン結合力の差を利用
する手段、吸着親和力の差を利用する手段、分子量の差
を利用する手段のいずれも、それぞれ単独、又は、適宜
組合わせて、あるいは反復して使用される。具体的には
、ＲＫ−１６は、培養濾液にその大部分が存在する。そ
の遠心濾液を陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば
、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）　５０　Ｗ、溶出液：　
０．５　Ｎアンモニア水）に付し、更に溶出液を中和後
吸着クロマトグラフィー（例えば、ダイヤイオンＨＰ−
２０、溶出液二含水メタノール）に付した後、溶出液を
減圧濃縮、凍結乾燥すると、ＲＫ−１６の粗粉末を得る
。

得られた粗粉末の水溶液を活性炭カラムを通過させ、含
水アセトンで溶出し、活性区分を集めａ縮、凍結乾燥す
る。得られた粉末を、ブタノール−メタノール−水混合
溶液に溶かし、セルロース粉末のカラムに乗せ、同じ溶
媒で展開する。活性区分を濃縮、凍結乾燥すると活性物
質の粗粉末が得られる。このものを、更に次の方法によ
って精製する。すなわち、上記粗粉末の水溶液をゲル濾
過クロマトグラフィー（例えば、セファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）　Ｌ　Ｈ−２０、溶出液二含水メタノー
ル）に付し、活性区分を集めて、減圧濃縮、凍結乾燥及
び再結晶化を行うと、ＲＫ−１６の純品が得られる。

かくして得られたＲＫ−１６の理化学的性質及び生物学
的性質は、次のとおりである。

ＣＲＫ−１６の理化学的性質及び生物学的性質〕（１）
形　　状：無色粉末 （２）融　　点：２３０℃以上（分解）（３）元素分析
：炭素３９．２２％、水素４．９０％、窒素１９．９４
％ （４）比旋光度：　〔α〕０　−１９．６°　（８，０
）（５）紫外部吸収スペクトル：λＩＩＩＸ　ｎｍ　（
Ｅ＋ｃ＋ａ　）第１図のとおり 酸性：　０．　Ｉ　Ｎ−ＨＣｌ２６４　ｎｍ　（２６１
）中性：）＋２０　　　　２６９　ｎｍ（３１１）、２
５５ｎｍ（ｓｈ）塩基性：　０．　Ｉ　Ｎ　−ＮａＯｔ
ｌ　　２８０　ｎｍ　（３５５）第２図のとおり ３４００、１７２０．１６６０．１５９０．１４００゜
１３７０、１３４０．１２００．１１１０．１０４１０
４Ｏ’（７）分子量：　　（Ｓｌ−ＭＳ）　ＭＨ′″ｍ
／ｚ　４８６（８）溶解性：水に可溶、メタノールに難
溶、酢酸エチル、クロロホルム、 ベンゼン、エーテル、ヘキサン、 アセトンに不溶。

（９）呈色反応：ニンヒドリン（Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）
反応−・・・・・・−陽性 レミｘ−（Ｌｅｍｉｅｕｘ）試薬・・・・・　陽性ｆｌ
ＧＲｆ値ニジリカゲル薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒ
ｃｋ　Ｆ２５４） 溶媒系　　　Ｒｆ値 ブタノ−Ｊトメタノールー水（４：に２）　　　　　　
０．２７ブタノール　−酢酸−水（４：Ｃ２）　　　　
０．４　８プロパノ−ルーＩＮ−ＮＨ，ＤＨ（７：３）
　　　　　０．２　２αυ塩基性、酸性、中性の区別二
両性物質（Ｐｋａ：　４．４．８．９） 面抗菌スペクトル：寒天平板希釈法による検定を行い、
胞子形成阻害 の最低濃度を求めた （他物質との比較） 本物質は特徴的な抗菌スペクトルを示し、植物病原性糸
状菌のうちボトリチス　シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　
ｃｉｎｅｒｅａ）に対し、特徴的に活性が認められる。

これまでに、Ｂ、シネレア（Ｂ、　ｃｉｎｅｒｅａ）に
選択的に抗菌作用を有する抗生物質として、プルマイシ
ン（ｐｒｕｍｙｃｉｎ）、ニジマイシン（ｅｚｏｍｙｃ
ｉｎ）が見出されているが、本物質と比較すると、薄層
クロマトグラフィーでＲｆ値は著しく異なり、また紫外
部吸収極大にも大きな相違が認められ、明らかに異なる
物質である。その紫外部吸収スペクトルを既知抗生物質
と比較したが、一致するものはなく、本物質を新規抗生
物質であると結論した。

（有用性） ＲＫ−１６は、上記の如く植物病原性の糸状菌に対し、
生育阻害作用を示すことから農業用抗生物質としての利
用が期待される。

実施例 放線菌ＮαＲＫ−１６株を、グルコース２％、可溶性デ
ンプン１％、肉エキス０．１％、酵母０．４％、大豆粉
２．５％、食塩０．２％、第二燐酸カリウム０．００５
％の組成の液体培地、１８ｆを含む３０１容ジヤー・フ
ァーメンタ−中に接種し、２７℃、７２時間、３５Ｑｒ
ｐｍ、通気量１８１　／ｍｉｎで通気撹拌培養を行った
。培養液の最＃ｐＨ値は７．３〜７．５であった。ジャ
ーファーメンタ−４基分の培養液に濾過助剤セライトを
加えて遠心濾過し菌体と濾液とに分けた。濾液（４０ｆ
）を腸イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗｘ　８　　（
１０Ｉ２）のカラムに通過させ、カラムを水４０１で洗
滌した後、０．５Ｎアンモニア水を用いて活性物質を溶
出した。溶出液（４０１’）を３Ｎ・塩酸によって中和
し、溶液をダイヤイオンＨＰ−２０（１０ｆ）のカラム
に通過させ、カラムを水１０１で洗滌した。次いで：活
性成分を６０％含水メタノール２Ｏｆを用いて溶出した
。溶出液を減圧濃縮し少量（３００ｍｊりにして凍結乾
燥することによって、８．３ｇの粗粉末を得た。この粉
末を２００ｍ１’の水に溶解して活性炭のカラム（２５
０−）を通過させた。カラムを水１１で洗滌後、７０％
含水メタノール１１で更に洗滌した。次いで、５０％含
水アセトンを用いて溶出し、溶出液は５ＯｒｒＬｌづつ
分別した。寒天プレート法によって、ボトリチス　シネ
リア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）に阻害活性
を示す両分を集めて濃縮し、得られる水溶液５０−を凍
結乾燥すると、粉末１．０６　ｇが得られた。この粉末
５００ｍｇを５ｍｌの溶媒系、ブタノール：メタノール
：水＝４：１：２に溶かし、同じ溶媒系でつめたセルロ
ース粉末のカラム（３３ｍｍφＸ１００ｃｍ）に乗せた
。同じ溶媒系で試料を展開し、フラクション、コレクタ
ーによって２０ｍｆｉづつ分画した。およそ２００番か
ら３００番の間の試験管に活性物質が溶出された。有効
部分を集めて濃縮し、約１５ｍ１！の水溶液にした。こ
れを凍結乾燥すると　５５■の活性物質の粗粉末が得ら
れた。この粉末を２ｍＮの水に溶解し、セファデックス
ＬＨ２０のカラム（２６１１１１１１φＸ７０ｃｍ）に
乗せた。カラムを３０％含水メタノールで展開し、フラ
クションコレクターによって１０＋ｙｔｆｉづつ分画し
た。ボト、リチチスシネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉ
ｎｅｒｅａ）に対し阻害活性を示す１５番目から３５番
目の試験管のうち強い活性画分を集めて減圧濃縮し、１
０ｒｎｌの水溶液を得た。

これを凍結乾燥し、得られる粉末（４０＋ｎｇ）を水−
エタノールによって再結晶し、濾過乾燥することによっ
て、３０ｍｇのＲＫ−１６物質が純品として得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＲＫ−１６の紫外線吸収スペクトルを示す図
であり、第２図は、ＲＫ−１６の赤外線吸収スペクトル
を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質及び生物学的性質を有する抗生
   物質ＲＫ−１６。 （１）形状：無色粉末 （２）融点：２３０℃以上（分解） （３）元素分析：炭素３９．２２％、水素４．９０％、
   窒素１９．９４％ （４）比旋光度：〔α〕＾２＾０＿Ｄ−１９．６°（Ｈ
   ＿２Ｏ）（５）紫外部吸収スペクトル：λ＿ｍ＿ａ＿ｘ
   ｎｍ（Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ）０．１Ｎ−ＨＣｌ２６
   ４ｎｍ（２６１） Ｈ＿２Ｏ２６９ｎｍ（３１１），（２５５ｓｈ）０．１
   Ｎ−ＮａＯＨ２８０ｎｍ（３５５） （６）赤外部吸収スペクトル：ν＾ｋ＾ｂ＾ｒ＿ｍ＿ａ
   ＿ｘ３４００，１７２０，１６６０，１５９０，１４０
   ０，１３７０，１３４０，１２００，１１１０，１０４
   ０ｃｍ＾−＾１（７）分子量：（ＳＩ−ＭＳ）ＭＨ＾＋
   ｍ／Ｚ４８６（８）溶解性：水に可溶、メタノールに難
   溶、ほとんどの有機溶媒に不溶 （９）呈色反応：ニンヒドリン反応・・・・・・陽性レ
   ミュー試薬・・・・・・陽性 （１０）塩基性、酸性、中性の区別：両性物質（Ｐｋａ
   ；４．４，８．９） （１１）抗菌スペクトル：植物病原性糸状菌に対し抗菌
   活性を示す。 ２、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
   に属する抗生物質ＲＫ−１６生産菌を培養し、その培養
   物から抗生物質ＲＫ−１６を分離採取することを特徴と
   する抗生物質ＲＫ−１６の製造法。 ３、抗生物質ＲＫ−１６生産菌が、ストレプトミセス・
   エスピー・Ｎｏ．１６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓ
   ｐ．Ｎｏ．１６）である特許請求の範囲第２項記載の製
   造法。