JPS5844359B2 - 新規抗生物質ｋ−７１０及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質に−７１０及びその製造法に関
するものである。

更（こ詳しくは、本発明のに−７１０の物質は、ストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）属に属する
抗生物質に一７１０生産菌を培養して、その培養物中か
ら前記抗生物質に−７１０を分離採取することにより得
られる文献未載の新規抗生物質である。

本発明者は、新規抗生物質の探索を目的として多数の土
壌中から微生物を分離し、その産生ずる抗生物質を分離
探索した結果、ストレプトミセス属に属する微生物の培
養液及び培養菌体ｔコ分献未載の新規抗生物質が産生、
蓄積されることの新たな知見を得て、こ＼に本発明を完
成するに至った。

以下）こ、本発明の新規抗生物質に−７１０及びその製
造法について詳述する。

まず、本発明において用いる微生物は、抗生物質に−７
１０の生産能を有するものであり、ストレプトミセス属
に属する菌種である。

その−例として、ストレプトミセス属４８０Ｋ ７１
０ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ、Ａ３０−に−
７１０）と呼称される微生物は上記の特性を有し、本発
明の抗生物質に−７１０を有利に生産するものであり、
本発明方法に有効に利用し得るものである。

また、上記ストレプトミセス属４８０−に−７１０の自
然的及び人工的変異株は勿論、ストレプトミセス属に属
する菌種で後述の抗生物質に−７１０の生産能を有する
微生物はすべて本発明方法において使用することができ
る。

上記ストレプトミセス属Ａ３０−に−７１０（以下、単
に「Ｋ−７１０株」という。

）は、本発明者により福島県会津若松市で採取された土
壌中より発見された土壌放線菌であり、工業技術院微生
物工業技術研究所Ｅコ昭和５６年１２月１９日付寄託さ
れ、その微生物受託番号は、微工研菌寄第６２７７号（
ＦＥＲＭ Ｐ−６２７７）である。

Ｋ−７１０株は、次の菌学的性質を有する。

（Ｉ）形態 に−７１０株の形態をオートミール寒天培地、グルコー
スアスパラギン寒天培地上、１４日白心観察した。

顕微鏡観察の結果、基土菌糸はよく発達し分岐している
。

気菌糸は短く、樹枝状に分岐し、屈曲している。

３〜７回転の螺旋糸を形成する。

胞子の連鎖は２０〜４０である。輪生板は形成しない。

電子顕微鏡による観察によると胞子表面は線状を呈し、
楕円形又は長円形で、胞子の大きさは（０，８〜１．１
μｍ）Ｘ（１，１〜１．５μ扉）である。

（ＩＩ） 各種培地上の性質 特許庁産業別審査基準ｌこ従い、各種培地を調製し、接
種後３週間後に観察した結果を次Ｅこ記載する。

尚色調の記載に於て０内の記号はディスクリブチイブ・
カラー・ネームズ・デイクシヨナリー（Ｄｅｓｃｒｉｐ
ｔｉｖｅ Ｃｏ１ｏｒ Ｎａｍｅｓ−Ｄｉｃｔｉｏｎａ
ｒｙ ）第４版の色名記号に従ったものである。

（１）シュークロース・硝酸寒天培地 生育：遅いが３〜４週間培養すると寒天表面に拡がった
よい生育が見られる。

裏面の菌体の色は淡い黄色である。

気菌糸：形成しない 可溶性色素：生成しない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地生育：生育は
遅く普通の生育が見られ裏面の菌体の色は白色乃至クリ
ーム色 （２ｂａ）である。

気菌糸：僅かにうすい白色の気菌糸が観察される。

可溶性色素：生成しない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育ニゲルコ
ース・アスパラギン寒天培地と同様の生育が見られる。

気菌糸：形成しない。

可溶性色素：生成しない。

（４）無機塩・澱粉寒天培地 生育：生育は遅く、ひろがった平坦な中程度の生育が見
られ、裏面の菌体の色は明 るい小麦色である。

気菌糸：僅かにうすい白色の気菌糸が見られ長期間培養
すると灰色となる （５ｆｅ）。

可溶性色素：生成しない。

（５）チロシン寒天培地 生育：貧弱な生育が見ら札裏面の菌体の色は明るい小麦
色（２ｅａ）である。

気菌糸：僅かに白色のうすい気菌糸が観察される。

可溶性色素：生成しない。

（６）栄養寒天培地 生育：貧弱な生育が見られ、裏面の菌体の色は無色であ
る。

気菌糸：形成しない。

可溶性色素：生成しない。

（７）イースト・エキストラクト・マルト・エキストラ
クト寒天培地 生育：良好な生育が見られ、裏面の菌体の色は黄金色（
２Ａ？ｅ）を呈する。

気菌糸：白色のうすい気菌糸をよく形成する。

可溶性色素：生成しない。

（８）オートミール寒天培地 生育：良好で、裏面の菌体の色は小麦色 （２ｅａ）乃至黄金色（２Ａ’ｃ）で長 期間培養すると中心部が黒褐色（２４ １ｒＬｌ）となる。

気菌糸二表面上に短い気菌糸を一面に着生し、長期間培
養すると培養状態により白 色或いは黒褐色（３７１２１）乃至黒色 （１０ｍｌ）となる。

可溶性色素：生成しない。

（９）ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天培地 生育：生育しないか、貧弱な生育が見られる。

気菌糸：形成しない。

可溶性色素：生成しない。

（期 生理的性質 （１）生育温度＝２３°Ｃより３７℃で生育するが２７
℃より３３℃が生育の適温 である。

（２）澱粉分解カニ陽性 （３）脱脂粉乳：ペプトン化する。

（４）メラニン様色素の生成：生成しない。

（５）ゼラチン液化カニ弱い。

（６）１硝酸爆速元：還元する。

（ＩＶ） 各種炭素源の利用性 プリダハムによる糖料用培地（ディスコ製）に各種の糖
を添加してに一７１０株を培養した結果は次の通りであ
る。

Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−フラクトース シュークロース ｉ−イノシトール Ｌ−ラムノース ラフィノース Ｄ−マンニトール 無添加 ＋＋ よく生育する ＋ 生育する ± 殆んど生育しない。

生 育 ＋ 丹 丹 丹 ＋ 丹 丹 丹 丹 ± に−７１０株の特徴的な菌学的性質を思約すれば次のと
おりである。

（１）オートミール培地上に於てよく生育し、灰色系の
気菌糸を形成する。

（２）気菌糸は短く螺旋糸を形成し、胞子表面は線状で
ある。

（３）メラニン様色素及び各種培地上１こ於て特徴ある
可溶性色素を生成しない。

（４）各種の糖をよく利用する。

上記の諸性質を有するストレプトミセス属の菌種を野々
村氏によるジャーナル・オブ・フェルメンテ−ジョン・
テクノロジー５２巻２号記載の放線菌１．Ｓ、Ｐ、株４
５８菌種の分類法の記載（キイ・フォア・クラシイフケ
−ジョン・アンド・アイデンティフィケーション・オブ
・４５８スペシス・オブ・ザ・ストレプトミセス・イン
クルーデッド・イン・Ｉ 、 Ｓ 、Ｐ ） （Ｋｅｙ
ｆｏｒ ｃｌａｓｓ−ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ４５８ｓｐｅｃｉ
ｅｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｎｃｌｕｄ
ｅｄ −１ｎ１．Ｓ、Ｐ、）Ｉこより検索すると、アク
チノミセス・マラキテイカス（Ａ、ｍａｌａｃｈｉｔｉ
ｃｕｓ）、アクチノミセス・ビリドーディアスチカス（
Ａ・ｖｉｒｉｄｏ−ｄｉａｓｔｉｃｕｓ）、ストレプト
ミセス・スバルソゲネス（Ｓ 、 ｓｐａｒｓｏｇｅｎ
ｅｓ ）に近縁の一菌種と考えられる。

次に、本発明方法を実施するに当っては、ストレプトミ
セス属に属する抗生物質に一７１０生産菌を、抗生物質
を生産する通常の方法で培養することができる。

培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的
に有利に培養するためｔこは、上記生産菌の胞子懸濁液
又は培養液を培地ｔこ接種し、通気撹拌培養を行えばよ
い。

培地の栄養源としては特に限定されることなく微生物の
培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地中に
含有させることができる。

炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセリン、ク
ルコース、シュークロース、ガラクトース、イノシトー
ル、マンニトールなどが、また窒素源としては、ペプト
ン、大豆粉、肉エキス、米ぬか、骸、尿素、コーンステ
イープリカー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機
または無機の窒素含有物が用いられる。

その他、無機塩類、たとえば食塩、リン酸塩類、カルシ
ウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加
してもよく、盛装に応じて消泡剤としての動、植、鉱物
油等を添加してもよい。

培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し
、しかもに−７１０物質の生産が最高となるような条件
が選ばれる。

たとえば、培地のｐＨは中性付近がよく、培養の適温は
２５℃〜３５°Ｃ程度が望ましい。

また培養時間は通常２〜７日間程度がよい。

しかし、これらの培養組成物、培地の液性、培養温度、
撹拌条件などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の
条件などに応じて好ましい結果が得られるよう適宜調節
選択されるべきであることはいうまでもない。

このようにして得られる培養物から、抗生物質に−７１
０を得るには代謝産物を採取するのに通常用いられる手
段を適宜に利用して採取し得る。

たとえば、Ｋ−７１０物質と不純物との溶解度差を利用
する手段、吸着親和力の差を利用する手段、イオン結合
力の差を利用する手段、有機溶剤との間の分配の差を利
用する手段のいずれも、それぞれ単独で、または組合わ
せて、あるいは反復して利用される。

具体的には、Ｋ−７１０物質は培養ろ液及び培養菌体に
存在するが、培養ろ液より酸性条件下で酢酸エチル、酢
酸ブチル、ブタノール、クロロホルム等の有機溶剤で抽
出することが出来る。

培養菌体中に存在するに一７１０物質は、菌体を含水ア
セトン、あるいは含水メタノール等を用いて抽出するこ
とが出来る。

このように抽出されたに一７１０物質は、その酸性及び
脂溶性の性質を利用して、吸着クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル流過クロマトグラフ
ィー等を組み合わせて精製することが出来る。

吸着クロマトグラフィーの担体としては、シリカゲル、
ダイアイオンＨＰ−２０等の吸着剤が使用される。

イオン交換クロマトグラフィーの担体としては、ＤＥＡ
Ｅ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファロース等の陰イオン
交換体を利用することが出来る。

又、ゲル濾過にはメタノールを溶剤とする関係上、セフ
ァデックスＬＨ−２０が有利１こ使用し得る。

更に高度の精製Ｅこは高速液体クロマトグラフィーが利
用される。

この場合の使用カラムは逆層分配型のものが有利ｔこ使
用出来る。

このようｔこして精製されたに一７１０物質は、そのメ
タノール溶液にエーテル、石油エーテル等を加えると高
純度の白色の粉末として沈澱するので、これを流過によ
り採取することが出来る。

かくして得られた抗生物質に−７１０の理化学的性質及
び生物学的性状は次のとおりである。

〔抗生物質に−７１０の理化学的性質及び生物学的性状
〕 形状：白色粉末 融点：２００°Ｃ以上で徐々に分解する。

元素分析：炭素５２．０８俤、水素６．９７俤、窒素１
１．５５多 比旋光度：〔α〕。

＝−９，１７゜（Ｃ＝０．４８、メタノール） 紫外部吸収スペクトル：メタノール中で２１１ｍμに末
端吸収を示す。

赤外部吸収スペクトル： ３４００．２９３０．２８５
０．１７４０，１６５０．１５３０．１４００．１２０
０，１０６０．７００．５５０ｃｒｆＬ ）こ特徴的な
吸収帯を有する。

溶解性：メタノールによく溶け、水、低級アルコールに
やや溶ける。

アセトン、エーテルに難溶。

ＰＫａ’ ： ４．０，５．９．９．６分子量：１１
７６（二次イオンマススペクトルによる） 含有するアミノ酸：酸分解により、アスパラギン酸、セ
リンの他数ケの未同定アミノ酸を与える。

呈色反応：ライドン、スミス反応は陽性、ニンヒドリン
、ドラーゲンドルフ反応は陰 性。

塩基性・酸性・中性の区別二面性物質と考えられる。

Ｒｆ値：メルク社製シリカゲル薄層クロマトプレートを
使用したときのＲｆ値 展開溶剤 Ｒｆ値プロパツール
／Ｎアンモニア水（７：３） ０．５２ブタノール
−酢酸−水（４：１：１） ０．３３クロロホルム
−メタノール（１：１） ０．５３メルク社製
セルロース薄層クロマトプレートを使用したときのＲｆ
値 ブタノール−酢酸−水（４：１：０．５） ０．
９５抗菌スペクトル（寒天希釈法１こよる）：以下に示
すように植物病原性かび類に菌糸の膨化を伴う生育阻害
活性を示すが試験した範囲で、細菌、酵母類には殆んど
阻害活性を示さない。

供 試 菌 最少阻止菌糸膨化を 濃度 起す最小濃度 （ｍｃｇ〆の（ｍ ｃ ｇ／ｍわ コクリオボラス・ミャビア ナス （稲ごま葉枯病菌） Ｃｏｃｈｉｉｏｂｏｌｕｓ ｍ１ｙａ− ｅａｎｕｓ ０．２５ ＜０．０１５ アルタナリア・マリ （りんご斑点落葉病菌） ０．２５ ＜０
．０１５Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｍａｌｉ グロメレラ・シンギュラータ 米 （ぶとう晩腐病菌） ＞２５０ ＜０．０１
５Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａコレトト
リカム・ラゲナリウム （そ菜炭痕病菌） ＞２５０７＜０．
０１５Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎ−ｒ
ｌｕｍ ピリキュラリア・オリゼ （補熱病菌） ＞２５０“ ０．２５Ｐ
ｉｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ米 部分的生育
阻害がみられる 以上の抗生物質に−７１０の理化学的性質並びに生物学
的性状を従来の抗生物質と比べると、抗生物質ＡＣ−６
９０特開昭５５−３３４４５号公報参照）が類似物質と
して挙げられるが、この物質とはアミノ酸組成、比旋光
度、ＰＫａ’ｌ直等に於て明らかに異る上、同条件に於
ける薄層クロマトグラフィーによる直接比較の結果明ら
かに異る物質であることが証明された。

従ってに−７１０は文献未記載の新規抗生物質であると
結論された。

また、抗生物質に一７ｉｏの各種植物病原性のかびに対
する阻害活性はｉｎ ｖｉｖｏ試験（ポット試験）に於
ても確認されたので、Ｋ−７１０は農園芸用抗かび剤と
しての実用化が太いに期待されるものである。

以下に、本発明方法を実施例によって詳述するが、本発
明方法はこれに何ら限定されるものではない。

実施例 １ グルコース２φ、可溶性澱粉１φ、肉エキス０．１φ、
酵母０．４係、大豆粉２．５斜、食塩０．２φ、第二燐
酸力ＩＪＯ，ｏ０５φの組成からなる培地３０１に、あ
らかじめ同一培地ｌこ、前記に一７１０株（微工研菌寄
第６２７７号（・ＦＥＲＭ、Ｐ−６２７７）を接種して
４８〜７２時間２７℃で振盪培養した培養液３００７ｒ
Ｌｌを接種して３０℃で７２時間、通気撹拌培養を行う
。

最終ｐＨは７．５〜８．０である。培養液を遠心流過に
より菌体とろ液とに分は菌体は６０咎アセトン１０１で
２回抽出する。

培養Ｆ液と菌体抽出液を合わせ、ダイヤイオンＨＰ−１
０６１１のカラムを通過させる。

カラムは１０φアセトン１０１を用いて洗滌後、７０φ
アセトン１４１を用いて溶出を行う。

活性区分を集め、減圧濃縮し、１．３１の濃縮水溶液を
得る。

ブタノール０．６１を用い２回抽出し、ブタノール層を
減圧濃縮し残渣８ｇを得る。

これを更に精製するためにシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーを行う。

クロロホルムで調整したメロ×３０ＣｒＩＬのカラムに
かけ、クロロホルム４Ｉ２．１０φメタノール−クロロ
ホルム２１．２０％メタノール−クロロホルム４ｉ、５
ｏ％メタノールークロロホルム２１で順次溶出を行い、
溶出液を１５−づつ分取する。

活性画分（フラクション／／６１１３−１７０ ）を集
め、減圧濃縮して粗粉末１３．１ｇを得る。

更に精製するために粗粉末１５００ｒｖをメタノール少
量に溶かし、メタノールで調製したセファデックスＬＨ
−２０（１００ｇ）のカラムにかけ、引き続きメタノー
ルで溶出する。

活性区分を集め減圧濃縮して粗粉末■３１５■を得る。

最終的に精製を行うために高速液体クロマトグラフィー
による分取を行う。

日立ＲＰ−１８（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５Ｃ１８、φ４
ｖｎｍＸ １５ｍ）のカラムを用い６５φメタノールを
溶剤として分取を繰返し、１６０■の粗粉末■より単一
のに一７１０物質１６■が白色粉末として得られた。

実施例 ２ 実施例１に於ける粗粉末１５００■を少量の水に溶かし
、ＤＥＡＥ−セファロース（炭酸型、φ２０ｍｍ×５７
ｃｒＩＬ）のカラムにかけ、水、ついで０．５Ｍ−重炭
酸アンモニウム溶液で溶出を行う。

１２−づつ溶出液を分取する。

活性画分（フラクション慮５３〜６５）を集め凍結乾燥
すると、２４０■の白色粉末が得られた。

この粉末は高速液体クロマトグラフィーで分析すると単
一ではなかったので、単一物質を得るために実施例１に
於ける高速液体クロマトグラフィー１とよる分取を繰返
しに一７１０物質の精製白色粉末を得た。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明の抗生物質に−７１０の臭化カリ錠
剤における赤外部吸収スペクトルを示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 形 状：白色粉末 融 点：２００℃以上で徐々に分解する。 元素分析：炭素５２．０８％、水素６．９７饅、窒素１
   １．５５φ 比旋光度＝（α）２１＝−９，１７゜ （Ｃ＝０．４８、メタノール） 紫外部吸収スペクトル： メタノール中で２１１扉μに末端 吸収を示す。 赤外部吸収スペクトル： ３４００１２９３０．２８５０，１７４０゜１６５０．
   １５３０．１４００，１２００１１０６０．７００．５
   ５０ｃｒ／Ｌ” ｔこ特徴的な吸収帯を有する。 溶解性：メタノールによく溶け、水、低級アルコールに
   やや溶ける。 アセトン、エーテルに難溶。 ｐ ｋ ａ ： ４．０． ５．９．９．６分子量：１
   １７６ （二次イオンマススペクトル（こよる） 含有するアミノ酸：酸分解により、アスパラギン酸、セ
   リンの池数ケの未同定ア ミノ酸を与える。 呈色反応：ライドン、スミス反応は陽性、ニンヒドリン
   、ドラーゲンドル フ反応は陰性。 塩基性、酸性、中性の区別： 両性物質と考えられる。 抗菌スペクトル（寒天希釈法による）： 植物病原性のかび類に生育阻害活性を 示す。 上記の理化学的性質及び生物学的性質を有する新規抗生
   物質に−７１０゜ ２ ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）
   属に属する抗生物質に一７１０生産菌を培養し、その培
   養物から新規抗生物質に−７１０を分離採取することを
   特徴とする新規抗生物質に−７１０の製造法。 ３ ストレプトミセス属ｌこ属する抗生物質に７１０生
   産菌がストレプトミセス・エスピー・８０−Ｋ −７１
   ０（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓ ｐ 、８０−に−
   ７１０）である特許請求の範囲第２項記載の方法。