JPS5834113B2 - 新規抗生物質シスタマイシン及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質シスタマイシン （ｃｙｓｔａｍｙｃｉｎ）及びその製造法に関するもの
である。

更に詳しくは、本発明のシスタマイシンは、ストレプト
ミセス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓ ）属に属する
抗生物質シスタマイシン生産菌を培養して、その培養物
中から前記抗生物質シスタマイシンを分離採取すること
により得られる文献未載の新規抗生物質である。

本発明者は、新規抗生物質の探索を目的として多数の土
壌中から微生物を分離し、その産生ずる抗生物質を分離
探索した結果、ストレプトミセス属に属する微生物の培
養液及び培養菌体中に文献未載の新規抗生物質が産生、
蓄積されることの新たな知見を得て、ここに本発明を完
成するに至った。

以下に、本発明の新規抗生物質シスタマイシン及びその
製造法について詳述する。

まず、本発明において用いる微生物は、抗生物質シスタ
マイシンの生産能を有するものであり、ストレプトミセ
ス属に属する菌種である。

その−例として、ストレプトミセス属ＡＡＭＳ−７３４
（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ、 ＡＡＮＳ −
７３４）と呼称される微生物は上記の特性を有し、本発
明の抗生物質シスタマイシンを有利に生産するものであ
り、本発明方法に有効に利用し得るものである。

また、上記ストレプトミセス属ＡＮＳ −７３４の自然
的及び人工的変異株は勿論、ストレプトミセス属に属す
る菌種で後述の抗生物質シスタマイシンの生産能を有す
る微生物はすべて本発明方法において使用することがで
きる。

上記ＡＮＳ−７３４株（以下、単にｒＡＮｓ −７３４
株」と称する）は本発明者により埼玉県比企郡吉見町で
採取した土壌試料中より発見されたストレプトミセス属
に属する土壌放線菌であり、工業技術院微生物工業技術
研究所に昭和５５年１２月２５日に寄託され、その微生
物受託番号は、微工研菌寄第５８４４号である。

ＡＮＳ −７３４株の菌学的性質は次の通りである。

（Ｉ） 形態 スターチ寒天培地、オートミル寒天培地上の生育につい
て観察を行った。

基生菌糸はよく分岐している。

気菌糸は各種培地上によく着生し、単軸分岐をし、分枝
は、−回転乃至三回転の螺旋糸を形成し、胞子を着生す
る。

オートミール寒天培地上の胞子の電子顕微鏡による観察
の結果、胞子表面は平滑である。

胞子の大きさは１．０〜１．４Ｘ０．７〜０．９μであ
る。

（旬 各種培地上の性質 特許庁産業別審査基準に従い、各種培地を調製し、接種
後３週間後に観察した結果を次に記載する。

尚色調の記載に於て０内の記号はディスクリブチイブ・
カラー・ネームズ・ディクショナリー（Ｄｅｓｃｒｉｐ
ｔｉｖｅ Ｃｏ１ｏｒ ＮａｍｅｓＤｉｃｔｉｏｎａｒ
ｙ ）第４版の色名記号に従ったものである。

（１） シュクロース・硝酸寒天培地 生育：周辺に拡がり、極めて良好な生育を呈し、裏面の
色は赤味を帯びた黄色より茶色（３１ａ〜４ｎｅ）であ
る。

気菌糸：よく着生し、粉状、クリーム色 （１％Ｃａ ）より淡い黄色を呈する。

可溶性色素：黄橙色（２１ａ）を呈する。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地生育：周辺に
拡がり、極めて良好な生育を呈し、裏面の色は明るい小
麦色（２ｅａ）より黄色（２１ｃ）を呈する。

気菌糸：よく着生し、粉状、明るい茶灰色（２ｇｅ）を
呈する。

可溶性色素：僅かに黄色い可溶性色素を生成する。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：不良。

裏面の色は白色乃至明る〜・黄色（１月ｌａ）を呈する
。

気菌糸：僅かに着生し白色を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（４）無機塩・殿粉寒天培地 生育：普通の生育を呈し裏面の色は黄茶色より灰色味を
帯びた茶色（２１ｇ〜２ｉｅ）を呈する。

気菌糸：よく着生し灰茶色（２ｉｇ）を呈する。

可溶性色素２僅かに黄色の色素を生成する。

（５）チロシン寒天培地： 生育二周辺に拡がり、極めて良い生育を呈し、裏面の色
は茶灰色（３ｉｇ）である。

気菌糸：よく着生し白色より灰茶色（３ｉｇ）を帯びる
。

可溶性色素：淡い褐色。

（６）栄養寒天培地 生育：悪い。

裏面の色は明るい象牙色（２ｃａ ）を呈する。

気菌糸二着生悪（、白色を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（７） イースト・エキストラクト、マルト・エキス
トラクト寒天培地 生育二周辺に拡がり、極めて良い生育を呈し、裏面は黄
色（３ｉａ）乃至濃い褐色（４ｈｌ）を呈する。

気菌糸：よく着生し、茶灰色（２ｉｇ）を呈する。

可溶性色素：明るい黄褐色を呈する。

（８）オートミール寒天培地 生育二周辺に拡がった極めて良い生育をし、裏面の色は
茶色（３ｎｉ）を呈する。

気菌糸：よく着生し、暗い茶灰色（２ｎｉ〜２ｎｌ）を
呈する。

可溶性色素：明るい褐色。

（９）ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天培地 生育二不良。

裏面の色は象牙色（２ｃａ）を呈する。

気菌糸二着生しない。

可溶性色素二生成しない。

叫 生理的性質 （１）生育温度：２７°〜３７℃に於てよい生育をする
。

殿粉分解カニ分解する。

脱脂粉乳：ペプトン化陽性 メラニン様色素の生成：生成しない。

ゼラチン液化カニ陰性 硝酸塩還元：還元せず。

各種炭素源の利用性 プリダハムによる糖料用培地（ディフコ製）に各種の糖
を添加してＡＮＳ−７３４株を培養した結果は次の通り
である。

ＡＮＳ −７３４株の菌学的性質は上記の如くであるが
、本菌株は■スパイラルを形成する。

■胞子表面は平滑である。

■メラニン色素は生成しない。

■菌体の色は茶灰色乃至濃褐色である。

■黄色の可溶性色素を生成する。■各種の糖をよく利用
する等の特徴を有する。

野々村氏によるジャーナル・オプ・フェルメンテ−ジョ
ン・テクノロジー５２巻２号記載の放線菌■。

ｓ、ｐ、株４５８菌種の分類法の記載（キイ・フォア・
クラシイフケ−ジョン４５８スペシス・オブ・ザ・スト
レプトミセス・インクルーデッド・イン・１．Ｓ、Ｐ、
） （Ｋｅｙ ｆｏｒ ｃｌａ −５ｓｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ａｎｄ １ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
４５８ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ １ｎｃｌｕｄｅｄ ｉｎ Ｉ。

ｓ、ｐ、）により、ＡＮＳ −７３４株に類似する菌種
を比較するとＡ ｃｔ ｉｎｏ ｍｙｃｅｓ ｃ ｙａ
ｎｏｇｅｎｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａ
ｃｅｏｌｕｔｕｓ等に類似するがＡＮＳ −７３４株は
赤色、青色の可溶性色素の生成は観察されない。

次に、本発明方法を実施するに当っては、ストレプトミ
セス属に属する抗生物質シスタマイシン生産菌を、抗生
物質を生産する通常の方法で培養することができる。

培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的
に有利に培養するためには、上記生産菌の胞子懸濁液又
は培養液を培地に接種し、通気攪拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることなく、微生物
の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地中
に含有させることができる。

炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセリン、グ
ルコース、シュークロース、ガラクトース、イノシトー
ル、マンニトールなどが、また窒素源としては、ペプト
ン、大豆粉、肉エキス、米ぬか、皺、尿素、コーンステ
イープリカー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機
または無機の窒素含有物が用いられる。

その他、無機塩類、たとえば食塩、リン酸塩類、カルシ
ウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加
してもよく、必要に応じて消泡剤としての動、植、鉱物
油等を添加してもよい。

培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し
、しかもシスタマイシンの生産が最高となるような条件
が選ばれる。

たとえば、培地のｐＨは中性付近がよく、培養の適温は
２５°〜３５℃程度が望ましい。

また培養時間は通常２〜７日間程度がよい。

しかし、これらの培養組成物、培地の液性、培養温度、
攪拌条件などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の
条件などに応じて好ましい結果が得られるよう適宜調節
選択されるべきであることはいうまでもない。

このようにして得られる培養物から、シスタマイシンを
得るには代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を
適宜に利用して採取し得る。

たとえば、シスタマイシンと不純物との溶解度差を利用
する手段、吸着親和力の差を利用する手段、イオン結合
力の差を利用する手段、有機溶剤との間の分配の差を利
用する手段のいずれも、それぞれ単独で、または組合わ
せて、あるいは反復して利用される。

具体的には、シスタマイシンは培養沢液及び培養菌体中
に存在するが、培養沢液より酸性条件下で酢酸エチル、
酢酸ブチル、ブタノール、クロロホルム等の有機溶剤で
抽出することが出来る。

培養菌体中に存在するシスタマイシンは、菌体を含水ア
セトン、あるいは含水メタノール等を用いて抽出するこ
とが出来る。

このように抽出されたシスタマイシンは、その酸性及び
脂溶性の性質を利用して、吸着クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル沢過クロマトグラフ
ィー等を組み合わせて精製することが出来る。

吸着クロマトグラフィーとしては、シリカゲル、ダイア
イオンＨＰ −１０等の吸着剤が有利に使用される。

更に高度の精製には高速液体クロマトグラフィーが利用
される。

この場合の使用カラムは逆層分配型のものが有利に使用
出来る。

このようにして精製されたシスタマイシンはそのメタノ
ール或いはアセトシ鼎液より、エーテル、石油エーテル
等を加えることにより高純度の白色の粉末として沈澱す
るので、沢過により採取することが出来る。

か（して得られたシスタマイシンの遊離酸の理化学的性
質及び生物学的性状は次のとおりである。

〔抗生物質シスタマイシンの理化学的性質及び生物学的性状〕

１、形状：白色粉末 ２、融点：２４０’Ｃ以上で徐々に着色分解し、明確な
融点を示さない。

３、元素分析値：炭素４７．２４％、水素４．３８％、
窒素１６．３７％、硫黄１５．０２％ ４、含有するアミノ酸：酸加水分解により、アスパラギ
ン酸、スレオニン、グリシン、シスチンの地歩なくとも
２個の未同定アミノ酸を与える。

５゜比旋光度二〇〕邸＝＋７５° （（：’＝０．８４
ジメチルホルムアミド中） ６、紫外部吸収スペクトル： 第１図に示す通りであるが、その極大吸収値ｎｍ（Ｅ１
％）を示すと、 ｃｆｒＬ 水溶液：２２０ （２２４）、２７０（１０８）０．０
５Ｎ塩酸：２２０（２０１） ０．０５Ｎ苛性ソーダ：２２０（２２５）、２６２（１
３３） ７、赤外部吸収スペクトル： 第２図に示されるとおり、臭化カリ錠剤申訳の特徴的な
吸収帯を有する。

３３３０．２９６０，１７３０，１６６０゜１５８０．
１５００．１４３０．１３８５．１２９０．１ｇ３０，
１１６５．１１１０．１０７０．１０３０．１０００．
８７５．８２５．７７０ｃｍ’ ８゜溶解性： アルカリ水、中性緩衝液、メチルセロソルブ、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシドによく溶ける。

水、メタノール、エタノールに僅か溶ける。

ベンゼン、クロロホルム、エーテル、石油エーテルには
難溶である。

９゜ｐＫａ’： ４．７ （７０％メチ＃セｌ：２／＃
７沖）１０、分子量：１３００（滴定当量より一塩基酸
として） １１、 Ｒｆ値 シリカゲル薄層クロマトグラフィー （メルク製Ｆ２５４薄層プレート使用） １５、急性毒性： マウスに対する静脈内注射による急性毒性試験では、１
００■／ｋｙの投与で生存、２００■／ｋｇの投与では
死亡した。

以上の抗生物質シスタマイシンの理化学的性質並びに生
物学的性状、特に植物病原菌に対する特異的抗かび性は
他の抗生物質に例をみないものであり、本発明の抗生物
質シスタマイシンは文献未載の新規抗生物質であること
が明らかにされた。

また、シスタマイシンが種物病原性のかびに対して特異
的阻害活性を示したことは、ｉｎ ｖｉｖｏ試験（ポッ
ト試験）においても確認されたので、抗生物質シスタマ
イシンは農園芸用抗かび剤としての実用化が大いに期待
されるものである。

以下に、本発明方法を実施例によって詳述するが、本発
明方法はこれに伺ら限定されるものではない。

実施例 グルコース２％、可溶性澱粉１％、肉エキス０．１％、
酵母０．４％二二層豆粉２，５、食塩０．２％、第二燐
酸カリ０．００５％の組成からなる培地（苛性ソーダで
殺菌前、ｐＨ８，８に調整）３６１に、あらかじめ同一
培地に前記ＡＮＳ −７３４株（微生物受託番号微工研
菌寄第５８４４号）を接種して９６時間２７℃で振盪培
養した培養液２４０ｍ１を接種して２８℃で９０時間通
気攪拌培養を行った。

最終ｐＨは７．０付近である。培養液を遠心沢過して菌
体と培養涙液とに分けた。

得られた培養涙液２３Ｊと、菌体の７０％メタノール抽
出液１２１を合わせ、ダイアイオンＨＰ−１００カラム
（７，５φ×１００ＣＩｒＬ）を通過させた。

カラムを４０％メタノール２０１で洗滌後、アンモニア
水でｐＨ８に調整した９０％メタノール２０１を用いて
溶出した。

溶出液の活性画分を合し、減圧下に濃縮して、濃縮液３
１を得た。

塩酸でｐｕを３に調整し、ブタノールで２度抽出した（
合計３１）。

ブタノール層を１１の重曹水で２度、ついで０．５１の
水で２度洗滌した後、減圧濃縮した。

残渣を少量のベンゼン−アセトン（１ニア）に溶かし、
同溶剤で調製したシリカゲルのカラム（５，５φ×３０
ｃｒｆＬ）にチャージした。

同溶剤２１．アセトン１１１アセトン−メタノール（４
：１）６１．ついでアセトン−０，ＩＮアンモニヤ水（
４：１ ）８１を用いて順次、溶出を行うと、活性は最
後の溶剤による溶出画分に現れた。

これを減圧濃縮し、残渣を更にクロロホルム−メタノー
ルの溶剤系を用いてシリカゲルクロマトグラフィーを行
った。

カラムのサイズは４φ×７０ｃｒＩＬのものを用い、ク
ロロホルム−メタノール（７： １ ）２１． クロロ
ホルム−メタノール（４二１ ）２Ｊ、 更にクロロホ
ルム−メタノール（３：１）３１を用いて順次溶出を行
うと、活性は最後の溶剤による溶出画分に現れた。

活性画分を濃縮し、残渣を少量のエタノールに溶かし、
これにエーテルを加えるとシスタマイシンは白色沈澱と
して析出し、Ｐ取乾燥ニより３００Ｔｎ９の粗粉末が得
られた。

これを更に精製するためにクロロホルム−エタノール−
〇、ＩＮアンモニア水（４ニア：０．５）の溶剤系を用
い２．８φＸ９０（１’７７１のシリカゲルカラムで再
度クロマトグラフィーを行った。

活性画分を集め、減圧濃縮し、アセトン−エーテルによ
り沈澱させ１３０■の精製粉末を得た。

水晶は６種類の溶剤系を用いたシリカゲル薄層クロマト
グラフィーに於て単一のスポットを与え、純粋性が確認
された。

実施例 ２ 実施例１で得られたシスタマイシンの粉末を、高速液体
クロマトグラフィーにかけて更に高度の精製を行った。

Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５ Ｃ１８（６φ×２５Ｃｒ
ｒＬ）のカラムを用い、７５％メタノールヨ詐酸（１０
０：Ｏ，ｉ５）により、１．０ｍｌ／分の流速で展開す
ると、シスタマイシンは保持時間２１分の部分に溶出さ
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の抗生物質シスタマイシンの紫外部吸収
スペクトルを示し、第２図はシスタマイシン（遊離酸）
の臭化カリ錠剤における赤外部吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学性質及び生物学的性質を有する新規抗
   生物質シスタマイシン。 融点：２４０℃以上で徐々に着色分解し、明確な融点を
   示さない。 元素分析：炭素４７．２４（％）、水素４．３８（％）
   、窒素１６．３７（％）、硫黄１５．０２（％）含有ス
   るアミノ酸：アスパラギン酸、スレオニン、グリシン、
   シスチンの地歩なくとも２個の未同定アミノ酸を含有す
   る。 比旋光度：■２３＝＋７５° （Ｃ＝０．８４、ジメチ
   ルホルムアミド中） 紫外部吸収スペクトル〔極大値ｎｍ（Ｅ”％）〕ｃＩＩ
   Ｌ 水溶液：２２０（２２４）、２７０（１０８）０．０５
   Ｎ塩酸：２２０（２０１） ０．０５Ｎ苛性ソーダ：２２０（２２５）、２６２（１
   ３３） 赤外部吸収スペクトル（臭化カリ錠剤中の主な極大値）
   ：３３３０．２９６０．１７３０，１６６０．１５８０
   ．１５００．１４３０，１３８５．１２９０１１２３０
   ．１１６５．１１１０゜１０７０ １０３０ １０００
   ．８７５．８２５、・７７０ｃＩＩｌ。 溶解性：アルカリ水、中性緩衝液、メチルセロンルブ、
   ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドによく溶
   ける。 水、メタノール、エタノールに僅かに溶ける。 ベンゼン、クロロホルム、エーテル、石油エーテルに難
   溶である。 ｐＫａ’： ４．７ （７０％メチルセロソルフ沖）分
   子量：１３００（滴定当量よりブ塩基酸として）呈色反
   応：過マンガン酸カリ、ヨード反応、ライドンスミス反
   応は陽性、ニンヒドリン、トレンス、過沃素酸−ベンジ
   ジン、塩化鉄、アンスロン反応は陰性。 塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質 抗菌スペクトル（寒天希釈法による）：植物病原性のか
   び類に生育阻害活性を示す。 ２ ストレプトミセス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   ）属に属する抗生物質シスタマイシン生産菌を培養し、
   その培養物から新規抗生物質シスタマイシンを分離採取
   することを特徴とする新規抗生物質シスタマイシンの製
   造法。 ３ ストレプトミセス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   ）属に属する抗生物質シスタマイシン生産菌が、ストレ
   プトミセス属Ａ、ＡＮＳ −７３４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
   ｙｃｅｓｓｐ 、ＡＡＮ Ｓ ３７４ ）である特許
   請求の範囲第２項記載の製造法。