JPH0158198B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質HK―803及びその製
造法に関するものである。

更に詳しくは、本発明のHK―803物質は、ス
トレプトミセス（Streptomyces）属に属する抗
生物質HK―803生産菌を培養して、その培養物
中から前記抗生物質HK―803を分離採取するこ
とにより得られる文献未載の新規抗生物質であ
る。

本発明者は、新規抗生物質の探索を目的として
多数の土壌中から微生物を分離し、その産生する
抗生物質を分離探索した結果、ストレプトミセス
属に属する微生物の培養液及び培養菌体に文献未
載の新規抗生物質が産生、蓄積されることの新た
な知見を得て、こゝに本発明を完成するに至つ
た。

以下に、本発明の新規抗生物質HK―803及び
その製造法について詳述する。

まず、本発明において用いる微生物は、抗生物
質HK―803の生産能を有するものであり、スト
レプトミセス属に属する菌種である。

その一例として、ストレプトミセス属No.80―
HK―803（Streptomyces sp.80―HK―803）と呼
称される微生物は上記の特性を有し、本発明の抗
生物質HK―803を有利に生産するものであり、
本発明方法に有効に利用し得るものである。

また、上記ストレプトミセス属No.80―HK―
803の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレプ
トミセス属に属する菌種で後述の抗生物質HK―
803の生産能を有する微生物はすべて本発明方法
において使用することができる。

上記ストレプトミセス属No.80―HK―803（以
下、単に「HK―803株」という。）は、本発明者
により福島県地蔵原で採取された土壌中より発見
された土壌放線菌であり、工業技術院微生物工業
技術研究所に昭和57年７月23日付寄託され、その
微生物受託番号は、微工研菌寄第6644号
（FERMP―6644）である。

HK―803株は、次の菌学的性質を有する。

（） 形態 無機塩・澱粉寒天培地、イースト・マルトエキ
ス寒天培地上の生育について顕微鏡、及び電子顕
微鏡により形態を観察した。HK―803株はスト
レプトミセス属に属する形態を示した。その形態
的特徴は次のとおりである。

１ 基生菌糸：寒天上によく生育し分岐してい
る。

２ 気菌糸：グルコース・アスパラギン寒天培
地、グリセリン・アスパラギン寒天培地以外の
培地上によく着生し、胞子柄の長さは短く、屈
曲し、緻密なラセン糸を多数形成し、20から50
の胞子の連鎖を形成する。電子顕微鏡による観
察によると、胞子表面は平滑であり、楕円形又
は長円形であり、その大きさは0.7〜0.9×1.0〜
1.2μmである。

（） 各種培地上の性質 特許庁産業別審査基準に従い、各種培地を調製
し、接種後３週間後に観察した結果を次に記載す
る。尚色調の記載に於て（ ）内の記号はデイス
クリプテイブ・カラー・ネームズ・デイクシヨナ
リー（Descriptive Color Names Dictionary）
第４版の色名記号に従つたものである。

(1) シユークロース・硝酸寒天培地 生育：普通の生育を示し裏面の色は薄い小麦色
（2ea）よりにぶい黄色（2ic）を呈する。

気菌糸：表面上に白色ベルベツト状の気菌糸を
形成し、４週間後にクリーム色がかつてく
る（2ba）。

可溶性色素：生成しない。

(2) グルコース・アスパラギン寒天培地 生育：生育は不良で、裏面の色調は明るいレモ
ン色（3ea）を呈する。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：生成しない。

(3) グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育：普通の生育を呈し、裏面の色は明るい黄
色（１1/2la）。

気菌糸：表面上に薄い白色の気菌糸を着生す
る。

可溶性色素：薄い黄色の可溶性色素を形成す
る。

(4) 無機塩・澱粉寒天培地 生育：良好の生育を示し、裏面の色は明るい小
麦色（2ea）乃至にぶい黄色（2ic）を呈す
る。

気菌糸：豊富に綿毛状の気菌糸を着生し、白色
を経て灰色（5fe）となる。

可溶性色素：生成しない。

(5) チロシン寒天培地 生育：良好の生育を示し、裏面はにぶい橙色
（4lc）を呈する。

気菌糸：ベルベツト状、白色の気菌糸を着生す
る。

可溶性色素：生成しない。

(6) 栄養寒天培地 生育：普通の生育を示し、裏面の色は明るい小
麦色（2ea）を呈する。

気菌糸：白色、ベルベツト状の気菌糸を一面に
着生する。

可溶性色素：生成しない。

(7) イースト・エキストラクト、マルト・エキス
トラクト寒天培地 生育：極めて良好な生育を示し、裏面の色は黄
橙色（3ia）を呈する。

気菌糸：豊富に一面に綿毛状の気菌糸を着生
し、培養30日間をすぎると灰色味（5ih）
をおび後に灰茶色（4ig）を呈する。

可溶性色素：黄色味をおびてくる。

(8) オートミール寒天培地 生育：極めて良好の生育を示し、裏面の色は明
るい小麦色（2ea）乃至、うす黄茶色を呈
する。

気菌糸：豊富に綿毛状の気菌糸を着生し、白色
乃至灰色（2fe）を呈する。集落の中心部
は長期間培養すると黒色味をおびてくる。

可溶性色素：生成しない。

(9) ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天
培地 生育：貧弱な生育を示し、裏面の色は明るい小
麦色（2ea）を呈する。

気菌糸：白色で薄い気菌糸を表面一面に着生す
る。

可溶性色素：生成しない。

（） 生理的性質 (1) 生育温度：23℃より37℃において生育する。

(2) 澱粉分解力：分解する。

(3) 脱脂粉乳：凝固性 陰性。

ペプトン化 陽性。

(4) メラニン様色素の生成：生成しない。

(5) ゼラチン液化力：陰性。

(6) 硝酸塩還元：陽性。

（） 各種炭素源の利用性 プリダハムによる糖利用培地（デイフコ製）に
各種の糖を添加してHK―803株を培養した結果
は次の通りである。

生育 Ｌ―アラビノース ± Ｄ―キシロース ± Ｄ―グルコース Ｄ―フラクトース シユークロース Ｉ―イノシトール Ｌ―ラムノース ラフイノース Ｄ―マンニトール ＋ 無添加 ± よく生育する ＋ 生育する ± 殆んど生育しない HK―803株の菌学的性質は上記の如くである
が、本菌株の特徴を要約すれば次の通りである。

１ 気菌糸をよく着生し胞子柄は屈曲しよく分岐
している。緻密なラセン糸を形成し、胞子の連
鎖を形成し、長期間培養すると灰色となる。胞
子表面は平滑である。ストレプトミセスに属す
る形態を有する。

２ 菌の集落の裏面には特徴ある色調は見られな
い。

３ 可溶性色素は形成しない。

４ クロモケニツク陰性である。

５ アラビノース、キシロース、マンニトールを
除き各種の糖を利用する。

野々村氏によるジヤーナル・オブ・フエルメン
テーシヨン・テクノロジー52巻２号記載の放線菌
I.S.P.株458菌種の分類法の記載（キイ・フオア・
クラシイフケーシヨン・アンド・アイデンテイフ
イケーシヨン・オブ・458スペシス・オブ・ザ・
ストレプトミセス・インクル―デツド・イン・I.
S.P.）（Key for classification and
identification of 458 species of the
streptomyces included in I.S.P.）により、HK
―803株の分類学的地位を検索すると、糖の利用
性について若干の相違が認められるが、ストレプ
トマイセス・シオヤエンシス（Streptomyces
sioyaensis）に最も近縁の菌株であると結論され
る。

しかしながら、抗生物質の生産能において明ら
かに相異が認められるため、HK―803株は、ス
トレプトミセス・シオヤエンシスに属する新菌株
とすることが妥当と結論された。

次に、本発明方法を実施するに当つては、スト
レプトミセス属に属する抗生物質HK―803生産
菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培養する
ことができる。培養の形態は、液体培養でも固体
培養でもよく、工業的に有利に培養するために
は、上記生産菌の胞子懸濁液又は培養液を培地に
接種し、通気撹拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることなく、
微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源そ
の他を培地中に含有させることができる。

炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセ
リン、グルコース、シユークロース、ガラクトー
ス、イノシトール、マンニトールなどが、また窒
素源としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、米
ぬか、〓、尿素、コーンステイープリカー、アン
モニウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の
窒素含有物が用いられる。その他、無機塩類、た
とえば食塩、リン酸塩類、カルシウム、亜鉛、マ
ンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加してもよ
く、必要に応じて消泡剤としての動、植、鉱物油
等を添加してもよい。

培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発
育に適し、しかもHK―803物質の生産が最高と
なるような条件が選ばれる。たとえば、培地のPH
は中性付近がよく、培養の適温は25℃〜35℃程度
が望ましい。また培養時間は通常２〜７日間程度
がよい。

しかし、これらの培養組成物、培地の液性、培
養温度、撹拌条件などの培養条件は使用する菌株
の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が
得られるよう適宜調節選択されるべきであること
はいうまでもない。このようにして得られる培養
物から、抗生物質HK―803を得るには代謝産物
を採取するのに通常用いられる手段を適宜に利用
して採取し得る。たとえば、HK―803物質と不
純物との溶解度差を利用する手段、吸着親和力の
差を利用する手段、イオン結合力の差を利用する
手段、有機溶剤との間の分配の差を利用する手段
のいずれも、それぞれ単独で、または組合わせ
て、あるいは反復して利用される。

具体的には、HK―803物質は培養液及び培
養菌体に存在するが、培養液より酸性条件下で
ブタノールで抽出することが適当である。培養菌
体中に存在するHK―803物質は、菌体を含水ア
セトン、あるいは含水メタノール等を用いて抽出
することが出来る。このように抽出されたHK―
803物質は、その酸性及び脂溶性の性質を利用し
て、吸着クロマトグラフイー、イオン交換クロマ
トグラフイー、ゲル過クロマトグラフイー等を
組み合わせて精製することが出来る。吸着クロマ
トグラフイーの担体としては、ダイヤイオンHP
―10、活性炭等の吸着剤が使用される。イオン交
換クロマトグラフイーの担体としては、DEAE―
セルロース、DEAE―セフアロース等の陰イオン
交換体を利用することが出来る。又、ゲル過に
はメタノールを溶剤とする関係上、セフアデツク
スLH―20が有利に使用し得る。更に高度の精製
には高速液体クロマトグラフイーが利用される。
この場合の使用カラムは逆層分配型のものが有利
に使用出来る。このようにして精製されたHK―
803物質は、そのメタノール溶液にエーテル、石
油エーテル等を加えると高純度の白色の粉末とし
て沈澱するので、これを過により採取すること
が出来る。この白色粉末を含水アルコール、含水
アセトン等により再結晶して無色結晶を得る。か
くして得られた抗生物質HK―803の理化学的性
質及び生物学的性状は次のとおりである。

〔抗生物質HK―803の理化学的性質及び生物学
的性状〕 (1) 形状：無色結晶 (2) 融点：183―186℃（分解） (3) 元素分析：炭素58.09、水素8.02 窒素 2.19、燐 3.81 (4) 比旋光度：〔α〕²⁶ _D＋66.5゜（Ｃ＝１、メタノー
ル） (5) 紫外部吸収スペクトル：メタノール中で
233mμにＥ１％ １cm516の極大吸収を示す。

(6) 赤外部吸収スペクトル：臭化カリ中、次の波
数に特徴的な吸収帯を有する。

3400，3275，2975，2950，2880，1725，1630，
1460，1385，1255，1185，1055，975，735，
555cm^-1 (7) 溶解性：メタノール、エタノール、アルカリ
水に可溶、アセトン、水に僅溶、エーテル、ク
ロロホルム、酢酸エチル、ベンゼンに難溶であ
る。

(8) pKa′：7.4，11.0（70％メチルセロソルブ中） (9) 分子量：560（滴定当量による） (10) Rf値：セルロース薄層クロマトにおけるRf
値は次のとおりである。

Rf値 ｎ―プロパノール1N NH₄OH（７：３） 0.38 ｎ―ブタノール―メタノール―水（４：１：
２） 0.37 クロロホルム―エタノール―0.1N NH₄OH
（４：７：0.5） 0.01 (11) 呈色反応：過マンガン酸カリウム溶液を脱色
する。デイトマー・レスター試薬に陽性であ
る。

(12) 塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質 (13) 抗菌スペクトル（寒天希釈法による）：以
下に示すように、広範囲の糸状菌、酵母に強い
生育阻害活性を示す。

供 試 菌 最小阻止濃度mcg／ml コクリオボラス・ミヤビアナス （稲ごまはがれ病菌） 0.5 Cochliobolus miyabeanus ピリキユラリア・オリゼ （稲いもち病菌） 0.25 Pyricularia oryzae グロメレラ・シンギユラータ （ぶどう晩腐病菌） ＜0.015 Glomerella cingulata コレトトリカム・ラゲナリウム （そ菜炭疽病菌） 0.125 Colletotrichum lagenarium ボトリテイス・シネリア （灰色かび病菌） ＜0.015 Bothytis cinerea アルタナリア・マリ （りんご斑点落葉病菌） 0.5 Alternaria mali リゾクトニア・ソラニ （稲もんがれ病菌） 8.0 Rhizoctonia solani アスパジラス・オリゼ 2.0 Aspergillus oryzae ペニシリウム・クリソゲナム 0.125 Penicillium Chrysogenum キヤンデイダ・アルビカンス 6.25 Candida albicans トリコフイトン・インタジギターレ 0.78 Trichophyton interdigitale トリコフイトン・ルブラム 0.20 Trichophyton・rubrum 以上の抗生物質HK―803物質の理化学的性質
及び生物学的性状を、既知の抗生物質と比べる
と、分子内に燐を含有する点でコママイシンＡ，
Ｂ（特公昭45―8636号）が類似物質として挙げら
れる。しかしコママイシンＡは中性物質と記載さ
れ本物質は酸性物質である点で明らかに異なる、
又、コママイシンＢは弱酸性物質と記載されてい
るが、本物質とは元素分析値に於て明らかな相違
がある。更にコママイシンＡは、アルギニン、ス
レオニン、アラニン、バリン、Ｂはアルギニン、
グルタミン酸、リジン、バリンを含有するポリペ
プチドと記載されているが、HK―803物質は、
アルギニン、グルタミン酸を全く含有しない。更
にコママイシンＡ，Ｂとは赤外線吸収スペクトル
に於ても明らかに有意な相違がみられる。従つて
本発明者らはHK―803物質を新規抗生物質と結
論した。

以下に、本発明方法を実施例によつて詳述する
が、本発明方法はこれに何ら限定されるものでは
ない。

実施例 30容積のジヤーフアーメンターにグルコース
２％、可溶性澱粉１％、肉エキス0.1％、酵母0.4
％、大豆粉2.5％、食塩0.2％、第二燐酸カリ0.005
％の組成よりなる培地18に、あらかじめ同一培
地に、前記HK―803株（微工研菌寄第6644号）
を接種して48〜72時間27℃で振盪培養した培養液
150mlを接種して27℃で48〜72時間、通気撹拌培
養を行う、最終PHは7.5〜8.0である。ジヤーフア
メンター４基分の培養液に過助剤セライトを加
えて遠心過し菌体と液とに分ける。菌体は60
％アセトン15を用いて抽出し、これを減圧濃縮
してアセトンを溜去し、８の水溶液を得る。培
養液と菌体抽出液を合わせ、ダイヤイオンHP
―10 10のカラムを通過させる、カラムは水８
、40％アセトン８を用いて洗滌後、60％アセ
トン８を用いて溶出を行う。活性区分を集め減
圧でアセトンを溜去し、水溶液をブタノール４
で２回抽出する。抽出液を減圧下に少量まで濃縮
した後、水500mlを加え、粘稠な沈澱部と上澄液
とに分ける。沈澱部は少量のメタノールに溶か
し、活性炭カラム（直径40mm、長さ300mm）にか
ける。水、30％メタノール、70％メタノール、40
％アセトン、70％アセトンの順に溶出を行うと、
活性区分は70％アセトン溶出部に現れる。活性区
分を集め、減圧濃縮して冷蔵すると、約500mgの
粗結晶が得られた。粗結晶をアセトンで洗滌し、
不溶部分を含水アルコールから再結晶して300mg
の結晶性粉末を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、HK―803物質の紫外部吸収スペク
トル（メタノール中）を示す図面であり、第２図
は、HK―803物質の赤外部吸収スペクトル
（KBr中）を示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質及び生物学的性質を有す
   る新規抗生物質HK―803。 形 状：無色結晶 融 点：183―186℃（分解） 元素分析：炭素58.09、水素8.02 窒素2.19、燐3.81 比旋光度：〔α〕²⁶ _D＋66.5゜（Ｃ＝１、メタノール） 紫外部吸収スペクトル：メタノール中で233mμに
   Ｅ１％ １cm516の極大吸収を示す。 赤外部吸収スペクトル：臭化カリ中、次の波数に
   特徴的な吸収帯を有する。 3400，3275，2975，2950，2880，1725，
   1630，1460，1385，1255，1185，1055，975，
   735，555cm^-1 溶解性：メタノール、エタノール、アルカリ水に
   可溶、アセトン、水に僅溶、エーテル、クロ
   ロホルム、酢酸エチル、ベンゼンに難溶であ
   る。 pKa′：7.4、11.0（70％）メチルセロソルブ中） 分子量：560（滴定当量による） Rf値：セルロース薄層クロマトにおけるRf値は
   次のとおりである。 Rf値 ｎ―プロパノール1N NH₄OH（７：３） 0.38 ｎ―ブタノール―メタノール―水（４：１：
   ２） 0.37 クロロホルム―エタノール―0.1N NH₄OH
   （４：７：0.5） 0.01 呈色反応：過マンガン酸カリウム溶液を脱色す
   る。デイトマー・レスター試薬に陽性であ
   る。 塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質 抗菌スペクトル（寒天希釈法による）：広範囲の
   糸状菌、酵母に強い生育阻害活性を示す。 ２ ストレプトミセス（Streptomyces）属に属
   する抗生物質HK―803生産菌を培養し、その培
   養物から新規抗生物質HK―803を分離採取する
   ことを特徴とする新規抗生物質HK―803の製造
   法。 ３ ストレプトミセス属に属する抗生物質HK―
   803生産菌がストレプトミセス属No.80―HK―803
   （Streptomyces SP.80―HK―803）である特許
   請求の範囲第２項記載の方法。