JPS5839516B2 - 新抗生物質ｔｋ−１２ａ物質及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質及びその製造法
に関するものである。

更に詳しくは、本発明はストレプトミセス（Ｓ ｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ）属に属する抗生物質ＴＫ１２Ａ物
質生産菌を培養して得られる培養物より新抗生物質ＴＫ
−１２Ａ物質を分離、採取することを特徴とする新抗生
物質ＴＫ−１２Ａ物質の製造法及び該抗生物質ＴＫ−１
２Ａ物質に係るものであり、前記ＴＫ−１２Ａ物質は既
知文献未載の新規物質である。

本発明者らは、マウス白血病細胞に対して分化誘導能を
示す新規活性物質の探索を目的として多数の土壌中より
微生物を分離し、その産生ずる二次代謝物質を分離、探
索した結果、ストレプトミセス属に属する微生物の培養
液中に文献未載の新規活性物質が産生、蓄積されること
の新たな知見を得て、ここに本発明を完成するに至った
。

以下に、本発明の新抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質及びその
製造法につ見・て詳述する。

本発明方法において用いる微生物は、新抗生物質ＴＫ−
１２Ａ物質の生産能を有するストレプトミセス属に属す
る菌種である。

その−例として、ストレプトミセス・エスピーＴ Ｋ−
１２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ、ＴＫ−１２）
（以下、単にＩＴＫ−１２株」という。

）と呼称される微生物が前記の特性を有する新菌株で、
本発明の新抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質を有利に生産する
ものであり、本発明方法に有効に利用し得る微生物とし
て挙げられる。

また、前記ストレプトミセス・エスピー・ＴＫ１２の自
然的及び人工的変異株は勿論、ストレプトミセス属に属
する菌種で、後述の新抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質（以下
、単にｒＴＫ−１２Ａ物質」という。

）の生産能を有する微生物は、すべて本発明方法におい
て使用することができる。

ＴＫ−１２株は本発明者により高知県高知市で採取した
土壌試料中より発見されたストレプトミセス属に属する
土壌放線菌であり、工業技術院微生物工業技術研究所に
昭和５５年１２月２５日に寄託され、その微生物受託番
号は、微工研菌寄第５８４５号である。

ＴＫ−１２株の菌学的性質は次の通りである。

ＣＩ）形態 イーストエキストラクト寒天培地、オートミール寒天培
地上の生育について観察を行った。

顕微鏡観察の結果、基生菌糸はよく分岐している。

気菌糸はよく着生し単軸分岐をし、螺旋糸をよく形成す
る。

電子顕微鏡による観察の結果、胞子表面にとげ状の突起
が観察された。

胞子は楕円形又は卵状をなしその大きさは１．０〜１．
６μ×０．５〜０，９μである。

（ＩＩ） 各種培地上の性質 特許庁産業別審査基準に従い各種培地を調製し接種後３
週間３０℃で培養し、観察した結果を次に記載する。

尚色調の記載に於て０内の記号はテイスクリプテイプ・
カラー・ネームズ・ディクショナリー（Ｄｅｓｃｒｉｏ
ｔｉｖｅ ＣｏｌｏｒＮａｍｅｓ Ｄｉｃｔｉｏｎ
ａｒｙ ）第４版の色名記号に従つたものである。

（１）シュークロース・硝酸寒天培地 生育：極めて良好。

周囲に拡がった生育が見られ、表面は平滑である。

裏面の色調は淡い象牙色（２ｅａ） である。

気菌糸：着生しな（・。

可溶性色素：生成しない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地生育：普通の
生育が見られ、裏面の色は明るい橙色（５ｇａ ）乃至
赤味を帯びた橙色（６１ａ ） を呈する。

気菌糸：薄く僅かに着生し、淡桃色（５ｅａ ）を呈す
る。

可溶性色素：生成しない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育二周辺に
拡がった普通の生育が見られ、裏面の色はクリーム色（
１％ｃａ ） である。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（４）無機塩・殿粉寒天培地 生育二周辺に拡がった、良好な生育が見られ、裏面の色
調は黄味を帯びた橙色（４ｉａ ）である。

気菌糸：僅かに着生し白色である。

可溶性色素：生成しない。

（５）チロシン寒天培地 生育：良好、周辺に拡がる。

裏面の色は淡黄色を呈する（３ｇｃ〜２ｃａ）。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（６）栄養寒天培地 生育：不良。

裏面の色は明るい小麦色（２ｅａ ） を呈する。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（７）イースト・エキストラクト、マルト・エキストラ
クト寒天培地 生育：周辺に拡がり、極めて良好な生育を呈し裏面の色
は明るい橙色（６ｇａ ）乃至赤味をおびた橙色（５１
ａ ） である。

気菌糸二白色をへてクリーム色（１％ｃａ ）よりオレ
ンジ色（５１ａ ） を呈する。

可溶性色素：生成しない。

（８）オートミール寒天培地 生育：周辺に拡がり、良好な生育を示し、裏面の色は橙
色（６ｉａ ）を呈する。

気菌糸：よく着生し白色より、橙色（５１ａ ）を呈す
る。

可溶性色素：生成しない。

（９）ペプトン・イーストエキストラクト・鉄寒天培地 生育：極めて悪い。

気菌糸：着生しない。

可溶性色素：生成しない。

（ＩＩＩ）生理的性質 （１）生育温度： ＴＫ１２株を２１℃、２７℃、３０℃、 ３３℃、３７℃でオートミル寒天培地上で培養した結果
、３３℃〜３７℃に於て気菌糸をよく着生し、最もよい
生育が見られた。

（２）殿粉分解カニ強い。

（３）脱脂粉乳：ペプトン仕方陽性。

（４）メラニン様色素の生育：生成しない。

（５）ゼラチン液化カニ２１℃に３週間培養した結果、
生育が見られなかった。

（６）硝酸塩還元：陰性。

（ＩＶ）各種炭素源の利用性 プリダハムによる糖料用培地（ディフコ製）に各種の糖
を添加してＴＫ−１２株を培養した結果は次の通りであ
る。

Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グリコース Ｄ−フラクトース シュークロース ｉ−イノシトール Ｌ−ラムノース ラフィノース Ｄ−マンニトール 無添加 生育 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ± ＋＋＋ ＋＋ ＋ ± 非常によく生育する。

よく生育する。

生育する。

殆んど生育しない。

ＴＫ−１２株の菌学的性質は上記の如くである。

本菌株は■スパイラルを形成する。■胞子表面はとげ状
である。

■メラニン色素を生成しない。

■菌体の色は橙色乃至桃色を呈する。■各種の糖を利用
する。

等の特徴を有する。野々村氏によるジャーナル・オブ・
フェルメンテ−ジョン・テクノロジー、５２巻２号記載
の放線菌１．Ｓ、Ｐ０株４５８株の分類法（Ｋｅｙ
ｆｏｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ １ｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ４５８５ｐｅｃｉｅ
ｓ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｎｃｌ
ｕｄｅｄｉｎ １．Ｓ、Ｐ、）及びＢ ｅｒｇｙ著Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅｂａｃ ｔｅ ｒｉ ｏｉｏ
ｇｙ第８版の分類より、ＴＫ−１２株はＳｔｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ ）に類似する。

以上記載の通りＴＫ−１２株はＳｔ、ｅｒｙｔｈｒａｅ
ｕｓと同一菌種が、極めて近縁のＳ ｔｒｅｐｔｏ ｍ
ｙｃｅｓ属に属する放線菌であると結論された。

次に、本発明を実施するに当っては、ストレフトミセス
属に属する抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質生産菌を、抗生物
質を生産する通常の方法で培養することができる。

培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的
に有利に培養するためには、前記生産菌の胞子懸濁液又
は培養液を培地に接種し、通気攪拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。

炭素源としては、殿粉、デキストリン、グリセリングル
コース、シュークロース、ガラクトース、イノシトール
、マンニトールなどが、また窒素源としてはペプトン、
大豆粉、肉エキス、米ぬか、皺、尿素、コーンステイー
プリカー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機また
は無機の窒素化合物が用いられる。

その他、無機塩類、たとえば、食塩、燐酸塩類、カリウ
ム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を
適宜に添加してもよく、必要に応じて消泡剤として、動
・植・鉱物油等を添加してもよい。

培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し
、しかもＴＫ−４２Ａ物質の生産が最高となるような条
件が選ばれる。

たとえば培地のｐＨは４〜９、特に中性付近がよく、培
養の適温は２５°〜３５℃程度がよ（・。

しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオン濃度、
培養温度、攪拌条件などの培養条件は使用する菌株の種
類や、外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節されるべきであることはいうまでもない
。

このようにして得られる培養物から、ＴＫ−１２Ａ物質
を得るには代謝産物を採取するのに通常用いられる手段
を適宜に利用して採取し得る。

たとえば、ＴＫ１２Ａ物質と不純物との溶解度差を利用
する手段吸着親和力の差を利用する手段のいずれも、そ
れぞれ単独で、または組合わせて、あるいは反復して使
用される。

具体的には、ＴＫ−１２Ａ物質は培養沢液にその大部分
が存在するが、その活性炭への吸着性の性質を利用して
、培養Ｆ液を粒状活性炭のカラムを通過させ吸着させる
ことが出来るカラムは水洗後、含水アセトン、含水メタ
ノール等を用いて１．活性物質を溶離させることが出来
る３溶出液を減圧下に濃縮し、少量の水溶液とした後、
数倍量のアセトンを加えて分別沈殿を行うと、目的物を
沈殿として得ることが出来る。

上澄液の除去により得られる組物質は更にシリカゲル、
セルロース等への吸着性を利用して、これらの吸着剤を
用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することが
出来る。

こうして精製された粉末は、互によく性質の類似した数
種の活性物質の混合物であるので、これらの成分を分離
するためには、逆層分配系のカラムを使用した高速液体
クロマトグラフィーが、効果的に利用出来る。

主要な単一の活性フラクションを分取し、凍結乾燥する
ことにより、純粋なＴＫ−１２Ａ物質の精製粉末を得る
ことが出来る。

か（して得られたＴＫ−１２Ａ物質の理化学的及び生物
学的性状は次の通りである。

〔ＴＫ−１２Ａ物質の理化学的及び生物学的性状〕 （１）元素分析値 炭素：５０．１４％、水素：５．４９％、窒素：６．０
５％ （２）分子量（ＦＤマススペクトルによる）２８ （３）融点 １９７℃以上で徐々に分解する。

（４）比旋光度 〔α） Ｄ＋１５３°（Ｃ＝０．２９、水）（５）紫外
線吸収スペクトル 第１図に示すとおり、水溶液中で末端吸収を示す。

（６）赤外線吸収スペクトル 第２図に示すとおり、臭化カリ錠剤中、次の主な極太値
を有する。

３４００．２９００，２３００．１６２０１６５０．１
１４３．１０７０．１０２０ｍ’（７）溶解性 水に易溶、メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、エ
チルエーテル、ベンゼン、ヘキサンに難溶である。

（８）呈色反応 過沃素酸−ベンジジン、過マンガン酸カリ反応は陽性で
ある。

（９）塩基性、酸性、中性の区別 弱塩基性物質 （１０） 物質の色 無色粉末 （１１）生物活性 大腸菌高感受性変異株ＢＥ １１８６に対して弱い抗
菌作用を示す。

即ち２．５■／ｍｌ！の濃度の溶液を寒天平板−ディス
ク法により検定した時に、直径１４山の阻止円を示した
。

マウス白血病細胞に対して、分化誘導作用を示す。

即ちフレンド細胞Ｂ８に対し、５■／ｒｕｌの濃度で８
７％、２．５ ｍ９７ｍｌの濃度で６７％の細胞を赤血
球に分化誘導した。

又、マウス骨髄性白血病Ｍ１に対して０．７〜１．３■
／ｒｒＬｌの濃度で、分化誘導作用を示し、リゾチーム
活性を誘導した。

以上のＴＫ−１２Ａ物質の理化学的性質及び生物学的性
質を、既知の抗生物質と比較すると、通常の微生物に対
して、抗菌活性を全く示さない点に於て、更に上述の理
化学的性状に於て一致する物質を見出し得ないので、新
規物質と結論された。

ＴＫ−１２Ａ物質は、マウス白血病細胞に対して分化誘
導作用を示し、正常細胞に誘導する作用を示すところか
ら、抗腫瘍剤としての利用が期待されるものである。

以下に、本発明方法を実施例によって詳述する。

実施例 グルコース２％、可溶性殿粉１％、肉エキス０．１％、
乾燥酵母０．４％、食塩０．２％、第二燐酸カリ０．０
０５％、大豆粉２．５％よりなる培地にＴＫ−１２株（
微生物受託番号微工研菌寄第５８４５号）を接種して９
６時間、２８℃で振盪培養した。

この培養液２８０ｍ１を同一組成の培地１６１に接種し
、ジャーファーメンタ−を用いて４８時間、２８℃で通
気攪拌培養を行った。

このときの通気量は毎分１８１１攪拌回転数は３５０
ｒｐｍであった。

この培養液を４００Ｊの同一組成の培地に接種しタンク
培養を行った。

この時の温度は２８℃、攪拌数は２００ｒｐｍ、通気量
は毎分４００１であった。

培養終了後、培養液を遠心沢過した。

培養沢液（ｐＨ７，６）に沢過助剤３５ｋｇを加えて沢
過した。

沢液及び洗液を合しく５０Ｍ）、活性炭６−を加えて一
時間攪拌後、濾過した。

水洗後、２０％アセトン６０ｔ！で２回溶出を行った。

溶出液を減圧濃縮して８１の濃縮液を得た。

これにアセトン４０Ｊを加え、放置後、上澄を捨て、沈
澱物を水に溶解して１．６１の溶液とした。

この２５０ｍ１を用いてシリカゲルのカラムクロマトグ
ラフィーを行った。

８φ×３０ｃＩｒＬのカラムを用い、クロロホルム２Ｊ
１２０％メタノール−クロロホルム２１１４０％メタノ
ール−クロロホルム２Ｊ１６０％メタノール−クロロホ
ルム３Ｊ１８０％メタノール−クロロホルム３１１ メ
タノール３Ｊを用い順次溶出を行うと、活性画分は６０
〜８０％メタノール−クロロホルムの両分約４１に亘り
溶出された。

これを減圧濃縮した後、５φ×８ｏｃＩｒＬのアビセル
セルロースカラムを用いクロマトグラフィーにより精製
した。

ブタノール−ピリジン−酢酸−水の溶剤系を用い、混合
比を（１５：１０：３：１２）、（１２：１０：３：１
２）、（８：１０：３：１２）と順次変えて各２１を用
いて展開溶出を行うと、活性画分は（１２：１０：３：
１２）溶出部約１１に亘って溶出された。

これを減圧濃縮し１５０ｒｒＬｌとし、これにアセトン
３００ｍ１、エーテル４００−を加え、沈澱させた。

沈澱を戸取しエーテルで洗滌し乾燥して３７．２Ｐの粗
粉末を得た。

これを更に精製するために４φ×４５ｃｒｆＬの粒状活
性炭カラムを用いクロマトグラフィーを行った。

水２１．１０％アセトン水２１．２０％アセトン水２１
．４０％アセトン水２１を用いて順次溶出すると１０〜
２０％アセトンの画分、約１．５１に亘って活性画分が
溶出された。

これを減圧濃縮し１１０ｍ１とし、これにアセトン４４
０ｒｒＬｌ、エーテル１５０ＴＩ′Ｌｌを加えて沈澱な
沢取、乾燥して１７．２１の粉末を得た。

この粉末は互によく似た成分よりなる混合物であり、各
成分を単離するために、ヌークレオシル５Ｃ１８のカラ
ム（８φＸ３００ｍｍ）を用いて高速液体クロマトグラ
フィーを行った。

溶剤として水を用い、２．５１の試料を用い、数十回の
反復操作により、保持時間２８分（流速：１ｍ１１分）
の両分から１７８■の精製粉末を得た。

これを更に１％メタノール水を用いて同じカラムで再ク
ロマトを行い、保持時間２７分の画分を集め濃縮、凍結
乾燥することにより３０■のＴＫ１２Ａ物質の精製粉末
を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴＫ−１２Ａ均質の水溶液での紫外部吸収スペ
クトルを示し、第２図はＴＫ−１２Ａ物質の臭化カリ錠
剤による赤外部吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質及び生物学的性質を有すること
   を特徴とする新抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質。 （１）元素分析値 炭素：５０．１４％、水素：５．４９％、窒素：６．０
   ５％ （２）分子量（ＦＤマススペクトルによる）４２８（３
   ）融点 １９７℃以上で徐々に分解する。 （４）比旋光度 〔α）Ｄ＋１５３°（Ｃ＝０．２９、水）（５）紫外線
   吸収スペクトル 水溶液中で末端吸収を示す。 （６）赤外線吸収スペクトル （臭化カリ錠剤中の主な極太値）３４００．２９００．
   ２３００，１６２０−１６５０．１１４３．１０７０．
   １０２０ＣＩｒＬ−１（７）溶解性 水に易溶、メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、エ
   チルエーテル、ベンゼン ヘキサンに難溶である。 （８）呈色反応 過マンガン酸カリ、過沃素酸−ベンジジン反応は陽性で
   ある。 （９）塩基性、酸性、中性の区別 弱塩基性物質 ■ 物質の色 無色粉末 （１］）生物活性 大腸菌高感受性変異株に対して弱い抗菌作用を示す他、
   マウス白血病細胞に対して分化誘導作用を示す。 ２ ストレプトミセス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   ）属に属する抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質生産菌を培養し
   、その培養物から新抗生物質ＴＫ−１２人物質を分離、
   採取することを特徴とする新抗生物質ＴＫ１２Ａ物質の
   製造法。 ３ ストレプトミセス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   ）属に属する抗生物質ＴＫ−１２Ａ物質生産菌がストレ
   プトミセス・エスピー・ＴＫ−１２（Ｓ ｔｒｅｐｔｏ
   ｍｙｃｅｓ ｓｐ、 ＴＫ−１２）である特許請求の範
   囲第２項記載の製造法。