JPS6241516B2

JPS6241516B2 -

Info

Publication number: JPS6241516B2
Application number: JP54135884A
Authority: JP
Inventors: Makoto Okaji; Isao Kawamoto; Tomoyasu Sato; Tetsuo Oka; Kimikatsu Shirahata; Takao Iida; Noriaki Hirayama; Makoto Morimoto; Ryoji Imai
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1979-10-23
Filing date: 1979-10-23
Publication date: 1987-09-03
Also published as: JPS5659777A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規抗性物質XK−213およびその製造
法に関する。本発明者らは放線菌の産生する新抗
生物質を検索中、土壌より分離された放線菌、ス
トレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.
）MK−213が細菌ならびに腫瘍細胞の増殖を阻
止する新抗生物質XK−213を産生すること、およ
び該菌株が新菌株であることを見出し本発明を完
成するに到つた。本発明の抗生物質XK−213の理化学的性状はつ
ぎのとおりである。 (1) 外解：白色粉末または白色結晶 (2) 融点：約260℃（分解） (3) 元素分析値（実験値、％）： C53.8 H4.0 N6.3 (4) PMR（CD₃OD）δ（ppm）： 295〜3.25（2H）、5.99（1H、ｔ、Ｊ＝1.5）、
6.22（1H、ｄ、Ｊ＝5.9、6.28（1H、ｄ、Ｊ＝
5.7）、6.45（1H、dd、Ｊ＝3.8、5.7） (5) CMR（DMSO−d₆）δ（ppm）： 171.8、161.8、142.7、141.7、133.2、105.7、
96.4、83.8、47.8、40.3 (6) マススペクトル

【表】 (7) 分子式：元素分析値、核磁気共鳴およびマス
スペクトルによる観測からC₁₀H₉NO₅と決定さ
れた。 (8) 比旋光度：〔α〕^２５ _Ｄ−400゜（Ｃ＝0.1、メタ
ノール） (9) 紫外部吸収スペクトル：メタノールに溶解し
て測定したスペクトルは第１図に示すとおり
で、極大吸収値は238ｍμ（中性（実線）およ
び酸性（一点鎖線））および246ｍμ（アルカリ
（性二点鎖線））である。 (10) 赤外線スペクトル（KBr）ν^ｃｍ−１ _ｎａｘ 3500、3300、1740、1685、1650、1600、
1400、1360、1325、1285、1270、1110、1090、
1065、1020、1005、915、840、785、770 なお、同スベクトルを第２図に示す。 (11) 溶解性：水、メタノール、ジメチルホルムア
ミドに可溶。酢酸エチル、エチルエーテル、ｎ
−ヘキサンに不溶。 (12) 呈色反応：ニンヒドリン、疑陽性以上の理化学的性質から抗生物質XK−213（以
下単にXK−213という場合がある）の構造はつぎ
のように決定された。なお、上記構造はＸ線回折法による分析の結果
からも確認された。かかる構造の化合物についての報告は抗生物質
をはじめとし一般の化合物についてもなされてお
らず、XK−213は新規化合物である。 XK−213はペーパークロマトグラフイーを行う
とつぎのようなRf値を与える。展開溶媒 Rf値 (1) 水飽和ｎ−ブタノール 0.36 (2) ｎ−ブタノール：酢酸：水（３：１：１）
0.48 (3) 水飽和酢酸エチル 0.00 紙：東洋紙No.51（２×40cm）展開：28℃、上昇法、1.2は15時間、３は４時
間つぎにXK−213の生物活性について述べ
る。寒天稀釈法（PH7.0）で測定した各種被検菌に
対する最少増殖阻止濃度（MIC）はつぎのとおり
である。

【表】またXK−213の抗腫瘍活性の一例を示すとつぎ
のとおりである。抗腫瘍活性はマウスにＰ−388
細胞を腹腔内に10⁶個移殖し、翌日XK−213を一
回腹腔内に投与した。抗生物質を投与されなかつ
た群のマウスの生存日数（Ｅ_p）に対する、XK−
213の投与された群の生存日数の延長日数（ｅ）
をもつて効果の判定を行つた。

【表】このようにXK−213は各種の病原菌に対して弱
い抗菌活性を有すると同時にＰ−388腫瘍に対し
て顕著な治療効果を示すことが判明した。この結
果からXK−213は、それ自体医薬用の抗生物質又
は抗腫瘍剤として有用な物質であるのみならず、
さらに効力の高い誘導体に変換すべき原料物質と
しての利用も期待できるので有用な物質である。つぎにXK−213の製造方法について述べる。 XK−213はストレプトミセス属に属するXK−
213生産菌株を栄養培地に培養し、培養中にXK−
213を生成せしめ、該培養物からXK−213を採取
することにより得られる。本発明で使用する菌株はストレプトミセス属に
属し、XK−213生産能をする菌株であればいずれ
の菌株でも使用可能であるが、代表的菌株はスト
レプトミセス・エスピーMK−213である。次にMK−213株の菌学的性質を示す。形態的特徴本菌株は、イースト麦芽寒天培地、スターチ
無機塩寒天培地、オートミル寒天培地上で良好
な生育を示し、その基生菌糸の色は黄土色から
こげ茶色を呈する。また気中菌糸の着生は豊富
であり、その色は白色から灰色ないし灰緑色も
しくは灰青色を呈する。気中菌糸を光学顕微鏡
により観察すると、その分枝法は単純分枝をな
しその先端に多くの場合10個以上の胞子を着生
し、胞子柄の形態はラセン状（スパイラル）で
ある。胞子の形態は球型ないしやや丸味がかつ
た卵型であり、その大きさは（0.8〜1.2μ×0.8
〜1.2μ）である。電子顕微鏡観察による胞子
の表面は比較的長いとげ状（スピニイ）を呈
し、鞭毛や胞子嚢及び菌核の形成などは認めら
れない。各種寒天培地上での生育状態第１表に示す。

【表】

【表】以上は、30℃、２週間後の観察結果である。
また色の表示は、Color Harmony Mannal
（Container Corporation of America）による
色の分類に従つたものである。細胞壁構成アミノ酸の一つジアミノピメリン
酸（Diaminopimelic acid）の分析ジアミノピメリン酸をアブライド・ミクロバ
イオロジー（Applied Microbiology）12：
p.421〜423（1964）記載の方法で分析した結
果、本菌株の細胞壁中に含まれるジアミノピメ
リン酸は、LL−２・６−ジアミノピメリン酸
であつた。生理的諸性質１炭素源の資化性（プリドハム・ゴツドリー
プ寒天培地）Ｄ−グルコース、Ｄ−ラフイノース、Ｌ−
ラムノース、Ｄ−マンニトール、ｉ−イノシ
トール、サツカロース、Ｄ−フラクトースを
資化するが、Ｄ−アラビノースは資化せず、
Ｄ−キシロースの資化力は微弱であつた。２ゼラチンの液化作用：あり（弱い）３スターチの加水分解作用：あり４脱脂乳のペプトン化作用：あり（弱い）５脱脂乳の凝固作用：なし６メラノイド様色素の生成：あり７至適生育温度：27℃〜30℃ 以上は30℃、２週間後の観察結果である。た
だし、２のゼラチンの液化作用は20℃、３週間
後、４および５の脱脂乳に対する作用について
は30℃、３週間後、７の至適生育温度は、５日
後の結果である。同定以上のように本菌株MK−213株は、寒天培
地上で真正気中菌糸を形成し、その分枝法は単
純分枝をなし、その先端に胞子を着生する。ま
た鞭毛や胞子嚢および菌核などを形成せず、細
胞壁にLL−２・６−ジアミノピメリン酸を含
む。このような性質から本菌株はストレプトム
セス属に属する菌株であることは明らかであ
る。ストレプトミセス・エスピーMK−213は、
各種寒天培地上での気中菌糸の色からみて、緑
色ないし青色シリーズの菌株であり、胞子柄の
構造からスパイラル・セクシヨンに属する菌株
である。また本菌株はその着生する胞子の表面
が比較的長いスピニイを示し、チロシン寒天培
地上でメラノイド様色素の生成が認められるク
ロモゲニツク（Chromogenic）タイプの菌株で
ある。そこでこれらの性質をともに、MK−213株
の近縁菌株をInternational Journal of
Systematic Bacteriology Vol.18、No.2p.69−
189（1968；Vol.18、No.4p.279−392（1968）；
Vol.19、No.4p.391−512（1969）；Vol.22、No.
4p.265−394（1972）；ワツクスマン
（Waksman）著、「ジ・アクチノミセテス
（The Actinomycetes）」Vol.2；バージーズ・
マニユアル・オブ・デターミナテイブ・バクテ
リオロジー第８版に記載されている既知菌株の
中から探索した結果、以下に示す11株が挙げら
れる。即ち、1.ストレプトミセス．コエルレオ
ルビダス（S.coeruleorubidus）、2.ストレプト
ミセス・コエルレオフスカス（S.
coeruleofuscus）、3.ストレプトミセス・ビカ
ラー（S.bicolor）、4.ストレプトミセス・チヤ
ートリユーシス（S.chartreusis）、5.ストレプ
トミセス・コエルレツセンス（S.
coerulescens）、6.ストレプトミセス・ラナタ
ス（S.lanatus）、7.ストレプトミセス・キユラ
コイ（S.curacoi）、8.ストレプトミセス・ベラ
ス（S.bellus）、９・ストレプトミセス・シア
ネウス（S.cyaneus）、10.ストレプトミセス・
インジゴカラー（s.indigocolor）、11.ストレプ
トミセス・ヴイリドクロモゲネス（S.
viridochromogenes）である。更にこれらの菌
株とMK−213株とを詳細に比較してみると、
１の菌株は裏面の色の相違およびイースト麦芽
寒天培地、グリセロール・アスパラギン寒天培
地上で赤色の色素を生成する点でMK−213株
と異なる。また、２、４、５、６、７の５株は
メラノイド様色素の生成以外に可溶性色素を生
成しないことからMK−213株とは異なり、３
の菌株はグリセロール・アスパラギン寒天培
地、スターチ無機塩寒天培地、オートミル寒天
培地、イースト麦芽寒天培地でMK−213株と
は異なる黄色の色素を産生することからこの菌
株もMK−213株とは異なる。８の菌株は、MK
−213株が可溶性色素を産生するスターチ無機
塩寒天培地よびオートミル寒天培地で色素を生
産せず裏面の色もMK−213株とは異なる。ま
た９、10の２菌株は、スターチ無機塩寒天培
地、オートミール寒天培地、イースト麦芽寒天
培地上で青色から紫色のPH感受性の可溶性色素
を生成する点でMK−213株とは異なる。また、11のS.viridochromogenesとの比較で
も、11の菌株は裏面の色素がPH感受性であるの
に対しMK−213株のそれはPH非感受性であ
り、11の菌株がオートミール寒天培地で緑色の
色素を産生しかつそれがPH感受性であるのに対
し、MK−213株はグリセロール・アスパラギ
ン寒天培地上でオリーブ色のPH感受性ではない
色素を生産することから両者は異なる菌株であ
る。以上から、緑色から青色の気中菌糸を形成し、
その胞子柄がスパイラルで着生する胞子表面が比
較的長いスピニイを呈し、クロモゲニツク・タイ
プの菌株で、グリセロール・アスパラギン寒天培
地上で特徴的なオリーブ色のPH非感受性の色素を
生成するという性質をもつ本菌株MK−213株と
一致する菌株は見い出せなかつた。よつてMK−213株を新種と見なし、成熟した
胞子の形態がウニに似ていることから、MK−
213株を、ストレプトミセス・エチノスポラウス
（Streptomyces echinosporus）MK−213と命名
した。このストレプトミセス・エチノスポラウス
MK−213は、工業的技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌第5229号として、またARS
Culture Collection Research Fermentation
Laboratory（U.S.A.）にNRRL125055として寄託
されている。本菌は他のストレプトミセス属の菌に於てもし
ばしば認められるように、その性状が変化しやす
く、たとえば紫外線、放射線、化学変異誘起剤な
どを用いた人工的変異手段で容易に変異し得るも
のであり、こうして得られた人工変異株あるいは
自然変異株であつても抗生物質XK−213を生産す
る能力を有するものであればすべて本発明に使用
することができる。つぎにXK−213の製造における菌株の培養につ
いて述べる。すなわちストレプトミセス属に属す
るXK−213生産菌株の培養においては通常の放線
菌の培養法が用いられる。栄養培地としては資化し得る炭素源、窒素源、
無機物などを適当含有する限り、天然培地、合成
培地いずれでも使用可能である。炭素源としては葡萄糖、デキストリン、澱粉、
シユークロース、グリセリン、糖蜜などが単独
で、あるいは組合せて用いられる。さらに菌の資
化性によつては炭化水素、アルコール類、有機酸
なども用い得る。窒素源としては無機もしくは有
機窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ソー
ダなど、窒素含有天然物、例えばペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、乾燥酵母、コーンステイープ
リカー、大豆粉、ソリユブルベジタブルプロテイ
ン、綿実粕どが単独または組合せて用いられる。
その他必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシ
ウム、燐酸塩、植物油、動物油などの無機物、有
機物を加えるほか、本菌の生育やXK−213の生産
を促進する物質を添加することもできる。培養は好気的条件下での液体培養、例えば振盪
培養、深部撹拌培養によつて行われるが、深部撹
拌培養がもつとも適している。培養温度は25〜40
℃であるが多くの場合27〜30℃付近で培養する。
培養PHは４〜10、特に５〜９が望ましい。かくし
てXK−213の生産量は培養日数２〜５日で最高に
達し目的物質は大部分が培養液中に生成蓄積され
る。培養物中の抗生物質の蓄積量が最大になつた
時に培養を停止し、培養液中から目的物質を単離
精製する。培養液中からXK−213を回収するためには、一
般に微生物代謝生産物をその培養液から回収する
方法が適される。とくに本発明の場合にはXK−
213が活性炭素に吸着される性質を利用するのが
有利である。つぎにその一例を示す。醗酵を終了した培養液
に珪藻土などの過助剤を加え、菌体および培養
物中の固型物を別し清澄な培養液を得る。こ
の培養液に活性炭素粉末を加えよく撹拌すると
目的物質は活性炭素に吸着される。そこで別し
て活性炭素を水洗し、液ならびに水洗液は廃棄
する。活性炭素粉末からのXK−213の溶出には
種々の方法が用いられるが、たとえば80％−水性
アセトンによる溶出も有効である。すなわち水洗
した活性炭素を80％−水性アセトン中に懸濁し撹
拌すると目的物質はアセトン溶液中に遊離してく
る。そこで別して活性炭素を除き、該活性炭素
を再び同一の抽出操作に付すと目的物質はほとん
ど完全に回収することができる。XK−213の精製
には本物質の特性を利用した種々の方法を用いる
ことができる。すなわちセルロースカラムクロマ
トグラフイー、シリカゲルカラムクロマトグラフ
イー、セフアデツクスLH−20カラムによる精製
あるいは溶解性を利用した沈澱、析出法などを、
単独あるいは組合せて用いることができる。通常
は本物質は結晶性の良好な物質であるので、活性
炭素からの水性アセトンによる溶出液を濃縮し、
濃縮液を冷所に放置するだけで純粋な結晶として
得ることができる。しかしながら、微量の不純物
が含まれている場合には、濃縮した活性炭素の溶
出液を50％の水性メタノールで懸濁しカラムに充
填したセフアデツクスLH−20に通し、同じく50
％水性メタノールで溶出する。目的物質は混在す
る色素等の不純物と分画して溶出されてくるの
で、目的物質の含まれる画分を集め減圧下で濃縮
して、濃縮液を冷所に保存する。結晶状沈澱物と
して生成するXK−213を別し、少量の冷水で洗
滌したあと水溶液中から再結晶させると抗生物質
XK−213の純粋な白色結晶を得ることができる。つぎに本発明の実施例を示すが、これは単なる
一例示であつて何ら本発明を限定するものではな
い。実施例１種菌としてストレプトミセス・エチノスポウラ
ス（Streptomyces echinosporus）MK−213株
（微工研菌5229号）（NRRL12055）を用い、第一
種培地としてデキストリン１ｇ／dl、グルコース
１ｇ／dl、酵母エキス0.5ｇ／dl、ポリペプトン
0.5ｇ／dl、炭酸カルシユーム0.1ｇ／dl（蒸煮前
PH7.0）の培地を用いた。種菌一白金耳を50ml容
大型試験管に入れた上記の種培地15mlに植菌し、
30℃で３日間振盪培養する。その種培養液10mlを
300ml容エルレンマイヤーフラスコに入つた30ml
の第二種培地に加える。第二種培地の組成は第一
種培地の組成と同一である。第二種培養は30℃で
２日間振盪培養する。この種培養液30mlを２バ
ツフル付エルレンマイヤーフラスコに入つた300
mlの第三種培地に加える。第三種培地の組成は第
一種培地の組成と同じである。第三種培養は30℃
で５日間振盪培養する。この第三種培地0.9
（フラスコ３本分）を30容のステンレススチー
ル製ジヤーフアーメンター中の主醗酵培地15に
加える。主醗酵培地の組成はソルブルベジタブル
プロテイン２ｇ／dl、乾燥酵母１ｇ／dl、
KH₂PO₄0.3ｇ／dl、Na₂HPO₄・12H₂O0.2ｇ／
dl、グリセリン２ｇ／dl、MgCl₂0.5ｇ／dl（蒸
煮前PH6.5）の組成である。主醗酵は30℃で４日
間通気撹拌方式（回転数350r.p.m.通気量15／
min）により行う。かくして得られた培養物に
過助材としてラジオライト＃600（昭和化学工業
KK製）を約１Kg加え菌体ならびに培養物中の固
型物を別する。得られた培養液に活性炭素60
ｇを加え15分間撹拌する。その後過により活性
炭素を分離し、約５の水で水洗する。水洗した
活性炭素は１の80％−水性アセトン中に懸濁し
15分間撹拌し、その後過して液を得る。一
方、活性炭素は再び１の80％−水性アセトン中
に懸濁し、15分間撹拌した後、過して液を得
る。上記の２回分の液を合わせ減圧下で約100
mlまで濃縮し、５℃で一晩放置すると結晶が生ず
るので過し、得られた結晶を少量の冷水で洗滌
し、デシケータ中で乾燥して白色のXK−213の
5.4ｇを得た。実施例２生産菌の培養は実施例１に示した方法と同一の
方法で行なつた。得られた培養物を実施例１と同
じ方法で過し培養液を得る。これを活性炭素
500mlを充填したガラスカラムに通し、目的物質
を活性炭素カラムに吸着させる。その後２の水
でカラムを洗滌し、流出液ならびに洗液は廃棄す
る。ついで約２の80％−水性アセトンでカラム
を溶出し、溶出液を20mlずつ分取する。得られた
溶出画面をプロテウス・ブルガリスATCC6897を
被検菌とするペーパーデイスクアツセイにより検
査し、同菌に阻止円を示す画分を集める。この溶
出液を減圧下で20mlまで濃縮し、50％−水性メタ
ノールに懸濁しガラスカラムに充填した300mlの
セフアデツクスLH−20（フアルマシア社製）に
通塔する。ついで同じく50％−水性メタノールで
溶出し、溶出画分を15mlずつ分取する。得られた
溶出画分を上記に同じペーパーデイスクアツセイ
で検査し、阻止円を示す画分を合わせて、減圧下
で20mlまで濃縮する。この濃縮液を５℃に一晩放
置すると白色結晶が生ずるので、これを別し、
少量の冷水で洗滌したあと蒸留水中から再結晶を
行なつてXK−213の白色結晶2.5ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質XK−213の紫外部吸収スペク
トルを示し、第２図は抗生物質XK−213の赤外部
吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１式〔〕で表わされる新規物質XK−213。２ストレプトミセス属に属するXK−213生産菌
株を栄養培地に培養し、培養物中にXK−213を生
成せしめ、該培養物からXK−213を採取すること
を特徴とするXK−213の製造法。