CN1243004C - 三环缩醛内酯素及其制备方法和用途 - Google Patents

三环缩醛内酯素及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及三环缩醛内酯素及其制备方法和用途。本发明用白浅灰链霉菌生产全新化学骨架结构的三环缩醛内酯素类化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂。

Description

三环缩醛内酯素及其制备方法和用途
技术领域：
本发明涉及三环缩醛内酯素类化合物、用白浅灰链霉菌制备三环缩醛内酯素类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
微生物发酵产物或植物材料中具有细胞周期抑制、细胞凋亡诱导或抗肿瘤活性的化合物已在文献[长田裕之等，新规物質トリプロスタチン、その裂造法、細胞周期阻害剤おょび抗腫瘍剤，日本专利，公開特許広報(A)，特開平9-59275，公告日平成9年(1997年)3月4日；长田裕之等，新规物質アセトフタリジン、細胞周期阻害剤おょび抗腫瘍剤，日本专利，公開特許広報(A)，特開平9-87269，公告日平成9年(1997年)3月31日]及文献[崔承彬等，咔唑生物碱类细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂及其制备，中国专利CN1309964A；崔承彬等，咔唑生物碱类抗癌药物及其制备，中国专利CN1357327A]中曾有报道。但以上这些文献所报道的化合物的化学结构属咔唑类等不同母体结构。
发明内容：
本发明旨在提供一种全新化学骨架结构的具有细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的化合物。
本发明人通过坚韧不拔的努力，发现了全新化学骨架结构的三环缩醛内酯素(tricyclacetalactonin)类新化合物，如式I所示：
Figure C20031011555500031
                                        式I
式I中，R1为氨基或羟基；R2为羟基、氨基或氢。
其结构特征是：分子骨架结构是由一个五元碳环和两个六元氧杂环组成的三环骨架结构，其中，五元碳环是结构的基本碳骨架，一个六元氧杂环是由该五元碳环上的一个醛基通过与该醛基的邻位一个侧链碳上的烯醇羟基缩合形成的一个缩醛烯醚类六元氧杂环，而另一个六元氧杂环则是由该醛基经与烯醇羟基缩合产生的半缩醛羟基与连在五元碳环上的一个羧基上的羟基进一步缩合形成的一个缩醛内酯类六元氧杂环，在上述三环骨架结构的不同位置上连接不同的取代基，
本发明采用丽丝胺罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)法和流式细胞术结合显微镜下检测细胞形态特征的方法，测试了式I化合物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞、人慢性髓性白血病K562细胞及人大肠癌HCT-15细胞的细胞增殖抑制、细胞周期抑制和细胞凋亡诱导以及对该细胞的直接杀伤等作用。实验证实，式I化合物对肿瘤细胞可通过抑制细胞周期周转、诱发癌细胞凋亡或直接的杀伤等方式，显示抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性，从而发挥其抗肿瘤作用。
因此本发明的式I化合物可用作细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂、或肿瘤细胞杀伤剂。
式I化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。
式I化合物还可作为抑制细胞周期或诱发细胞凋亡的低分子生物探针用于生命科学研究。当把式I化合物作为细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂用于生命科学研究时，可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
本发明的式I化合物可通过发酵培养能够生产三环缩醛内酯素的微生物，获取含有三环缩醛内酯素类化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化而得到。
所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析、薄层层析及重结晶等。
所述能够产生三环缩醛内酯素的微生物包括链霉菌属产素菌等，如链霉菌属的白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)。
在本发明的一个实验例中，所用产素菌是从青岛近海海泥样品中分离得到的，经分类学研究鉴定为白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)的A2-2002株。该菌株已于2003年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号：CGMCC1005)。该白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)A2-2002CGMCC 1005株具有如下微生物菌学特征：
1各种培养基上的培养特征和形态特征
培养特征  在高氏合成一号琼脂、蔗糖察氏琼脂、甘油天门冬素琼脂、克氏合成1号琼脂、无机盐淀粉琼脂、燕麦粉琼脂、马铃薯浸汁琼脂等7种培养基上28℃培养7-12天后观察菌丝体的颜色和色素的产生等情况，有关特征见表1。
            表1 A2-2002菌株在7种培养基上的培养特征
  培养基   气生菌丝   基内菌丝   可溶性色素
  高氏合成一号琼脂蔗糖察氏琼脂甘油天门冬素琼脂克氏合成1号琼脂无机盐淀粉琼脂燕麦粉琼脂马铃薯浸汁琼脂   白浅灰色白浅灰色灰白色灰白色灰白色灰白色灰白色   浅黄褐橄榄褐杏仁黄象牙黄棕褐色淡黄色污褐色   无无无无浅褐色淡黄色淡褐色
形态特征  在高氏合成一号琼脂和蔗糖察氏琼脂上28℃插片培养7～10天后，取插片用光学显微镜和电子显微镜进行菌丝体的形态观察，结果观察到菌株的基内菌丝体无横隔，不断裂；气生菌丝体生长丰茂；孢子丝紧密和松敞螺旋形；孢子卵圆形，表面粗糙带疣(光学显微镜照片和电子显微镜照片略)。
2化学分类学特征
胞壁化学组分分析  按照Hasegawa的薄层层析(TLC)法进行了全细胞水解液DAP(二氨基庚二酸)氨基酸和糖型分析，结果表明，A2-2002菌株全细胞水解液含有LL-DAP(左旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，甘氨酸；无特征性糖(糖型C)。细胞壁化学组分属于I型。
3生理生化特征
参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.IV的内容对菌株进行了生理生化鉴定。A2-2002菌株的生理生化特征见表2。
         表2 A2-2002菌株的生理生化特征
  特征   结果   特征   结果
  D-葡萄糖D-麦芽糖L-阿拉伯糖D-木糖   +++-   明胶液化牛奶凝固牛奶胨化淀粉水解   +-++
  D-果糖蔗糖鼠李糖肌醇乳糖D-甘露醇棉子糖     -+--++- 硝酸盐还原纤维素上生长H2S产生酪氨酸酶产生类黑色素产生     +----
由上述试验结果，根据形态特征与细胞壁化学组分相结合定属的原则，A2-2002菌株的基内菌丝体无横隔、不断裂；孢子丝螺旋形，孢子表面粗糙带疣，细胞壁化学组分I型，属于链霉菌属(Streptomyces)。根据培养特征和生理生化特征定种的原则，A2-2002菌株的气生菌丝白浅灰，灰白色调，基内菌丝浅黄，褐色调，综合生理生化特征的实验结果均与白浅灰链霉菌十分相似，故A2-2002菌株定名为白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)。
需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产三环缩醛内酯类化合物的链霉菌属微生物，只要能生产三环缩醛内酯素类化合物的链霉菌属微生物均可用作产素菌用于制备式I化合物。
附图说明：
图1是化合物I在甲醇中的紫外吸收光谱；
图2是化合物I的红外吸收光谱(KBr)；
图3是化合物I在氘代吡啶中的1H核磁共振谱；
图4是化合物I在氘代吡啶中的13C核磁共振谱；
图5是化合物I的单晶X线衍射晶体结构；
图6是化合物II在甲醇中的紫外吸收光谱；
图7是化合物II的红外吸收光谱(KBr)；
图8是化合物II在氘代吡啶中的1H核磁共振谱；
图9是化合物II在氘代吡啶中的13C核磁共振谱；
图10是小鼠乳腺癌tsFT210细胞经不同浓度的化合物I处理17小时后测得的流式细胞直方图。左上图为空白对照组，其余五个为不同浓度的化合物I(浓度见每个图右上方)处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
图11是人慢性髓性白血病K562细胞经不同浓度的化合物I处理24小时后测得的流式细胞术直方图。左上图为空白对照组，其余五个为不同浓度的化合物I(浓度见每个图右上方)处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
图12是人大肠癌HCT-15细胞经不同浓度的化合物I处理24小时后测得的流式细胞术直方图。左上图为空白对照组，其余五个为不同浓度的化合物I(浓度见每个图右上方)处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
图13是小鼠乳腺癌tsFT210细胞经不同浓度的化合物II处理17小时后测得的流式细胞直方图。左上图为空白对照组，其余五个为不同浓度的化合物II(浓度见每个图右上方)处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
图14是人慢性髓性白血病K562细胞经不同浓度的化合物II处理24小时后测得的流式细胞术直方图。左上图为空白对照组，其余五个为不同浓度的化合物II(浓度见每个图右上方)处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
图15是人大肠癌HCT-15细胞经不同浓度的化合物II处理24小时后测得的流式细胞术直方图。左上图为空白对照组，其余五个为不同浓度的化合物II(浓度见每个图右上方)处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
具体实施方式：
在如下的实施例中所指的化合物I的化学结构是：式I化合物，其中R1为氨基；R2为羟基；化合物II的化学结构是：式I化合物，其中R1为氨基；R2为氢：
Figure C20031011555500071
                            式I
          式中，阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位。
实施例1  化合物I的发酵生产及分离精制
1发酵生产
产素菌的发酵培养  按培养微生物的常规方法，取白浅灰链霉菌Streptomycesalbogriseolus A2-2002株适量，接种到高氏合成1号琼脂固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株适量，接种到一个含100毫升种子培养液[培养基组成(克/升)：葡萄糖20.0，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，牛肉膏3.0，玉米浆3.0，酵母膏10.0，淀粉10.0，CaCO3 2.0，pH7.0]的三角烧瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得白浅灰链霉菌的种子培养液。取该种子培养液适量，按5％接种量分别接种于100个内装100毫升生产培养液[培养基组成(克/升)：葡萄糖20.0，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，牛肉膏3.0，玉米浆3.0，酵母膏10.0，淀粉10.0，CaCO3 2.0，pH7.0]的三角烧瓶中，装载于28℃、120转/分钟摇床上进行为期7天的生产发酵，获得含有取代三环缩醛内酯类目标化合物的白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolusA2-2002株的发酵培养物约10升。
2含化合物I的菌体粗提物的制备
将白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株的发酵培养物(约10升)抽滤，弃滤液，得到菌体830克。将该菌丝体用1.5升80％丙酮水溶液浸泡并在室温下搅拌过夜提取，4000转/分钟离心15分钟，取上清液，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得含化合物I的菌丝体粗浸膏(2.5克)。
3化合物I的分离精制
取含化合物I的白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株发酵培养物的菌丝体粗浸膏(2.5克)，用10毫升氯仿-甲醇(9∶1)混合溶剂溶解后加10克200-300目硅胶G(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，上到装填有30克青岛海洋化工集团公司产薄层层析用硅胶G的玻璃减压柱上，以石油醚-氯仿-甲醇混合液为洗脱溶剂系统，进行减压柱层析，洗脱溶剂的极性通过分别加大石油醚中氯仿的用量或氯仿中甲醇的用量来梯度递增，每个流份分别为50毫升，经薄层层析检测，进行合并，共得到14个组份，即Fr-1(20毫克，石油醚洗脱物)，Fr-2(65毫克，石油醚-氯仿1∶1洗脱物)，Fr-3(120毫克，石油醚-氯仿1∶1洗脱物)，Fr-4(260毫克，氯仿及氯仿-甲醇99∶1洗脱物)，Fr-5(70毫克，氯仿-甲醇99∶1洗脱物)，Fr-6(80毫克，氯仿-甲醇99∶1→98∶2洗脱物)，Fr-7(90毫克，氯仿-甲醇98∶2洗脱物)，Fr-8(150毫克，氯仿-甲醇97∶3洗脱物)，Fr-9(124毫克，氯仿-甲醇97∶3→96∶4洗脱物)，Fr-10(190毫克，氯仿-甲醇96∶4洗脱物)，Fr-11(108毫克，氯仿-甲醇95∶5洗脱物)，Fr-12(252毫克，氯仿-甲醇94∶6→90∶10洗脱物)，Fr-13(250毫克，氯仿-甲醇90∶10→60∶40洗脱物)，Fr-14(93毫克，氯仿-甲醇50∶50→100∶0洗脱物)。继而，采用温敏型小鼠乳腺癌tsFT210细胞的流式细胞术结合形态学检测的筛选模型，以细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及细胞坏死活性为抗癌指标，检测每个组份的活性，确定了Fr-11具有相关生物活性，从而得到含化合物I的层析组份Fr-11(108毫克)。在减压回收溶剂的过程中，组份Fr-11给出化合物I的淡黄色粗结晶，经在甲醇中反复重结晶精制，得到化合物I纯品无色透明粒状晶体49毫克。
化合物I  无色透明方晶，mp 236.9-237.9℃，[α]D 27-377.9°(c 1.0，MeOH)，分子式C10H9NO5，TOF-MS m/z：224[M+H]+，246[M+Na]+；Positive HR-TOF-MS m/z：实测值224.0585[M+H]+，计算值224.0559(C10H10NO5[M+H]+)；Negative HR-TOF-MS m/z：实测值222.0379[M-H]-，计算值222.0402(C10H8NO5[M-H]-)。UVλmax nm(logε)in MeOH：219(3.99)，末端吸收。IRνmax cm-1(KBr)：3437(NH)，3314，3184(OH)，3095，3002(olefin protons)，2947(methine protons)，1746(lactone carbonyl)，1690(amide I absorption，-CON＜)，1654，1602(amide II absorption，NH2)，1406(C＝C)，1324，1181(＝C-O)，1136，1115，1097(C-O)，1004，953(m)，937(m)，917(vs)，847(m)，791(m)，775(m)，697(m)，675(m)，642(m)，576(s)，530(m)，419(m)。1H及13C NMR数据见表3。
          表3化合物I在氘代氯仿中的600MHz 1H和150MHz13C NMR数据a)
  位置标号   δH(Jin Hz)   1H-1H COSYb)   δC   HMBCc)
  12345678910N-HaN-Hb5-O H   ————6.82d(5.8)3.39td(ca.5.8，1.5)——6.43d(5.9)6.28dd(5.9，3.3)2.95m6.16dd(ca.1.8，1.5)——8.62br s8.30br s9.06br s 43，8，9d)76，84，7，94d)，8N- HbN- Ha   163.00s144.27s106.35d49.30d85.03s143.37d133.18d41.30d97.42d172.84s——————   33，4，9，N- Ha43，6，7，94，6，7，87，86，83，4，6，74，6e)4，9
a)本表信号归属基于DEPT、PFG 1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此栏中的数字和代号分别代表在PFG1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。c)此栏中的数字和代号分别代表在PFGHMBC(1JCH＝8Hz)中与相应行中的碳信号给出远程杂核相关(HMBC)信号的1H核。d)从PFG1H-1H COSY谱中在4-H和9-H之间检测到虽然弱但比较显著的相隔四根键的远程相关信号。e)从PFG HMBC谱(1JCH＝8Hz)中在C-9和6-H之间检测到相隔四根键的远程杂核相关信号。
实施例2  化合物II的发酵生产及分离精制
1发酵生产
取白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株适量，完全按实施例1中所述相同方法和步骤，在相同条件下进行生产发酵，获得含有取代三环缩醛内酯类目标化合物的白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株的发酵培养物约10升。
2含化合物II的发酵液粗提物的制备
将白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株的发酵培养物(约10升)抽滤，菌体用适量蒸馏水在抽滤漏斗上直接洗涤、抽滤两次，合并滤液，得到发酵滤液10升。将该发酵滤液(10升)，减压浓缩至1升，用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得到含化合物II的发酵滤液粗浸膏(6克)。
3化合物II的分离精制
与跟踪活性分离纯化化合物I的过程一样，分离纯化化合物II的下述实验的每一步骤都采用温敏型小鼠乳腺癌tsFT210细胞的流式细胞术结合形态学检测的筛选模型，以细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及细胞坏死活性为抗癌指标，在检测每个组分的活性并确定活性组份的基础上，选择活性组份，进一步实施下一步分离操作。
取含化合物II的白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus A2-2002株发酵培养物的滤液粗浸膏(6克)，用5毫升氯仿溶解后加5克200-300目硅胶G(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，上到装填有15克青岛海洋化工集团公司产薄层层析用硅胶G的玻璃减压柱上，以石油醚、氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂，进行减压柱层析，洗脱溶剂的极性在由石油醚更换为氯仿后通过增加氯仿中甲醇的用量来梯度递增，接收每个流份分别为20毫升，经薄层层析检测，进行合并，共得到5个组份，即A-1(200毫克，石油醚洗脱和氯仿洗脱物)，A-2(2.5克，氯仿、氯仿-甲醇98∶2→95∶5洗脱物)，A-3(580毫克，氯仿-甲醇95∶5→92∶8洗脱物)，A-4(740毫克，氯仿-甲醇92∶8→90∶10洗脱物)，A-5(910毫克，氯仿-甲醇80∶20→50∶50及甲醇洗脱物)。
取活性组份A-2(2.5克)，用适量甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱，用单一甲醇作为洗脱剂洗脱，按流出先后顺序接受，分为五个组份B-1(50毫克)、B-2(2克)、B-3(130毫克)、B-4(83毫克)、B-5(127毫克)。其中，B-2为活性组份。
取B-2(2克)，用氯仿2毫升溶解后加4克200-300目硅胶G(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，上到装填有10克青岛海洋化工集团公司产薄层层析用硅胶G的玻璃减压柱上，以氯仿-甲醇溶剂系统为洗脱剂进行减压柱层析，洗脱溶剂的极性通过增加氯仿中甲醇的用量来梯度递增，每个流份分别为10毫升，经薄层层析检测，进行合并，共分为4个组份，即C-1(54毫克，氯仿洗脱物)、C-2(70毫克，氯仿洗脱物)、C-3(1.4克，氯仿及氯仿-甲醇95∶5→90∶10洗脱物)、C-4(192毫克，氯仿-甲醇80∶20及甲醇洗脱物)。其中，C-3为活性组份。
将组份C-3(1.4克)湿法上反相硅胶(RP-186克)柱(2.2cm×7.5cm)，用水-甲醇-氯仿溶剂系统梯度洗脱，经薄层检测合并，得到5个组份，D-1(25毫克，水洗脱物)、D-2(49毫克，5％甲醇水洗脱物)、D-3(1.1克，5％→30％甲醇水洗脱物)、D-4(72毫克，50％甲醇及甲醇洗脱物物)、D-5(34毫克，氯仿洗脱物)。其中，D-3为活性组份。
取组份D-3(1.1克)，湿法上减压硅胶G(5克)柱(2.5cm×7cm)，用石油醚-氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，通过薄层检测并合并相关流份，得到10个组份，E-1(27毫克，石油醚及石油醚-氯仿80∶20→70∶30洗脱物洗脱物)，E-2(700毫克，石油醚-氯仿70∶30、氯仿及氯仿-甲醇99∶1→98∶2洗脱物)，E-3(46毫克，氯仿-甲醇97∶3洗脱物)，E-4(50毫克，氯仿-甲醇96∶4→95∶5洗脱物)，E-5(46毫克，氯仿-甲醇95∶5→94∶6洗脱物)，E-6(31毫克，氯仿-甲醇93∶7洗脱物)，E-7(23毫克，氯仿-甲醇92∶8→90∶10洗脱物)，E-8(30毫克，氯仿-甲醇90∶10洗脱物)，E-9(51毫克，氯仿-甲醇90∶10→60∶40洗脱物)，E-10(12毫克，甲醇洗脱物)。其中，E-2为活性组份。
取组份E-2(700毫克)，湿法上加压硅胶G(10克)柱(2.5cm×7cm)，用氯仿-甲醇-水(10∶3∶3)混合溶剂恒梯度洗脱，按洗脱顺序接收各流份，经薄层层析检测后合并，得到7个组份，F-1(300毫克)，F-2(33毫克)，F-3(24毫克)，F-4(15毫克)，F-5(17毫克)，F-6(8毫克)，F-7(59毫克)。其中，F-1为活性组份。
将含化合物II的活性组份F-1(300毫克)用适量甲醇溶解，上甲醇中浸泡填装的Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱层析，截取含目标化合物的洗脱流份，减压浓缩，得到油状化合物II的纯品190毫克。
化合物II  淡棕色油状物，[α]D 31-531.7°(c 0.5，CHCl3)，分子式C10H9NO4，TOF-MS m/z：208[M+H]+，225[M+H2O]+，230[M+Na]+；Positive HR-TOF-MS m/z：实测值208.0585[M+H]+，计算值208.0559(C10H10NO4[M+H]+)；Negative HR-TOF-MS m/z：实测值207.0379[M-H]-，计算值207.0402(C10H8NO4[M-H]-)。UVλmax nm(logε)in MeOH：216(3.95)，末端吸收。IRνmaxcm-1(KBr)：3428(NH)，3085(olefin protons)，2987，2930(methine protons)，1754(lactonecarbonyl)，1687(amide I absorption，-CON＜)，1649，1595(amide II absorption，NH2)，1406(C＝C)，1369，1320(＝C-O)，1199，1122，1096，1066(C-O)，991(m)，964(s)，911(m)，840(m)，805(w)，771(m)，695(m)，638(w)，596(m)，554(w)，474(vw)。1H及13C NMR数据见表4。
           表4化合物II在氘代吡啶中的600MHz 1H和150MHz 13C NMR数据a)
  位置标号   δH(Jin Hz)   1H-1H COSYb)   δC   HMBCc)
  12345678910N-HaN-Hb   ————6.59d(5.8)3.02m3.42m6.27AB type6.27AB type2.66m6.06dd(ca1.8，1.4)——8.59br s8.29br s 43，5，8，9d)4，6584，7，94d)，8N- HbN- Ha   163.23s144.04s107.43d42.11d52.29d136.69d135.22d38.93d96.29d168.78s————   33，4，9，N- Ha43，6，7，8，94，6，7，87，85，63，4，5，6，744，5，6，9
a)本表信号归属基于DEPT、PFG 1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此栏中的数字和代号分别代表在PFG1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。c)此栏中的数字和代号分别代表在PFGHMBC(1JCH＝8Hz)谱中与相应行中的碳信号给出远程杂核相关(HMBC)信号的1H核。d)从PFG 1H-1H COSY谱中在4-H和9-H之间检测到虽然弱但比较显著的相隔四根键的远程相关信号。
实施例3  对癌细胞的增殖抑制、细胞周期抑制、凋亡诱导及细胞杀伤活性测试1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制  测试样品为上述实施例1和实施例2中分离精制的纯品化合物I和化合物II。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养  活性测试采用小鼠乳腺癌tsFT210细胞、人慢性髓性白血病K562细胞及人大肠癌HCT-15细胞等哺乳动物的癌细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在32℃(tsFT210细胞)或在37℃(K562细胞及HCT-15细胞)于通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法(SRB法)
本法明采用SRB(sulforhodamine B，丽丝胺罗丹明B)法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。该SRB法是近来开发并用于抗癌药物筛选和评价的新的比色法。丽丝胺罗丹明B即SRB是一种亮粉红色的氨基夹氧杂蒽类染料(aminoxanthene dye)，分子中具有两个磺酸基。在微酸性条件下，SRB可定量地结合到经三氯醋酸固定的细胞内蛋白质中的碱性氨基酸残基上，从而提供测定细胞蛋白质含量的很灵敏的定量指标。细胞内蛋白质的含量与活细胞的密度呈线性关系，因此，SRB法可用于评价抗癌药物对癌细胞增殖的抑制活性。
活性测试时，取对数生长期的tsFT210、K562或HCT-15细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，32℃下培养17小时(tsFT210细胞)或37℃下培养24小时(K562细胞和HCT-15细胞)。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，继而在4℃、3000转/分钟条件下下离心3分钟，吸去上清。每孔细胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1％醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRAMAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔作为空白对照。取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)，再利用Bliss方法，由各种浓度的抑制率(IR％)求得半数抑制浓度(IC50)。同样的测试和计算分别进行三次，求得IC50的平均值和标准差。
细胞周期抑制和细胞凋亡诱导活性的流式细胞术测试方法
取对数生长期的tsFT210、K562或HCT-15细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔0.5毫升接种于24孔板中，每孔加入5微升不同浓度的样品溶液，320℃下培养17小时(tsFT210细胞)或37℃下培养24小时(K562细胞和HCT-15细胞)。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，必要时进行拍照。继而将细胞分别从24孔板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中，4℃下3000转/分离心3分钟，吸去上清液，加0.5毫升磷酸缓冲溶液(PBS)震荡洗涤一次，相同条件下离心收集细胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克柠檬酸纳和200毫克NP-40)，4℃下染色30分钟后，加入150微升PBS稀释，用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。细胞在细胞周期各时相中的分布利用库尔特公司产计算机软件WinCycle进行分析计算。
2实验结果
化合物I和化合物II的细胞增殖抑制活性：用不同浓度的化合物I和II分别处理tsFT210细胞17小时、K562和HCT-15细胞各24小后用SRB法测试的活性结果见表5和表6。
表5化合物I细胞增殖抑制活性的SRB法测试结果(平均值±标准差，n＝3)
    浓度(μg/ml)     抑制率％
tsFT210细胞 K562细胞 HCT-15细胞
    0.390.781.563.136.2512.5025.050.0100.0IC50     5.2±6.17.1±4.914.1±6.723.8±10.635.0±8.541.8±6.649.2±1.257.6±7.263.6±5.920.4±5.9     4.6±2.913.8±1.723.1±2.739.3±1.552.0±1.657.1±3.659.1±4.159.8±0.860.2±1.35.6±0.4     9.8±11.46.2±2.616.2±2.621.5±17.433.8±15.035.3±18.838.4±13.647.0±1.459.6±6.555.1±13.2
表6化合物II细胞增殖抑制活性的SRB法测试结果(平均值±标准差，n＝3)
    浓度(μg/ml)     抑制率％
tsFT210细胞 K562细胞 HCT-15细胞
    0.390.78     10.4±11.66.84±5.8     8.3±2.914.1±2.8     6.6±3.87.0±5.3
  1.563.136.2512.5025.050.0100.0IC50   12.2±7.8-15±12.8-4.2±9.0-44±2.77.2±7.513.4±2.524.8±5.2＞100   13.4±3.620.1±2.223.4±7.533.7±5.349.7±1.856.2±2.359.4±0.729.6±6.0   6.2±2.86.3±3.813.6±1.822.1±4.833.9±6.445.1±1.547.6±1.2＞100
化合物I活性的流式细胞术分析检测结果：用不同浓度的化合物I分别处理tsFT210细胞17小时、K562和HCT-15细胞各24小后，用流式细胞术分析测得的化合物I对癌细胞的细胞周期抑制及凋亡诱导活性测试结果见表7、表8和表9。
表7tsFT210细胞经化合物I处理17小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
  浓度(μg/ml)   sub-G0/G1％   G0/G1％   S％   G2/M％
  Cotroll0.390.781.563.136.2512.5025.050.0100.0   0.6±0.30.8±0.60.9±0.51.0±0.61.5±1.02.8±1.94.3±2.16.8±8.86.5±8.90.9±0.5   31.7±4.231.8±4.931.3±3.222.1±4.43.1±4.11.1±0.515.8±3.117.0±2.917.5±1.114.1±2.9   47.5±0.846.4±1.145.9±3.247.5±5.053.4±26.541.7±1.944.5±19.446.9±8.146.5±11.156.3±2.7   20.8±3.321.8±4.222.7±6.430.4±1.343.5±30.557.2±2.439.6±16.436.2±10.036.0±12.129.7±5.5
注：本表数据系将tsFT210细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表8 K562细胞经化合物I处理24小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
浓度(μg/ml)   sub-G0/G1％   G0/G1％   S％   G2/M％
Cotroll0.390.78   2.832.92.2±1.82.7±2.4   36.9±3.036.8±3.835.2±3.8   48.2±1.847.1±3.247.9±5.7   14.9±1.416.1±1.316.9±1.8
  1.563.136.2512.5025.050.0100.0   2.5±1.84.7±1.416.7±6.910.6±5.06.0±3.43.6±1.61.8±1.2   24.5±10.67.43±11.623.7±0.923.9±2.027.4±2.027.2±4.615.3±11.6   55.4±3.870.1±1.359.0±2.057.4±2.363.1±2.368.3±5.170.9±10.0   20.1±6.922.4±12.017.3±2.918.7±1.29.57±1.14.53±1.713.8±8.1
注：本表数据系将K562细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表9 HCT-15细胞经化合物I处理24小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
浓度(μg/ml)   sub-G0/G1％   G0/G1％   S％   G2/M％
Cotroll0.390.781.563.136.2512.5025.050.0100.0   3.6±1.95.4±4.65.8±2.69.8±5.313.9±12.530.2±6.622.6±6.220.3±7.514.8±6.135.7±16.1   38.5±2.634.8±4.424.3±6.14.40±3.66.70±10.812.8±5.212.2±4.628.9±2.716.5±9.829.6±17.5   39.2±4.039.5±5.543.6±1.232.1±5.241.3±24.456.8±12.464.6±2.624.6±7.950.5±3.430.7±20.0   22.3±2.125.7±1.132.1±5.763.5±1.652.0±14.030.4±7.323.2±7.146.5±5.732.9±7.939.7±6.1
注：本表数据系将HCT-15细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
化合物II活性的流式细胞术分析检测结果：用不同浓度的化合物II分别处理tsFT210细胞17小时、K562和HCT-15细胞各24小后，用流式细胞术分析测得的化合物I对癌细胞的细胞周期抑制及凋亡诱导活性测试结果见表10、表11和表12。
表10 tsFT210细胞经化合物II处理17小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
浓度(μg/ml)   sub-G0/G1％   G0/G1％   S％   G2/M％
Cotroll0.390.78   0.3±0.22.6±1.63.8±0.9   30.1±1.031.3±1.335.3±4.3   47.7±1.647.1±0.446.4±1.3   21.9±1.721.6±1.018.3±3.1
  1.563.136.2512.5025.050.0100.0   3.9±1.25.1±0.84.8±1.65.3±2.44.4±1.89.8±3.210.0±2.9   35.6±4.937.9±7.236.0±4.235.8±2.926.8±3.410.0±5.218.9±0.7   46.5±2.146.1±2.847.1±1.848.1±0.852.5±1.854.7±1.651.8±0.4   18.0±2.916.0±4.816.9±2.516.0±2.220.5±2.935.3±5.329.2±0.5
注：本表数据系将tsFT210细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表11 K562细胞经化合物II处理24小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
浓度(μg/ml)   sub-G0/G1％   G0/G1％   S％   G2/M％
Cotroll0.390.781.563.136.2512.5025.050.0100.0   2.6±1.02.1±1.82.1±1.92.0±1.92.3±2.11.7±1.32.0±1.75.2±1.27.1±1.63.37±0.7   45.8±7.443.9±4.344.1±4.742.5±3.542.9±4.437.0±1.017.1±15.42.8±3.011.5±0.911.3±3.2   44.2±10.046.0±7.245.5±12.046.5±12.246.2±7.647.6±7.554.2±3.151.2±13.757.0±2.663.2±17.9   10.0±2.510.0±2.910.4±3.311.0±4.710.8±3.315.4±7.428.7±17.646.1±16.332.9±2.825.5±14.9
注：本表数据系将K562细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表12 HCT-15细胞经化合物II处理24小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
浓度(μg/ml)   sub-G0/G1％   G0/G1％   S％   G2/M％
Cotroll0.390.781.563.136.2512.5025.0   5.2±2.05.1±1.65.1±0.74.3±0.34.2±0.45.2±0.79.1±3.222.4±0.8   43.8±2.140.7±2.741.0±2.639.1±2.039.4±0.634.2±1.816.6±0.624.3±9.4   40.6±1.544.3±1.444.8±0.846.4±1.146.6±1.445.4±1.039.5±1.455.3±9.5   15.5±0.914.9±1.414.3±1.914.5±1.914.1±0.820.4±1.043.9±1.920.4±3.2
  50.0100.0   9.8±3.419.9±2.8   28.7±1.045.5±5.9   26.6±2.816.6±7.5   44.6±3.638.0±5.4
注：本表数据系将HCT-15细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
化合物I和化合物II对癌细胞杀伤活性的形态学检测结果：
在光学倒置显微镜下观察到，tsFT210细胞当分别用化合物I和化合物II处理时，随着样品浓度增高细胞形态逐渐发生变化。在低浓度(化合物I低于0.78μg/ml，化合物II低于12.5μg/ml)时与空白对照组一样，满视野大多是体积较小的G0/G1细胞，随着样品浓度的提高，从化合物I为1.56μg/ml、化合物II为25μg/ml时开始，视野中胞体饱满且体积较大的G2/M期细胞逐渐多起来，呈典型的G2/M期抑制，并在化合物I为3.13-6.25μg/ml、化合物II为50μg/ml时达高峰。另外，经化合物II高浓度(100μg/ml)处理后的tsFT210细胞中可观测到部分雪花瓣状或膜裹着碎片凋亡细胞。
同样，当用不同浓度的化合物I和化合物II处理时，K562细胞的形态学变化也与上述tsFT210细胞相似，从化合物I为1.56μg/ml、化合物II为6.25μg/ml时开始，视野中G2/M期细胞逐渐多起来，呈典型的G2/M期抑制，并且在化合物I为3.13μg/ml、化合物II为25μg/ml时G2/M期抑制达高峰。同时，随着药物浓度提高，从化合物I为3.13μg/ml、化合物II为25μg/ml时开始，从视野中可观测到部分凋亡细胞。
HCT-15细胞当分别用不同浓度的化合物I和化合物II处理时，形态学变化与上述tsFT210及K562细胞相似，从化合物I为0.78μg/ml、化合物II为6.25μg/ml时开始，视野中G2/M期细胞逐渐多起来，呈典型的G2/M期抑制，并在化合物I为1.56-3.13μg/ml、化合物II为12.5μg/ml时G2/M期抑制达高峰。但HCT-15细胞似乎对化合物I和化合物II更为敏感、更易于被化合物I和II诱发凋亡，从化合物I为1.56μg/ml、化合物II为12.5μg/ml时开始，从视野中就可观测到比较显著的部分凋亡细胞，而且当浓度达到化合物I为6.25μg/ml、化合物II为25μg/ml以上时，可观测到非常显著的凋亡细胞。
另外，当化合物I和化合物II的浓度超过100μg/ml时，无论tsFT210及K562细胞还是HCT-15细胞均有部分细胞呈胞体膨大且暗色不透明的典型的坏死细胞的形态特征，表明高浓度的化合物I和化合物II对这些癌细胞均具有直接的杀伤作用。
上述形态学观测结果与流式细胞术检测分析结果完全吻合(参见图10-图15以及表7-表12)。
总之，化合物I和化合物II均可显著抑制tsFT210、K562、HCT-15等癌细胞的增殖，化合物I抑制这些癌细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)分别为20.4±5.9μg/ml(tsFT210细胞)、5.6±0.4μg/ml(K562细胞)、55.1±13.2μg/ml(HCT-15细胞)；化合物II的IC50分别为IC50＞100μg/ml(tsFT210细胞，100μg/ml时的抑制率IR％为24.8±5.2％)、29.6±6.0μg/ml(K562细胞)、IC50＞100μg/ml(HCT-15细胞，100μg/ml时的抑制率IR％为47.6±1.2％)。
化合物I对tsFT210、K562和HCT-15细胞发挥细胞周期抑制作用的MIC值为1.56μg/ml(tsFT210细胞)、0.78μg/ml(K562细胞)和0.39μg/ml(HCT-15细胞)，发挥细胞凋亡诱导作用的MIC值为6.25μg/ml(tsFT210细胞)、3.13μg/ml(K562细胞)和0.39μg/ml(HCT-15细胞)。化合物II对tsFT210、K562和HCT-15细胞发挥细胞周期抑制作用的MIC值为25μg/ml(tsFT210细胞)、6.25μg/ml(K562细胞)和6.25μg/ml(HCT-15细胞)，发挥细胞凋亡诱导作用的MIC值为25μg/ml(tsFT210细胞)、50μg/ml(K562细胞)和6.25μg/ml(HCT-15细胞)。
3结论
化合物I和化合物II对包括人在内的哺乳动物来源的癌细胞具有直接杀伤(坏死性细胞杀伤作用)和细胞周期抑制及细胞凋亡诱导等抗肿瘤作用。

Claims (4)

1.式I化合物，其中R1为氨基；R2为羟基或氢
式I
2.权利要求1所述式I化合物的制备方法，其特征是发酵培养白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)A2-2002 CGMCC 1005、获取含有三环缩醛内酯素类化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I化合物。
3.权利要求1所述的式I化合物用于制备细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂的用途。
4.权利要求1所述的式I化合物用于制备抗肿瘤药物的用途。
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