CN1033591C - 普拉迪霉素类抗生素的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生产BMY-28960和脱木糖基BMY-28960的发酵方法，并涉及属于马杜拉放线菌属并被命名为AB1236株的新的BMY-28960生产菌(CCTCCM92012)。
Description
本发明涉及生产普拉迪霉素(Pradimicin)类抗生素的发酵方法，以及所述抗生素的生产微生物。
由马杜拉放线菌(Actinomadura)产生的普拉迪霉素家族已报导了各种不同的成员，其中美国专利4,973,673所公开的普拉迪霉素FA-1(Ia)和FA-2(Ib)含有D-丝氨酸部分。已有人报导了一种与普拉迪霉素密切相关的化合物即苯纳诺霉素(benanomicin)A(II)(J.Antibiot.，41：807-811，1988)，它与普拉迪霉素的不同之处在于缺少普拉迪霉素的糖氨基。1991年6月19日公开的欧洲专利申请432,527公开了化合物4′-脱氨基-4′-直立羟基普拉迪霉素FA-2(m，以下简写为BMY-28960)，该化合物是用化学方法从普拉迪霉素FA-2制得的。EP 432,527还一般性地公开了脱木糖基BMY-28960，它可由脱木糖基普拉迪霉素FA-2制得。
Ia：R1＝CH2OH，R2＝NHCH3Ib：R1＝CH2OH，R2＝NH2II：R1＝CH3，R2＝OHIII：R1＝CH2OH，R2＝OH
制备BMY-28960及其脱木糖基衍生物的化学方法既困难又费力，产物的产率也低。因此，迫切需要适于大量生产这些抗生素的替代方法。经过仔细寻找能够产生BMY-28960和脱木糖基BMY-28960的微生物，结果发现，属于马杜拉放线菌属的一个新的微生物菌株是这样一种抗生素生产菌。
本发明提供一种制备下式抗生素的方法，其中R为氢或β-D-木糖基该方法包括：在有氧条件下，在含有可吸收碳源、氮源和D-丝氨酸源的含水培养基中，培养能够产生所述抗生素约马杜拉放线菌菌株；从培养液中回收所述抗生素。生产菌优选马杜拉放线菌AB1236(Actinomadura sp.AB1236)，即CCTCC M92012。在一个优选实施方案中，发酵培养基中还含有D-环丝氨酸。
本发明的另一方面提供微生物马杜拉放线菌AB1236的生物纯培养物，该培养物具有CCTCC M92012的鉴定特征，并且在含有可吸收碳源、氮源和D-丝氨酸源的含水培养基中培养时，能够产生BMY-28960和脱木糖基BMY-28960。
图1是BMY-28960的红外光谱(KBr)。
图2是BMY-28960的1H核磁共振谱(DMSO-d6，400MHz)。
图3是BMY-28960的13C核磁共振谱(DMSO-d6，100MHz)。
图4是脱木糖基BMY-28960的红外光谱(KBr)。
图5是脱木糖基BMY-28960的1H核磁共振谱(DMSO-d6，400MHz)。
本发明提供一种适于大量生产BMY-28960和脱木糖基BMY-28960的发酵方法。该方法使用了一种属于马杜拉放线菌属的新微生物。
I、BMY-28960生产微生物的筛选
从分离自土壤样品的放线菌中各取一环，以片状接种到三个琼脂平板上，然后于37℃下培养1至2周。这三个琼脂平板是：葡萄糖-酵母-大豆胨(Soytone)琼脂(葡萄糖1％、酵母提取物0.05％、大豆胨(Difco Laboratories)0.05％、CaCl2·2H2O 0.01％、琼脂1.5％)；甘油-酵母-大豆胨琼脂(甘油1％、酵母提取物0.05％、大豆胨0.05％、CaCl2·2H2O 0.01％、琼胨1.5％)；淀粉-酵母-大豆胨琼脂(可溶性淀粉1％、酵母提取物0.05％、大豆胨0.05％、CaCl2·2H2O 0.01％、琼脂1.5％)。取每块琼脂平板中产生深粉色至深红色可扩散色素的菌株，接种到装有100ml生产培养基的500ml锥形瓶中，并于32℃下旋转振荡(200rpm)培养。生产培养基的组成为：甘油2％、Esusan mito(味之素株式会社)1.5％、CoCl2·6H2O0.0001％、KH2PO4 0.1125％、K2HPO4 0.0025％、D-丝氨酸0.2％。培养10天后，用白假丝酶母A9540作受试菌，对上清液进行琼脂井试验，从而监测培养液中BMY-28960的产生。将显示出抗假丝酵母活性的培养液离心，用DMSO稀释10倍，过滤(Gelman Sciences Japan，Ltd.，Ekicrodisc 13CR，孔径：0.45μm)。对滤液进行HPLC和TLC分析。HPLC分析用乙腈：0.02M磷酸盐缓冲液，PH7.0(15∶85)在Excel PakSTL-C185R(横河电机株式会社)上进行，流速为1ml/分，在254nm处检测；TLC分析在硅胶薄层板(硅胶60F254 0.25mm；Merck公司制造)上进行。所用的展开剂体系为正丁醇∶乙酸∶水(2∶1∶1，BW-14)和乙酸甲酯∶正丙醇∶28％氨水(45∶105∶60，S-114)。BMY-28960用上述溶剂体系时的HPLC保留时间为11.5分钟，用BW-14和S-114时的Rf值分别为0.50和0.24。
对各种放线菌进行筛选发现，属于马杜拉放线菌属的AB1236株以适于大量生产的水平产生所希望的化合物。以下将描述AB1236株的分类特征。
II、BMY-28960生产菌
马杜拉放线菌AB1236是从1990年10月24日在日本东京都新竹区采集的土壤样品中分离出的新菌株。按照《关于国际上承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约》，AB1236株的培养物已保藏于美国典型培养物保藏中心，本申请被授予专利后，对公众获取该保藏微生物的所有限制都将永远取消。该保藏培养物已指定登记号为ATCC 55208。该菌株已于1992年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M92012。
A.AB1236株的形态和培养特征
用于该菌株分类研究的培养基和方法为文献中所述的培养基和方法(Shirling和Gottlieb，“鉴定链霉菌的方法”，Int.J.Syst.Bact.，16：313-340，1966；Waksman，Actino-mycetes第二卷，“属和种的分类、鉴定和描述”第328-334页，The Williams and Wilkins公司出版，Baltimore，1961；Arai，Culture Media for Actinomycetes，日本放线菌学会出版，1975)。将该菌株于37℃下培养2至4周。根据《色名手册》(Japan Color Enterprise Co.，Ltd，1987)把培养物的颜色与色片做比较，从而确定颜色。
在20和41℃之间的温度下，AB1236株在有机培养基上比在无机培养基上的生长情况要好，并形成分枝营养菌丝体。在酵母淀粉琼脂和酵母-淀粉-麦芽琼脂(YSM，可溶性淀粉1％、酵母提取物0.1％、麦芽汁0.1％、CaCl2·2H2O 0.05％、琼脂1.5％)上，成熟气生菌丝体的颜色都是白至灰白色。在光学显微镜和扫描电子显微镜下，短孢梗的顶端每条单链上有2至8个孢子。这些孢子的形状为近球形(大小为0.8-1.0×1.0-1.2μm)，表面光滑。这些孢子不运动。营养菌丝体和可扩散色素在有机琼脂培养基上的颜色为柔粉色至深红色。加入0.1N HCl使颜色由柔橙色变为浓黄橙色。AB1236株在各种琼脂培养基上的培养特性概括于表1。
表1 AB 1236株的培养特征培养基 生长情况 背面 气生菌丝体 可溶性色素蔗糖硝酸盐琼脂 黄白色(393) 黄白色(393) 无 无(Waksman 1号培养基)甘油硝酸盐琼脂 灰红色(60)，良好 灰红色(60) 无 粉白色(391)葡萄糖天冬酰胺琼脂 黄白色(393)，良好 黄白色(393) 无 无(Waksman 2号培养基)酵母提取物-麦芽汁琼脂 深红色(57)，良好 深红色(57) 灰白色(390)至 深红色(58)(ISP 2号培养基) 粉白色(391)燕麦粉琼脂 柔粉色(25)，良好 柔粉色(26) 白色(388)，棉状 柔粉色(26)(ISP 3号培养基)无机盐-淀粉琼脂 黄白色(393)，良好 黄白色(393)至 无 无(ISP 4号培养基)甘油天冬酰胺琼脂 深红色(58)，良好 深红色(58) 无 柔粉色(25)(ISP 5号培养基)酪氨酸琼脂 深红色(58)，良好 深红色(58) 无 柔粉色(25)(ISP 7号培养基)营养琼脂 黄白色(393)，差 黄白色(393) 无 无(Waksman 14号培养基)酵母淀粉琼脂 深灰红色(61)，良好 深灰红色(61) 白色(388)至 深黄红色(53)灰白色(390)，棉状贝内特琼脂 深红色(57)，良好 深红色(57) 灰白色(390)，缺乏 深粉色(22)B.AB1236株的生理特征AB1236株的生理特征和碳源利用情况分别示于表2和表3。
表2 AB1236株的生理特征
试 验 结果淀粉水解(ISP4号培养基) +硝酸盐还原(Difco，硝酸盐培养液) -10％脱脂乳(Difco，10％脱脂乳)
凝固 +
胨化 -纤维素分解(蔗糖硝酸盐溶液，用一张纸条 -
作唯一的碳源)明胶液化 不生长黑素形成(ISP 7号培养基) -生长温度范围(℃) 20-41最适温度(℃)(酵母淀粉琼脂) 30.5-35.5生长PH范围 6-8最适PH(胰酶解酪蛋白大豆肉汤，BBL) 7
-：阴性
+：阳性
表3 AB1236株的碳源利用
碳 源 利用
D-葡萄糖 +
L-阿拉伯糖 +
D-木糖 +
肌醇 +
甘露醇 +
D-果糖 +
L-鼠李糖 +
蔗糖 +
棉子糖 +
+：阳性
(ISP 9号培养基，37℃，3周)
用抗生素圆片(Tridisk，Eiken Chemical CO.，Ltd.)测试AB 1236株的抗生素敏感性。把圆片置于已接种AB 1236株(4％种菌)的酵母-葡萄糖-麦芽琼脂(酵母提取物0.1％、葡萄糖1％、麦芽汁0.1％、CaCl2·2H2O 0.05％、琼脂1.5％)表面上，然后把培养皿于37℃下培养4天。AB1236株对50μg磷霉素和300单位多粘菌素B有抗性，对下列抗生素敏感：20单位氨苄青霉素、1μg棒酸、2μg羧噻吩青霉素、10μg头孢氨苄、30μg四环素、10μg氯霉素、0.5μg红霉素、2μg交沙霉素、2μg林可霉素、5μg卡那霉素、5μg庆大霉素、5μg妥布霉素、2μg萘啶酸、2μg norfloxacin、50单位多粘菌素E。
C.AB1236细胞的化学分析
用Becker和Lechevalier所述的方法分析全细胞组成(“用全细胞水解液纸色谱法快速鉴别诺卡氏菌和链霉菌”，Appl.Microb.，12：421-423，1964；“好气放线菌各种形态属菌株的细胞壁制备物的化学组成”，Appl.Microb.，13：236-243，1965)。AB1236株含有内消旋二氨基庚二酸、马杜拉糖(madurose)、核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。因此，AB1236株的细胞壁属于IIIB型。用Minnikin等人的方法(“利用全菌体甲醇解产物的薄层色谱分析鉴别分枝杆菌、诺卡氏菌和相关分类群”，j.Gen.Microb.，88：200-204，1975)未检测出霉菌酸。用Lechevalier等人的方法(“具有重要临床意义的好气放线菌的鉴定”，J.Lab.Clin.Med.，71：934-944，1968；“好气放线菌的化学分类学：磷脂组成”，Biochem.Syst.Ecol.，5：249-260，1977)进行磷脂分析表明，AB1236株的细胞壁为P1型，含有二磷脂酰肌醇甘露糖苷、磷脂酰肌醇和二磷脂酰甘油。用Collins等人的方法(“关于用反相薄层色谱法分离细菌甲基萘醌类天然混合物的报告”，J.Appl.Bacteriol.，48：277-282，1980)分析甲基萘醌组成的结果为：47％MK-9(H8)、35％MK-9(H6)、10％MK-9(H4)和8％MK-9(H10)。用Suzuki等人的方法(“某些棒状细菌中细胞脂肪酸组成的分类意义”，Int.J.Syst.Bacteriol.，33：188-200，1983)测得的全细胞脂肪酸的组成为：49％ 14-甲基十五烷酸(异16∶0)、13％ 14-甲基十六烷酸(反异-17∶0)、8％ 10-甲基十七烷酸(10Me-17∶0)，以及少量其他脂肪酸。
AB1236株的形态、培养和化学分类特性与马杜拉放线菌属相一致，也与由Kroppenstedt等人提出的该属的定义相一致(“马杜拉放线菌属和小四孢菌属的分类修订”，System.Appl.Microbiol.，13：148-160，1990)。因此，AB1236株被鉴定为马杜拉放线菌属的一个种。
III.抗生素的生产
可以在常用于生产普通发酵产物的条件下，由AB1236株生产BMY-28960和脱木糖基BMY-28960。将生产菌培养在营养培养基中，培养基中除含有放线菌的已知营养源即可吸收的碳源和氮源加上或有或无的无机盐和其他已知生长因子外，还含有可吸收的D-丝氨酸源。对大量生产抗生素来说优选采用深层通气条件，但对有限量生产来说也可采用表面培养和瓶内培养。
作为可吸收的D-丝氨酸源，既可以使用D-丝氨酸，也可以使用DL-丝氨酸。可吸收碳源的例子有甘油；糖类，如核糖、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖；淀粉；其他碳水化合物，如葡聚糖。可吸收氮源的例子有氯化铵、硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钠，以及有机氮源，如胨、肉膏、酵母提取物、玉米浸液、大豆粉、棉子粉等。如有必要还可加入无机盐如氯化钴和磷酸钾。另外，在生产培养基中加入苏氨酸可提高抗生素的产量。苏氨酸可以是D-苏氨酸、L-苏氨酸或其混合物。加入D-环丝氨酸可进一步提高抗生素的产量。一种优选的液体培养基是实施例2或实施例3所述的培养基。另一种更为常规的液体培养基的组成为：葡萄糖和/或甘油(1-4％)、Pharmame-dia(1-3％)、KH2PO4(0.1-0.2％)、D-丝氨酸(0.1-0.2％)。可以使用烷醇、硅酮等作为消沫剂。
抗生素的生产可以在适于使生产菌的生长令人满意的任何温度下进行。通常，经过5-14天的摇瓶培养后能使抗生素的产量最佳，但在某些情况下可能需要更长的时间。摇瓶的通气通过搅动来实现，例如在旋转摇床上振荡。如果要进行罐式发酵，最好由菌体的斜面培养或冷冻干燥培养物制成液体培养物，然后将其接种在营养液体培养基中使其产生营养接种物。以这种方式得到有活性的接种物后，将其无菌转移到发酵罐培养基中。发酵罐的搅动通过搅拌来实现，通气可通过向搅动着的混合物中注入空气或氧气来实现。抗生素的生产过程可以用色谱技术或分光技术来监测，也可用常规的生物测定法来监测。优选的发酵条件为在PH5-8和20-37℃下通气培养5-14天，优选在PH6-7和28-35℃下通气培养5-12天。
虽然本发明用具体的微生物菌株描述了抗生素的生产，但人们公知，放线菌的分类特性可以发生自然变异或人工变异。因此应当理解，本发明的方法不限于已提到的特定微生物，而是包括了用各种人工方法(如紫外光或X光照射)或化学诱变剂(如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)由该特定菌株衍生的变异株和突变株。可以用本公开中前面所述的方法对所产生的突变株和变异株进行筛选，看其是否产生抗生素。
IV.抗生素的分离和纯化
可以用分离亲水性酸性物质的常规方法，从培养液中分离BMY-28960和脱木糖基BMY-28960。上述方法的例子包括有机溶剂萃取、离子交换树脂、分配色谱、酸性沉淀。这些技术既可单独使用也可组合使用。一种示例性的分离纯化方法如下。发酵完成后，将培养液调至pH2.0，离心或过滤。使所得到的上清液或滤液吸附到多孔高聚物树脂如Diaion HP-20(三菱化成株式会社)上，用水互溶性有机溶剂如甲醇或丙酮洗脱。将所得的流出液浓缩并冰冻干燥，得到粗制抗生素复合物。为进一步纯化，可将该粗品加到反相硅胶柱如YMC-ODS A60(Yamamura Chemical Lab.)上，用乙腈：0.02M磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗脱。合并含BMY-28960的部分并脱盐，得到纯的BMY-28960。用类似的分离纯化方法可得到脱木糖基BMY-28960，但最好不酸化发酵液。
V.抗生素的物理化学性质
用本发明的方法制得的BMY-28960具有下列物理化学性质，这些性质与用EP 432,527所公开的半合成法制得的BMY-28960相同。
(1)外观：无定形深红橙色粉末
(2)熔点：＞220℃(逐渐分解)
(3)FAB-MS(正)：m/Z 844(M+H)+
(4)分子式：C39H41NO20
(5)紫外吸收光谱：λmax nm(ε)：
0.02N NaOH∶MeOH(1∶1)：211(34，700)，320(15，100)，
498(14，100)
(6)红外光谱：如图1所示
(7)在溶剂中的溶解度
易溶：二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和碱性水
微溶：乙醇、甲醇和丙酮
不溶：乙酸乙酯、苯、氯仿、酸性水等
(8)薄层色谱(硅胶板)：
Rf＝0.24(乙酸甲酯∶正丙醇∶28％氨水＝45∶105∶60)(9)HPLC分析柱：Cosmosil 5C18-AR，5μm，4.6mm内径×150mm洗脱剂：CH3CN：0.02M磷酸盐缓冲液，pH7.0(15∶85)流速：1.0ml/分紫外检测器：254nm保留时间：11.5分内标：普拉迪霉素A(保留时间＝9.7分)(10)1H NMR谱：如图2所示(11)13C NMR谱：如图3所示脱木糖基BMY-28960具有下列物理化学性质：(1)外观：深红橙色粉末(2)熔点：＞180℃(3)HR-FAB-MS(正)：m/z 712.1871(M+H)+(4)分子式：C34H33NO16(5)紫外吸收光谱：λmax nm(ε)：H2O-MeOH-DMSO(4.5∶4.5∶1)：470(10，100)，0.02N HCl-MeOH-DMSO(4.5∶4.5∶1)：461(10，600)0.02N NaOH-MeOH(1∶1)：213(31，500)，242(30，100)，
320(13，600)，498(12，600)(6)红外光谱(KBr)vmaxcm-1：如图4所示(7)在溶剂中的溶解度
易溶：二甲亚砜、二甲基甲酰胺和碱性水
微溶：乙醇、甲醇、丙酮和乙腈
不溶：酸性水、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和其他普通有机溶剂
(8)1H NMR谱：如图5所示。
VI.抗生素的生物活性
用常规琼脂稀释法，在含有1/15M磷酸盐缓冲液(PH7.0)的酵母形态琼脂上，测定由本发明发酵方法制得的BMY-28960和脱木糖基BMY-28960的体外抗真菌活性。结果示于表4和表5。
表4 BMY-28960的体外抗真菌活性
受试菌 BMY-28960 两性霉素B 酮哌噁咪唑啤酒酵母ATCC 9763 3.1 0.4 100白假丝酵母A9540 6.3 0.4 25白假丝酵母ATCC 38247 1.6 6.3 6.3白假丝酵母ATCC 32354(B311) 3.1 0.2 50白假丝酵母83-2-14(Juntendo) 12.5 0.4 25热带假丝酵母85-8(Kitasato) 12.5 0.4 100热带假丝酵母IFO 10241 3.1 0.4 50新隐球酵母D49 3.1 0.4 6.3新隐球酵母IAM 4514 6.3 0.4 6.3烟曲霉菌IAM 2034 6.3 0.4 3.1须发癣霉菌#4329 6.3 0.4 0.8培养基：酵母形态琼脂+1/15M磷酸盐缓冲液(pH7.0)接种量：106个细胞/ml(须发癣霉菌为107个细胞/ml)培养条件：28℃，40小时(须发癣霉菌为60小时)
表5 脱木糖基BMY-28960的体外抗真菌活性
受试菌 脱木糖基 BMY-28960 两性霉素B
BMY-28960啤酒酵母ATCC 9763 3.1 1.6 0.8白假丝酶母A9540 3.1 3.1 0.8白假丝酵母IAM 4888 3.1 3.1 0.8白假丝酵母ATCC 32354(B311) 3.1 3.1 0.8白假丝酵母83-2-14(Juntendo) 1.6 3.1 0.8热带假丝酵母85-8(Kitasato) 1.6 12.5 1.6热带假丝酵母IFO 10241 6.3 12.5 1.6新隐球酵母D49 1.6 3.1 0.8新隐球酵母IAM 4514 3.1 1.6 0.8烟曲霉菌IAM 2034 6.3 3.1 0.8须发癣霉菌#4329 6.3 3.1 1.6培养基：酵母形态琼脂+1/15M磷酸盐缓冲液(pH7.0)接种量：106个细胞/ml(须发癣霉菌为107个细胞/ml)培养条件：28℃，40小时(须发癣霉菌为60小时)
用雄性ICR小鼠(体重20-24g)评价BMY-28960对抗白假丝酵母A9540全身性感染的体内效力。每个剂量用五只小鼠。取悬浮在盐水中的病原体，以半致死剂量给小鼠静脉感染10次，并在感染后立即静脉给予一次BMY-28960。由第21天记录的存活率计算半保护剂量(PD50)。结果概括于表6。
表6 在小鼠体内对抗白假丝酵母
A9540全身性感染的体内效力
化合物 PD50(mg/kg，静脉)
BMY-28960 6.7
普拉迪霉素A 10
两性霉素B 0.31
Fluconazole ＞50
ICR小鼠对BMY-28960的耐受力很强，在静脉给予BMY-28960高达600mg/kg后，既没有观察到致死作用，也没有观察到明显副反应。
提供下列实施例以更充分地说明本发明，但不应误认为这些实施例是要以某种方式限制本发明的范围。
实施例1.种子培养
取生产菌即马杜拉放线菌AB1236(CCTCC M92012)的原培养物，在YSM琼脂斜面上划线，并于37℃下培养2周。取一环菌株接种在一个装有100ml培养基的500ml锥形瓶中，培养基的组成为：葡萄糖0.5％、可溶性淀粉2％、酵母提取物0.2％、NZ-case0.3％、鱼粉提取物D30x(Banyu Eiyou K.K.)0.5％、CaCO3 0.3％(高压灭菌前将培养基的pH调至7.0)。将该培养物置于旋转摇床上于32℃下培养5天，作为种子培养物使用。
实施例2 瓶发酵
将实施例1所述的种子培养物分成5ml为一份，每份分别转移至装有100ml生产培养基的500ml锥形瓶中，培养基的组成为：甘油2％、Esusan mi-to(大豆粉，味之素株式会社)1.5％、K2HPO4 0.0025％、KH2PO4 0.1125％、CoCl2·6H2O0.0005％、D-丝氨酸0.125％，以及D-环丝氨酸(WakoPure Chemical Industries Ltd.)10μg/mg。将该培养物置于转速为200rpm的旋转摇床上，于28℃下培养12天，此时BMY-28960的产量达到530μg/ml。
实施例3 瓶发酵(加入苏氨酸的影响)
将实施例1所述的种子培养物分成5ml为一份，每份分别转移至装有100ml生产培养基的500ml锥形瓶中，培养基的组成为：甘油2％、Pharmamedia(Traders Protein)1.5％、KH2PO4 0.1％、L-或D-苏氨酸0.2％、CoCl2·6H2O 0.0005％、D-丝氨酸0.2％、D-环丝氨酸10μg/ml。将该培养物置于转速为200rpm的旋转摇床上，于28℃下培养11天。为观察苏氨酸对BMY-28960产量的影响，还在不加苏氨酸的情况下进行了发酵。结果概括如下：
氨基酸 BMY-28960产量
L-苏氨酸 1008μg/ml
D-苏氨酸 954
- 780
实施例4 BMY-28960的分离纯化
用6N HCl将实施例2的发酵液(2.0升)酸化至pH2.0，离心。将上清液(1.7升)加到Diaion HP-20柱(300ml)上，该柱先用水(1.5升)洗，再用1.6升甲醇洗脱。将流出液浓缩，然后冰冻干燥，得到2.1g粗制固体物。将此固体物溶于1升水中，用1N NaOH将溶液的pH调至6.3。将该溶液加到Diaion HP-20柱上，该柱先用0.002N HCl∶丙酮(1∶1)混合物洗，再用1升0.002N NaOH∶丙酮(1∶1)混合物洗脱。将流出液浓缩得到一种固体物(690mg)。取一部分(400mg)固体溶于乙腈：0.02M磷酸盐缓冲液，PH7.0(12.5∶87.5，30ml)中，并加到已用同一溶剂体系平衡过的YMC凝胶ODS A60柱(500ml，YamamuraChemical Lab.)上进行色谱分离。用同样的溶剂进行洗脱。将含BMY-28960的部分浓缩，用Diaion HP-20脱盐，冰冻干燥，得到BMY-28960(82mg)。
实施例5 脱木糖基BMY-28960的分离纯化
将通过AB1236株在D-丝氨酸存在下发酵而制得的培养液(25升)离心。使上清液(27升)通过3.8升Diaion HP-20。将该树脂依次用80％丙酮水溶液(8升)和丙酮-0.01N HCl(60∶40)混合物(12升)洗，再用丙酮-0.01N NaOH(60∶40)混合物(12升)洗脱，得到16.04g粗品。将该复合物(2g)溶于200ml CH3CN-0.02M磷酸盐缓冲液，PH7.0(13∶87)混合物中，并加到已用同一溶齐体系平衡过的YMC凝胶ODS-A60柱(10升，Yamamura Chemical Lab.)上。用溶解样品所用的溶剂体系进行洗脱，流出液用HPLC监测(柱：Cosmosil5C18 AR，5μm，4.6mm内径×150mm，Nacalai Tesque Inc.；流动相：CH3CN-1/15M磷酸盐缓冲液，PH3.5(27∶73)；流速：1.0ml/分；检测：254nm处的紫外吸收；保留时间：脱木糖基BMY-28960 8.3分，BMY-28960 7.6分)。将较快洗脱出的含脱木糖基BMY-28960的红色部分(3.7升)浓缩，并加到Diaion HP-20柱(30ml)上进行色谱分离，用丙酮-0.1NNaOH(60∶40)混合物(50ml)作洗脱剂。将红色流出液浓缩并冰冻干燥，得到29mg固体物。用0.1N HCl将样品水溶液(30ml)调至PH2.5，沉降出纯的脱木糖基BMY-28960(19mg)。对由YMC凝胶色谱中较慢洗脱出的部分(24升)进行类似的后处理，得到700mg纯的BMY-28960。
Claims (3)
1.一种制备下式抗生素的方法，
其中R为氢或β-D-木糖基
该方法包括：在有氧条件下，在含有可吸收碳源、氮源和D-丝氨酸源的含水培养基中，培养能够产生所述抗生素的马杜拉放线菌(Actinomadura)菌株；从培养液中回收所述抗生素，其中所述马杜拉放线菌菌株是命名为AB1236的菌株，它保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M92012。
2.权利要求1的方法，其中所述培养基还含有D-环丝氨酸。
3.权利要求2的方法，其中所述培养基还含有苏氨酸。
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