PL169264B1 - Sposób wytwarzania antybiotyku pradymicynowego PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób w ytw arzania antybiotyku pra- dymicynowego o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub ß-D-ksylozyl, znam ienny tym, ze hoduje sie szczep Actinomadura zdolny do wytwarzania tego antybiotyku w pozywce stano- wiacej srodowisko wodne zawierajace przyswa- jalne zródlo wegla, azotu i D-seryny w warunkach tlenowych, po czym odzyskuje sie antybiotyk z brzeczki hodowlanej. Wzór 1 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotyku pradymicynowego na drodze fermentacji.

Wśród różnych opisanych członków rodziny pradymicynowej wytwarzanej przez Actinomadure o wzorze 2, pradymicyny FA-1 (IIa) i fA-2 (IIb), ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 973 673 zawierają ugrupowanie D-serynowe. Benanomicynę A (II), związek bardzo zbliżony do pradymicyn, opisano w J. Antibiot., 1988,41: 807-811; różni się on od pradymicyn brakiem cukrowej grupy aminowej pradymicyn. W opisie europejskiego zgłoszenia patentowego nr 432 527 ujawniono 4’-deamino-4’-aksjalną-hydroksypradymicynę FA-2 (III, określaną dalej jako BMY - 28960), którą otrzymano z pradymicyny FA-2 metodami chemicznymi. W opisie tym ujawniono także ogólnie deksylozylo - BMY - 28960 i można go otrzymać z deksylozylopradymicyny FA-2.

IIa : R¹ = CH₂OH ; R² = NHCH3

IIb : R1 = CH2OH ; R2 = NH2

II: R¹ = CH3; R2 = OH

III: R1 = CH2OH ; r2 = OH

Chemiczne sposoby otrzymywania BMY - 28960 i jego deksylozylowej pochodnej są trudne i pracochłonne i dają produkty z niską wydajnością. Tak więc wysoce pożądany byłby alternatywny sposób masowego wytwarzania tych antybiotyków. Wynikiem intensywnych badań nad drobnoustrojami zdolnymi do wytwarzania BMY - 28960 i deksylozylo BMY - 28960 było znalezienie nowego szczepu drobnoustroju należącego do rodzaju Actimadura, który okazał się być takim wytwórcą antybiotyku.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania antybiotyku o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub (β-D-ksylozyl, polegającego na hodowaniu szczepu Actinomadura, zdolnego do wytwarzania tego antybiotyku, w środowisku wodnym zawierającym przyswajalne źródło węgla, azotu i D-seryny w warunkach tlenowych, oraz odzyskiwanie tego antybiotyku z wyhodowanej brzeczki. Korzystnie ustrojem wytwarzającym jest Actinomadura sp. AB 1236, ATCC 55208. W korzystnej postaci środowisko fermentacyjne zawiera ponadto D-cykloserynę.

169 264

W sposobie według wynalazku stosuje się biologicznie czystą kulturę drobnoustroju Actinomadura sp. AB 1236, mającego cechy identyfikacyjne ATCC 55208 i zdolnego do wytwarzania BMY - 28960 i deksylozylo - BMY - 28960 podczas hodowania w środowisku wodnym zawierającym przyswajalne źródło węgla, azotu i D-seryny.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia widmo IR (KBr, BMY - 28960), fig. 2 przedstawia widmo ’H NMR (dMsO-^, 400 MHz) BMY - 28960, fig. 3 przedstawia widmo '3c NMR (DMSO-dó, 100 MHz) BMY - 28960, fig. 4 przedstawia widmo IR (KBr, deksylazo- BMY - 28960), a fig. 5 przedstawia widmo *H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) deksylozylo - BMY - 28960.

Wynalazek zapewnia sposób fermentacji odpowiedni do masowego wytwarzania BMY 28960 i deksylozylo-BMY-28960. Sposób ten wykorzystuje nowy drobnoustrój należący do gatunku Actinomadura.

I. Przegląd drobnoustrojów produkujących BMY - 28960.

Oczkiem ezy każdego promieniowca wydzielonego z próbek gleby szczepiono w postaci plamki na trzech płytkach agarowych, a konkretnie glikoza - drożdże - agar z mąki sojowej (glikoza 1%, ekstrakt drożdżowy 0,05%, mąka sojowa /Difco Laboratories/ 0,05%, CaCh x 2H2O 0,01% i agar 1,5%), gliceryna - drożdże - agar z mąki sojowej (gliceryna 1%, ekstrakt drożdżowy 0,05%, mąka sojowa 0,05%, CaCh x 2H2O 0,01% i agar 1,5%) i skrobia - drożdże - agar z mąki sojowej (skrobia rozpuszczalna 1%, ekstrakt drożdżowy, 0,05%, mąka sojowa 0,05%, CaCl2 x 2H2O 0,01% i agar 1,5%) i następnie płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 do 2 tygodni. Tak wyprodukowane szczepy ciemnoróżowych do ciemnoczerwonych, mogących się szerzyć pigmentów na każdej płytce agarowej szczepiono do kolb Erlenmayera o pojemności 500 ml, zawierających 100 ml pożywki produkcyjnej 20 złożonej z gliceryny 2%, Esusan mito (Ajinomoto Co., Ltd.) 1,5%, CaCh x 6H2O 0,0001%, KH2PO40,1125%, K2HPO4 0,0025% i D-seryny 0,2% i inkubowano z obrotowym wstrząsem (200 obr./min.) w temperaturze 32°C. Po 10 dniach inkubacji kontrolowano wytwarzanie BMY - 28960 w brzeczce poprzez próbę z cylinderkami agarowymi z supernatantem stosując jako organizm testujący Candida albicans A9 540. Brzeczki wykazujące aktywność przeciw Candida odwirowywano, rozcieńczano dziesięciokrotnie DMSO i sączono (Gelman Sciences Japan, Ltd. Ekicrodisc 13CR, wymiar porów 0,45 μm). Przesącze analizowano metodą HPLC na Excel pak SIL - C185 R (Yokogawa Electronic Co., Ltd.) stosując acetoni tryl: 0,02 M bufor fosforanowy, pH 7,0 (15:85) z prędkością przepływu 1 ml/min i z detekcją przy 254 nm oraz metodą TLC na płytkach do chromatografu cienkowarstwowej z żelem krzemionkowym (Kiesel gel F 254 0,25 mm; mfd Merck). Jako układy rozpuszczalników rozwijających stosowano n-butanol:kwas octowy:woda (2:1:1, BW14) i octan metylu:n-propanol:28% wodny amoniak (45:105:60, S-14). BMY - 289,0 miał czas retencji HPLC 11,5 minuty przy powyższym układzie rozpuszczalników i wartości Rf 0,50 i 0,24, stosując odpowiednio BW-14 i S-14.

Dokonano przeglądu różnych promieniowców i stwierdzono, że szczep AB 1236 należący do rodzaju Actinomadura wytwarza żądany związek na poziomie odpowiednim do produkcji masowej. Cechy taksonomiczne szczepu AB 1236 opisano poniżej.

II. Drobnoustrój produkujący bMy - 28 960.

Actinomadura sp. AB 1236 jest nowym szczepem wydzielonym z próbki gleby zebranej w Shinjuku, Tokio, Japonia, 24 października 1990. Kultura szczepu AB 1236 została zdeponowana w Amerykańskiej Kolekcji Typów Kultur (ATCC) zgodnie z Traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytów drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego i wszystkie ograniczenia co do ogólnej dostępności zostaną nieodwołalnie usunięte po udzieleniu patentu. Zdeponowana kultura została oznaczona numerem dostępności ATCC 55208.

A. Morfologia i cechy kulturowe szczepu AB 1236.

Środowisko i sposoby postępowania stosowane do badania taksonomicznego szczepu były takie jak opisane przez Shirlinga i Gottlieba w Methods for characterization of Streptomyces Species, Int.J.Syst.Bact.. 1966, 16 : 313-340; przez Waksmana w The Actinomycetes, tom II, Classification, Identification and Description of and Species, strony 328-334, opublikowanych przez The Williams Co., Baltimore, 19,1; i przez Arai w Culture Media for Actinomycetes,

169 264 opublikowanym przez The Society for Actinomycetes Japan, 1975. Szczep inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 do 4 tygodni. Oznaczenie barwy wykonano przez porównanie barwy kultury z barwnymi paskami według Manual of Color Names (Japan Color Enterprise Co., Ltd., 1987).

Szczep AB 1236 rósł lepiej w środowiskach organicznych niż w nieorganicznych w temperaturach pomiędzy 20 i 41°C i tworzył rozgałęzioną wegetatywną grzybnię. Barwa dojrzałych napowietrznych grzybni była biała do szarawobiałej zarówno na agarze drożdże skrobiajak i drożdżowo-skrobiowym agarze słodowym (YSM, skrobia rozpuszczalna 1 %, CaCk x 2H2O 0,05% i agar 1,5%). Pod mikroskopem optycznym i skaningowym mikroskopem elektronowym, wierzchołek krótkich sporoforów miał 2 do 8 zarodników napojedynczy łańcuch. Kształt tych zarodników był kulistopodobny o wymiarach 0,8-1,0 x 1,0-1,2 pm), a ich powierzchnia była gładka. Zarodniki te nie były ruchome. Barwa wegatatywnych grzybni i pigmentów zdolnych do rozszerzania się na organiczne środowiska agarowe sięgała od lekko różowej do ciemnoczerwonej. Barwa zmieniała się od jasnopomarańczowej do silnie żółtawopomarańczowej po dodaniu 0,1 N HCl. Cechy kulturowe szczepu AB 1236 na różnych podłożach agarowych zsumowano w tabeli 1.

Tabela 1

Cechy kulturowe szczepu AB 1236

Podłoże	Wzrost	Spód	Grzybnia napowietrzna	Rozpuszczalny pigment
Agar z azotanu sacharozy (Waksman med nr 1)	Żółtawobiały (393)	Żółtawobiały (393)	Brak	Brak
Agar z azotanu gliceryny	Szarawoczerwony (60), dobry	Szarawoczerwony (60)	Brak	Różowobiały
Agar z asparginy glikozowej (Waksman med, nr 2)	Żółtawobiały (393), dobry	Żółtawobiały (393)	Brak	Brak
Agar z ekstraktu drożdży-eks-	Ciemnoczerwo-	Ciemno-	Szarawobiały	Ciemnoczer-
traktu słodu (ISP med nr 2)	ny (57), dobry	czerwony (57)	(390) do różowobiałej (391)	wony (58)
Agar z mąki owsianej (ISP med,	Jasnoróżowy	Jasnoróżowy	Biała (388),	Jasnoróżowy
nr 3)	(25), dobry	(25)	puszysta	(26)
Sole nieorganiczne-agar skrobiowy (ISP med. nr 4)	Żółtawobiały (393), dobry	Żółtawobiały (393) do różowobiałego (391)	Brak	Brak
Agar z asparginy glicerynowej	Ciemnoczerwony (58), dobry	Ciemnoczerwony (58)	Brak	Jasnoróżowy (25)
Agar tyrozynowy (ISP med nr 7)	Ciemnoczerwony (58), dobry	Ciemnoczerwony (58)	Brak	Jasnoróżowy (25)
Agar odżywczy (Waksman med. nr 14)	Żółtawobiały (393), słaby	Żółtawobiały (393)	Brak	Brak
Agar drożdżowo-skrobiowy	Ciemnoszara- woczerwony (61), dobry	Ciemnoszara- woczerwony (61)	Biała (388) do szarawobiałej (390), puszysta	Ciemnożółtawoczerwony (53)
Agar Bennetta	Ciemnoczerwony (57), dobry	Ciemnoczerwony (57)	Szarawobiała (390), rzadka	Ciemnoróżowy (22)

Cechy fizjologiczne szczepu AB 1236

Cechy fizjologiczne i sposób wykorzystania źródła węgla szczepu AB 1236 przedstawiono odpowiednio w tabelach 2 i 3.

169 264

Tabela 2

Cechy fizjologiczne szczepu AB 1236

Test	Wyniki
Hydroliza skrobi (ISP med nr 4)	+
Redukcja azotanu (Difco, brzeczka azotanowa)	+
Koagulacja 10% odtłuszczonego mleka (Difco, 10% chude mleko)	+
Peptonizacja	+
Rozkład celulozy (roztwór azotanu sacharozy z paskiem papieru jako jedy-	+
nym źródłem węgla
Przeprowadzanie żelatyny w stan ciekły	Brak wzrostu
Tworzenie melaminy
Na ISP med. nr 7	-
Zakres temperatury dla wzrostu (°C)	20-41
Optymalna temperatura (°C) (na agarze skrobiowo - drożdżowym)	30,5-35,5
Zakres pH dla wzrostu	6-8
Optymalne pH (na brzeczce z tryptykazy sojowej, BBL)	7

- Negatywny + Pozytywny

Tabela 3

Wykorzystanie źródeł węgla przez szczep AB 1236

Źródło węgla	Wykorzystanie
D - glikoza	+
L - arabinoza	+
D - ksyloza	+
Inosyt	+
Mannit	+
D - fruktoza	+
L - ramnoza	+
Sacharoza	+
Rafinoza	+

+ . Pozytywne (ISP med. nr 9, 37°C przez 3 tygodnie)

Wrażliwość szczepu AB 1236 na antybiotyki testowano stosując krążki do antybiotyków (Tridisk, Eiken Chemical Co., Ltd.). Krążki umieszczono na powierzchni agaru słodowego z drożdżami - glikozą (ekstrakt drożdżowy 0,1 %, glikoza 1 %, ekstrakt słodu 0,1 %, CaCh x 2 H2O 0,05% 1 agar 1,5%), w którym wsiano szczep AB 1236 (4% inokulum) i płytki następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 dni. Szczep AB 1236 był odporny na 50 μg fosfomycyny i 300 U polimiksyny B, a wrażliwy na 20 U ampicyliny, 1 gg kwasu klawulanowego, 2 gg tikarcyliny, 10 gg cefaleksyny, 30 gg tetracykliny, 10 gg chloramfenikolu, 0,5 gg erytromycyny, 2 gg jozamycyny, 2 gg linkomycyny, 5 gg kanamycyny, 5 gg gentamycyny, 5 gg torbamycyny, 2 gg kwasu nalidiksowego, 2 gg norfloksacyny i 50 U kolistyny.

C. Analiza chemiczna komórek AB 1236.

Skład całych komórek analizowano metodą opisaną przez Beckera i Lachevaliera, Rapid Differentiation between Nocardia i Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysate, Appl.Microb., 1964,12:421-423 i Composition ofClell-Wall Preparations from Strains of Various Form Genera of Aerobic Actionomycetes, Appl.Microb., 1965, 13 : 236-243. Szczep AB 1236 zawierał kwas mezodiaminopimerinowy, madurozę, rybozę, mannozę, glikozę i galaktozę. Tak więc szczep AB 1236 ma ścianę komórki należącą do typu III B. Kwasów mikolowych nie wykryto metodą Minnikina i in. Differentation of Mycobacterium, Nocardia

169 264 and Related Taxa by Thin-Layer Chromotographic Analysis of Whole-Organise Methandysates, J. Gen. Microb., 1975, 88 : 200-204. Analiza fosfolipidów sposobem opisanym przez Lechevaliera i in. Identyfikation of Aerobic Actionomycetes of Clinical Importance, J. Lab. Clin. Med., 1968, 71 : 934-944, i Chemataxonony of Aerobic Actionomycetes Phospholipid Composition, Biochem. Syst. Ecol., 1977, 5 : 249-260, wykazała, że ścianka komórki szczepu AB 1236 była typu P 1 zawierającego mannozyd difosfatydyloinozytu, fosfatydyloinozyt i difosfatydyloglicerynę. Analiza składu menochinonów sposobem opisanym przez Collinsa i in. A Note on the Separation of Natural Mixtures of Bacterial Menaquinones Using Reverse-Phase Thin-Lager Chromatography, J. Appl. Bacteriol., 1980,48 : 277-284, wykazała 47% MK-9 (H 8), 35% MK-9 (H 6) , 10% MK-9 (Hi 4) i 8% M.K-9 (H 10). Kwasytłuszczowe zcałych komórek oznazznoo metoąą Suzuki i in. Taxzzomic Significance of Cellular Faty Acids Composition in Some Caryneform Bncterin, Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33 :188-200. Składały się one z 49% kwasu 14-metylopentadekczowegz (izo 16:0), 13% kwasu metylzheksadekczzwego (anteizz-17:0) i 8 % kwasu 10-met.yloCeptadekcnowego (10 Me-17:0) i innych kwasów tłuszczowych w mniejszych ilościach.

Szczep AB 1236 miał morfologiczne, kulturowe i cCemotneszzomiczne właściwości zgodne z właściwościami rodzaju Aatizzmadura Lechevalier i LecCevalier oraz z definicją tego rodzaju zaproponowaną przez Kroppenstedta i in. w Taksonomic Revision of the Actiznomycetes Genera Actionomadura and Microtetócupera System. Appl. Microbiol., 1990, 13 : 148-160. Tak więc szczep AB 1236 zidentyfikowano jako gatunek Actinomadura.

UL Wytwarzanie antybiotyku

BMY - 28960 i deksylozylo-BMY-28960 można wytwarzać przez szczep AB 1236 w warunkach powszechnie stosowanych do wytwarzania zwykłych produktów fermentacyjnych. Organizm produkujący wzrasta w środowisku środka odżywczego zawierającym przyswajalne źródło D-seryny oprócz znanych źródeł odżywczych dla promieniowców, to jest przyswajalnych źródeł węgla i azotu plus ewentualnie soli nieorganicznych i innych znanych czynników wzrostu. Do wytwarzania dużych ilości antybiotyku korzystnie jest stosować warunki zamknięcia z dostępem tlenu, chociaż do wytwarzania ilości ograniczonych można także stosować kultury powierzchniowe i kolby.

Jako przyswajalne źródło D-seryny można stosować zarówno D-serynę, jak tez DL-serynę. Przykładami przyswajalnego źródła węgla są gliceryna; cukry takie jak ryboza, glikoza, sacharoza, ceHo^oza; skrobia i inne węglowodory takie jak dekstran. Przykładami źródła przyswajalnego azotu są chlorek amonu, siarczan amonu, mocznik, azotan amonu, azotan sodu i źródła azotu organicznego, takiejak pepton, ekstrakt z mięsa, ekstrakt z drożdży, namok kukurydziany, sproszkowana soja, mąka z nasion bawełny i tym podobne. Można także dodać, jeśli to konieczne, sole nieorganiczne, takiejak chlorek kobaltu i fosforan potasu. Ponadto wytwarzanie antybiotyku rośnie z dodaniem do pożywki produkcyjnej treoniny; treonina może być D-treoniną, L-treoniną lub ich mieszaniną. Dodanie D-cykloseryny również poprawia wytwarzanie antybiotyku. Korzystną ciekłą pożywkę opisano w przykładzie II lub w przykładzie III. Inna, bardziej konwencjonalna ciekła pożywka składa się z glikozy i/lub gliceryny (1-4%), PCcrmamedla(3%), KH2PO4, (0,1-0,2%) i D-seryny (0,1-0,2%). Jako środki przeciw pienieniu można stosować adekazzl, silikon i podobne.

Wytwarzanie antybiotyku można prowadzić w każdej temperaturze sprzyjającej zadawalającemu wzrostowi organizmu wytwarzającego. Na ogół optymalnie wytwarzanie antybiotyku uzyskuje się w kolbach do wytrząsania po okresie inkubacji 5-14 dni, chociaż w określonych przypadkach dłuższy okres może być niezbędny. Napowietrzanie w kolbach do wytrząsania uzyskuje się przez mieszanie np. wytrząsanie na wytrząsarce obrotowej. Jeżeli fermentacja ma być prowadzona w fermentorach, pożądane jest wytwarzanie szczepionki wegetatywnej w brzeczce odżywczej przez szczepienie kultury brzeczki z kultury skośnej lub liofilizowanej kultury organizmu. Po uzyskaniu w ten sposób aktywnej szczepionki przenosi się ją αseptycznir do środowiska zbiornika fermentacyjnego. Pobudzenie w fermentatorze zapewnia się przez mieszanie, a napowietrzenie można uzyskać przez injekcję powietrza lub tlenu do pobudzonej mieszaniny. Wytwarzanie antybiotyku można kontrolować stosując technikę chromatograficzną lub spektroskopową bądź konwencjonalną próbę biologiczną. Korzystnymi warunkami fermentacji są hodowle tlenowcowe przy pH 5-8 w temperaturze 20-37°C przez 5-14 dni, korzystnie przy pH 6-7 w temperaturze 28-35°C przez 5-12 dni.

169 264

Powszechnie wiadomo, że właściwości taksonomiczne promieniowców można zmieniać naturalnie lub sztucznie. Tak więc należy rozumieć, że sposób wytwarzania antybiotyku o wzorze 1 nie ogranicza się do wymienionego konkretnego organizmu, ale obejmuje odmiany i mutanty otrzymane z konkretnego szczepu przez różne sztuczne metody, takie jak naświetlanie światłem ultrafioletowym lub promieniami X, lub przez chemiczne środki mutagenne takie jak N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna. Tak produkowane mutanty i odmiany można selekcjonować do produkcji antybiotyku sposobami postępowania opisanymi poprzednio.

IV. Wydzielenie i oczyszczenie antybiotyku.

BMY - 28960 i deksylo - BMY - 28960 można wydzielić z brzeczek kulturowych konwencjonalnymi sposobami postępowania dla wydzielania hydrofilowych substancji kwasowych. Przykłady takich sposobów postępowania obejmują ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym, stosowanie żywicy jonowymiennej, chromatografię podziałową i wytrącanie kwasowe; możnaje stosować pojedynczo lub w kombinacji. Przykładowy sposób postępowania przy wydzielaniu i oczyszczaniu jest następujący. Po zakończeniu fermentacji bulion doprowadza się do pH 2,0 i odwirowuje lub sączy. Powstały supernatant lub przesącz poddaje się adsorbcji na żywicy polimerycznej o wysokiej porowatości, takiej jak Diaion HP-20 (Mitsubishi Kasei Co), i eluuje wodą z mieszającymi się z wodą rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak metanol lub aceton. Tak otrzymany eluat zatęża się i liofilizuje w celu uzyskania surowego kompletu antybiotyku. W celu dalszego oczyszczania surowy materiał można podawać na kolumnę z żelem krzemionkowym z fazą odwróconą, taką jak YMC - ODS, A60 (Yamamura Chemical Lab.), i eluować acetonitrylem : 0,02 M buforem fosforanowym, pH 7,0. Frakcje zawierające BMY - 28960 łączy się i odsala w celu uzyskania czystego BMY - 28960. Deksylozylo - BMY - 28960 można uzyskać, stosując podobny sposób wydzielania i oczyszczania; korzystnie jest, aby brzeczka fermentacyjna nie była zakwaszona.

V. Fizykochemiczne właściwości antybiotyku.

BMY - 28960 otrzymany w wyniku hodowli drobnoustroju ma następujące właściwości, które są identyczne z właściwościami BMY - 28960 uzyskanego drogą półsyntezy, jak ujawniono w europejskim opisie patentowym EP 432 527.

/Wygląd: amorficzny ciemnoczerwonawo-pomarańczowy proszek

2/ Temperatura topnienia > 220°C (rozkład)

3/ FAB - MS (pozytywny): m/z 844 (M+H)+

4/Wzór cząsteczkowy: C39H41NO20

5/ Widmo absorbcji w UV, Zmaks nm (ε): 0,02 N NaOH:MeOH (1:1) : 211 (34.700), 320(15.100) 498 (14.100)

6/ Widmo IR: jak pokazano na fig. 1

7/ Rozpuszczalność w rozpuszczalnikach

Rozpuszczalny: dimetylosulfotlenek, N,N-dimetyloformamid i woda zalkalizowana. Słabo rozpuszczalny: etanol, metanol i aceton.

Nierozpuszczalny: octan etylu, benzen, chloroform, zakwaszona woda, itd.

8/ Chromatografia cienkowarstwowa (płytka z żelem krzemionkowym): Rf = 0,24 (octan metylu : n-propranol: 28% wodny amoniak = 45:105:60).

9/ Analiza HPLC

Kolumna: Cosmosil 5Ci8-AR, 5gm, 4,6 mm I.D x 150 mm Faza ruchoma: CH3CN : 0,02 M bufor fosforanowy pH 7,0 (15:85)

Szybkość przepływu: 1ml/min.

Detektor Uv : 254 nm Czas retencji: 11,5 min.

Wzorzec wewnętrzny: pradymicyna A (Rt = 9,7 min).

10/ Widmo ’H NMR: jak pokazano na fig. 2

11/ Widmo ¹³C NMR: jak pokazano na fig 3.

Deksylozylo - BMY - 28960 ma następujące właściwości fizykochemiczne:

Wygląd: Ciemnoczerwonawo-pomarańczowy proszek

2/Temperatura topnienia > 180°C

3/ HR - FAB - MS (pozytywny): m/z 712, 1871 (M+H)+

169 264

4/Wzór cząsteczkowy: C34H33NO16

5/ Widmo absorbcji w UV, X_maks nm (ε): w H2O - MeOH - DMSO (4,5:4,5:1): 470 (10.100), w 0,02 n HCl -MeOH - DMSO (4,5:4,5:1): 461 (10.600) w 0,02 N NaOH - MeOH (1:1) : 213 (31.500), 242 (30.100) 320 (13.600), 498 (12.600).

6/ Widmo IR (KBr) ν maks cm'¹: jak pokazano na fig. 4 7/ Rozpuszczalność w rozpuszczalnikach.

Rozpuszczalny: dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid i woda zalkalizowana.

Słabo rozpuszczalny: etanol, metanol, aceton i acetonitryl.

Nierozpuszczalny: zakwaszona woda, n-butanol i inne zwykłe rozpuszczalniki organiczne.

8/ Widmo *H NMR : jak pokazano na fig. 5.

VI. Aktywność biologiczna antybiotyku

Aktywności przeciwgrzybicze in vitro BMY - 28960 i deksylozylo -BMY - 28960 uzyskanych przez fermentację jak opisano wyżej oznaczano metodą rozcieńczania agoru na agarze na morfologię drożdży, zawierającym 1/15 M bufor fosforanowy (pH 7,0).

Wyniki przedstawiono w tabelach 4 i 5.

Tabela 4

Aktywność przeciwgrzybicza BMY - 28960 in vitro

Organizm testowany	BMY - 28960	Amfoterycyna B	Ketokonazol
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763	3,1	0,4	100
Candida albicans A9540	6,3	0,4	25
Candida albicans ATCC 38247	1,6	6,3	6,3
Candida albicans ATCC 32354 (B311)	3,1	0,2	50
Candida albicans 83-2-14 (Juntendo)	12,5	0,4	25
Candida tropicalis 85-8 (Kitasato)	12,5	0,4	100
Candida tropicalis IFO 10241	3,1	0,4	50
Cryptococcus neoformans D49	3,1	0,4	6,3
Cryptococcus neoformans IAM 4514	6,3	0,4	6,3
Aspergillus fumigatus IAM 2034	6,3	0,4	3,1
Trichophyton mentagrophytes nr 4329	6,3	0,4	0,8

Środowisko: Agar na morfologię drożdży + 1/15 M bufor fosforanowy (pH 7,0) Wielkość szczepionki: 10° komórek/ml (10⁷ komórek/ml dla T.mentagrophytes) Warunki inkubacji 28°C, 40 godzin (60 godzin dla T.mentagrophytes)

Tabela 5

Aktywność przeciwgrzybicza deksylozylo - BMY - 28960 in vitro

Organizm testowany	Deksylozylo BMY - 28960	BMY 28960	Amfoterycyna B
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763	3,1	1,6	0,8
Candida albicans A9540	3,1	3,1	0,8
Candida albicans IAM 4888	3,1	3,1	0,8
Candida albicans ATCC 32354 (B311)	3,1	3,1	0,8
Candida albicans 83-2-14 (Juntendo)	1,6	3,1	0,8
Candida tropicalis 85-8 (Kitasato)	1,6	12,5	1,6
Candida tropicalis IFO 10241	6,3	12,5	1,6
Cryptococcus neoformans D49	1,6	3,1	0,8
Cryptococcus sp. IAM 4514	3,1	1,6	0,8
Aspergillus fumigatus LAM 2034	6,3	3,1	0,8
Trichophyton mentagrophytes nr 4329	6,3	3,1	1,6

Środowisko Agar na morfologię drożdży + 1/15 M bufor fosforanowy (pH 7,0) Wielkość szczepionki 10⁶ komórek/ml (Tm 10⁷ komórek/ml)

Warunki inkubacji 28°C, 40 godzin (60 godzin dla T.mentagrophytes)

169 264

Skuteczność BMY - 28960 in vitro oceniano przeciwko infekcji systemicznej Candida albicans A9540 u samców myszy ICR (ciężar ciała 20-24 g). Do każdego poziomu dawki stosowano pięć myszy. Myszy prowokowano dożylnie 10-krotnością średniej dawki śmiertelnej czynnika chorobotwórczego zawieszonego w roztworze soli fizjologicznej i podawano jednorazowo dożylnie BMY - 28960 bezpośrednio po prowokacji. Średnią dawkę ochronną (PD50) obliczono ze współczynnika przeżycia na 21 dzień. Wyniki zsumowano w tabeli 6.

Tabela 6

Skuteczność in vitro przeciwko systemicznej infekcji C. albicans A9540 u myszy

Związek	PD50 (mg kg, i.v.)
BMY - 28960	6,7
Pradymicyna A	10
Amfoterycyna B	0,31
Flukonazol	>50

BMY - 28960 był dobrze tolerowany przez myszy ICR; nie zaobserwowano ani śmiertelności, ani widocznych efektów ubocznych po dożylnym podawaniu BMY - 28960 do 600 mg/kg.

Następujące przykłady podano w celu pełniejszego zilustrowania wynalazku i nie powinno się ich interpretować w żaden sposób ograniczający zakres tego wynalazku.

Przykład I. Kultura posiewowa.

Macierzystą kulturę ustroju wytwarzającego Actinomadura sp. AB 1236 (ATCC 55208) naniesiono pasmowo na skos z agarem YSM i inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 tygodnie. Jedno oczko ezy szczepu szczepiono do 500 ml kolby Erlenmayera zawierającej 100 ml pożywki złożonej z glikozy 0,5%, rozpuszczalnej skrobii 2%, ekstraktu z drożdży 0,2%, NZ - kazy 0,3%, ekstraktu z mączki rybnej D30X (Banyn Eiyou K.K) 0,5% i CaCO3 0,3% (pH pożywki doprowadzono do 7,0 przed autoklarowaniem). Kulturę inkubowano na wstrząsarce obrotowej w temperaturze 32°C przez 5 dni i stosowano jako kulturę posiewową.

Przykład II. Fermentacja w kolbie.

Każdą 5-ml porcję kultury posiewowej, otrzymanej w przykładzie I, przenoszono do 500 ml kolby Erlenmayera zawierającej 100 ml pożywki produkcyjnej złożonej z gliceryny 2%, Esusan mito (mączka sojowa; Ajinomoto Co., Inc.) 1,5%, K2HPO4 0,0025%, KH2PO4 0,1125%, CaCl2 x 6H2O 0,0005% i D-seryny 0,125% z D-cykloseryną (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) 10 (ig/ml. Kulturę inkubowano na obrotowej wytrząsarce pracującej przy 200 obrotach /minutę w temperaturze 28°C przez 12 dni, w którym to czasie wytwarzanie BMY - 28960 osiągnęło 530 pg/ml.

Przykład III. Fermentacja w kolbie (wpływ dodania treoniny).

Każdą 5-ml porcję kultury posiewowej, otrzymanej w przykładzie I, przeniesiono do 500 ml kolby Erlenmayera zawierającej 100 ml pożywki produkcyjnej złożonej z gliceryny 2%, Pharmamedia (Traders Protein) 1,5%, KH2PO4 0,1%, L- lub D-treoniny 0,2%, CaCh x 6H2O 0,0005%, D-seryny 0,2% i D-cykloseryny 10 pg/ml. Kulturę inkubowano na obrotowej wytrząsarce (200 obrotów/minutę przez 11 dni w temperaturze 28°C. Aby stwierdzić wpływ treoniny na wytwarzanie BMY - 28960, fermentację prowadzono także przy braku treoniny. Wyniki zsumowano poniżej.

Aminokwas Wytwarzanie BMY - 28960

L-treonina 1008pg/gil

D-treonina 954

- 780

Przykład IV. Wydzielanie i oczyszczanie BMY - 28960

Brzeczkę fermentacyjną w ilości 2,0 litrów z przykładu II zakwaszono do pH 2,0 stosując 6H HCl i odwirowano. Supernatant (1,7 litra) podano na kolumnę Dision HP-20 (300 ml) i kolumnę tę początkowo przemywano wodą (1,5 litra), a następnie eluowano 1,6 litra metanolu.

169 264

Eluat zatężano i następnie liofilizowano, uzyskując 2,1 g surowej stałej substancji. Substancję tę rozpuszczono w 1 litrze wody, a pH roztworu doprowadzono do 6,3 za pomocą 1N NaOH. Roztwór podano na kolumnę Diaion HP-20 i kolumnę początkowo przemyto mieszaniną 0,002N HCl · (1:1), a następnie eluowano 1 litrem mieszaniny 0,002N NaOH : aceton (1:1). Zatężenie eluatu dało substancję stałą (690 mg). Część (400 mg) substancji stałej rozpuszczono w mieszaninie acetonitryl : 0,02 M bufor fosforanowy, pH 7,0 (12,5 : 87,5, 30 ml) i poddano chromatografii na kolumnie z żelem YMC, ODS A60 (500 ml, Yamamura Chemical Lab.), który doprowadzono do równowagi tym samym układem rozpuszczalników. Eluowanie wykonano tym samym rozpuszczalnikiem. Frakcje zawierające BMY - 28960 zatężono, odsolono za pomocą Diaion HP-20 i liofilizowano w celu uzyskania BMY - 28960 (82 mg).

Przykład V. Wydzielenie i oczyszczenie deksylozylo - BMY - 28960.

Brzeczkę hodowlaną (25 litrów) otrzymaną przez fermentację szczepu AB 1236 w obecności D-seryny odwirowano. Supernatant (27 litrów) przepuszczono przez 3,8 litra Diaionu HP-20. Żywicę przemyto sukcesywnie 80% wodnym acetonem (81 ) i mieszaniną aceton-0,01N HCl (60:40) (12 l), a następnie eluowano mieszaniną aceton-0,01N NaOH (60:40) (12 l) uzyskując 16,04 g surowego produktu. Kompleks (2 g) rozpuszczono w 200 ml mieszaniny CH3CN - 0,02 M bufor fosforanowy, pH 7,0 (13:87) i podano na kolumnę z żelem YMC, ODS-A60 (10 l, Yamamura Chemical Lab.), którą doprowadzono do równowagi tym samym układem rozpuszczalników. Eluowanie przeprowadzono tym samym układem rozpuszczalników, który stosowano do rozpuszczenia próbki i eluaty, kontrolowano metody HPLC (Kolumna : Cosmosil 5Ci8 AR, 5gm, 4,6 i.d. x 150 mm, Nacalai Tesque Inc., faza ruchoma: CH3CN -1/15 M bufor fosforanowy, pH 3,5 (27:73), szybkość przepływu 1,0 ml/min., detekcja: absorpcja UV w 254 nm, czas retencji: deksylozylo - BMY - 28960 8,3 min.: BMY - 28960,7,6 min.). Szybciej eluowaną czerwoną frakcję (3,7 l) zawierającą deksylozylo - BMY - 28960 zatężono i poddawano chromatografii na kolumnie Diaion HP-20 (30 ml) stosując jako eluent mieszaninę aceton-0,1N NaOH (60:40) (50 ml). Czerwone eluaty zatężono i liofilizowano, uzyskując 29 mg substancji stałej. Wodny roztwór (30 ml) próbki doprowadzono do pH 2,5 za pomocą 0,1N HCl wytrącając czysty deksylozylo - BMY - 28960 (19 mg). Wolniej wymywaną frakcję (24 l) z chromatografii na żelu YMC opracowano w podobny sposób uzyskując 700 mg czystego BMY - 28960.

169 264

Η : R1 - CH₃; r2=0H jj : R¹ = CH₂OH i R²=OH

Wzór 2

169 264

169 264

169 264

PPM

169 264

Dtugość fali w mikrometrach

MO

Liczba falowa (^cm_1)

169 264

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz

Cena 4,00 zł

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania antybiotyku pradymicynowego o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub β-D-ksylozyl, znamienny tym, że hoduje się szczep Actinomadura zdolny do wytwarzania tego antybiotyku w pożywce stanowiącej środowisko wodne zawierające przyswajalne źródło węgla, azotu i D-seryny w warunkach tlenowych, po czym odzyskuje się antybiotyk z brzeczki hodowlanej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się szczep Actimadura AB 1236, zdeponowany w Amerykańskiej Kolekcji Typów Kultur (ATCC) pod nr dostępności ATCC 55208.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pożywkę zawierającą ponadto D-cykloserynę.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się pożywkę zawierającą ponadto D-cykloserynę
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się pożywkę zawierającą ponadto treoninę.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, ze stosuje się pożywkę zawierającą ponadto treoninę.