RU2057181C1 - Способ получения антибиотика прадимицина, штамм actinomadura species - продуцент прадимицина - Google Patents

Способ получения антибиотика прадимицина, штамм actinomadura species - продуцент прадимицина Download PDF

Info

Publication number
RU2057181C1
RU2057181C1 SU925052180A SU5052180A RU2057181C1 RU 2057181 C1 RU2057181 C1 RU 2057181C1 SU 925052180 A SU925052180 A SU 925052180A SU 5052180 A SU5052180 A SU 5052180A RU 2057181 C1 RU2057181 C1 RU 2057181C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
pradimycin
strain
vmu
species
antibiotic
Prior art date
Application number
SU925052180A
Other languages
English (en)
Inventor
Фурумай Тамотсу
Хатори Масами
Какусима Масатоси
Икеда Тихару
Сайтох Киойтиро
Кобару Сейкити
Original Assignee
Бристоль-Мейерз Сквибб Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бристоль-Мейерз Сквибб Компани filed Critical Бристоль-Мейерз Сквибб Компани
Application granted granted Critical
Publication of RU2057181C1 publication Critical patent/RU2057181C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/244—Anthraquinone radicals, e.g. sennosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/03—Actinomadura
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/825—Actinomadura

Abstract

Использование: микробиологическая и медицинская промышленность, производство антибиотиков. Сущность изобретения: способ получения антибиотика прадимицина культивированием штамма микроорганизма вида Actinomadura species АВ 1236, АТСС 55208 в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральных солей, Д-серии, Д-циклосерин и треонин, погруженным методом, выделением целевого продукта из культуральной жидкости и его очисткой. 2 с. п. ф-лы, 5 ил., 6 табл.

Description

Изобретение относится к способу ферментации, предназначенному для получения прадимициновых антибиотиков, а также к продуцированию микроорганизма указанных антибиотиков.
Среди различных описанных соединений семейства прадимицина, продуцируемого разновидностью Actinomadura, прадимицины FA-I (Ia) и FA-2 (Ib) [1] содержат фрагмент D-серина. Бенаномицин А (II) соединение, являющееся ближайшим аналогом прадимицинов, было описано в I.Autibiot, 1988, 41:807-811; это соединение отличается от прадимицинов тем, что в нем отсутствует аминогруппа сахаров, свойственная прадимицинам. В заявке на Европейский патент 432827, опубликованной 19 июня 1991 г раскрывается соединение 4'-деамино-4'-аксиальный-гидроксипрадимицин Fa-2 (III, далее в тексте ВМУ-28960), который получают из прадимицина FA-2 химическими средствами. В ЕР 432527 также раскрыт ВМУ-28960 и это соединение может быть получено из диэксилозил прадимицина FA-2.
Figure 00000001
Figure 00000002

Ia R' CH2OH; R2 NHCH3
Ib R' CH2OH; R2 NH2
II R' CH3; R2 OH
III R' CH2OH; R2 OH
Химические способы получения ВМУ-28960 и его дезксилозильного производного трудны и трудоемки, причем в результате целевые продукты получают с низким выходом. Таким образом, чрезвычайно желательна разработка альтернативного способа, пригодного для массового производства таких антибиотиков. В результате интенсивного поиска микроорганизмов, способных продуцировать ВМУ-28960 и деэксилозил ВМУ-28960, было установлено, что таким продуцентом антибиотика является новый штамм микроорганизма, принадлежащий к виду Actinomadura.
Настоящим изобретением обеспечивается способ получения антибиотика общей формулы:
Figure 00000003
Figure 00000004
H в которой R представляет собой водород или β-D-ксилозил, заключающийся в культивации штамма Actinomadura, способного продуцировать указанный антибиотик в водной среде, содержащей ассимилируемый источник углерода, азота и D-серина в аэробных условиях и регенерации указанного антибиотика из культурного бульона. Предпочтительно продуцирующий организм представляет собой Actinomadura sp. АВ 1236 АТСС 55208. Согласно предпочтительному тоническому решению ферментационная среда дополнительно содержит D-циклосерин.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает биологически чистую культуру микроорганизма Actinomadura sp. АВ 1236 с идентификационными характеристиками согласно АТСС 55208 и способную продуцировать ВМУ-28960 и деэксилозил ВМУ-28960 в ходе культивации в водной среде, содержащей ассимилируемый источник углерода, азота и D-серина.
На фиг. 1 представлен ИК-спектр (KBr) ВМУ-28960; на фиг.2 1Н ЯМР спектр (ДМСО-Д6, 400 МГц) ВМУ-28960; на фиг.3 13С-ЯМР спектр (ДМСО-Д6, 100 МГц) ВМУ-28960; на фиг.4 ИК-спектр (КBr) десксилозил ВМУ-28960; на фиг.5 1H-ЯМР спектр (ДМСО-д6, 400 МГц) десксилозил ВМУ-28960.
Настоящее изобретение обеспечивает способ ферментации, пригодный для массового производства ВМУ-28960, и дескилозил ВМУ-28960. В таком способе используется новый микроорганизм, принадлежащий к роду Actinomadura.
I. Скрининг микроорганизмов, продуцирующих ВМУ-28960
Полную петлю каждого актиномицета, выделенного из образцов почвы, инокулировали в виде пятна на три агаровые пластины, глюкозадрожжевой сойтоновый агар (глюкоза 1% дрожжевой экстракт 0,05% сойтон (Дифко Лабораторис) 0,05% CaCl2 x x 2H2O 0,01% и агар 1,5%), глицерин-дрожжевой сойтоновый агар (глицерин 1% дрожжевой экстракт 0,05% сойтон, 0,05% CaCl2·2H2O, 0,01% и агар 1,5% ) и крахмал-дрожжевой сойтоновой агар (растворимый крахмал 1% дрожжевой экстракт 0,05% сойтон 0,05% CaCl2·2H2O 0,01% и агар 1,5%) и затем инкубировали в течение 1-2 недель при 37оС. Штаммы, продуцирующие способные к диффузии пигменты с цветом от темно-фиолетового до темно-красного, на каждой агаровой пластине инокулировали в 500-мл Эрленмейровские колбы, содержащие 100 мл продукционной среды, составленной из 2% глицерина. Эсусан мито (Аджиномото Ко. Клт. ) 1,5% CoCl2 ·6H2O 0,000 1% KH2PO4 0,1125% К2НРО4 0,0025% и D-серина 0,2% и инкубировали на роторном встряхивателе (200 об/мин) при 32оС. Через 10 дней инкубации за продуцированием ВМУ-28960 в бульоне следили с помощью анализа надосадочной жидкости в агаровых отверстиях с использованием в качестве испытательного организма Candida albicans А9540.
Бульоны с анти-Candida активностью центрифугировали, разбавляли в 10 раз с помощью ДМСО и фильтровали (Гелман Сайнсез Джэпэн, Лтд. Экикродиск 1302, размер пор: 0,45 мкм). Фильтраты анализировали методом HPIC на Эксцел пак SIL-C185R (Екогава Электроник Ко. Лтд.) с использованием системы ацетонитрил: 0,02 М фосфатный буффер, рН 7,0 (15:85) при объемной скорости 1 мл/мин с детекцией при длине волны 254 нм и с помощью ТСХ на силикагелевых тонко-слойных пластинах (Кэйзель гель 60 F254 0,25 мм: mfd Мерк). В качестве проявляющих растворительных систем использовали смесь н-бутанол: уксусная кислота:вода (2:1:1, BW 14) и метилацетат: н-пропанол: 28% воды, аммиак (45: 10: 5: 60), S-114, ВМУ-28960 имел время удерживания в методе НPIC 11,5 мин в присутствии указанной выше системы растворителей и значения 0,50 и 0,24 при исполь- зовании BW-14 и S-114 соответственно.
Различные актиномицеты подвергали скринингу и было установлено, что штамм АВ 1236, принадлежащий к виду Actinomadura, продуцирует желаемое соединение с уровнем содержания, подходящим для массового получения. Таксономные характеристики штамма АВ 1236 будут описаны ниже.
II. Организм продуцирующий ВМУ-28960.
Actinomadura sp. АВ1236 представляет собой новый штамм, выделенный из образца почвы, собранного в Шиндужку, Токио, Япония 24 октября 1990 г. Культура штамма АВ 1236 была депонирована в Американской коллекции типовых культур в соответствии с Будапештским договором по международному признанию депонирования микроорганизмов в целях патентования, и все ограничения, касающиеся доступности депонированных микроорганизмов, будут окончательно сняты после выдачи патента по настоящей заявке. Депонированной культуре был присвоен каталожный номер АТСС 55208
А. Морфология и культуральные характеристики штамма АВ 1236
Среда и методы, используемые для таксономического исследования штамма, описаны Ширлингом и Готтлибом в статье "Методы и характеристики разновидностей Steptomyces", Int. J. Syst. Bact. 1966, 16: 313-340; Ваксманом в книге Актиномицеты, т.11, Классификация, идентификация и описание вида и разновидностей, с. 328-334. / Под ред. Вильямса и Вилкинса Ко. Балтимора, 1961; Аран в статье "Культурная среда для антиномицет, опубликованной Японским обществом актиномицет, 1975, Штамм инкубировали в течение 2-4 недель при 37оС. Определение цветовых характеристики проводили путем сравнения цвета культуры с цветом чипсов (chips) в соответствии с Manual of color names (Джэпэн Колор Энтерпрайс Ко. Лтд. 1987).
Штамм АВ 1236 лучше рос на органической среде, чем на неорганической среде при температурах 20-41оС и образовывал разветвленный вегетативный мицелий. Зрелый воздушный мицелий имел цвет в интервале от белого до серовато-белого как на дрожжевом крахмальном агаре, так и на дрожжевом-крахмально-солодовом агаре (YSM, растворимый крахмал 1% дрожжевой экстракт 0,1% солодовый экстракт 0,1% CaCl2·2H2O 0,05% и агар 1,5%).
Методом сканирующей электронной микроскопии было установлено, что верхняя часть коротких спорофор имела по 2-8 спор на одну цепь. Форма таких спор была субсферической (0,8-1,0х1,0-1,2 мкм по размеру) и их поверхность была гладкой. Такие споры не обладают подвижностью. Цвет вегетативного мицелия и способных к диффузии пигментов на органической агаровой среде изменялся от бледно-фиолетового до темно-красного. В результате добавления 0,1 N HCl цвет изменялся от бледно-оранжевого до яркого желтовато-оранжевого. В табл.1 суммированы культуральные характеристики штамма АВ 1236 на различных агаровых средах.
В. Физиологические характеристики штамма АВ 1236.
В табл. 2 и 3 представлены физиологические характеристики и примеры утилизации источников углерода штамма АВ 1236.
Антибиотическую восприимчивость штамма АВ 1236 испытывали с использованием антибиотических дисков (Тридиск, Эйке, Кэмикл Ко. Лтд.). Такие диски помещали на поверхность дрожжевого глюкозно-солодового агара (дрожжевой экстрат 0,1% глюкоза 1% солодовый экстракт 0,1% CaCl2·2H2O ),05% и агар 1,5% ), которые засевали штаммом АВ 1236 (4% прививочного материала), после чего пластины инкубировали в течение 4 дней при 37оС. Штамм АВ 1236 оказался устойчивым в отношении 50 мкг фосфомицина и 300 ед. поли- миксина В и восприимчивым к 20У ампицилина, 1 мкг клавулановой кислоты, 2 мкг тикарциллина, 10 мкг цефалексина, 30 мкг тетрациклина, 10 мкг хлорамникола, 0,5 мкг эритромицина, 2 мкг езомицина, 2 мкг линомицина, 5 мкг канамицина, 5 мкг гентамицина, 5 мкг тобрамицина, 2 мкг налидиксовой кислоты, 2 мкг норфлоксацина и 50 У колистина.
С. Химический анализ клеток АВ 1236.
Композиции целевых клеток анализировали в соответствии со способом, описанным Бекером и Лешевалье в статье "Быстрая дифференциация между Nocardia и Spreptomyces методом бумажной хроматографии гидролизата целых клеток" (Appl. Microb. 1964, 12, р.421-423) и в статье "Химические составы препаратов клеточных стенок из штаммов различных видоферм аэробных актиномицетов" (Appl. Microb, 1965, 13, р.236-243). Штамм АВ 1236 содержал мезо-диаминопимеровую кислоту, мадурозу, рибозу, маннозу, глюкозу и галактозу. Таким образом, штамм АВ 1236 имел клеточную стенку, принадлежащую к типу III В. Муколовые кислоты не детектировались по методу Миникина с сотр. описанному в статьи "Дифференциация Mycobacterium, Nocardia и родственной таксы с помощью анализа методом тонкослойной хроматографии метанолизатов целого организма" (J.Cen. Microb. 1975, 88, р.200-204). Фосфолипидный анализ с использованием метода Лешавалье с сотр. описанный в статьях "Идентификция аэробных актиномицет клинического значения" (J.Lab, Chin. Med. 1968, 71, р.984-944) и "Гемотаксономия аэробных актиномицет: фосфолипидная композиция" (Biochem. Syst. Ecol. 1977, 5, р.249-260), позволил установить, что клеточная стенка штамма АВ 1236 относится к типу РI, содержащему дифосфатидилинозитол моноид, фосфатидилнозитол и дифосфатилглицерин. Анализ менахинонового состава с использованием метода Коллинза с сотр. описанного в статье "Замечания относительно разделения природных смесей бактериальных менахинонов с использованием обратимофазной тонкослойной хроматографии" (J. Appl. Bacteriol, 1980, 48, р.277-282), позволил установить наличие 47 МК-9 (Н8), 35% МК-9 (Н6) 10% МК-9 (Н4) и 8% МК-9 (Н-10). Анализ на жирные кислоты целых клеток, проведенный согласно методу Сузуки с сотр. описанному в статье "Таксономическое значение состава клеточных жирных кислот в некоторых бактериях вида Корниформ" (Jut. J. Syst. Bacteriol. 1983, 33, р.188-200), позволил выявить наличие 49% 14-метаилпентадекановой кислоты (изо 16:0), 13% 14-метилгексадекановой кислоты (антиизо 17: 0) и 8% 10-метилгептадекановой кислот (10 Ме 17:0), при этом в системе присутствовали в небольших количествах другие жирные кислоты.
Штамм АВ 1236 имеет морфологические, культуральные и хемотоксономические свойства, согласующиеся со свойствами микроорганизма вида Actinomadura, описанного Лешевелье, и с характеристиками такого вида, предложенными Кроппенштедтом с сотр. в статье "Таксономическое исследование актиномицет вида Actinomadura и Microtetraspora" (System. Appl. Microbiol. 1990, 13, р.148-160). Таким образом, штамм АВ 1236 был идентифицирован как разновидность Actinomadura.
III. Продуцирование антибиотика.
ВМУ-28960 и ВМУ-28960 и дезксилозильный ВМУ-28960 может быть продуцирован штаммом АВ 1236 в условиях, которые традиционно применяются для получения общепринятых продуктов ферментации. Продуцирующий организм выращивают в питательной среде, содержащей ассимилируемый источник D-серина помимо известных питательных источников для актиномицет, т.е. ассимилируемых источников углерода и азота плюс необязательные неорганические соли и другие известные факторы роста. Аэробные условия при погружении предпочтительно используются для получения больших количеств антибиотика, хотя для получения ограниченных количеств можно также использовать поверхностные культуры и бутыли.
Могут применяться ассимилируемые источники D-серина либо D-серина или DI-серина. Примерами ассимилируемых источников углерода могут служить глицерин; такие сахара, как рибоза, глюкоза, сахароза, целлобиоза; крахмал; а также такие другие карбогидраты, как декстрин. Примерами ассилимируемых источников азота могут служить хлористый аммоний, сульфат аммония, мочевина, нитрат аммония, нитрат натрия, а также такие органические источники азота, как пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовая жидкость, соевой порошок, мука хлопкового семени и т.п. Могут также при необходимости добавляться такие неорганические соли как хлористый кобальт и фосфат калия. Кроме этого, получение антибиотика облегчается в результате добавления в продукционную среду треонина; в качестве треонина могут использоваться D-треонин, 1-треонин или их смесь. Получению антибиотика также благоприятствует добавление D-циклосерина. Предпочтительной жидкой средой является среда, описанная в примере 2 или примере 3. Другая более употребительная жидкая среда состоит из глюкозы и/или глицерина (1-4%), формамедина (1-3%), КН2РО4 (0,1-0,2%) и D-серина (0,1-0,2%). В качестве противовспенивающих агентов можно также использовать деканол, кремний и т.д.
Получение антибиотика можно осуществлять при любой температуре, подходящей для удовлетворительного роста продуцирующего организма. Обычно оптимальное производство антибиотика осуществляют во встряхиваемых колбах после периода инкубации в 5-14 дней, хотя в некоторых случаях период инкубации может быть более длительным. Аэрация в колбах со встряхиванием достигается перемешиванием, например, встряхиванием в роторной трясучке. Если ферментацию проводят в ферменторах, желательно получить вегетативный прививочный материал в питательном бульоне путем инокулирования культурного бульона из скошенных культур или лиофилизированной культуры организма. После получения таким методом активного прививочного материала его асептически переносят в среду ферментора. Перемешивание в ферменторе осуществляют механическими средствами, а аэрация может обеспечиваться инжектированием в перемешиваемую среду воздуха или кислорода. За ходом получения антибиотика можно следить с использованием хроматографических или спектроскопических методик или с помощью общепринятого биологического анализа. Предпочтительные условия ферментации включают аэробное культивирование при рН 5-8 при 20-37оС в течение 5-14 дней, предпочтительно при рН 6-7 и температуре 28-35оС в течение 5-12 дней.
Хотя в настоящем изобретении описывается получение антибиотика с помощью специфического штамма микроорганизма, хорошо известно, что таксономические свойства актиномицет могут регулироваться естественным путем или искусственно. Таким образом, следует иметь в виду, что способ настоящего изобретения не ограничивается конкретным микроорганизмом, а включает варианты и мутанты, полученные из конкретного штамма такими различными искусственными методами, как облучение ультрафиолетовым светом или рентгеновскими лучами или обработка такими химическими мутагенными агентами, как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин. Полученные таким образом мутанты и варианты могут быть подвергнуты скринингу на получение антибиотика по методике, описанной ранее.
IV. Выделение и очистка антибиотика
ВМУ-28960 и дезксилозил ВМУ-28960 могут быть выделены из культурных бульонов методами, традиционными для выделения гидрофильных кислотных соединений. Примерами таких методов могут служить экстракция органическим растворителем, использование ионо-обменных смол, распределительной хроматографии и кислотное осаждение, такие методы могут использоваться как таковые или в комбинациях друг с другом. Ниже следует пример метода выделения и очистки. После завершения ферментации рН бульона устанавливали на значении, равном 2, и подвергали центрифугированию или фильтровали. Полученный в результате надосадочный слой или фильтрат адсорбировали на такой высокопористой смоле, как Дианон НР-20 (Митшубиши Казеи Ко.) и элюировали таким несмешивающимся с водой органическим растворителем, как метанол или ацетон. Полученный таким образом элюат концентрировали, как метанол или ацетон. Полученный таким образом элюат концентрировали и лиофилизировали с получением сырого антибиотического комплекса. В целях дополнительной очистки сырой материал может быть загружен в обратимо-фазную силикагелевую колонку, например, УМС-ОДSA60 (Ямамура Кэмикл Лаб.) и элюирован смесью ацетонитрил: 0,02 М фосфатный буфер при рН 7,0. Фракции, содержащие ВМУ-28960, объединяли и обессоливали с получением чистого ВМУ-28960. Дезксилозил ВМУ-28960 может быть получен путем аналогичного выделения и очистки (предпочтительно не подкислять ферментационный бульон).
V. Физико-химические свойства антибиотика
ВМУ-28960, полученный по предлагаемому способу обладает следующими физико-химическими свойствами, которые идентичны свойствам ВМУ-28960, полученного путем полусинтеза в соответствии с ЕР 432 527.
Внешний вид: аморфный темно-красновато-оранжевый порошок.
Температура плавления: > 220оС (постепенное разложение).
FAB-MS (положительный): m/z 844 (М+Н)+
Молекулярная формула: C39H41NO20.
Спектр УФ-абсорбции, λмакс нм (ε):
0,02 N NaOH:MeOH (1:1) 211 (34,700), 320 (15, 100), 498 (14, 100).
ИК-спектр: показан на фиг.1.
Растворимость в растворителе
Растворим: диметил сульфоксид, N,N-диметилформамид и водный раствор щелочи.
Плохо растворим: этанол, метанол и ацетон.
Нерастворим: этил ацетат, бензол, хлороформ, подкисленная вода и т.п.
Тонкослойная хроматография (силикагелевая пластина):
Rf 0,24 (метил ацетат: н-пропанол: 28% водный аммиак 45:105:60).
Анализ HPIC:
Колонка: космесил 5С18-АR 5 мкм; 4,6 мм вн. диаметр х 150 мм.
Элюент СН3ССl: 0,02 М фосфатный буфер, рН 7,0 (15:85).
Объемная скорость: 1,0 мл/мин.
УФ-детектор: 254 нм.
Время удерживания: 11,5 мин.
Внутренний стандарт: прадимицин А (Rt 9,7 мин).
1Н ЯМР спектр: показан на фиг.2.
13С ЯМР-спектр: показан на фиг.3.
Дезксилозил ВМУ-28960 обладает следующими физико-химическими свойствами:
Внешний вид: темно-красновато-оранжевый порошок
Температура плавления: 180оС.
НР-FAB-MS (положительный): m/z 712.1871 (М+Н)+
Молекулярная формула: С34Н33NO16
УФ-абсорбционный спектр, λ макс нм ( ε):
в Н2О-МеОН-ДМСО (4,5:4,5:1); 470 (10, 100),
в 0,02 N HCl-MeOH-ДMCO (4,5:4,5:1): 461(10,600)
в 0,02 N NAOH-MeOH (1:1): 213 (31,500), 242 (30,100) 320 (13,600), 498 (12,600).
ИК-спектр (КBr) λ макс. см-1 показан на фиг.4.
Растворимость в растворителях
Растворим: диметилсульфоксид, диметилформамид и водные растворы щелочей.
Плохо растворим: этанол, метанол, ацетон и ацетонитрил.
Нерастворим: подкисленная вода, н-бутанол, этилацетат, хлороформ и другие общепринятые органические растворители.
1Н ЯМР спектр: показан на фиг.5.
VI. Биологические активности антибиотика
Противогрибковые активности in vitro ВМУ-28960 и дезксилозил ВМУ-28960, полученные в настоящем процессе ферментации, определяли общепринятым методом агарового разбавления на агаре дрожжевой морфологии, содержащем 1/15М фосфатного буфера (рН 7,0). Полученные результаты представлены в табл.4 и 5.
Среда: агар дрожжевой морфологии + 1/15 М фосфатный буфер (рН 7,0)
Количество прививочного материала: 106 кл/кл (107 кл/мл для Т).
Условия инкубации: 28оС, 40 с (60 ч для Т.mentagrophytes)
Среда: агар дрожжевой морфологии + 1/15М фосфатного буфера (рН 7,0).
Количество прививочного материала: 106 кл/мл (Тм: 107 кл/мл.
Условия инкубирования: 28оС, 40 ч (60 ч для T/mentagrophytes).
In vivo эффективность ВМУ-28960 оценивали по системному заражению Candida albicans А9540 самцов мышей разновидности ICR (масса тела 20-24 г). Для каждого уровня дозировки использовали группы из пяти мышей. Мышей подвергали внутривенному заражению 10-кратной средней летальной дозой патогена суспензированного в физиологическом растворе и сразу после заражения внутривенно применяли ВМУ-28960. Средние значения защитной дозы (РД50) рассчитывали на основании оценок выживания, зарегистрированный на 21 день. Полученные результаты представлены в табл.6.
ВМУ-28960 хорошо переносится мышами разновидности 10Р; после внутривенного применения ВМУ-28960 вплоть до дозировок 600 мг/кг не отмечалось летальности или каких-либо побочных эффектов.
Следующие ниже примеры приведены с целью более полной иллюстрации настоящего изобретения и они некоим образом не ограничивают сферу изобретения.
П р и м е р 1. Посевная культура
Чистую культуру продуцирующего организма Actinomadura разн. АВ 1236, АТССС 55208 наносили полосами на скос агара YSM и инкубировали в течение 2 недель при 37оС. Одну петлю штамма инокулировали в 500-мл Эрленмейеровскую колбу, содержащую 100 мл среды, состоящей из глюкозы 0,5% растворимого крахмала 2% дрожжевого экстракта 0,2% NZ-казы 0,3% экстракта рыбьего мяса ДЗОХ (Банму Ю К.К.) 0,5% и СаСО3 0,3% (рН среды устанавливали перед помещением в автоклав равным 7,0). Культуру инкубировали на роторном встряхивателе в течение 5 дней при 32оС и использовали в качестве посевной культуры.
П р и м е р 2.
Ферментация в колбе
5 мл порции посевной культуры, указанной в примере 1, переносили в 500-мл Эрленмейеровскую колбу, содержащую 100 мл продукционной среды, состоящей из 2% глицерина, 1,5% Эсусан ми-то (соевая мука: Аджиномото Ко. Инк. ), 0,025% К2НРО4, 0,1125% КН2О4 0,0005% СоCl2·6H2O и 0,125% D-серина в присутствии 10 мкг/мл D-циклосерина (Вако Пьюз Кэмикл Индастриез Лтд.). Культуру инкубировали на роторном встряхивателе при скорости 200 об/ин и при 28оС в течение 12 дней, при этом продуцирование ВМУ-28960 достигало 530 мкг/мл.
П р и м е р 3.
Ферментация в колбе (влияние добавления треонина)
5 мл порции посевной культуры, полученной в примере 1, переносили в 500-мл Эрленмейеровские колбы, содержащие 100 мл продуционной среды, состоящей из 2% глицерина, 1,5% фармамедиа (Трэйдерс Протеин), 0,1% КН2РО4, 0,2% 1-или D-треонина, 0,0005% СoСl2·6H2O, 0,2% D-серина и 10 мкг/мл D-циклосерина. Культуру инкубировали на роторном испарителе, работающем со скоростью 200 об/мин в течение 11 дней при 28оС. С целью демонстрации влияния треонина на продуцирование ВМУ-28960 ферментацию также осуществляли в отсутствии теронина. Полученные результаты представлены в табл.7.
П р и м е р 4.
Выделение и очистка ВМУ-28960
Ферментационный бульон (2,0 л) из примера 2 подкисляли до рН2 с использованием 6 N HCl и центрифугировали. Надосадочный слой (1,7 л) загружали на колонку Дианон НР-20 (300 мл) и такую колонку вначале промывали водой (1,5 л) и затем элюировали 1,6 л метанола. Элюат концентрировали и затем лиофилизировали с получением 2,1 г сырого продукта. Это твердое вещество растворяли в 1 л воды и рН раствора устанавливали равным 6,3 с помощью 1N NaOH. Полученный раствор применяли на колонке с Дианоном НР-20 и колонку вначале промывали смесью 0,002 N HCl: ацетон (1:1) и затем элюировали 1 л смеси 0,002 N NaOH: ацетон (1: 1). В результате концентрирования элюата получали твердое вещество (690 мг). Часть (400 мг) такого твердого вещества растворяли в смеси ацетонитрил: 0,02 М фосфатный буфер, рН 7,0 (12,5 87,5, 30 мл) и подвергали хроматографическому разделению на колонке с УМС гелем, ODS А60 (500 мл, Ямамара Кэкикл Лаб.), которую уравновешивали с помощью той же системы растворителей. Элюирование осуществляли с помощью того же растворителя. Фракции, содержащие ВМУ-28960, концентрировали, обессоливали с помощью Дианон НР-20 и лиофилизировали с получением ВМУ-28960 (82 мг).
П р и м е р 5. Выделение и очистка дезксилозил ВМУ-28960.
Культурный бульон (25 л), полученный ферментацией штамма ДВУ236 в присутствии Десерина, подвергали центрифугированию. Надосадочный слой (27 л) пропускали через 3,8 л Дианона НР-20. Смолу последовательно промывали 80% воды ацетона (8 л) и смесью ацетона 0,01 N HCl (60:40) (12 л) и затем элюировали смесью ацетон 0,01 N NaOH (60:40) (12 л) с получением 16,04 г сырого продукта. Комплекс (2 г) растворяли в 200 мл смеси СH3CN 0,02 М фосфатный буфер, рН 7,0 (13:87) и загружали на колонку с УМС гелем, ОДS A 60 (10 л, Ямамура Кэмикл Лаб.), которую уравновешивали той же системой растворителей. Элюирование осуществляли с помощью системы растворителей, которую использовали для растворения образца, и за составом элюатов следили методом НPIC. Колонка: Космосил 5С18 АР, 5 мкм, 4,6 мм вн.диаметр х 150 мм, Накалаи Теску Инк. подвижная фаза: CH3CN 1/15 М фосфатный буфер, рН 3,5 (27:73), объемная скорость: 1,0 мл/мин. Детекция: УФ-поглощение при 254 нм, время удерживания: дезксилозил ВМУ-28960 8,3 мин, ВМУ-28960, 7,6 мин). Быстро элюируемую красную фракцию (3,7 н), содержащую дезксидозил ВМУ-28960, концентрировали и подвергали хроматографической очистке на колонке с Дианоном НР-20 (30 мл) с использованием в качестве элюента смеси ацетон 0,1 N NaOH (60:40) (50 мл). Красные элюаты концентрировали и лиофилизировали с получением 29 мг твердого вещества. рН водного раствора образца устанавливали равным 2,5 с помощью 0,1 N HCl с целью осаждения чистого дезксилозил ВМУ-28960 (19 мг). Медленно элюирующую фракцию (24 л) со стадии хроматографирования на УМС геле обрабатывали аналогичным образом с получением 700 мг чистого ВМУ-28960.

Claims (2)

1. Способ получения антибиотика прадимицина, включающий культивирование штамма микроорганизма вида Actinomadura species в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральных солей и D-серии, погруженным методом, выделение целевого продукта из культуральной жидкости и его очистку, отличающийся тем, что культивируют штамм микроорганизма Actinomadura spesies АВ 1236, АТСС 55208, а питательная среда дополнительно содержит D-циклосерин и треонин.
2. Штамм Actinomadura species АВ 1236, АТСС - продуцент прадимицина.
SU925052180A 1991-07-31 1992-07-20 Способ получения антибиотика прадимицина, штамм actinomadura species - продуцент прадимицина RU2057181C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/739.019 1991-07-31
US07/739,019 US5194371A (en) 1991-07-31 1991-07-31 Production of pradimicin antibiotics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2057181C1 true RU2057181C1 (ru) 1996-03-27

Family

ID=24970472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU925052180A RU2057181C1 (ru) 1991-07-31 1992-07-20 Способ получения антибиотика прадимицина, штамм actinomadura species - продуцент прадимицина

Country Status (19)

Country Link
US (2) US5194371A (ru)
EP (1) EP0525588A2 (ru)
JP (1) JPH05227985A (ru)
KR (1) KR930019833A (ru)
CN (1) CN1033591C (ru)
AR (1) AR247247A1 (ru)
AU (1) AU652268B2 (ru)
CA (1) CA2071140A1 (ru)
CZ (1) CZ281277B6 (ru)
FI (1) FI923310A (ru)
HU (1) HUT66834A (ru)
IE (1) IE922354A1 (ru)
IL (1) IL102587A (ru)
NO (1) NO922864L (ru)
NZ (1) NZ243601A (ru)
PL (2) PL169657B1 (ru)
RU (1) RU2057181C1 (ru)
TW (1) TW215929B (ru)
ZA (1) ZA924167B (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5326867A (en) * 1992-07-16 1994-07-05 Bristol-Myers Squibb Company Pradimic acids, amides, and pradimicin derivatives
US7750030B2 (en) 2001-03-29 2010-07-06 Michael Davis Acute pharmacologic augmentation of psychotherapy with enhancers of learning or conditioning
JP4046708B2 (ja) * 2004-06-04 2008-02-13 明治製菓株式会社 ３−アルケニルセフェム化合物の製造方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4870165A (en) * 1987-02-02 1989-09-26 Bristol-Myers Company Antifungal antibiotics
US4990497A (en) * 1987-02-02 1991-02-05 Toshikazu Oki Antifungal antibiotics
US4992425A (en) * 1988-06-07 1991-02-12 Bristol-Myers Company Antibiotics BU-3608D and BU-3608E
US5096817A (en) * 1988-06-07 1992-03-17 Bristol-Myers Company Process for producing antibiotics BU-3608 D and BU-3608 E
US5114857A (en) * 1988-11-10 1992-05-19 Bristol-Myers Company Actinomadura hibisca microorganism useful for preparing serine analogs of BU-3608 antibiotics
US5061624A (en) * 1988-11-10 1991-10-29 Bristol-Myers Company Serine analogs of BU-3608 antibiotics
US4973673A (en) * 1988-11-10 1990-11-27 Bristol-Myers Company Serine analogs of BU-3608 antibiotics
US5053395A (en) * 1989-03-24 1991-10-01 Bristol-Myers Company Pradimicin amide derivatives
CA2030166C (en) * 1989-11-22 1997-10-07 Shimpei Aburaki Pradimicin derivatives
US5091418A (en) * 1990-09-28 1992-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Novel alpha-glucosidase inhibitor, pradimicin Q

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Патент US N 4973673, 536 - 6. 4, 1990. *

Also Published As

Publication number Publication date
JPH05227985A (ja) 1993-09-07
EP0525588A3 (ru) 1994-03-30
HUT66834A (en) 1995-01-30
HU9202387D0 (en) 1992-12-28
FI923310A (fi) 1993-02-01
PL295353A1 (ru) 1993-02-08
CN1069286A (zh) 1993-02-24
AR247247A1 (es) 1994-11-30
IE922354A1 (en) 1993-02-10
CA2071140A1 (en) 1993-02-01
FI923310A0 (fi) 1992-07-20
TW215929B (ru) 1993-11-11
EP0525588A2 (en) 1993-02-03
PL169657B1 (pl) 1996-08-30
PL169264B1 (pl) 1996-06-28
NO922864D0 (no) 1992-07-20
IL102587A0 (en) 1993-01-14
AU652268B2 (en) 1994-08-18
CN1033591C (zh) 1996-12-18
NO922864L (no) 1993-02-01
CZ227492A3 (en) 1993-02-17
AU2063992A (en) 1993-02-04
NZ243601A (en) 1993-11-25
US5194371A (en) 1993-03-16
IL102587A (en) 1996-05-14
ZA924167B (en) 1993-02-26
KR930019833A (ko) 1993-10-19
CZ281277B6 (cs) 1996-08-14
US5374552A (en) 1994-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0641182A (ja) Ｂｂｍ−２４７８ｂ抗生物質
CA1291054C (en) Antitumor antibiotics (ll-e33288 complex)
US5468849A (en) Rebeccamycin analogs by tryptophan analogs feeding
US4992425A (en) Antibiotics BU-3608D and BU-3608E
RU2057181C1 (ru) Способ получения антибиотика прадимицина, штамм actinomadura species - продуцент прадимицина
CA2037596C (en) Rebeccamycin analog by bromide precursor feeding
FURUMAI et al. BMS-181184, a new pradimicin derivative screening, taxonomy, directed biosynthesis, isolation and characterization
EP0414914B1 (en) New substance trehalostatin and production thereof
EP1001957B1 (en) Macrolides with antitumor activity
US5158938A (en) Rebeccamycin
US4895933A (en) New antitumor agent obtained by microbial stereoselective reduction of 4'-deoxy-4'-iododoxorubicin
US4626503A (en) Antitumor agents LL-D49194α1, LL-D49194β1, LL-D49194β2, LL-D49194β3, LL-D49194γ, LL-D49194δ, LL-D49194ε, LL-D49194ξ, LL-D49194η, LL-D49194ω1, LL-D49194ω2, and LL-D49194ω3
EP0444503A2 (en) Staurosporine fermentation process
US5378463A (en) Antitumor antibiotic
EP0058838A1 (en) Antibiotic LL BO1208 alpha and LL BO1208 beta
JPH0374388A (ja) 新規なｌ―６８３，５９０の微生物変換生成物
US5096817A (en) Process for producing antibiotics BU-3608 D and BU-3608 E
EP0329109B1 (en) Antitumor antibiotics
EP0157203A2 (en) Antitumor agents LL-D49194 alpha 1, LL-D49194 beta, LL-D49194 beta 2, LL-D49194 upsilon, LL-D49194 delta, LL-D49194 epsilon, LL-D49194 zeta, and LL-D49194 eta
US5036010A (en) BMY-40800 antitumor antibiotics
US5919671A (en) Antitumor antibiotic BMS-199687
CA1265758A (en) Antibiotics, and their production
US5126436A (en) Physiologically active sn-198c compounds
CA2037783C (en) Rebeccamycin analogs by tryptophan analogs feeding
KR960016591B1 (ko) 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신을 미생물에 의해 입체 선택적으로 환원시켜 수득한 항종양제