KR960016591B1 - 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신을 미생물에 의해 입체 선택적으로 환원시켜 수득한 항종양제 - Google Patents

Abstract

요약없음

Description

4'-데옥시-4'-요오도독소루비신을 미생물에 의해 입체 선택적으로 환원시켜 수득한 항종양제

본 발명은 독소루비신(doxorubicin) 유도체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 구조식(II)의 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신 및 약제학적으로 허용되는 이의 염을 제공한다.

스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 미생물을 구조식(I)의 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신의 13-케톤 작용기의 입체선택적 환원에 사용하여 2개의 가능한 C-13 입체이성체 4'-데옥시-13-디하이드로-4'-요오도독소루비신중의 하나인 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신을 특정적으로 수득한다.

이후부터는 FCE 24883으로 명명되는 신규 화합물 (II)는 항종양제로 유용하며, 종양 실험에서 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신(I)에 필적하는 활성을 나타낸다. 미생물에 의한 입체선택적 환원에 사용되는 기질은 본 출원인의 미합중국 특허 제4,438,105호(1984년 3월 20일)에 기재된 독소루비신 반-합성 동족체이다.

더욱 특히, 본 발명은 M 87 F.I. 균주로 명명되고 독일연방공화국 소재의 미생물 기탁기관(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)에 기탁번호 DSM 2444로 기탁되어 있는, 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신(I)의 13-케톤 작용기를 입체 선택적으로 환원시키는 능력을 가짐을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 퍼세티우스(Streptomyces peucetius)종의 돌연변이체에 의한 생합성 방법에 관한 것이다. 생성된 FCE 24883 화합물(II)는 발효 브로쓰(broth)에 축적된다. FCE 24883(II)을 발효 브로쓰로부터 회수하여 이의 조악한 용액을 농축 및 정제할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 스트렙토마이세스 퍼세티우스 M 87 F.I. 균주(DSM 2444)를 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신의 존재하에 배양하고 생성된 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신을 그 자체 또는 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 회수함을 특징으로 하여, 구조식(II)의 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 이의 범주내에 순수한 염산염 형태의 신규한 항종양 안트라사이클린 FCE 24883(II)를 포함한다.

또한, 본 발명은 구조식(II)의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 혼합된 형태로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

미생물

스트렙토마이세스 퍼세티우스 아종 아우레우스(aureus) ATCC 31428을 니트로소구아니딘을 사용하여 돌연변이시켜 화합물(I)를 화합물(II)로 선택적으로 변형시키는, 스트렙토마이세스 퍼세티우스 M 87 F.I. 균주로 명명된 실험실용 미생물을 수득한다. 에스. 퍼세티우스 M 87 F.I. 균주는 독일연방공화국 소재의 미생물 기탁기관(DSM)에 기탁번호 DSM 2444로 상시 기탁물로서 기탁되어 있다.

M 87 F.I. 돌연변이 균주의 형태는 모(parent) 에스. 퍼세티우스 ATCC 31428의 형태와 구별되지 않으나, 이 둘의 배양물은 이들의 배양 및 생화학적 특성에 의해 명백히 구분된다. 실제로, M 87 F.I. 돌연변이 균주는 한천 배지에서 이의 모 에스. 퍼세티우스 ATCC 31428의 특징인 암황색 내지 담황색의 가용성 안료를 생성하지 않는다.

또한, M 87 F.I. 돌연변이 균주는 화합물(I)을 화합물(II)로 선택적으로 변형시킬 수 있으나, 모 에스. 퍼세티우스 ATCC 31428은 이러한 관점에서 비선택적이다. M 87 F.I. 돌연변이 균주의 이러한 특성은 본원에 기술되어 있는 바와 같이 대단히 유용하다.

변형 방법

본 발명의 입체선택적 생물학적 변형은 배양기간 동안 에스. 퍼세티우스 M 87 F.I. 균주의 성장 배양물중에서 당해 배양물에 화합물(I)을 기질로서 가함으로써 수행할 수 있다.

염산염 형태의 화합물(I)을 멸균한 증류수에 용해시킨 후 가할 수 있다. 이것으로 제한하는 것은 아니지만, 배양물 중의 화합물(I)의 농도는 약 50 내지 200㎍/l가 바람직하다. 배양물은 탄소원(예 : 동화가능한 탄수화물) 및 질소원(예 : 동화가능한 질소 화합물 또는 단백질 물질)을 함유한 영양 배지내에서 성장시킨다. 바람직한 탄소원에는 글루코오즈, 슈크로오즈, 글리세롤, 전분, 옥수수 전분, 덱스트린, 당밀 등이 포함된다. 바람직한 질소원에서 옥수수 스팁 (steep)액, 효모 추출물, 브루어(brewer) 건조 효모, 대두 가루, 목화씨 가루, 옥수수 가루, 카제인, 생선 가루, 증류기의 고체(distiller's solid), 동물 펩톤, 고기 추출물, 암모늄염등이 포함된다. 이들 탄소원 및 질소원의 혼합물을 유익하게 이용할 수 있다. 수돗물 및 비정제된 성분을 멸균하기 전에 배지 성분으로 사용하므로, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 철 등의 미량 금속을 발효 배지에 필수적으로 가할 필요는 없다.

생물학적 변형방법에는 약 72시간 내지 8일이 소요될 수 있다. 생물학적 변형과정 동안의 배양온도는 약 25 내지 약 37℃, 바람직하게는 29℃일 수 있다. 변형 용기의 함유물을 약 250r.p.m.으로 진탕하거나 멸균공기로 교반시킴으로써 통기시켜 미생물의 성장을 촉진시키고 변형공정의 효과를 높인다.

분석방법

미생물에 의한 변형반응 과정은 발효 샘플을 다양한 시간 간격을 두고 취한 다음, pH 8.0에서 디클로로메탄 : 메탄올(9 : 1)의 혼합물로 추출하여 모니터링한다. 유기 추출물의 샘플을 클로로포름 : 메탄올 : 아세트산 : 물(80 : 20 : 7 : 3의 용적비)의 혼합물을 용출제로 사용하여 박층 크로마토그래피(TLC)하는 경우, 화합물 FCE 24883(II)는 0.50의 Rf 중간값을 갖는데 반해, 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신( I )은 0.60의 Rf값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 2개의 안트라사이클린의 정량적 측정은 용출 시스템을 사용하여 TLC한 후, 스크래핑하여 상응하는 적색 영역을 메탄올로 용출시킨 다음, 최종적으로 496mm에서 분광광도 측정함으로써 수행할 수 있다.

분리공정

화합물( I )을 FCE 24883(II)로 전환시키는 발효 브로쓰 전체를 규조토의 존재하에 여과시킨다. 적색 균사 케이크(cake)를 수-혼화성 유기 용매, 예를 들면, 메탄올 및 기타 저급 알콜, 디옥산, 아세토니트릴, 아세톤 등, 바람직하게는 아세톤을 사용하여 추출한다. 균사 추출물을 수집하여 감압하에 농축시키고 여과된 발효액과 합하여 pH 8.0으로 조절한 후, 수-볼혼화성 유기 용매, 예를 들면, n-부탄올, 클로로포름 또는 디클로로메탄, 바람직하게는 디클로로메탄 : 메탄올(9 : 1)의 혼합물로 추출한다. 유기 추출물은 화합물(I) 및 몇몇 소량의 분해 생성물과 FCE 24883(II)를 함유한다.

정제공정

유기 추출물을 감압하에 농축 건조시키고, 잔사를 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 이를 pH 7로 완충시킨 실리카겔 컬럼 상에서 디클로로메탄 : 메탄올 : 물의 혼합물의 구배를 사용하여 크로마토그래피한다. 먼저, 화합물( I )을 95 : 5 : 0 : 0.25의 혼합물로 용출시킨 후, FCE 24883(II)를 90 : 10 : 0.5의 혼합물로 용출시킨다. 모아진 분획을 물로 세척하고, n-프로판올의 존재하에 소용적으로 농축시킨 다음, 1당량의 염산과 과량의 n-헥산을 가하여 순수한 FCE 24883(II)의 침전물을 염산염 형태로 수득한다.

화학적 및 물리적 특성

유리 염기 형태의 FCE 24883(II)는 극성 유기 용매 및 수성 알콜에 용해되는 반면, 이의 염산염은 물 및 저급 알콜에는 용해되나 유기 용매에는 잘 용해되지 않는다. FCE 24883의 염산염은 하기의 물리화학적 특성을 지닌다 :

융점 : 200℃(분해)

비선광도 :

+188°(c 0.05, CH₃OH)

U.V. 및 VIS 흡수 스펙트럼 :

232, 254, 290 및 480nm(

= 492, 70, 127, 163).

I.R. 스펙트럼(KBr) : 3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472, 1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 1235, 1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010, 985, 965, 940, 920, 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 및 415cm^-1에서 피크(peak)를 나타냄.

¹H-NMR 스펙트럼(DMSOd₆, 200MHz, 22℃) : 14.03(bs,2H,OH-6,OH-11), 7.6-7.9(m,3H H-1,H-2,H-3), 5.26(m,1H,H-1'), 4.96(d,J=5.2Hz,1H,OH-13), 4.92(m,1H,H-7), 4.55(m,1H,H-4'), 4.51(t,J=6.7Hz,1H,OH-14), 4.20(s,1H,OH-9), 3.97(s,3H,4-OCH₃), 3.76(ddd,J=3.5,6.7,11.0Hz,1H,CH(H)-OH), 3.60(dq,J=1.0,6.0Hz,H-5'), 3.48(ddd,J=7.2,6.7,11.0Hz,1H,CH(H)-OH), 3.37(ddd,J=5.2,3.5,7.2Hz,1H,H-13), 3.02(m,1H,H-3'), 2.81(m,2H,CH₂-10), 2.15(dd,J=2.0,15.3Hz,1H,H-8e), 1.97(dd,J=6.0,15.3Hz,1H,H-8ax), 1.7-1.9(m,2H,CH₂-2') 및 1.14δ(d,J=6.0Hz,3H,CH₃-5')

분자식 : C₂₇H₃₀NIO₁₀·HCl

유리 염기와 동등한 FD중 m/z : 656｜MH｜⁺; 655｜M｜⁺; 및 아글리콘에 상응하는 416(M⁺).

선택적 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법으로, 화합물( I )을 NaBH₄환원시켜 제조한 합성 4'-데옥시-1,3-디하이드로-4'-요오도독소루비신의 샘플중에 존재하는 2개의 C-13 입체이성체 알콜(체류시간이 18.8 및 19.3분인 2개의 피크)을 분리시킨다.

동일한 HPLC 방법을 이용하는 경우, FCE 24883(II)는 합성 13-디하이드로 유도체의 서이동 성분의 체류시간에 상응하는 19.3분의 체류 시간을 갖는 단일 피크를 나타낸다.

HPLC 방법

컬럼 : 2개의 RP 슈페리소브(Spherisorb) S30DS2(C18 3μ, 상 분리 U.K.), 150×4.5mm, 연속적으로 연결되어 있음.

온도 : 45℃

이동상 A : 1M H₃PO₄/CH₃OH[80/20(용적비)]를 사용하여 pH를 3.0으로 조절한 0.05M 수성 KH₂PO₄

이동상 B : CH₃OH

용출 : 30분간 이소크래틱(isocratic)(42% A+58% B)

유동량 : 0.6ml/분

검출 : 254nm

구조 설명

화합물(II)를 산 가수분해(0.2N 수성 HCl, 80℃, 30분)시켜 상응하는 아글리콘(III)의 적색 침전물을 수득하고, 수성 상중에 존재하는 당 성분, 즉 3-아미노-2,3,4,6-테트라데옥시-4-요오도-L-릭소헥소헥소오즈(IV)를 화합물( I )을 산 가수분해시켜 수득한 정격(authetic) 샘플과 비교하여 확인한다.

(III) : 13-(S)-디하이드로아드리아마이시논

화합물(III)의 C-13에서의 절대 (S)배열은 당해 화합물(III)의 9,13-O-이소프로필리덴-14-O-3급-부틸디페닐실릴 유도체를 13-(S)-디하이드로아드리아마이시논[문헌(참조 : S. Penco et al. Gazzetta Chimica Italiana, 115, 195, 1985)에 기술된 바와 같이 수득됨]의 정격 샘플의 상응하는 유도체와 직접 비교[1H-NMR 및 질량 스펙트럼, TLC]하여 결정한다.

생물학적 활성

HeLa 및 P 388 세포의 콜로니 형성에 대한 "시험관내" 실험을 통해, FCE 24883(II)의 세포독성 활성을 화합물( I ) 및 독소루비신과 비교한다. 표 1에 기록된 바와 같이, 화합물(II)는 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신( I ) 및 독소루비신과 같은 효능을 나타낸다.

FCE 24883(II)의 "생체내" 항종양 활성을 만연된 그로쓰(Gross) 백혈병에 대해 실험한다. C3H 마우스에 백혈병 세포를 2×10⁶개의 세포/마우스의 양으로 정맥내 주사하고 종양을 주입한지 24시간 후에 조사하면서 화합물로 처리한다.

표 2는 두 실험의 결과를 나타낸다. 최적 투여량에서, FCE 24883(II)는 독소루비신보다 효능이 강하고, 4'-데옥시-4'-요오도독소루비신(I)과 같은 효능을 나타내며, 활성 용량에서 보다 작은 독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 대조용 마우스들의 평균 생존시간에 대한 처리된 마우스들의 평균 생존 시간의 비로 평가된 화합물(II)의 항종양 활성을 화합물( I ) 및 독소루비신의 항종양 활성과 비교할 수 있다.

[표 1]

4'-데옥시-4'-요오도독소루비신( I )(FCE 21954) 및 독소루비신(DX)과 비교한 13-[S]-디하이드로-4'-요오도독소루비신(II)(FCE 24883)의 시험관내 활성

a) 비처리된 대조군과 비교하여 세포수를 50% 감소시키는 투여량.

b) 인체 경부 상피의 악성 종양 세포.

c) P388 백혈병 세포

[표 2]

4'-데옥시-4'-요오도독소루비신( I )(FCE 21954) 및 독소루비신(DX)과 비교한 13-[S]-디하이드로-4'-요오도독소루비신(II)(FCE 24883)의 만연된 그로쓰 백혈병에 대한 활성.

a) C3H 마우스들에게 2×10⁶개의 백혈병 세포를 정맥내 주사하고, 종양을 주사한지 1일 후 화합물로 정맥내 처리한다.

b) (처리된 마우스들의 평균 생존 시간/대조용 마우스들의 평균 생존시간)×100

c) 사망한 마우스들에 대한 부검 조사결과에 기초하여 평가.

본 발명의 방법 및 생성물을 보다 상세히 기술하기 위해 하기의 비-제한적 실시예를 예시한다.

실시예 1

스트렙토마이세스 퍼세티우스 M 87 F.I. 균주(DSM 2444)를 28℃에서 하기 성분을 함유하는 보존 배지(배지 SA)의 한천 슬란트(slant) 상에서 14일 동안 성장시킨다 ; 글루코오즈 3%, 브루어 건조 효모 1.2%, NaCl 0.1%, KH₂PO₄0.05%, CaCO₃0.1%, MgSO₄0.005%, FeSO₄·7H₂O 0.0005%, ZnSO₄·7H₂O 0.0005%, CuSO₄·5H₂O 0.0005%, 한천 2% 및 수돗물 100ml 이하 ; pH 6.7 ; 115℃에서 20분간 오토클레이브에서 가열하여 멸균시킴.

성장된 배양물의 포자를 수집하여 멸균 증류수 3ml에 현탁시키고, 당해 현탁액을 하기 성분을 함유하는 액체 성장 배지 60ml를 함유하는 300ml들이 삼각 플라스크에 접종한다 : 브루어 건조 효모 0.3%, 펩톤 0.5%, Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.05% 및 수돗물 100ml 이하, 120℃에서 20분간 오토클레이브에서 가열하여 멸균시킨다. 멸균후, 당해 배지의 pH 6.8 내지 7.0이다. 접종된 플라스크를 직경 7cm의 원을 그리는 회전 진탕기에서 250r.p.m.으로 2일 동안 28℃에서 진탕한다. 전술한 바와 같이 성장된 배양물 1.5ml를 하기 성분을 함유하는 생물학적 변형 배지 50ml를 함유하는 300ml들이 삼각 플라스크에 접종한다 : 효모 추출물 1.5%, KH₂PO₄0.25%, 글루코오즈 1.5% 및 수돗물 100ml 이하 ; pH 6.0 ; 115℃에서 20분간 오토클레이브에서 가열하여 멸균시킴. 글루코오즈 용액은 별도로 멸균하여 적당한 농도로 각각의 멸균된 플라스크에 가한다.

이어서, 플라스크를 종자 상(seed phase)에 대해 기술된 조건하에 28℃에서 24시간 동안 배양한다. 이때, 5mg/ml 농도의 멸균 증류수중의 화합물( I ) 용액 1.0ml을 각 플라스크에 가한다. 진탕시킨 플라스크를 2일동안 배양하여 화합물( I ) 70%를 화합물(II)로 전환시킨다.

실시예 2

에스. 퍼세티우스 M 87 F.I. 균주를 실시예 1에 기술된 바와 같이 같은 고체 배지에서 배양한다. 3개의 슬란트의 포자를 모아 멸균 증류수 10ml에 수집하고, 수득된 현탁액을 실시예 1에 기술된 종자 배지 500ml를 함유하는, 배플(baffle)이 장착된 2ℓ들이 환저 플라스크에 접종한다. 플라스크에 7cm 직경의 원을 그리는 회전 진탕기에서 120 r.p.m.으로 28℃의 온도에서 48시간 동안 배양한다. 종자 전체를 실시예 1에 기술된, 120℃에서 30분간 증기로 멸균시킨 생물학적 변형 배지 7.5ℓ를 함유하는 10ℓ들이 스테인레스-스틸 발효조에 접종하되, 단 이 때 글루코오즈 용액은 별도로 멸균하여 적당한 농도로 멸균된 발효조에 가한다. 28℃에서 230r.p.m.으로 교반하고 공기 유량 0.7ℓ/배지의 ℓ/분으로 통기시켜 배양한다. 48시간 후, 기질 화합물을 실시예 1에서 기술한 농도로 가하고 배양물을 3일 이상 배양하여 화합물( I )의 60%를 화합물(II)로 전환시킨다.

실시예 3

실시예 2에 따라 수득된 발효물로부터의 전체 비어(beer : 5ℓ)를 여과 조제로서 2% 규조토를 사용하여 여과한다. 습윤 여과 케이크를 아세톤(3ℓ)으로 추출한다. 여과후, 아세톤을 사용하여 추가로 2회 추출하여 적색 안료를 완전히 회수한다. 합한 아세톤 추출물을 감압하에 농축시키고, 농축물 (1ℓ)을 여과된 브로쓰와 합하고 pH 8에서 디클로로메탄 : 메탄올(9 : 1)의 혼합물로 남김없이 추출한다. 몇몇 분해 생성물과 화합물(I) 및 (II)를 함유하는 유기 추출물을 감압하에 농축 건조시킨다. 디클로로메탄에 용해시킨 잔사를 M/15 인산염 완충액으로 pH 7로 완충시킨 실리카겔 컬럼 상에서 디클로로메탄 : 메탄올 : 물의 혼합물의 구배를 사용하여 크로마토그래피한다. 몇몇 분해 생성물을 용출시킨 후, 화합물(I)을 95 : 5 : 0.25 혼합물로 용출시키고, 다시 FCE 24883(II)를 90 : 10 : 0.5 혼합물로 용출시킨다.

모아진 분획을 물로 세척한 후, n-프로판올의 존재하에 소용적으로 농축시키고 1당량의 염산 및 과량의 n-헥산을 가하여 순수한 FCE 24883(II)(0.30g, 60%)을 염산염(융점 : 200℃ 분해) 형태로 수득한다. 또한, 동일한 공정에 따라, 미변형된 화합물(I)(0.13g, 26%)을 염산염으로서 회수한다.

실시예 4

FCE 24833(I)의 샘플(200mg)을 0.2N 수성 염산(50ml)에 용해시켜 100℃에서 30분간 가열한다. 적색 결정성 침전물인 아글리콘(III)(0.12g)를 여과 수집하여 물로 세척한 후 건조시킨다. 질량 스펙트럼 : m/e416(M⁺). 정격 샘플과 비교한 결과, 아글리콘(III)은 13-(S)-디하이드로아드리아마이시논으로 확인되었다.

Claims (6)

1. 구조식(II)의 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신 및 약제학적으로 허용되는 이의 염.

   
2. 제1항에 있어서, 염산염인 화합물.
3. 호기성 조건하에 동화가능한 탄소원, 동화가능한 질소원 및 무기염을 함유하는 수성 배양 배지에서, 염산염 형태의 구조식(I)의 4'-데옥시-4'-요요도독소루비신의 존재하에 M 87 F.I.(DSM 2444) 균주로 명명된 스트렙토마이세스 퍼세티우스 종의 돌연변이체를 배양한 다음, 생성된 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신(II)의 염산염을 회수함을 특징으로 하는, 구조식(II)의 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신의 미생물학적 제조방법.

   

   
4. 제3항에 있어서, 배양을 25 내지 37℃, 바람직하게는 29℃의 온도에서 72시간 내지 8일 동안 수행하는 방법.
5. 제3항에 있어서, 제1항에 따른 구조식(II)의 안트라사이클린 글리코사이드를 pH 8에서 균사 케이크로부터는 아세톤을 사용하여 추출하고, 여과된 발효액으로부터는 디클로로메탄 : 메탄올(9 : 1의 용적비)의 혼합물을 사용하여 추출한 다음, 합한 추출물을 감압하에 농축, 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
6. 제3항에 있어서, 제3항에 따라 수득된 조 생성물을 디클로로메탄에 용해시키고, 생성물을 pH 7로 완충된 실리카겔 컬럼상에서 먼저 미반응된 출발물질(I)을 제거하기 위해 디클로로메탄 : 메탄올 : 물(95 : 5 : 0.25의 용적비)의 혼합물을 용출 시스템으로 사용하여 크로마토그래피 정제한 다음, 다시 디클로로메탄 : 메탄올 : 물(90 : 10 : 0.5의 용적비)의 혼합물을 용출 시스템으로 사용하여 크로마토그래피 정제하며, 용출된 분획을 n-프로판올의 존재하에 소용적으로 농축시킨 다음, 1당량의 염산과 과량의 n-헥산을 가하여 목적하는 4'-데옥시-13(S)-디하이드로-4'-요오도독소루비신(II)을 순수한 염산염 형태로 회수함을 특징으로 하는 방법.