DK169035B1 - 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4'-ioddoxorubicin samt mikrobiologisk fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i DK 169035 B1

Den foreliggende opfindelse angår et doxorubicinderivat samt fremstillingen deraf.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4/-ioddoxorubicin med formlen (II) 5

O OH QH

0000^"

«“j ° OH * "'O

10 I

1 II

15 — samt farmaceutisk acceptable salte deraf.

En mikroorganisme tilhørende slægten Streptomyces anvendes til stereoselektiv reduktion af den funktionelle 13-ketongruppe i 4'-deoxy-4'-ioddoxorubicin (I) 20 9 o

icH, O OH ηΛ 3 O

25 »V

Γ * i 30 hvilket specifikt giver 4'-deoxy-13-(S)-dihydro-4'-ioddoxorubicin, en af de to mulige C-13 stereoisomere 4'-deoxy-13-dihydro-4'-ioddoxorubiciner.

Den nye forbindelse (II), herefter kaldet FCE 24883, har nyttig antitumorvirkning og udviser på eksperimentelle tumorer en aktivitet, der kan sammenlignes med aktiviteten af 4'-deoxy-4'-ioddoxorubicin (I). Den te- 35 rapeutiske virkningsbredde er imidlertid langt større for forbindelsen FCE 24833, som derfor mere fordelagtigt kan anvendes som antitumormiddel. Substratet for den mikrobielle stereoselektive reduktion er beskrevet i vor US-A-4438105 (20. marts 1984).

2 DK 169035 B1

Mere specielt angår opfindelsen en biosyntetisk proces, ved hvilken en mutant af arten Streptomyces peucetius, benævnt stamme M 87 F.I., deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktaten hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, hvor den er registreret under løbenummeret DSM

5 2444, karakteriseres ved dens evne til stereoselektivt at reducere den funktionelle 13-ketongruppe i 4'-deoxy-4'-ioddoxorubicin (I). Den resulterende forbindelse, FCE 24883 (II), akkumuleres i fermentationssubstraterne. FCE 24883 (II) kan udvindes fra fermentationssubstraterne, og rå opløsninger deraf kan koncentreres og renses.

10 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således også en mikro biologisk fremgangsmåde til fremstilling af 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4'-ioddoxorubicin med formel (II) i form af dens hydrochlorid, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man under aerobe betingelser i et vandigt dyrkningsmedium indeholdende en assimilerbar carbonkilde, en as- 15 similerbar nitrogenkilde og mineral salte, dyrker en mutant af arten

Streptomyces peucetius, benævnt stamme M 87 F.I. (DSM 2444), i nærvær af 4,-deoxy-4/-ioddoxorubicin (I) 0 OH o 2°

icH. O OH

J O

“ H.c-7-°V

J l/1—x <7 kh2 .Kee. τ I — 30 i form af dens hydrochlorid og udvinder den resulterende 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4/-ioddoxorubicin (II) som dens hydrochlorid.

Opfindelsen omfatter endvidere det nye antitumor-anthracyclin FCE 24883 (II) i den rene form som hydrochloridet.

Streptomyces peucetius aureus, ATCC 31428, blev muteret under an- 35 vendelse af nitrosoguanidin til opnåelse af en laboratoriemikroorganisme benævnt Streptomyces peucetius stamme M 87 F.I., der selektivt transformerer forbindelse (I) til forbindelse (II). S. peucetius stamme M 87 F.I. har af Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Vesttyskland, hvor 3 DK 169035 B1 den er deponeret i den permanente samling, fået løbenummeret DSM 2444.

Morfologien af mutantstammen M 87 F.I. kan ikke skelnes fra morfologien af ophavsstammen S. peucetius ATCC 31428, hvorimod begge kulturer klart kan skelnes fra hinanden ved deres dyrkningsmæssige og biokemiske 5 egenskaber. Mutantstammen M 87 F.I. producerer således ikke på agarmedium det strågule til citrongule opløselige pigment, der karakteriserer ophavsstammen S. peucetius ATCC 31428.

Desuden kan mutantstammen M 87 F.I. selektivt transformere forbindelse (I) til forbindelse (II), hvorimod ophavsstammen S. peucetius 10 ATCC 31428 ikke er selektiv i denne henseende. P.g.a. denne egenskab er mutant M 87 F.I., som anført i det foreliggende, til stor nytte.

Transformati onsprocessen

Den stereoselektive biotransformation ifølge opfindelsen kan udfø-15 res i en voksende kultur af S. peucetius stamme M 87 F.I. ved at tilsætte forbindelse I som substrat til kulturen under inkubationsperioden.

Forbindelse I kan som hydrochlorid tilsættes efter opløsning i sterilt destilleret vand. Det foretrukne, men ikke dertil begrænsede koncentrationsområde af forbindelse I i kulturen er ca. 50-200 /ig/1.

20 Kulturen dyrkes i et næringsmedium, der indeholdenr en carbonkilde, fx. et assimilerbart carbohydrat, og en nitrogenkilde, fx. en assimilerbar nitrogenforbindelse eller et proteinhol digt materiale. Foretrukne car-bonkilder omfatter glucose, saccharose, glycerol, stivelse, majsstivelse, dextrin, melasse o.l. Foretrukne nitrogenkilder omfatter majsstøbe-25 væske, gærekstrakt, tørret ølgær, soyabønnemel, bomuldsfrømel, majsmel, casein, fiskemel, destillationsfaststoffer, animalsk pepton, kødekstrakt, ammoniumsalte o.l. Kombinationer af disse carbon- og nitrogenkilder kan anvendes med fordel. Spormetaller, fx. zink, magnesium, mangan, kobolt, jern o.l. behøves ikke nødvendigvis tilsættes til fermenta-30 tionsmedierne, da postevand og urensede ingredienser anvendes som komponenter i mediet før sterilisation.

Biotransformationsprocessen kan strække sig fra ca. 72 timer til 8 dage. Under biotransformationsprocessen kan inkubationstemperaturen ligge i området fra ca. 25°C til ca. 37°C, idet 29°C er foretrukket.

35 Indholdet i transformationsbeholderne luftes ved rystning med ca. 250 o.p.m. eller ved omrøring med steriliseret luft for at lette mikroorganismevækst, og dette forøger effektiviteten af transformationsprocessen.

4 DK 169035 B1

Analysemetoder

Forløbet af den mikrobielle transformationsreaktion overvåges ved udtagning af fermentationsprøver med forskellige tidsintervaller og ekstrahering ved pH 8,0 med en 9:1 blanding af dichlormethan:methanol.

5 Når en prøve af den organiske ekstrakt underkastes tyndtlagskromatografi (TLC) under anvendelse af en blanding af chloroform:methanol:eddikesy-re:vand (80:20:7:3 vol umenforhold) som elueringsmiddel, viser det sig, at forbindelse FCE 24883 (II) optræder ved en Rf mediumværdi på 0,50, hvorimod 4'-deoxy-4'-ioddoxorubicin (I) viser sig at optræde ved Rf 10 0,60. En kvantitativ bestemmelse af de to anthracycliner kan udføres efter TLC under anvendelse af de ovenfor nævnte elueringssystemer ved afskrabning og eluering af de tilsvarende røde farvezoner med methanol efterfulgt af en spektrofotometrisk bestemmelse ved 496 nm.

15 Isolati onsprocedure

De komplette fermentationssubstrater, hvori forbindelse I blev underkastet omdannelse til FCE 2488 (II), filtreres ved hjælp af diatoméjord. Den røde myceliekage ekstraheres med et vandblandbart organisk opløsningsmiddel såsom methanol og andre lavere alkoholer, dioxan, aceto-20 nitril eller acetone, idet acetone foretrækkes. Mycelieekstrakterne opsamles, koncentreres under reduceret tryk og kombineres med de filtrerede fermentati onsvæsker indstillet til pH 8,0, og ekstraheres så med et ikke vandblandbart organisk opløsningsmiddel såsom n-butanol, chloroform, dichlormethan eller fortrinsvis en 9:1 blanding af dichlormethan-25 methanol. De organiske ekstrakter indeholder FCE 24883 (II) sammen med forbindelse I og nogle mindre nedbrydningsprodukter.

Rensningsprocedure

Den organiske ekstrakt koncentreres til tørhed under reduceret 30 tryk, og remanensen, opløst i dichlormethan, kromatograferes på en sil i -cagelkolonne, forpufret til pH 7, med en gradient af di chl ormethan .-methanol :vand blanding. Forbindelse I elueres først i en 95:5:0,25 blanding efterfulgt af FCE 24883 (II) i en 90:10:0,5 blanding. Fra de samlede fraktioner opnås efter vask med vand, koncentration til et lille volumen 35 i nærvær af n-propanol, tilsætning af et ækvivalent saltsyre og et overskud af n-hexan, et præcipitat af ren FCE 24883 (II) som hydrochloridet.

5 DK 169035 B1

Kemiske og fysiske egenskaber FCE 24883 (II) som fri base er opløselig i polære organiske opløsningsmidler og vandige alkoholer, hvorimod dens hydrochlorid er opløseligt i vand og lavere alkoholer, men tungt opløseligt i organiske opløs-5 ningsmidler. Hydrochloridet af FCE 24883 har følgende fysisk-kemi ske egenskaber:

Smp.: 200°C (dek.) 10 Specifik rotation: [a]^° + 188° (c 0,05, CH,0H) D -3 UV- og VIS-absorptionsspektrum: λ^2° 232, 254, 290 og 480 nm max 15 (E1% = 492, 370, 127, 163) 1 cm IR-spektrum (KBr): toppe ved følgende frekvenser: 3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472, 1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 20 1235, 1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010, 985, 965, 940, 920, 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 og 415 cm'1.

lH-NMR-spektrum (DMS0dg, 200 MHz, 22°C): 14,03 (bs, 2H, 0H-6,0H-11), 7,6-7,9 (m, 3H, H-l, H-2, H-3), 5,26 (m, IH, H-l'), 4,96 (d, J=5,2 Hz, 25 IH, OH-13), 4,92 (m, IH, H-7), 4,55 (m, IH, H-4'), 4,51 (t, J=6,7 Hz, IH, 0H-14), 4,20 (s, IH, 0H-9), 3,97 (s, 3H, 4-0CH3), 3,76 (ddd, J=3,5, 6,7, 11,0 Hz, IH, CH (H)-0H), 3,60 (dq, J=1,0, 6,0 Hz, H-5'), 3,48 (ddd, J=7,2, 6,7, 11,0 Hz, IH, CH(H)-OH), 3,37 (ddd, J=5,2, 3,5, 7,2 Hz, IH, H-13), 3,02 (m, IH, H-3'), 2,81 (m, 2H, CH£-10), 2,15 (dd, J=2,0, 15,3 30 Hz, IH, H-8e), 1,97 (dd, J=6,0, 15,3 Hz, IH, H-8ax), 1,7-1,9 (m, 2H, CH2-2') og 1,14 δ (d, J=6,0 Hz, 3H, CH3-5').

Molekylformel: C27H3onioio*hc1 m/z i FD ækvivalent med den fri base: 656 [MH]+, 655 35 [M]+ og 416 [M]+ svarende til aglyconen.

En selektiv højtryksvæskekromatografimetode (HPLC) giver mulighed for at adskille (to toppe med retentionstider på 18,8 og 19,3 minutter) 6 DK 169035 B1 de to C-13-stereoisomere alkoholer, der er til stede i en prøve af syntetisk 4'-deoxy-13-dihydro-4'-ioddoxorubicin fremstillet ved NaBH^-re-duktion af I.

Ved at anvende samme HPLC-metode optræder FCE 24883 (II) som en 5 enkelt top med en retentionstid på 19,3 minutter svarende til retentionstiden af den langsommere vandrende bestanddel af det syntetiske 13-dihydroderivat.

HPLC-metode 10 Kolonne: to "RP Spherisorb S30DS2" (C18 3/z, Phase Separation U.K.) 150x4,5 mm serieforbundet.

Temperatur: 45°C

Mobil fase A: 0,05 M vandig af KHgPO^, indstillet til pH 3,0 med 1M

H3P04/CH30H = 80/20 (volumenforhold)

15 Mobil fase B: CH30H

Eluering: i sokratisk i 30 minutter (42%A + 58%B)

Strømningshastighed: 0,6 ml/min.

Detektion: 254 nm.

20

Strukturvurdering

Syrehydrolyse af II (0,2N vandig HC1, 80°C, 30 minutter) giver et rødt præcipitat af den tilsvarende aglycon (III), mens sukkerbe-standdelen, dvs. 3-amino-2,3,4,6-tetradeoxy-4-iod-L-lyxohexohexose, 25 (IV), der er til stede i den vandige fase, er blevet identificeret efter sammenligning med en autentisk prøve opnået fra forbindelse I ved syrehydrolyse.

FCE 24583 (II) .

30 syrehydrolyse (HC1)

0 9H L OH NNNNNN ^ 1 I H„. / ~OH

35 CuOTi^ yt—

VvVy oh + 3/-^r OCH O OH H OH 12

3 I

III: 13-(S)-dihydroadriamycinon IV

7 DK 169035 B1

Den absolutte (S)-konfiguration af III ved C-13 blev bestemt ved direkte sammenligning (1H-NMR og massespektrum, TLC) af dens 9,13-0-iso-propyliden-14-O-t-butyldiphenylsilylderivat med det tilsvarende derivat af en autentisk prøve af 13-(S)-dihydroadriamycinon, opnået som beskre-5 vet af S. Penco et al i Gazzetta Chimica Italiana, 115, 195, 1985.

Biologisk aktivitet

Den cytotoxiske aktivitet af FCE 24883 (II) testedes "in vitro" på HeLa og P 388 cellekolomdannelse i sammenligning med forbindelse I og 10 doxorubicin. Som anført i tabel 1 viste forbindelse II sig lige så virkningsfuld som 4'-deoxy-4'-ioddoxorubicin (I) og doxorubicin.

In vivo antitumoraktiviteten af FCE 24883 (II) testedes over for dissemineret Gross-leukæmi. C3H-mus injiceredes intravenøst med 2xl06 celler/mus og behandledes med forbindelser, som skulle undersøges, i 24 15 timer efter tumorinjektionen.

Tabel 2 viser resultaterne af to forsøg. Ved den optimale dosis viste FCE 24883 (II) sig at være mere virkningsfuld end doxorubicin og lige så virkningsfuld som 4/-deoxy-4/-ioddoxorubicin (I), og den udviste en større terapeutisk virkningsbredde. Antitumoraktiviteten af for-20 bindelse II, bestemt som middel overlevelsestid af behandlede mus i forhold til kontrolmus, kan sammenlignes med aktiviteten af forbindelse I og doxorubicin.

Tabel 1 25

In vitro aktivitet af 13-[S]-dihydro-4'-ioddoxorubicin (II, FCE 24883) i sammenligning med 4'-deoxy-4'-ioddoxorubicin (I, FCE 21954) og doxorubicin (Dx) 30 Forbindelse IDgg (ng/ml)

HeLa b) P388 c) 35 Dx 10,8 8 FCE 21954 (I) 10,4 2,1 FCE 24883 (II) 8 3,5 DK 169035 B1 8 a) Dosis, der giver 50% reduktion af antal celler i sammenligning med ubehandlede kontrol prøver.

b) Humane cervikal-epithelioide carcinomacell er.

c) P388 leukæmicel!er.

5

Tabel 2

Aktivitet af 13-[S]-dihydro-4'-ioddoxorubicin (II, FCE 24883) i sammenligning med 4'-deoxy-4'-ioddoxorubicin (I, FCE 21954) og doxorubicin 10 (Dx) over for dissemineret Gross-leukæmi

Forbindelse Dosis T/C% Dødelighed (mg/kg) p.g.a. toxicitet0^ 15 _

Dx 10 200 (200, 200) 0/20 13 225 (230, 220) 0/20 16,9 250 (260, 240) 2/20 FCE 21954 (I) 4 240 (240, 240) 0/20 20 5,2 260 (260, 260) 4/20 6.8 145 (160, 130) 19/20 FCE 24883 (II) 4 180 (180) 0/10 5,2 220 (220, 220) 0/20 6.8 220 (220, 220) 0/20 25 8,8 140 (140) 5/9 a) C3H-mus injiceredes intravenøst med 2xl06 1eukæmicel1 er og behandledes i.v. med forbindelserne dagen efter tumorinjektionen.

b) (middeloverlevelsestid af behandlede mus/middeloverlevelsestid af 30 kontrolmus) x 100.

c) Bestemt på basis af autopsiresul tater på døde mus.

Fremgangsmåderne og produktet ifølge opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler 1-3.

Eksempel 1

En kultur af Streptomyces peucetius stamme M 87 F.I. (DSM 2444) dyrkedes i 14 dage ved 28°C på agarskråsubstrater af følgende nærings- 35 9 DK 169035 B1 medium (medium SA): 3% glukose, 1,2% tørret ølgær, 0,1% NaCl, 0,05% KH2P04, 0,1% CaC03, 0,005% MgS04, 0,0005% FeS04.7H20, 0,0005%

ZnS04.7H20, 0,0005% CuS04.5H20, 2% agar, postevand op til 100 ml, pH

6,7, sterilisation udførtes ved opvarmning i autoklav ved 115°C i 20 5 minutter.

Sporerne af den således dyrkede kultur opsamledes og suspenderedes 1 3 ml sterilt destilleret vand. Suspensionen podedes i 300 ml Erlenmey-er-kolber indeholdende 60 ml af følgende flydende vækstmedium: 0,3% tørret ølgær, 0,5% pepton, 0,05% Ca(N03)2.4H20, postevand op til 100 ml.

10 Sterilisation udførtes ved opvarmning i autoklav ved 120°C i 20 minutter. Mediets pH-værdi efter sterilisation var mellm 6,5 og 7,0. De podede kolber rystedes i 2 dage ved en temperatur på 28°C på et rotationsrysteapparat, der kørte med 250 o.p.m. og beskrev en cirkel på 7 cm i diameter. 1,5 ml af kulturen dyrket som ovenfor beskrevet podedes i 300 15 ml Erlenmeyer-kolber indeholdende 50 ml af følgende biotransformationsmedium: 1,5% gærekstrakt, 0,25% KH2P04, 1,5% glucose, postevand op til 100 ml, pH 6,9. Sterilisation udførtes ved opvarmning i autoklav ved 115°C i 20 minutter. Glucoseopløsningen steriliseredes separat og sattes i en passende koncentration til hver steriliseret kolbe.

20 Kolberne inkuberedes dernæst ved 28°C under de for podningsfasen beskrevne betingelser i 24 timer. På dette tidspunkt sattes 1,0 ml af en opløsning af forbindelse I i sterilt destilleret vand til hver kolbe i en koncentration på 5 mg/ml. De rystede kolber inkuberedes i yderligere 2 dage, hvilket resulterede i en 70% omdannelse af forbindelse I til 25 forbindelse II.

Eksempel 2

En kultur af S. peucetius stamme M 87 F.I. dyrkedes på fast medium som beskrevet i eksempel 1. Sporerne af 3 plader kombineredes og opsam-30 ledes i 10 ml sterilt destilleret vand. Den således opnåede suspension podedes i en 2 1 rundbundet, med prel pi ader forsynet kolbe indeholdende 500 ml af det i eksempel 1 beskrevne podemedium. Kolben inkuberedes i 48 timer på et rotationsrysteapparat, der kørte med 120 o.p.m. og beskrev en cirkel på 7 cm i diameter, ved en temperatur på 28°C. Hele pod-35 ningsmediet podedes i en 10 1 fermenteringsbeholder af rustfrit stål indeholdende 7,5 1 af det i eksempel 1 beskrevne biotransformationsmedium og steriliseredes med damp ved 120°C i 30 minutter, idet glucoseopløsningen steriliseredes separat og sattes til den steriliserede fermenta- 10 DK 169035 B1 tionsbeholder i en passende koncentration. Kulturen dyrkedes ved 28°C under omrøring med 230 o.p.m. og luftedes med en luftstrøm på 0,7 liter/liter medium/minut.

Efter 48 timer tilsattes substratforbindelsen i den i eksempel 1 5 beskrevne koncentration, og kulturen inkuberedes i yderligere 3 dage, hvilket resulterede i en 60% omdannelse af forbindelse I til forbindelse II.

Eksempel 3 10 Hele brygget (5 1) fra en fermentering opnået ifølge eksempel 2 filtreredes under anvendelse af 2% diatoméjord som filterhjælp. Den våde filterkage ekstraheredes med acetone (31). Efter filtrering udførtes to yderligere ekstraktioner med acetone for at sikre en komplet udvinding af de røde pigmenter. De kombinerede acetoneekstrakter koncentreredes 15 under reduceret tryk, og koncentratet (1 1) kombineredes med det filtrerede næringsmedium og ekstraheredes grundigt ved pH 8 med en 9:1 blanding af dichlormethanrmethanol. Den organiske ekstrakt, der indeholdt forbindelserne I og II samt nogle nedbrydningsprodukter, koncentreredes til tørhed under reduceret tryk. Remanensen, opløst i dichlormethan, 20 kromatograferedes på en sil icagelkolonne, forpufret til pH 7, (M/15 phosphatpuffer) med en gradient af dichlormethan:methanol:vand blanding. Efter nogle nedbrydningsprodukter elueredes forbindelse I i en 95:5:0,25 blanding efterfulgt af FCE 24883 (II) i en 90:10:0,5 blanding.

Fra de kombinerede fraktioner opnåedes efter vask med vand, kon-25 centration til et lille volumen i nærvær af n-propanol, tilsætning af et ækvivalent saltsyre og et overskud af n-hexan, ren FCE 24883 (II, 0,30 g, 60%) som hydrochloridet (smp. 200°C, dek.). Ved at følge samme procedure udvandtes også utransformeret forbindelse I (0,13 g, 26%) som hydrochloridet.

30

Eksempel 4

En prøve af FCE 24883 (I) (200 mg) opløstes i 0,2 N vandig saltsyre (50 ml) og opvarmedes i 30 minutter ved 100°C. Et krystallinsk, rødt præcipitat (0,12 g) af aglycon (III) opsamledes ved filtrering, vaskedes 35 med vand og tørredes.

Massespektrum: m/e 416 (M+).

11 DK 169035 B1

Aglyconen (III) identificeredes som 13-(S)-dihydroadriamycinon ved sammenligning med en autentisk prøve.

Claims (6)

0 OH ‘o H'c7-^ 10

1 II samt farmaceutisk acceptable salte deraf.

2. Salt ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det er hydrochlorid- saltet.

3. Mi krobi ologi sk fremgangsmåde til fremstilling af 4'-deoxy- 13(S)-dihydro-4'-iodrubicin med formlen (II) 20 ? 0» SH r YYYV^0H “0H

25 I o yj J /y “ 4*/^nh2 .VW 1 11 30 — KENDETEGNET ved, at man under aerobe betingelser i et vandigt dyrkningsmedium indeholdende en assimilerbar carbonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde og mineral sal te, dyrker en mutant af arten Streptomyces peuce-tius, benævnt stamme M 87 F.I. (DSM 2444), i nærvær af 4'-deoxy-4'-iod-35 doxorubicin (I) DK 169035 B1

0 OH o (ί#:νΛγ^ν^νΙ\--'0Η ' æ 4‘r™2 ~h<ul j I — 10. form af dens hydrochlorid og udvinder den resulterende 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4'-ioddoxorubicin (II) som dens hydrochlorid.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at den udføres ved en temperatur fra 25 til 37°C (fortrinsvis 29°C) i et tidsrum 15 fra 72 timer til 8 dage.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, KENDETEGNET ved, at man ekstraherer anthracyclinglycosidet med formel II ifølge krav 1 fra en isoleret myceliekage med acetone og fra isolerede fermentationsvæsker 20 med en blanding af dichlormethan:methanol (9:1 vol/vol) ved pH 8 og koncentrerer de kombinerede ekstrakter til tørhed under reduceret tryk.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, KENDETEGNET ved, at man udvinder det ønskede produkt ved at underkaste et opnået råprodukt kro- 25 matografisk rensning på en sil icagelkolonne, forpufret til pH 7, idet der som elueringsmiddel først anvendes en blanding af dichlormethan:me-thanolrvand (95:5:0,25 vol/vol) til eliminering af uomsat udgangsmateriale (I) efterfulgt af en blanding af dichlormethan:methanol:vand (90:10:0,5 vol/vol), koncentrerer de eluerede fraktioner til et lille 30 volumen i nærvær af n-propanol og isolerer den ønskede 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4'-ioddoxorubicin (II) som dens hydrochlorid i ren form ved tilsætning af et ækvivalent saltsyre og et overskud af n-hexan. 35