DK161338B - Fremgangsmaade til fremstilling af 2-hydroxyaclacinomycin a, b og n eller syreadditionssalte deraf samt en rekombinant mikroorganisme til anvendelse derved - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af 2-hydroxyaclacinomycin a, b og n eller syreadditionssalte deraf samt en rekombinant mikroorganisme til anvendelse derved Download PDFInfo
- Publication number
- DK161338B DK161338B DK358882A DK358882A DK161338B DK 161338 B DK161338 B DK 161338B DK 358882 A DK358882 A DK 358882A DK 358882 A DK358882 A DK 358882A DK 161338 B DK161338 B DK 161338B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hydroxyaclacinomycin
- hydroxyaclavinone
- streptomyces
- galilaeus
- mutant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DK 161338 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N med formlen o COOCH3
HO ,v Jk /v ΓΗ CH
2 3 T T x°h VYyy
OH 0 OH
(& 0 f^CH,
1 N
R NCH3 hvori R er
° 0H
0 Vi) for 2-hydroxyaclacinomycin A, R er p Λ: ϊ 0
DK 161338B
2 for 2-hydroxyaclacinomycin B, og R er
- rf*\T
HO '- 5 for 2-hydroxyaclacinomycin N direkte ved fermentering.
I litteraturen er beskrevet, at et antal anthracyclinglyco-sider er blevet påvist i dyrkningsmedier fra Streptomyces dyrkninger. Blandt disse anthracyclinglycosider har man allerede anvendt daunomycin og adriamycin klinisk mod humane 10 cancere.
Rhodomycinoner, iso-rhodomycinoner og rhodomycin-beslægtede antibiotika er beskrevet i Chem. Ber. (58, 1792-1818 (1955) , Chem. Ber. 101, 1341-1348 (1968), J.Med.Chem., 20, 957-960 (1977^ Pharmazie 21_, 782-789 (1972), Zeit.Allg.Mikrobiol., 15 14, 551-558 (1974), Tetrahed.Lett. nr. 38, 3699-3702 (1973),
Folia Microbiol., 24, 293-295 (1979), og J .Antibiotics, 32, 420-424 (1979) .
Aclacinomycin A er kendt fra beskrivelsen til USA-patent nr. 3.988.315 og er endvidere beskrevet af Oki et al. i 20 J.Antibiotics 28, 830 (1975)/og 32, 791-812 (1979).
Cinerubin A og B er kendt fra beskrivelsen til GB-patent nr. 846.130, fra beskrivelsen til USA-patent nr.3.864.480, Keller-Schierlein et al., "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", side 68 (1970), Chemical Abstracts 5j4, 1466i (1960)/ 25 og J.Antibiotics 2J3, 830 (1975) .
DK 161338 B
3
Endvidere er 2-hydroxyaclacinomycin A beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 30255.
Endvidere er forskellige anthracyclinantibiotika beskrevet i Index of Antibiotics from Actinomycetes, Hamao Umezawa, 5 Editor-in-Chief, University Park Press, State College, Pennsylvania, U.S.A. (1967), som følger:
Antibiotikum_ Side_
Aclacinomycin A og B 101-102
Adriamycin 122 10 Carminomycin I 225
Galirubin A-D 405-408
Rhodomycin X-Y 879-880 Ø-Rhodomyciner 881-885 γ-Rhodomyciner 886-892 15 Steffimycin 945 I Antibiotics, bind 1, Mechanisms of Action, redigeret af David Gottlieb og Paul D.Shaw, Springer-Verlag New York,
Inc., N.Y. (1967),indeholder siderne 190-210 en oversigt af A.DiMarco med titlen "Daunomycin and Related Antibiotics".
20 I Information Bulletin, nr. 10, International Center of Information of Antibiotics, gives i samarbejde med WHO, december, 1972, Belgien, en oversigt over anthracycliner og derivater deraf.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter tillige frem-25 stillingen af syreadditionssalte af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N, og den er ejendommelig ved, at en stamme af slægten Streptomyces, som kan danne 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N direkte ved fermentering, dyrkes i et næringssubstrat, forbindelserne isoleres fra dyrknings-30 væsken, hvorpå de eventuelt omdannes til syreadditionssalte deraf, hvilken stamme af slægten Streptomyces er dannet ved protoplastsammensmeltning af en mutant af
DK 161338B
4
Streptomyces galilaeus MA 144-Mi, der kan danne 2-hydroxyaklavinon, med en mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-M^, som kan omdanne 2-hydroxyaklavinon 5 til 2-hydroxyaclacinomycin A men ikke selv kan danne 2-hydroxyaklavinon.
Desuden omfatter opfindelsen en rekombinant mikroorganisme af slægten Streptomyces, som kan danne 2-hydroxyaclacino-mycin A, B og N, og den er ejendommelig ved, at den er 10 Streptomyces galilaeus A-862 dannet ved protoplast-sammensmeltning af en mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-M-j_, som kan danne 2-hydroxyaklavinon, med en mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-M^, som kan omdanne 2-hydr-oxyaklavinon til 2-hydroxyaclacinomycin A men ikke selv 15 kan danne 2-hydroxyaklavinon.
Aclacinomycin A dannet af Streptomyces galilaeus MA 144-Μχ (ATCC 31133) er et antitumor antibiotikum, som er nyttigt til behandling af leukæmi og faste tumorer, jfr. beskrivelsen til US-patent nr. 3.988.315. Endvidere har 2-hydr-20 oxyaclacinomycin A, som er nært beslægtet med aclacinomycin A, og som har formlen
DK 161338 B
5 o cooch3 ”ναΛαΛ/“λ
^OH
WyV
OH 0 OH
0 0 C^CH3
/CH N XCH3 0 OH
--O
0=/^H3 y en kraftigere antitumorvirkning,men en svagere cardio-tok-sisk virkning end aclacinomycin A.
2-Hydroxyaclacinomycin A er beskrevet i europæisk patent-5 publikation nr. 30255.
Ifølge fremgangsmåden i ovennævnte patentskrift fremstilles 2-hydroxyaclacinomycin A ved en to-trins fremgangsmåde, ved hvilken 2-hydroxyaklavinon med formlen O COOCH3 H°vVvVVCH2CIi3
^OH
VyW
OH O OH OH
DK 161338 B
6 fremstilles ved dyrkning af en mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-m^, hvorefter 2-hydroxyaklavinon omdannes til 2-hydroxyaclacinomycin A ved hjælp af Streptomyces 5 galilaeus MA 144-Μχ eller mutanter heraf, som kan glyco-sidere 2-hydroxyaklavinon men ikke selv kan danne 2-hydr-oxyaklavinon.
Med henblik på at videreudvikle den ovenfor beskrevne totrins fermenteringsfremgangsmåde til fremstilling af 2-10 hydroxyaclacinomycin A har man søgt at tilvejebringe en mikroorganisme, som kan danne 2-hydroxyaclacinomyciner ved en 1-trinsfermenteringsfremgangsmåde. Det har vist sig, at det ved anvendelse af en rekombinant mikroorga- nisme af slægten Streptomyces fremkommet ved protoplast-15 sammensmeltning af den 2-hydroxyaklavinon-producerende mutant med den 2-hydroxyaklavinon-glycosiderende mutant, som ikke selv kan danne 2-hydroxyaklavinon, er muligt direkte i ét trin at fremstille 2-hydroxyaclacinomycin A. Derved opnås en væsentligt enklere fremstilling af 20 2-hydroxyaclacinomycinerne, idet et fermenteringstrin og et oprensningstrin kan udelades.
Det har endvidere vist sig, at ovennævnte rekombinante mikroorganisme foruden 2-hydroxyaclacinomycin A kan danne 2-hydroxyaclacinomycin N, som er et reduktionsprodukt af 25 2-hydroxyaclacinomycin A, og som har formlen
DK 161338 B
7 O COOCH, H0\A/Y\Ai/ CH2CH3
n OH
ww OH 0 i£) o O ^CH3
--0 OH
OH
jfr. europæisk patentpublikation nr. 45474, og en hidtil ukendt anthracyclinforbindelse, som betegnes 2-hydro xyacla-cinomycin B, og som har formlen
DK 161338 B
8 o cooch3 E0\^\/\/\^ CH2CH3
j ^ OH
YWY
OH O OH *
O
Λ-O
0 9 0<:· Λ" o
Sidstnævnte anthracyclinantibiotikum har også udtalt antitumorvirkning .
2-Hydroxyaclacinomycinerne A, B og N er potentielle kli-5 niske antitumormidler til pattedyr og mennesker, da de udviser særdeles god virkning ved behandling af tumor-angrebne forsøgsdyr, hvilket forklares nærmere i det følgende.
Ifølge den foreliggende opfindelse kan 2-hydroxyaclacino-10 mycin A, B og N dannes ved anvendelse af en rekombinant af Streptomyces galilaeus, såsom Streptomyces galilaeus A-862, der er tilvejebragt ved protoplastsammensmeltning.
°κ 161338 Β 9
Protoplastsammensmeltningsteknikken anvendes i vid udstrækning til fremstilling af rekombinanter af forskellige mikroorganismer, herunder streptomycetes. Rekombina-5 tionen af Streptomyces galilaeus er imidlertid ikke tidligere beskrevet. Nærmere betegnet findes der i litteraturen ingen angivelser af, at protoplast-sammensmeltnings-teknikken kan anvendes til tilvejebringelse af en rekombi-nant, som afviger fra moderstammerne med hensyn til anti-10 biotikumproduktivitet, uden at beskadige de enkelte moderstammers nyttige karakteristika.
Som eksempler på modermutanter til tilvejebringelse af en rekombinant, som er i stand til at danne 2-hydroxyaclacino-mycin A, B og N, ved protoplastsammensmeltning kan nævnes en 15 2-hydroxyaklavinon-akkumulerende mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-M1, såsom Streptomyces galilaeus 10U-2936 (denne mutant er blevet isoleret på samme måde som beskrevet for Streptomyces galilaeus ANR 58 (FERM P-5081) i japansk offentliggørelsesskrift 56-49341/1981) og en mutant af Strep-20 tomyces galilaeus MA 144-M^, som er anthracyclinon-glycosi-derende, men som ikke selv danner 2-hydroxyaklavinon, såsom Streptomyces galilaeus 11U-111 (denne mutant er isoleret på samme måde som beskrevet for Streptomyces galilaeus KE-303 (FERM P-4808) i JP-offentliggørelsesskrift nr. 56-15299/1981).
25 Ved protoplastsammensmeltningen anvendes med fordel auxo- trope mutanter med henblik på at lette adskillelsen af rekom-binanterne, da det er let og effektivt at udvælge rekombinanter som heterotrope på et minimalsubstrat.
I praksis afprøves heterotrope rekombinanter derefter for dan-30 nelse af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N.
I det følgende gives en detaljeret beskrivelse af en fremgangsmåde til tilvejebringelse og isolering af en rekombi-
DK 161338B
10 nant mikroorganisme, som kan danne 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N direkte ved fermentering.
Nedenstående to auxotrope mutanter blev afledt af Strepto-myces galilaeus MA 144-M1 ved mutation med henblik på efter-5 følgende rekombinationsforsøg under anvendelse af protoplast-sammensmeltningsteknikken:
Stamme 10U-2936: ACM-, AKN-, 2H0-AKN+, Glyc-, ade”
Stamme 11U-111: ACM-, AKN-, 2HO-AKN-, Glyc+, ura“ I det følgende angives betydningerne af de forkortede gene-10 tiske betegnelser, som anvendes ved den foreliggende opfindelse.
ACM- : ingen direkte dannelse af aclacinomycin AKN : ingen dannelse af aklavinon 2H0-AKN : dannelse af 2-hydroxyaklavinon 15 2H0-AKN : ingen dannelse af 2-hydroxyaklavinon
Glyc+ : evne til at omdanne exogent tilsat aklavinon el ler 2-hydroxyaklavinon til henholdsvis aclacinomycin· eller 2-hydroxyaclacinomycin ved endogen glycosidering 20 Glyc : manglende evne til at omdanne exogent tilsat aklavinon eller 2-hydroxyaklavinon til henholdsvis aclacinomycin eller 2-hydroxyaclacinomycin ved endogen glycosidering ade : kræver adenin til vækst 25 ura : kræver uracil til vækst.
Med øjet på en podenål udtages modne sporer fra de enkelte kulturer af de to mutanter på et YS-agarmedium, sporerne inokuleres i et reagensglas indeholdende sterilt YS-substrat (0,3% gærekstrakt, 1,0% opløselig stivelse, pH-værdi = 7,2, 30 4 ml pr. reagensglas) og inkuberes natten over ved 28°C.
0,3 ml af kulturen overføres til en 250 ml erlenmeyerkolbe indeholdende 30 ml MSG-medium (Okanishi et al., J.Gen.Microbiol. iJO, 389, 1974), og der foretages rystedyrkning ved 28°C
DK 161338 B
11 i 20 timer på et roterende rysteapparatur (220 omdrejninger pr. minut). 20 ml af kulturen centrifugeres til isolering af mycelium, som derefter vaskes med 10 ml P-medium (jfr.
J.Gen.Microbiol. 80, 389, 1974). Det vaskede mycelium suspen-5 deres i 20 ml P-medium indeholdende 1 mg/ml lysozym (Sigma Chemical Co.) og henstår ved 28°C i 1 time. Blandingen sættes til et glasrør (15 x 200 ml) pakket med steril affedtet bomuld, hvorefter filtratet centrifugeres ved lav temperatur (1000 G, 10 minutter) til isolering af protoplaster. Proto-10 plasterne optages i 1,5 ml P-medium og fortyndes med P-medium, indtil suspensionen har en optisk tæthed på 1,0 ved 600 nm. Protoplasttætheden for stamme 10U-2936 og stamme 11U-111 er g henholdsvis 4,4 x 10 kolonidannende enheder pr. ml og g 1,1 x 10 kolonidannende enheder pr. ml. Pro toplasterne blan-15 des i forholdet 10:1 med henblik på protoplastsammensmelt-ning.
0,2 ml af protoplastblandingen sættes til 1,8 ml P-medium indeholdende 40% polyethylenglycol (i det følgende betegnet PEG) 4000, hvorpå der foretages forsigtig blanding, og blan- o 20 dingen henstår ved 28 C i 5 minutter. Efter passende fortynding i P-medium anbringes protoplastsuspensionen på såvel et minimalsubstrat som et komplet substrat indeholdende adenin og uracil, begge i en mængde på 100 yg/ml, og der inkuberes ved 28°C i 10 dage.
25 Minimalsubstrat
Saccharose 110 g
Polyethylenglycol 1000 50 g K2S04 0,25 g
Sporelementopløsning * 2 ml 30 KH2P04 ** 0,05 g
MgCl2*6H20 4,06 g
CaCl2*2H20 ** 2,95 g
Glycose 10 g L-Asparagin 3 g 35 0,1 M TES, pH 7,4 ** 100 ml
Agar 22 g
DK 161338 B
12
Der tilsættes vand til et samlet rumfang på 1 liter.
* ZnCl2*4H20 40 mg, FeCl2*6H20 200 mg, CuC12*2H20 10 mg, MnCl2*4H20 10 mg, Na2B407-10H2O 10 mg, (NH4)6(Mo7024)*4H20 10 mg, opløst i 1 liter destilleret 5 vand.
i* Steriliseret separat.
Ca. 500 kolonier på minimalsubstratet overføres til minimal-agarskrårør med den nedenstående sammensætning. Efter inkube-ring ved 28°C i 5 dage overføres hver kultur igen til et mi-10 nimalagarskrårør.
Minimalagarskrårør
Glucose 10 g L-Asparagin 3 g KN03 1 g 15 K2HP04 0,5 g
MgS04*7H20 0,5 g
CaCl2“2H20 0,5 g 0,1 M Tris-HCl, pH 7,2 100 ml
Agar 15 g 20 Destilleret vand tilsættes til et samlet rumfang, på 1 liter.
Med en podenål udtages prøve af kulturen, som inokuleres i et reagensglas indeholdende YS-substrat (beskrevet ovenfor) og der foretages rystedyrkning natten over ved 28°C. Hele kulturen inokuleres i en 250 ml Erlenmeyerkolbe indeholden-25 de 30 ml dyrkningssubstrat med den nedenfor anførte sammensætning, og dyrkningen foretages i 2 dage på det ovenfor beskrevne rysteapparatur.
Dyrknings substrat
Opløselig stivelse 1,5% 30 Glucose 1,0%
Sojabønnemel 3,0%
, DK 161338B
13 Gærekstrakt 0,2% k2hpo4 0,1%
MgS04-7H20 0,1%
NaCl 0,3% 5 Mineralopløsning * 0,125%
Ledningsvand pH 7,4 * CuS04*5H20 2,8 g, FeS04*7H20 0,4 g, MnCl2*4H20 3,2 g,
ZnS04*7H20 0,8 g, opløst i 500 ml destilleret vand.
Til analyse af produktet udtages 5 ml af dyrkningsvæsken, 10 som blandes med 5 ml af en 3:2-blanding af chloroform og methanol på en magnetisk blander. Efter centrifugering udtages chloroformlaget/ som koncentreres til tørhed. Remanensen opløses i et lille rumfang chloroform og anbringes 1,5 cm fra bunden på en forbehandlet silicagel tyndtlags-15 kromatografiplade (E.Merck, Darmstadt). Pladen fremkaldes i et opløsningsmiddelsystem af chloroform/methanol/konc.ammoniak (150/11/0,3). Dannelsen af 2-hydroxyaclacinomyciner bedømmes ved sammenligning med autentiske prøver af 2-hydroxy-aclacinomycin A og 2-hydroxyaklavinon, som er fremkaldt sam-20 tidigt på den samme plade. Blandt 500 isolater findes 420, som ikke danner antibiotikum, og 40, som danner 2-hydroxyaklavinon, medens 30 rekombinanter danner 2-hydroxyaclacinomyciner.
Blandt rekombinanterne, som danner 2-hydroxyaclacinomycin, 25 er Streptomyces galilaeus A-862 den mest velegnede til dannelse af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N. Denne rekombinant er deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, med deponeringsnummeret FERM BP-45 i overensstemmelse med Budapest-traktaten an 30 international anerkendelse om deponering af mikroorganismer til patentformål.
De mikrobiologiske karakteristika for denne rekombinant er stort set de samme som for moderstammen Streptomyces galilaeus MA 144-M·^ (jfr. japansk offentliggørelsesskrift 51-35 34915/1976 ) .
DK 161338B
14
Stamme A-862 har følgende mikrobiologiske egenskaber: 1) Morfologi
Lige, kroget eller spiralformet luftmycelium, der strækker sig fra velforgrenet substratmycelium. Især på stivelse-5 uorganiske salte-agar konstateres udbredt kroget eller spiralformet luftmycelium. Ingen hvirvelformer.
Modne sporekæder består af mere end 10 sporer. Sporerne har en størrelse på 0,4-0,8 x 0,8-1,6 μ og har glat overflade.
Ingen luftmyceliumvækst på de fleste medier bortset fra gær-10 ekstrakt-maltékstrakt-agar og stivelse—uorganiske salte-agar, hvor der dannes ringe luftmycelium uden sporedannelse.
2) Kulturegenskaber på forskellige substrater
Farvebetegnelserne i parenteserne er i overensstemmelse med definitionerne i Color Harmony Manual (Container Corporation 15 of America), og subsidiært henvises til Color Standards of Japan Color Institute.
(1) Saccharose-nitrat-agar (inkuberet ved 27°C)
Vegetativ vækst farveløs eller svag gul (2db) 20 Luftmycelium intet
Opløseligt pigment intet (2) Glycose-asparagin-agar (inkuberet ved 27°C)
Vegetativ vækst lys orangegul (3ea) til lysebrun (4ie) 25 Luftmycelium ringe
Opløseligt pigment let, gulligbrunt (3) Glycerol-asparagin-agar (ISP-5-substrat, inkuberet ved 27°C)
Vegetativ vækst svag gul (2db) til gullig brun
DK 161338 B
15
Luftmycelium meget lidt
Opløseligt pigment intet (4) Stivelse—uorganiske salte-agar (ISP-4-substrat, inkuberet ved 27°C) 5 Vegetativ vækst lys gul (2db) til gullig brun
Luftmycelium lysegråt (d)
Opløseligt pigment intet (5) Tyrosin-agar (ISP-7-substrat, inkuberet ved 27°C) 10 Vegetativ vækst lys oliven (2ge) til gråligbrun (4ig)
Luftmycelium intet
Opløseligt pigment ' brunt (6) Næringsagar (inkuberet ved 27°C) 15 Vegetativ vækst gulligbrun
Luftmycelium gulliggråt (2dc) til lysegråt (d)
Opløseligt pigment let, brunt (7) Gærekstrakt-maltekstrakt-agar (ISP-2-substrat, inkube- 20 ret ved 27°C)
Vegetativ vækst lys organgegul (3ea) til lysebrun (4ie)
Luftmycelium gulliggråt (2dc)
Opløseligt pigment rødt 25 (8) Havremel-agar (ISP-3-substrat, inkuberet ved 27°C)
Vegetativ vækst gulligbrun til grålig gul (3ec)
Luftmycelium næsten intet
Opløseligt pigment lidt, brunt
DK 161338 B
16 3) Fysiologiske egenskaber
Denne rekoinbinant kan ikke differentieres fra moderstammerne med hensyn til fysiologiske egenskaber, såsom gelatineudnyttelse, melanoid-dannelse, stivelseshydrolyse, peptonisering 5 af skummet mælk, udnyttelsesmønster for carbonkilder osv.
De fysiologiske egenskaber for stamme A-862 er som anført i det følgende: (1) vaeksttemperatur
Ved dyrkning ved temperaturer på 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C 10 på maltose-gærekstrakt-agar (maltose 1,0%, gærekstrakt (Oriental Yeast Co.) 0,4%, agar 2,0%, pH-værdi 6,0) viser det sig, at denne rekombinant kan vokse ved de anførte temperaturer bortset fra 50°C, og den optimale temperatur ligger i området 27-37°C.
15 (2) Omdannelse af gelatine fra fast til flydende form (gluco- se-pepton-gelatine, inkuberet ved 20°C)
Positiv.
(3) Hydrolyse af stivelse (stivelse-uorganiske salte-agar, inkuberet ved 27°C) 20 Positiv.
(4) Koagulering og/eller peptonisering af skummetmælk (in kuberet ved 27°C)
Peptonisering uden koagulering.
(5) Dannelse af melanoidpigment (trypton-gærekstrakt-sub- 25 strat (ISP-l-medium), pepton-gærekstrakt-jernagar (ISP- 6-medium), tyrosin-agar (ISP-7-medium), alle inkuberet ved 27°C)
Melanoidpigment dannes i alle de afprøvede medier.
(6) Udnyttelse af carbonkilder (Pridham-Gottlieb-medium
DK 161338 B
17 (ISP-9-medium), inkuberet ved 27°C)
Positiv: L-arabinose, D-xylose, glucose, D-fructose, saccharose, inositol, L-rhamnose, raffinose.
Negativ: D-mannitol.
5 Til dannelse af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N dyrkes en 2-hydroxy-aclacinomycin-producerende stamme under anvendelse af en almindeligt anvendt fremgangsmåde i et substrat indeholdende forskellige assimilerbare næringskilder. Med fordel anvendes carbonkilder, såsom glucose, glycerol, saccharose, stivelse, 10 maltose samt fedtstoffer og olier, organiske nitrogenkilder, såsom sojabønnemel, kødekstrakt, gærekstrakt, pepton, majsstøbevand og bomuldsfrø-mel, og uorganiske nitrogenkilder, såsom ammoniumsulfat, ammoniumchlorid, ammoniumnitrat og ammoniumphosphat, om nødvendigt kan der tilsættes uorganiske 15 salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, phosphater og tungmetalsalte, vitaminer, skumdæmpende midler, såsom silicone KM 75 (Shinetsu Chemical Co.) og lignende.
Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, pH-værdi, tvungen beluftning og omrøring samt dyrkningsperioden vælges hensigts-20 mæssigt for den pågældende stamme, således at der akkumuleres maksimale mængder 2-hydroxyaclacinomyciner i dyrkningsvæsken.
I praksis er det fordelagtigt at foretage dyrkningen ved en temperatur på 20-40°C, fortrinsvis 28°C, i et tidsrum på 1-5 dage, fortrinsvis 3 dage, ved en pH-værdi på 5-9, fortrins-25 vis 7,4.
Til isolering af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N fra dyrkningsvæskerne anvendes sædvanligvis traditionelle fremgangsmåder, som er kendt fra fremstillingen af anthracyclinantibio-tika. F.eks. adskilles dyrkningsvæsken først i myceliet og 30 filtratet ved centrifugering eller ved blanding med et filterhjælpemiddel, såsom kiselgur, efterfulgt af filtrering. Myceliet underkastes ekstraktion med et med vand blandbart opløsningsmiddel, såsom acetone, methanol, ethanol og butanol, medens filtratet ekstraheres med organiske opløsningsmidler, 18
DK 161337 B
såsom chloroform og ethylacetat. Det er også muligt at udvinde antibiotikaene direkte fra dyrkningsvæsken ved passende valg af ekstraktionsopløsningsmidler uden forudgående adskillelse af myceliet fra filtratet.
5 De organiske ekstrakter indeholdende 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N koncentreres til tørhed under formindsket tryk.
Til isolering af de enkelte anthracyclinantibiotika er det fordelagtigt at anvende forskellige isolerings- og rensningsmetoder· enten enkeltvis eller i kombination, såsom 10 søjlekromatografi under anvendelse af adsorptionsmidler såsom silicagel, aktivt kul og aluminiumoxidgel, svagt sure eller basiske ionbytterharpikser og gelfiltreringsmaterialer, såsom Sephadex® LH-20, præparativ silicagel-tyndtlags-kromatografi, væske-væske-kromatografi og modstrømsfordeling.
15 2-Hydroxyaclacinomycin A, B og N kan danne salte med uorganiske og organiske syrer. De frie baser af 2-hydroxy-acla-cinomycin A, B og N kan omdannes til syreadditionssaltene på i og for sig kendt måde. Som eksempler på syrer, der med fordel kan anvendes til fremstilling af syreadditionssalte 20 af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N, kan nævnes: saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, hydrogenbromidsyre, salpetersyre, eddikesyre, propionsyre, maleinsyre, citronsyre, ravsyre, vinsyre, fumarsyre, glutaminsyre, pantothensyre, laurylsulfonsyre, benzensulfonsyre og naphthalensulfonsyre.
25 I praksis omsættes 2-hydroxy-aclacinomycin A, B eller N i form af de frie baser med syrerne i et passende opløsningsmiddel, og syreadditionssaltene isoleres ved frysetørring eller ved tvungen fældning med et opløsningsmiddel, hvori syreadditionssaltene er tungtopløselige.
30 2-Hydroxyaclacinomycinerne A, B og N har en udtalt inhiberende virkning på væksten og nucleinsyresyntesen i museleukæmiceller L1210. Til bestemmelse af 50%'s vækst- 4 hæmningskoncentrationen (IC,-q) inokuleres 5 x 10 L1210 cel- ler/ml (slutkoncentration) i RPMI 1640 medium (Rosewell Park 19 °Κΐ6?3 38Β
Memorial Institutes 1640 medium) indeholdende 20% kalveserum. 2-Hydroxyaclacinomycin A, B eller N tilsættes til en slutkoncentration på fra 0,01 yg/ml til 0,25 yg/ml, medens kontrolprøverne ikke tilsættes nogen forbindelse.
5 Efter inkubering ved 37°C i en carbondioxidinkubator foretages celleoptællinger i forsøgskulturerne og kontrolkulturerne til bestemmelse af IC.-n-koncentrationen for antibio-
DU
tikumet.
Til bestemmelsen af virkningen på nucleinsyresyntesen for- 5 10 dyrkes 5 x 10 L1210 celler/ml (slutkoncentration) ved 37°C i 1-2 timer i en carbondioxidinkubator i et RPMI 1640 medium tilsat 10% kalveserum. 15 minutter efter tilsætningen af 2-hydroxyaclacinomycin A, B eller N i forskellige koncentrationer tilsættes 0,05 yCi/ml (slutkoncentration) 14 14 15 af C-uridin eller C-thymidin, og dyrkningen fortsættes ved 37°C i yderligere 60 minutter. Inkorporeringen af den radioaktive base afbrydes ved tilsætning af 10%'s trichlor-eddikesyre. De syreuopløselige stoffer isoleres, vaskes 3 gange med 10-5% trichloreddikesyre og opløses i myresyre.
20 Radioaktiviteterne i de syreuopløselige fraktioner fra forsøgs- og kontrolkulturerne bestemmes til beregning af antibiotikumets 50%'s hæmningskoncentration for nucleinsyre-syntese.
Den terapeutiske virkning af 2-hydroxyaclacinomycin B under-25 søges på CDF.-mus med Ll210-leukæmi. 24 timer efter intra- 1 5 peritoneal indgift af 1 x 10 L1210 celler pr. dyr til CDF^-mus indgives 2-hydroxyaclacinomycin B intraperitonealt hver dag i 10 dage. Forlængelsen af overlevelsestiden beregnes i forhold til kontroldyr, som indgives fysiologisk salt-30 opløsning, og hvis overlevelsestid sættes til 100. I tabel 1 er anført in vitro og in vivo virkningerne og toksiciteter-ne af 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N og aclacinomycin A.
DK 161338 B
20
Tabel 1
2-Hydroxy- 2-Hydroxy- 2-Hydroxy- Aclacino-aclacino- aclacino- aclacino- mycin A mycin A mycin B mycin N
1. Antitumor-aktivitet mod L1210 i mus Overlevelsesforlængelsestal (T/C %) (dosis i mg/kg) 12 120 113 108 10 158 139 144 toksisk 7.5 220 226 219 123 5 218 200 202 196 2.5 176 153 148 186 1,25 148 131 128 125 0,63 124 110 109 107 2. In vitro virkning mod 50% hæmningskoncentration dyrkede (IC,-n ^ ug/ml)
Ll210-celler Væksthæmning 0,04 0,03 0,04 0,01 DNA-syntesehæmning 0,85 1,0 1,18 0,30 RNA-syntesehæmning 0,14 0,22 0,18 0,04 3. Toksicitet (akut)
Mus, i.p. 50,0 50,0 45,7 22,6
DK 161338 B
21
De i tabel 1 anførte resultater indicerer, at 2-hydroxy-aclacinomycin A, B og N er lovende antitumormidler, da (1) de dræber museleukæmiceller L1210 i en lav koncentration og bevirker en udmærket forlængelse af overlevelses- 5 perioden for mus med transplanterede leukæmiceller, (2) de har en betydeligt lavere toksicitet end de kendte anthracyclinforbindelser, såsom adriamycin og daunomycin, og de har en lavere toksicitet end aclacinomycin A, som har den laveste toksicitet og cardio-toksicitet blandt de 10 kendte anthracyclinantibiotika, (3) deres antitumorvirkning svarer til eller er bedre end virkningen af aclacinomycin A, og (4) dosisområdet for antitumorvirkningen er ca. dobbelt så stort som for aclacinomycin A.
Sædvanligvis er det primære mål for virkningen af anthra-15 cyclinantibiotika nucleinsyresyntesen. Da 2-hydroxyacla-cinomycin A, B og N hæmmer RNA-syntesen mere specifikt end DNA-syntesen, har de samme virkningsmekanisme som aclacinomycin- og rhodomycin-analoge.
Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de følgende eksemp-20 ler.
Eksempel 1.
Der fremstilles podekulturer af Streptomyces galilaeus A-862 (FERM BP-45) ved podning af femten 500 ml kolber, som hver indeholder 100 ml podemedium (opløselig stivelse 1,0%, gluco-25 se 1,0%, Essan Miit (sojabønnemel, Ajinomoto Co.) 0,1%, gærekstrakt 0,1%, K2HP04 0,1%, MgS04-7H20 0,1%, NaCl 0,3%), med podemateriale fra en agarskrårørkultur, og kolberne rystedyrkes ved 28°C i 48 timer.
Til fem 30 liters fermenteringsbeholdere sættes hver for sig 30 15 liter dyrkningssubstrat bestående af glycerol 2,0%, soja bønnemel 3,0%, gærekstrakt 0,2%, K2HP04 0,1%, MgS04*7H20 0,1%, NaCl 0,3%, CuS04*5H20 0,0007%, FeS04*7H20 0,0001%, MnCl2.4H20 0,0008% og ZnS04*7H20 0,0002% (pH 7,4), og der autoklaveres
DK 161338 B
22 under standardbetingelser. Tre kolber med de ovenfor beskrevne podekulturer blandes, og fermenteringsbeholderne podes dermed. Dyrkningen fortsættes i 3 dage ved 300 omdr. pr. minut under anvendelse af en beluftning på 1/2 rum-5 fang/rumfang/minut. Dyrkningsvæsken fra de fem fermenterings-beholdere hældes sammen og centrifugeres, hvorved der fås et mycelium og en ovenstående opløsning. Den ovenstående opløsning blandes grundigt med 20 liter chloroform, og chloroformlaget isoleres. Myceliet ekstraheres med 30 liter 10 acetone, og .acetoneekstrakten koncentreres under fomindsket tryk til ca. en trediedel af det oprindelige rumfang. Anthracyclinantibiotikaene ekstraheres fra acetonekoncentratet med 5 liter chloroform. Denne chloroformekstrakt kombineres med chloroformekstrakten af den ovenstående opløs-15 ning, hvorefter der koncentreres under formindsket tryk til dannelse af en rå ekstrakt indeholdende 2-hydroxyaclacino-mycin A, B og N.
Eksempel 2.
Den rå ekstrakt fra eksempel 1 opløses i ammoniakalsk methanol 20 (400 ml methanol plus 0,4 ml koncentreret ammoniak), og der centrifugeres til fjernelse af uopløselige bestanddele. Den ovenstående væske opdeles i fire 100 ml portioner. Opløsningen (100 ml) sættes til en Sephadex LH-20 søjle (4,0 x 35 cm), og der elueres med ammoniakalsk methanol. De første 25 elueringsfraktioner med rødt pigment opsamles fra fire søjle-kromatograferingsperioder og koncentreres til tørhed under formindsket tryk, hvorved 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N fås i rå form.
Det rå produkt opløses i en lille mængde chloroform, anbrin-30 ges lineært på en for-overtrukket silicagel-tyndtlags-kroma-tografiplade til præparativ anvendelse (silicagel 60 PF254' E.Merck, Darmstadt) og fremkaldes i et opløsningsmiddelsystem bestående af chloroform og methanol (10/1). 2-Hydr-oxyaclacinomycin A, B og N giver Rf-værdier på henholdsvis 35 0,5, 0,7 og 0,2. Hvert af de tilsvarende silicagelområder
DK 161338 B
23 afskrabes fra pladen og elueres med en 40:10:0,l-blanding af chloroform, methanol og koncentreret ammoniakvand.
Eluaterne koncentreres til tørhed i vakuum. 2-Hydroxyacla-cinomycin A, B og N renses atter ved præparativ silica-5 gel-tyndtlags-kromatografi under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding bestående af chloroform, methanol og eddikesyre (150/15/1). Silicagelområderne svarende til 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N afskrabes fra kromatogram-met og elueres med en blanding af chloroform og methanol 10 (5/1). Eluaterne koncentreres til tørhed under formindsket tryk, og remanenserne opløses hver for sig i 20 ml 0,2 M acetatpuffer, pH-værdi 3,5. Efter fjernelse af små mængder uopløseligt materiale ved centrifugering vaskes de ovenstående opløsninger hver især med 10 ml toluen under kraf-15 tig rystning. De vandige lag isoleres, neutraliseres med 4 N natriumhydroxidopløsning og ekstraheres med chloroform. Derpå skylles med en 0,01 M EDTA-opløsning med pH-værdi 6,0 og derpå med vand, hvorefter chloroformekstrakterne tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres i vakuum til 20 små rumfang. Overskud af n-hexan sættes til chloroformkoncentraterne, og de gule bundfald frafiltreres. Ved tørring i vakuum fås 61 mg 2-hydroxyaclacinomycin A, 92 mg 2-hydroxyaclacinomycin B og 24 mg 2-hydroxyaclacinomycin N.
De fremstillede 2-hydroxyaclacinomyciner A, B og N har de 25 nedenfor anførte fysisk-kemiske egenskaber:
2-Hydroxyaclacinomycin A
Udseende: gulbrunt pulver
Smeltepunkt: 165-167°C
Molekylvægt: 827,9 30 Elementær analyse for C42H53NOi6:
Beregnet (%) C 60,93, H 6,45, N 1,69, 0 30,93 Fundet (%) C 60,27, H 6,20, N 1,64,
Specifik drejning: [a]33 +42,3° (c = 0,04, CH3OH)
DK 161338 B
24
Ultraviolet-synligt absorptionsspektrum: χ90% CH3OH ^ ( 1% ); 222(375), 256(235) max l cm 295 (207) , 450 (110) IR-absorptionsspektrum (KBr): 5 3450, 2975, 2940, 1735, 1675, 1620, 1610, 1450, 1400, 1380, 1300, 1255, 1230, 1170, 1120, 1010.
Proton-NMR-spektrum (100 MHz, CDCl^-CD^OD): δ, ppm: 2,20 (6H, s, N(CH3)2), 3,65 (3H, s, COOCH3) 6,20 (IH, d, J=2Hz, ArH), 10 6,70 (IH, d, J=2Hz, ArH), 7,30 (IH, s, ArH).
2-Hydroxyaclacinomycin B
Udseende: gulligbrunt pulver
Smeltepunkt: 186-188°C
Molekylvægt: 825,8 15 Elementæranalyse for C42H5iN^i6:
Beregnet (%) C 61,08, H 6,22, N 1,70, O 31,00 Fundet (%) C 60,92, H 6,25, N 1,68, O 31,20
SpeciEikdrejning: [a]33 +97,5° (c = 0,04, CH3OH)
Ultraviolet-synligt absorptionsspektrum: 20 λ90% CH30H nm (ε): 220 (580), 255(390), 2 93(350), max 1 cm 450 (190), 500s(100) .
IR-absorptionsspektrum (KBr): 3450, 2930, 1730, 1620, 1610, 1380, 1300, 1250, 1120, 1010, 760.
25 Proton-NMR-spektrum (100 MHz, CDC13-CD30D): 6, ppm: 2,20 (6H, s, N(CH3)2), 3,70 (3H, s, C00CH3) 6,56 (IH, d, J=2Hz, ArH) 7,18 (IH, d, J=2Hz, ArH), 7,57 (IH, s, ArH)
DK 161338 B
25
2-Hydroxyaclacinomycin N
Udseende: gulligbrunt pulver
Smeltepunkt: 167-169°C
Molekylvægt: 829,9 5 Elementæranalyse for C42H55NOi6:
Beregnet (%) C 60,79, H 6,68, N 1,69
Fundet (%) C 60,30, H 6,85, N 1,71
Specifik drejning: [a]j^ +103° (c = 0,04, CH^OH).
Ultraviolet-synligt absorptionsspektrum: 10 λ90% CH3OH nm ( 1% j 223(381), 256(227), 294(204), max 1 cm ' ' 440 (113), 520s (37) .
IR-absorptionsspektrum (KBr): 1735, 1675, 1620, 1250, 1000.
Proton-NMR-spektrum (100 MHz, CDCl3-CD3OD): 6, ppm: 2,20 (6H, s, N(CH3)2), 3,67 (3H, s, COOCH3), 15 6,56 (IH, d, J=2Hz, ArH), 7,19 (IH, d, J=2Hz, ArH), 7,57 (IH, s, ArH).
Claims (3)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af 2-hydroxy- aclacinomycin A, B og N med formlen 0 cooch3 H0va\v\C¥H3 ^OH νννγ fvP R nch3 hvori R er A-O Φ O 0H for 2-hydroxyaclacinomycin A, R er p .0 oA] o DK 161338 E 27 for 2-hydroxyaclacinomycin B, og R er HO '- 5 for 2-hydroxyaclacinomycin N, eller syreadditionssalte deraf, kendetegnet ved, at en stamme af slægten Strepto-myces, som kan danne 2-hydroxyaclacinomycin A, B og N direkte ved fermentering, dyrkes i et næringssubstrat, hvorefter forbindelserne isoleres fra dyrkningsvæsken, og 10 eventuelt omdannes til syreadditionssalte deraf, hvilken stamme af slægten Streptomyces er dannet ved protoplast-sammensmeltning af en mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-Mi, der kan danne 2-hydroxyaklavinon, med en mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-Μχ, som kan omdanne 15 2-hydroxyaklavinon til 2-hydroxyaclacinomycin A men ikke selv kan danne 2-hydroxyaklavinon.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen af slægten Streptomyces er Streptomyces galilaeus A-862. 20
3. Rekombinant mikroorganisme, som kan danne 2-hydr oxyaclacinomycin A, B og N, til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er Streptomyces galilaeus A-862 (FERM BP-45) dannet ved proto-plastsammensmeltning af en mutant af Streptomyces 25 galilaeus MA 144-M^, som kan danne 2-hydroxyaklavinon, med en mutant af Streptomyces galilaeus MA 144-M^, som kan omdanne 2-hydroxyaklavinon til 2-hydroxyaclacinomycin A men ikke selv kan danne 2-hydroxyaklavinon.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12582681A JPS5826895A (ja) | 1981-08-11 | 1981-08-11 | ２‐ヒドロキシアクラシノマイシンｂ |
| JP12582681 | 1981-08-11 | ||
| JP10725682 | 1982-06-21 | ||
| JP10725682A JPS58224698A (ja) | 1982-06-21 | 1982-06-21 | ２−ヒドロキシアクラシノマイシンａ及びｎの製造法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK358882A DK358882A (da) | 1983-02-12 |
| DK161338B true DK161338B (da) | 1991-06-24 |
| DK161338C DK161338C (da) | 1992-01-06 |
Family
ID=26447294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK358882A DK161338C (da) | 1981-08-11 | 1982-08-10 | Fremgangsmaade til fremstilling af 2-hydroxyaclacinomycin a, b og n eller syreadditionssalte deraf samt en rekombinant mikroorganisme til anvendelse derved |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4474945A (da) |
| EP (1) | EP0072974B1 (da) |
| CA (1) | CA1187434A (da) |
| DE (1) | DE3266843D1 (da) |
| DK (1) | DK161338C (da) |
| ES (1) | ES514892A0 (da) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5982395A (ja) * | 1982-11-02 | 1984-05-12 | Microbial Chem Res Found | アントラサイクリン化合物、その製造法およびその用途 |
| JPS59148795A (ja) * | 1983-02-08 | 1984-08-25 | Microbial Chem Res Found | アントラサイクリン化合物、その製造法およびその用途 |
| IE58981B1 (en) * | 1985-10-15 | 1993-12-15 | Vestar Inc | Anthracycline antineoplastic agents encapsulated in phospholipid micellular particles |
| US4977084A (en) * | 1989-02-16 | 1990-12-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Production, isolation, and identification of novel antifungal compounds |
| CN108864221B (zh) * | 2018-06-08 | 2022-04-01 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 阿克拉霉素类似物及其制法和用途 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4204038A (en) * | 1976-04-07 | 1980-05-20 | Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai | Process for preparing antibiotics MA 144-M1 and MA 144-M2 |
| JPS52136159A (en) * | 1976-04-07 | 1977-11-14 | Microbial Chem Res Found | Anti/malignanttumor containing the same as active ingredients |
| US4309503A (en) * | 1978-02-09 | 1982-01-05 | Farmitalia Carlo Erba S.P.A. | Preparation of 11-deoxy anthracycline antibiotics |
| IL60094A0 (en) * | 1979-05-22 | 1980-07-31 | Sparamedica Ag | Tetracyclic compounds,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| DE3071391D1 (en) * | 1979-09-07 | 1986-03-13 | Sanraku Ocean Co | 2-hydroxyaclacinomycin a, pharmaceutical composition containing it; 2-hydroxyaclavinone and fermentative process for preparing same |
| JPS5731696A (en) * | 1980-08-01 | 1982-02-20 | Sanraku Inc | Anthracycline derivative |
| JPS5756494A (en) * | 1980-09-22 | 1982-04-05 | Microbial Chem Res Found | New anthracyclin derivative |
| EP0050725B1 (en) * | 1980-10-27 | 1984-07-04 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Process for aclacinomycins and microorganism used therein |
| EP0050724B1 (en) * | 1980-10-27 | 1985-01-09 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Process for anthracycline glycosides |
-
1982
- 1982-08-05 CA CA000408759A patent/CA1187434A/en not_active Expired
- 1982-08-06 US US06/405,917 patent/US4474945A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-08-10 ES ES514892A patent/ES514892A0/es active Granted
- 1982-08-10 DK DK358882A patent/DK161338C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-08-11 DE DE8282107295T patent/DE3266843D1/de not_active Expired
- 1982-08-11 EP EP82107295A patent/EP0072974B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8400489A1 (es) | 1983-10-16 |
| EP0072974A1 (en) | 1983-03-02 |
| DK358882A (da) | 1983-02-12 |
| DE3266843D1 (en) | 1985-11-14 |
| EP0072974B1 (en) | 1985-10-09 |
| DK161338C (da) | 1992-01-06 |
| CA1187434A (en) | 1985-05-21 |
| US4474945A (en) | 1984-10-02 |
| ES514892A0 (es) | 1983-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK141761B (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotika aclacinomycin A og/eller B eller salte eller deoxyribonucleinsyrekomplekser deraf. | |
| US4518589A (en) | BBM-2478 Antibiotic complex | |
| DK145200B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af anthtacyclinglycosid-antibiotika | |
| IE840201L (en) | Rebeccamycin and derivatives | |
| GB2164035A (en) | A novel antibiotic and production thereof | |
| NZ208622A (en) | Anthracycline derivatives, preparation by fermentation process and pharmaceutical compositions | |
| EP0182152B1 (en) | Antitumor antibiotics (LL-E33288 Complex) | |
| IE851504L (en) | Antitumour cyclic depsipeptides | |
| DK161338B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af 2-hydroxyaclacinomycin a, b og n eller syreadditionssalte deraf samt en rekombinant mikroorganisme til anvendelse derved | |
| DK146342B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af anthracyclinglycosidantibiotika betegnet ma 144-m1 og ma 144-m2 eller ikke toksiske syreadditionssalte eller komplekser deraf med desoxyribonucleinsyre | |
| KR920001448B1 (ko) | Bbm-2478 항생제 착화합물 | |
| EP0110155B1 (en) | Novel anthracycline derivatives, a process for preparing the same by a microorganism strain, the novel strain streptomyces cyaneus, and use of the anthracycline derivatives as medicaments | |
| US4942155A (en) | Biosynthetic anthracyclines related to daunorubicin | |
| EP0171677A1 (en) | Novel anthracycline antibiotics | |
| EP0206138B1 (en) | Anthracycline compounds, a process for their preparation and their use as medicaments | |
| US4572895A (en) | Process for preparing an antibiotic complex by culturing actinomyces strain ATCC 39417 | |
| US4743594A (en) | Antibiotic, antitumor compounds and their use | |
| US4565861A (en) | Serirubicum | |
| CA1306213C (en) | Phenanthridine derivatives, process for the preparation thereof, and compositions containing them | |
| CA1338184C (en) | Bu-3862t antitumor antibiotic | |
| AU616946B2 (en) | Antibacterial and antitumor agents ll-e33288epsilon-i and ll-e33288-epsilonbr, with processes and intermediates for producing said agents | |
| JPH0576958B2 (da) | ||
| JPH0578322A (ja) | 新規抗生物質ｓｆ２７３８物質及びその製造法並びに制癌剤 | |
| GB2036021A (en) | Antitumor antibiotics | |
| JPS6334159B2 (da) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |