JPS5826895A - ２‐ヒドロキシアクラシノマイシンｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗腫瘍性アント２サイクリン系抗生物質２−
ヒドロキシアクラシノマイシンＢおよびその製造法に関
し、さらに詳しくは、式で示される２−ヒトｐキシアク
ラシノマイシンＢまたはその塩と、蚊化合物の発酵によ
る製造法に関する。

ストレプトきセス　ガリラエウスＭＡ１４４−Ｍｓ　（
ＡＴＣＣ３１１３３）が生産する抗生愉質アクラシノｉ
イシンＡは、白血病及びｗｉ蓋がんに著効を示す優れた
抗腫瘍性抗生物質である（米１！ｉｔ特杵第３．９８８
．３１５号５明細書参照）。一方、その＃１４縁化合物
の一つで次式 で示される２−ヒドロキシアクラシノマイシンＡは、ア
クラシノマイシンＡ以上に強い抗腫瘍作用を示し、且つ
６毒作用も軽微であることが見い出され、本発明者らが
先に提案した（特許ｌｌ８５５−４９４００号出願明細
書参照）。

２−ヒドロキシアクラシノマイク／Ａは、＃明細書によ
れば、ストレプトミセス　ガリラエウスＭＡ１４４−Ｍ
ｌの変異菌株が生産する次式で示される２−ヒドロキシ
アクラビノンをストレプトミセス　ガリラエウスＭＡ１
４４−Ｍｌから誘導される抗生物質非生産性で且つグリ
コシデージ璽ン能を有する変異菌株の培養液中に添加し
、咳菌株による変換によって得られている（前述の出願
明細書参照）。

本発明者らは、上記２段階の発酵法による２−ヒドロキ
シアクラシノｉイシンＡの製造法をさらに改良すべく、
直接発酵法に供することのできる微生物を検累したとこ
ろ、前記２−ヒドロキシアクラビノン生産変異菌株と抗
生物質非生産性変換性変異菌株をプロトプラスト融合に
よる交配に付し、その子孫から２−ヒドロキシアク２ジ
ノマイシンＡを生産する能力を宵する１株の造成に成功
した。本発明者らは、さらに該菌株は、培養によって２
−ヒドロキシアク２ジノマイシンＡと、咳抗生物質が還
元された化合物２−ヒドロキシアクラシノマイシンＮ　
（＊願昭５５−１０６５２２号出願明細書参照）および
文献未載の式（Ｉ）で示され、本発明者によって２−ヒ
ドロキシアクラシノ１イシンＢと命名された化合物をも
生産すること、さらに該新規化合物は、強い抗腫瘍性を
有することを見い出し本発明を完成した。

本発明によシ提供される２−ヒドロキシアクラシノマイ
シンＢは、後述のように動物の実験腫瘍に対して高い活
性を有している丸め、人間をはじめとする哺乳動物の抗
がん剤としての使用が期待される。

本−発明に従えば、２−ヒドロキクアクラシノマイシン
Ｂの製造は、該化合物を生産する能力を有するものであ
る限シ、どのような属に属する微生物でも使用できるが
、一般にはストレプトミセス属に属する微生物のうち、
殊に前述のプロトプラスト融合法によって得られる菌株
のうち、例えば（二 ストレプトミセス　ガリラエウスＡ−８６２が有利用へ いられる。

え 微生物のプロトプラスト融合法による組換体の△ 作成は微生物界で紘既に知られており、抗生物質生産性
放線菌でも報告があるが、ストレプトミセス　ガリラエ
ウスでは報告されておらず、特に本発明における如く抗
生物質生産に関して特徴を有する菌株間の交配に応用し
、両親菌株のそれらの１！＃徴を有し、且つ、親菌株と
社異表る抗生物質を生産する組換え体の作成の例は、文
献未載でオシ、本願により始めて明らかにされるもので
ある。

本発明の２−ヒドロキシアク２ジノマイシンＢ生産画を
プロトプラスト融合法によシ造成するには、ストレプト
ミセス　ガリラエウスＭＡ１４４−Ｍｓ由来の変異菌株
である２−ヒドロキシアクラビノン蓄積変異菌株、例え
ばストレプトミセス　ガリラエウスｌ０Ｕ−２９３６（
特開昭５６−４９３４１号公報記載のＡＮＲ５８菌株（
クエ研菌寄第５０８１号）と同様の方法によシ分離した
〕と抗生物質非生産性変換性変異株、例えばストレプト
ミセス　ガリラエウスＩＩＵ−１１１菌−株〔特開昭５
６−１５２９９号公報記載のＫＥ−３０３（微工研菌寄
第４８０８号）と同様の方法によシ分離した〕を交配し
、その組換え体よシ選択単離する。

本発明では組換え体の選択を容易にするため、菌株を栄
養要求性標識で遺伝的に標印し、交配後の組換え体の選
択を最少培地上で増殖し得る非栄養要求性コロニーとし
て選択する。

かくして得られる非栄養要求性組換え体のうちから、目
的の２−ヒドロキシアクラシノマイシンＢを生産する菌
株を選択する。

以下に、２−ヒドロキクアクラシノマイシンＢ生産菌株
の造成、単離方法を詳述する。

ストレプトミセス　ガリラエウスＭＡ１４４−Ｍｌから
変異処理によシ単離した以下の特徴を有する２薗株辞 を、プロトプラスト融合による変配実瑚に供した。

１０Ｕ−２９３６１株：　ｈｃｙｒ−、ＡＫＮ　、　２
ＨＯ−ＡＫＮ’。

Ｇｌｙｃ　、　ａｄｓ １１Ｕ−１１１菌株　：　ＡＣＭ　、　ＡＫＮ　、　２
ＨＯ−ＡＫＮ　。

十 Ｇｌｙｃ　　ｌ　　ｕｒａ なお、上記の菌株の遺伝的標識は便宜上の記号で示して
おシ、それぞれ次の内容を表わすものとする。

ＡＣＭ　　ニアクラジノマイシン非生産性＋　。

ＡＫＮ　　、アクラビノン生産性 ＡＫＮ：アクラビノン非生産性 ＋ ２ＨＯ−ＡＫＮ　：　２−ヒドロキシアクラビノン生産
性２ＨＯ−ＡＫＮ　：　２−ヒドロキシアクラピノン非
生産性Ｇｌｙｃ＋：外部より添加アクラビノン又は２−
ヒドロキシアクラビノンに糖を結合 させ、アクラシノｉイシン又は２− ヒドロキシアクラシノマイシンを生 成せしめる能力 Ｇｌｙｅ　　：外部よ如添加アクラビノン又は２−ヒド
ロキシアクラビノンに糖を結合 させ、アクラシノマイシン又は２− ヒドロキシアクヲシノマイシンを生 成せしめる能力の欠損 ａｄｓ　　：アデニンの要求性 ｕｒａ　　：ウラシルの要求性 上記両菌株をそれぞれＹ８斜面寒天培養よ）−白金耳と
シ、別々の殺ｗＹＳ液体培地（Ｏ，ａ％酵母エキス、　
１チ可溶性殿粉、　ｐＨ７，２、４ｔｔｄ／試験管）に
接種し、２８℃で一夜培養する。この０．３−を３０−
の関西らのＭＳＧ培地（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏ
ｌ、８０　：　３８９（１９７４）］を分注殺菌した２
５〇−容三角フラスコに接種し、ロータリーシェーカー
（回転数２２０７分）上で、２８℃にて２０時間振盪培
養する。両培養菌液より２０−をそれぞれ採取し、遠心
操作にて菌体を集め、１０−のＰ培地ｃＪ−、Ｇｅｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　８０　：　３８９（１９７４）
１ｍ照〕で１回洗浄したのち、１１−濃度のリゾチーム
（シグマ社製、商標）を含むＰ培地２〇−中に再懸濁す
る。２８℃で１時間反応させ、次いで殺菌脱脂綿でパッ
クし九炉適用ガラス管（φ１５ｘ２００ｓｇｍ）を通過
させたＦ液を低温下で遠心分離（１０００１Ｊ、　１０
分間）シ、集めたプロトプラスト細胞をそれぞれ１．５
−のＰ培地に懸濁し、さらに濁度（０、Ｄ　６００　）
が１．０になるべく　Ｐ培地で希釈して融合用プロトプ
ラスト細胞液とする。これらのグロトグラスト細胞懸濁
液はコロニー形成単位として１０Ｕ−２９３６菌株由来
のもので４．４Ｘ１０’鷹、ＩＩＵ−１１１由来のもの
で１．ｌＸ１０’％−であった。前者のプロトプラスト
細胞液１０に対し後者のプロトプラスト細胞液を１の割
合で混合し、プロトプラスト融合処理に供した。

すなわち、混合プロトプラスト細胞液の０２−をＩＢ−
の４０チポリエチレングリコール（以下ｒ　ＰＥＧＰ１
↓１ｅ２．加１＞９Ｊｔｌ′ｌ（ｒ：、ｔ、２Ｑ゛ｃ７
り小Ｆ＊’ｌｔ’４？Ｌ」と略記する）　４０００含有
　Ｐ培地で希釈して以下△ に示す再生最少培地及び更にアデニン及びウラシルをそ
れぞれ１００μｆ／ｄ補添した再生完全培地から成る平
板上にてレートＬ、２８℃で１０日間培養する。

再生最少培地組成 ！　　糖　　　　　　　　　　目Ｏｆ ポリエチレングリコール１０００　　　５Ｇ　　・ｆＫ
、８０４　　　　　　　　　　　　　０．２５　Ｆ米 Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　　　
　２　　＋ｄＫＨ，ＰＯ，”来　　　　　　　　　　　
　０．０５　ｆＭｇｃＬ２＠６Ｈ２Ｏ４，０６ｆ ＣａＣ４”２Ｈ２０米”　　　　　　　　　　　２．９
５　ｔグルコース　　　　　　　１Ｏｆ Ｌ−アスパラギン　　　　３ｆ 未来 ０．１ＭＴＥＳ　　（ｐＨ７，４）　　　　　１００　
　ｄ寒　　　天　　　　　　　　　　　　　２２　　　
Ｆ蒸溜水で全量を１ｔとする。

；ｂｌ−来　ＺｎＣｔ、５４Ｈ１０４０ｗｑ　、　Ｆｏ
ｃｔ、ｍ６Ｈ，０２００＋＋ｖ　。

ＣｕＣ４”２４０１０ｗＩＩ、　　ＭｎＣ４ｇ”４Ｈ１
０１０１１Ｆ。

Ｎａ、Ｂ２Ｏ，＠ＩＯＨ，０１０ｑＩ　　Ｇ’ＪＨ４％
（ＭＯ，（１，ｌｌ）＊４Ｈ，０１０′ｑを１ｔの蒸溜
水に溶解した溶液来来　分別殺菌する。

最少平板培地上で生じたコロニーのおよそ５００個を単
離し、次に示す最少眸天斜面に採る。２８℃で５日間培
養したのち、さらに同寒天斜面に１回議代する。

最少寒天斜面培地組成 グルコース　　　　　　　１０　　Ｆ Ｌ−アスパラギン　　　　３ｆ ＫＮｏ、　　　　　　　　　　　１　　？に、ＨＰＯ４
０，５ｆ ＭｇＳＯ４＠７Ｈ１００，５ｔ ＣａＣ４・２Ｈｇｏ　　　　　　　　Ｏ，５ｆＯ，ＩＭ
　Ｔｒｉｒ　ＨＣＬ　（ｐＨ７２）　　１００　　ｍ蒸
溜水で電量１ｔとする。

これよシー白金耳をＹｓ液体培地（前出）に接種し、−
夜２８℃で振盪培養する。これを以下に示す発酵培地 発酵培地組成 可溶性殿粉　　　　　　　　　　１ｊチグルコース　　
　　　　　　　　　ｉ、ｏチェスサン・ミート　（大豆
粉、味の素社製）３．０−酵母エキス　　　　　　　　
　Ｏ２チ に２ＨＰ０４０．１　％ Ｍｇ５Ｏ，”７Ｈ，ＯｏＪＴ。

ＮａＣｔＯ，３％ ミネラル米　　　　　　　　　０．１２５チ水　　道　
　水　　　　　　　　　　　　ｐＨ７，４＊　　ＣｕＳ
Ｏ４＊５Ｈ２０２，８９＋　　ＦｓＳＯ４＊７Ｈ１００
，４ｔ　。

ＭｎＣ２！＠４Ｈ１０３，２１Ｐ　、ＺｎＳＯ４”７Ｈ
２００，８Ｆを蒸溜水５００−に溶解 の３０ＩＩ！／を含む２５〇−容三角フラスコに全量接
種して、ロータリーシェーカー（前出）上で２日間振盪
培養する。生成物を検するため、培養液５−を採取し、
これにクロロホルム／メタノール混液（３／２）の５−
を添加、ミキサーにて攪拌、遠心処理にてりはロホルム
抽出層を分離、別取し濃縮乾個する。これを少量のクロ
ロホルムに溶解シテ、シリカゲル薄層Ｆ！５４　（メル
ク社製）の下端よシ１．５ｍ下にスポットし、クロロホ
ルム／メタノール／濃アンモニア水（１５０／１１１０
．３）の溶媒系で展開し、２−ヒドロキシアク２ビノマ
イシンＡ及び２−ヒドロキシアク２ビノンを対照として
判定し、２−ヒドロキシアクラシノマイシン生産菌を検
索単離する。被検１株５００株のうち４２０菌株は抗生
物質非生産性菌株、４０菌株は２−ヒドロキシアク２ビ
ノン生産−菌株、　３０＃ｉ株が２−ヒドロキシ−アク
２ジノマイシン生産菌株であった。

かくして得られた２−ヒドロキシアクラ７ノマイシン生
産菌株中、ストレプトミセス　ガリラエウスＡ−８６２
と命名した菌株は諌抗生物質の生産に有利に用いられる
。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第４５号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４５）として国際寄託さ
れている。

本菌株の主な菌学的性状は、兄妹であるストレプトミセ
ス　ガリラエウスＭＡ１４４−Ｍ５の性状（特許公開昭
５１−３４９１５号公報参照）と殆んど変わらない。

以下に菌株Ａ−８６２の菌学的性状を記す。

１）形態 基 本菌株は、いずれも明確に分枝した寒中菌糸よシ直状或
は鉤状〜螺旋形成を有する気中菌糸を伸長する。特にス
ターチ無機塩寒天培地上で気中菌糸は鉤状〜螺旋形成が
顕著に観察された。

輪生枝は認められない。

成熟した胞子鎖は１０個以上の胞子の連鎖を認め、胞子
の大きさは０．４〜０．８　Ｘ　Ｏ，８〜１．６ミクロ
ン位で胞子の表面は平滑である。多くの培地で気中菌糸
を作らず僅かにイースト・麦芽寒天培地及びスターチ・
無機塩寒天培地で気中菌糸を形成するも、熟成胞子の着
生は認められない。

２）各種培地における生育状態 色の記載について〔〕内に示す記号はコンテイナー・コ
ーポレーシ嘗ン・オブ・アメリカの力５　　＠　バー　
％　ニー　＠　マニュアル（ＣｏｎｔａｉｎｅｒＣｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍ５ｒｉｃａのＣｏ１ａｒ
　ｈａｒｍｏｎｙｍａｎｕａｌ　）　　に従い、日本色
彩研究所の色の標準も参照し記載した。

（１）シュクローズ・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）発
育は無色〜うすい黄Ｃ２ｄｂ　）　、気菌糸は着生せず
、水溶性色素Ｆｉ認められない。

（２）グルコース・アスパラギン酸寒天（２７℃培養）
発育は明るい橙黄色（３ｅａ　）〜明るい茶〔４１・〕
、気菌糸は殆んど着生せず、僅かに黄褐色の水溶性色素
が認められる。

（３）グリセリン０アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５．２７℃培養）発育は淡黄Ｃ２ｄｂ　）〜黄茶色、
気菌糸は殆んど着生せず、水溶性色素は認められない。

１４１スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４．２
７℃培養）うすい黄（２ｄｂ　）〜黄茶の発育上に明る
い灰（ｄ）の気菌糸を着生し、水溶性色素は認められな
い。

（５）チロシン寒天培地（Ｉｓｐ−培地７．２７℃培養
）発育紘明るいオリーブ基（２ｅａ　）〜灰茶〔４ｉｇ
　）　、気菌糸は着生せず、水溶性色素は褐色を呈する
。

（６）ｌ針打１で（２７・こ１１） 黄茶色の発育上に、黄味灰Ｃ２ｄｅ　）〜明るい灰色（
ｄ）の気菌糸を着生し、僅かに茶色の水溶性色素が認め
られる。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩｓＰ−培地２．２７
℃培養）明るい橙黄色（３ｅａ　）〜明るい茶（４ｉｅ
　］の発育上に、黄味灰色（２ｄｃ　）の気菌糸を着生
し、水溶性色素は赤色を呈する。

（８）オートミール寒天培地（］］ｓＰ−培地３．２７
℃培養発育は黄茶〜灰黄色（３ｓｅ　）　＋気菌糸は殆
んど着生せず、水溶性色素は僅かに褐色を呈する。

３）生理的性質 ゼラチン分解、メラニン色素生成、殿粉分解力、スキム
ミルクのペプトン化、炭水化物の利用性などの生理的性
質は親株及び本菌株の間に差異は認められず、その性質
を挙げれば以下の如くである。

（１）生育温度範囲： マルトース・酵母エキス寒天（マルトースｔ、ｏ％　、
酵母エキス〔オリエンタル酵母株製）　Ｏ，４％　＋寒
天２．Ｏ％　、　ｐＨ６，０）を用いて２０℃、２４℃
、２７℃、３０℃、３７℃及び５０℃の各温度で生育を
検した結果、５０℃を除くいずれの温度でも生育するが
、最適温度は２７℃〜３７℃付近である。

（２）ゼラチンの液化（グルコース、ペプトン、ゼラチ
ン、２０℃培養）：液化する。

（３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天。

２７℃培養）：分解する。

（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
プロス、　ｌ５Ｐ−培地１；ペプトン・イースト−鉄寒
天、　ｌ５Ｐ−培地６；チロシン寒天。

ｌ５Ｐ−培地７．いずれも２７℃培養）：いずれの培地
にもメラニン様色素の生成が認められる。

（６）炭素源の利用性（ブリドノ−ム・ゴツトリープ寒
天、　ｌ５Ｆ−培地９．２７℃培養）：Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、グルコース、Ｄ−７ラクトース、
シェフロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、−）フ
イノースを利用する。Ｄ−マンニトールは利用しない。

本発明の方法によって、２−ヒドロキシアクラシノマイ
シンＢを得るには、まず２−ヒドロキシアクラシノマイ
シンＢ生産菌株を通常の微生物が利用し得る公知の栄養
源を含有する培地で公知の方法で培養する。例えば炭素
源としてはグルコース、グリセリン、蔗糖、殿粉、マル
トース、動橋物油などが使用でき、窒素源としては例え
ば大豆粉、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンス
テイープ・リカー、綿実粕などの有機物並びに硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウムなどの無機体窒素が使用できる。又必要
に応じて食塩、塩化カリウム。

リン酸塩、その他重金属塩などの無機塩類及びビタミン
類を添加する他、発酵中の発泡を抑制するため、例えば
シリコーン（信越化学に、に、製−ぶ７５：商ｌ１ｌ）
などの消泡剤を適宜添加することができる。

温度、ｐＨ１通気攪拌および発酵時間のような発酵条件
は用いられる菌株が最大量の諌死合物を蓄積するよ５に
選択する。例えば、発酵条件としては２０〜４０℃、好
ましくは２８℃の温度でｐＨ５〜９、好ましくは７．４
において　１〜５日間、好ましくは３日間行うのが有利
である。

発酵培養物より２−ヒドロキシアクラシノマイシンＢを
単離するには、アントラサイクリン系抗生物質の製造の
技術分野に於ける常法の手段、例えば遠心操作によるか
、あるいは適当なケイ藻土の如き濾過助剤の存在下に培
養液を濾過し、菌体とＦ液に分離した後、菌体からはア
セトン、メタノール、エタノールもしくはブタノール等
の水と混和する有機溶媒を用いて抽出し、またＦ液から
は、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽
出することができるが、これらの溶媒を適宜選択するこ
とによシ、菌体を予め分別することなく培養液から直接
抽出することも可能である。

かくして抽出された有機溶媒中の有効成分は減圧下で濃
縮乾個し、更に目的の核化合物を単離するために、シリ
カゲル、活性炭、アルミナ等の吸着剤、弱酸性あるいは
弱塩基性イオン交換樹脂、セファデックスＬＨ−２０（
７アルマシア製；　商８１１１）などのゲル濾過剤など
を用いるカラムクロｉトゲラフイー法、又は分域用シリ
カゲル薄層クロマトグラフィー法、液体り四マドグラフ
ィー法及び向流分配法などを単独あるい社適宜に組合せ
ることにより有利に行うことができる。

かくして得られる本発明の化合物２−ヒドロキシアクラ
シノマイシンＢは各種の無機酸または有機酸と付加塩を
形成させることが出来る。すなわち遊離の塩基の造塩に
用いられる公知の方法によって、２−ヒドロキシアク２
ジノマイシンＢの酸付加塩が得られる。例えば塩酸、硫
酸、リン酸、臭酸、硝酸、酢酸、プロピオｙ酸、マレイ
ン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、７マール酸、グル
タミン酸、パントテン酸、ラウリルスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸等の付加塩として
得ることができる。一般的な造塩方法としては、２−ヒ
ト筒キシアクラシノマイシンＢの遊離の塩基を適当な溶
媒−中で上記の酸と反応させて凍結乾燥法か又は、該当
の塩が僅かしか溶けない溶媒を用いて沈殿せしめて回収
する方法を挙げることができる。

本発明の新規化合物２−ヒドロキシアクラシノマイシン
Ｂはマウス白血病培養ＩＩａ胞（Ｌ１２１０　）の増殖
及び核酸合成を顕著に抑制する。例えば、２０チ仔牛血
清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（ロースウェルパーク
研究所１６４０　）へＬ１２１０細胞を５Ｘ１０＋／ｄ
接種し、同時に本発明の化合物を０．１及び０．５μ２
鷹の濃度で添加し、３７℃にて炭酸ガス培養器中で培養
し対照区に対する５０チ増殖阻害濃度を求めた。

更に上記のＬ１２１０培養細胞をｌＯチ仔子牛血清含む
ＲＰＭＩ　１６４０培地へｓ　ｘ　ｉｏ’ケ鷹となるよ
うに懸濁し、３７℃にて炭酸ガス培養器中で１〜２時間
培養を行った後、本発明の化合物を種々の濃度で添加し
、１５分後に更に１４Ｃ−ウリジｙ　（０，０５μｃｔ
／ｌ１ｔ）及び１４Ｃ−チミジン（０，０５μＣｉ／ｍ
）を添加し、３７℃にて６０分間培養した。　反応液へ
１０１１　）　！Ｉジクロル酸溶液を添加し、反応を停
止すると同時に、酸不溶愉を沈殿させ、１０〜５％　）
リクロル酢′酸にて更に３回洗浄した後、ギ酸に溶解し
、酸不溶物中の放射活性を測定し対照区に対する放射能
の取込み率から５０％取込み阻害濃度を求めた。

実験膿瘍動物に対する効果は、ＣＤＦ１マウスの腹腔内
へマウス白血病Ｌ１２１０細胞をＩ　Ｘ　１０’ケ／マ
ウス移殖し、２４時間後より連日１０日間２−ヒドロキ
シアクラシノマイシンＢを腹腔内へ投与し、対照区（生
理食塩水投与）に比較し算定した延命率、Ｌ１２１０白
血病に対する抗腫瘍効果及び毒性について２−ヒドロキ
シアク２ジノマイシンＡ及び２−ヒドロキシアク２ジノ
マイシンＮのそれと併せ第１表に示す。

第１表 以上の結果から、本発明の２−ヒドロキシアクラシノマ
イシンＢはマウス白血病Ｔ、１２１０細胞の増殖を低議
度で死滅させ、白血病細胞移殖マウスに対してすぐれた
延命効果を示し、且つアドリアマイシンあるいはダウン
マイシンなどの既知アントラサイクリン系抗生物質に比
べ、毒性は社るかに低く、アントラサイクリン抗生物質
のうちでは最も低毒性、低心毒性抗腫瘍性物質として研
究開発されたアクラシノｉイシンＡに比し、更に低毒性
であシ、かつ同等あるいはそれ以上の抗腫瘍効果を有し
ており、更に抗腫瘍性効果を示す濃度域はアクラシノマ
イシンＡに比し、およそ２倍であり、制がん剤として優
れた性質を有している。

なお、アントラサイクリン系抗生物質の直接の作用点と
考えられている核酸合成に対しては、本物質ｄ　ＲＮＡ
　＋成をより特異的に阻害する特徴を有しておシ、その
阻害作用ね既知のアクラシノマイシン及びロドマイシン
群抗生物質に類似している。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ 可溶性殿粉ｘ−ｏ％　＋グルコース１．０チ、ニスサン
ミート（大豆粉、味の素社［）０．１チ、酵母エキス０
．１％　、　Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、　Ｍｇ５Ｏ，−７
）１２００．１％、　ＮａＣ２０，３チから成る種母用
培地１００−を分注、殺菌した５０〇−容フラスコ１５
本に、ストレプトミセス　ガリラエウスＡ−８６２（微
工研条寄第４５号）の斜面培養から一白金耳ずつ接種し
、２８℃にて４８時間振盪培養を行い種母を調製した。

クリセロール２９に、ニスサンミー）３１酵母エキス０
．２％　、　Ｋ、ＨＰＯ４０，１％　、　ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２０ｏ、ｉ＊　、　ＮａＣ１ｏ、３％　、　ＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ，００，０００７％　、　ＦｅＳＯ４・７Ｈ
，Ｏｏ、ｏｏｏｔ＊　。

ＭｎＣＬ２ｅ４Ｈ，Ｏｏ、ｏｏｏｓ＊およびＺｎＳＯ４
−７Ｈ，Ｏｏ、ｏｏｏｚ＊　（ｐＨ７，４）から成る発
酵培地１５ｔを分注、殺菌した３０１容ジヤーフアメン
ター５基に１基当り上記フラスコ種母３本分を混合接種
した。通気量１／２ｖ、ｖｍ、回転数３００／分で３日
間培養を実施した。培養液を混合し、遠心操作にて菌体
と上清に分けた。

上清は２０ｔのクロロホルムを添加攪拌抽出し、クロロ
ホルム層を分取した。一方薗体成分はアセトン３０ｔで
抽出後、アセトン層をおよそ１／３量に減圧下で濃縮乾
個し、さらにクロロホルム５ｔで抽出して、上清からの
クロロホルム抽出層と混合し、濃縮乾個して２−ヒドロ
キシアクラシノマイシンＢを含有するオイル状の粗抽出
物を得た。

実施例２ 実施例１で得た粗抽出物をアンモニア性メタノール（蟻
０−のメタノールに貴アンモニア水ＯＡｄ添加）に溶解
し、不溶物を遠心操作で除去したのち、その上清を１回
１００　ｄずつ４回に分けてセファデックスＬＨ−２０
カラム（φ４．Ｑ　Ｘ　３＆＋＋＋　）にかけ、上記の
アンモニア性メタノールで溶出した。最初に溶出される
赤色色素区分を集め、濃縮乾個して２−ヒト−キシアク
２ジノマイシンＢの組成分を得た。

次いでこの粗成分を少量のクロロホルムに溶解し、分取
用シリカゲル６０　ＰＦ□４薄層（メルク社製）に線状
に塗布し、クロロホルム／メタノール（１０／　１　）
の溶媒系で展開した。２−ヒドロキシアクラシノマイシ
ン成分Ａ、Ｂ及びＮはそれぞれおよそ０．７　、０．５
及び０．２付近のＲｆ値を示し、それぞれをかきとシ、
クロロホルム／メタノール／濃アンモニア水（４０／　
１０　／　０．１　）混液で溶出濃縮乾個した。次いで
Ａ及びＢ成分に関して拡開分取用シリカゲル６０　ＰＦ
５５４薄層を用い、クロロホルム／メタノール／酢酸（
ｒｓｏ　／　１５　／　ｘ、）の溶媒系で展開して再ク
ロマトを行った。Ａ及び８区分をかきとシ、クロロホル
ム／メタノール（ｓ／１）ｆｉ液で抽出し、それぞれを
濃縮乾個した。乾個物をそれぞれ０．２Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ３３）の２０−に溶解し、僅かに残る不溶物を遠心
操作にて除去し、次いでトルエン１０−で振盪混合して
洗浄した。水層を４Ｎ苛性ソーダー溶液で中和し、クロ
ロホルムにて抽出した。クロロホルム抽出液は０．０１
Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，０）で洗浄し、次いで水洗し
て、芒硝で乾燥させたのち、減圧濃縮した。濃縮液へｎ
−へキサンを過剰に加え、黄褐色の沈殿を生成させたの
ち、Ｐ遍にて集積せしめ真空乾燥を行い、２−ヒドロキ
シアクラシノマイシンＡ及びＢをそれぞれ６１岬及び９
２ｑ取得した。得られた２−ヒドロキシアクラシノマイ
シンＢの理化学的性状を以下に示す。

（１１形　　状　　黄褐色粉末 （２）融　　　点　　　　１８６〜１８８℃（３）分子
量　８２５．８ （４）元素分析　　Ｃ４□Ｈ３□ＮＯ□、とじて実験値
　　８０．９２　６２５　１．６８　３１．２０（５）
紫外可視吸収スペクトル ２９３　（３５０）　、　４５０　（１９０）　、　５
００ｍ　（１００）１６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢ
ｒ錠）ＣＩＩＭ。

３４５０、２９３０．１７３Ｇ、　１６２０．１６１０
．１３８０゜１３００、１２５０．１１２０．１０１０
．７６０（７）プロトン核磁気共鳴スペクトｋ　（１０
０ＭＨｚ、　ＣＤＣ２３−ＣＤ３０Ｄ　）δ、、、、　
　：　ｚ２ｏ　（６Ｈ，ｌ、　Ｎ（ＣＨｓ）＊　）３．
７０　（３Ｈ，ＩＩ、　Ｃ００ＣＨａ）６５６　（ＩＨ
，ｄ、　Ｊ＝２Ｈｚ、　Ａｒｃ）７．１８　（ＩＨ，ｄ
、　Ｊ＝２Ｈｚ、　ＡｒＢＤ７５７　（１）Ｉ、　ｓ、
　Ａｒ）ｐ 特許出願人　　三楽オーシャン株式会社代　　理　　人
　　　伊　　東　　守　　忠（ほか１名）第１頁の続き ０発　明　者　石倉知之 茅ケ崎市小和田１丁目２２−３２ ０発　明　者　竹内富雄 東京部品用区東五反田５−１− １ ０発　明　者　梅沢浜夫 東京都練馬区豊玉北４丁目２３番 地 手続補正書 昭和５６年９月２り日 特許庁長官　島　田春樹　殿 １、事件の表示 昭和５６年　特　　許　　願　第１２５８２６　号２、
　発明（７）名称２−ヒドロキシアクラシノマイシンＢ
３、　補正’ｅ　ｔ　；！＝　者　　およびその製造法
事件との関係　　　　　特　　　許　　出願人住所 氏名　　（１９１）三楽オーシャン株式会社４、代　理
　人 住　ｈ　　福岡県福岡市博多区博多駅前１丁目１−１博
多新三井ビル ５、補正命令の日付　　　昭和　　年　　月　　日　＞
、、、、、−、、、、。

６、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 ＋１１　　明細書第２５頁第１４行「０．１及びｏ、５
」を［０，０１ないし０．２５　Ｊと訂正する。

（２）　　同第２６頁下よシ第１行　［２−ヒドロキシ
アクラシノマイシンＮ」を［２−ヒドロキシアクラシノ
マイシンＢ」と訂正する。

（３）　　同第３１頁第７行「よそ０．７　、０．５及
び０．２」を「よそ０．５　、０．７及び０．２」と訂
正する。

手続補正書 特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１２５８２６号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 氏　名　（１９１）三楽オーシャン株式会社４、代理人 氏名　（５６５０）弁理士伊東置忘 ５、補正命令の日付　　　　昭和　　年　　月　　日６
、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 （１）　　明細書１０頁１２行 ｒＡＫＮ”　　：アクラビノン生産性」を削除。

（２）同１１頁３行 「・・添加」の次に「した」を挿入。

（３）同２６頁１７行〜１８行 「ついて２−ヒドロキシアクラシノマイシンＡ及び２−
ヒドロキシアクラシノマイシンＢ」を［ついて２−ヒド
ロキシアクラシノマイシンＢ及び公知の抗腫瘍性物質ア
クラシノマイシンＡ」と訂正。

（４）同２７頁表１の項目 「２−ヒドロキシアクラシノマイシンＡ」を「アクラシ
ノマイシンＡ」と訂正。

（５）同ｎ頁表１の Ｊ−ｒ　　− ＴＯＸ　　　　　　　　Ｔｏ　Ｘ Ｔ　ｏ　’ｘ　　　　　　　　１２３ １４０　　　　　　　１９６ １７２　　　　を　　　　１８６　　　　と訂正。

１２５　　　　　　　　　１２５ １０７」　　　　　　　　１０７４ 手続補正書 補正率件の表示 昭和５６年特許願第１２５８２６号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 氏　名　（１９１）三楽オーシャン株式会社４、代理人 ６、補正の対象 明細書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 で示される２−ヒドロキシアクラシノマイシンＢまたは
   その塩。 ２、　ストレプトミセス属に属する式 で示される２−ヒドロキシアクツクノマイシ／Ｂを生産
   する能力を有する微生物を栄養培地中で培養し、この培
   養物から賦化合物を回収することを特徴とする２−ヒド
   ロキシアク２ジノマイシンＢの製造法。 ３、ストレプトミセス属に属する微生物がストレプトミ
   セス　ガリツエウス（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｅ＊ｓｇａｌ
   ｉｌａｅｕｓ　）　Ａ−８６２である特許請求の範囲第
   ２項記載の２−ヒドロキシアクラシノマイシンＢの製造
   法。 ４、　ストヒプトミセス　ズリ２エウスＭＡ１４４−Ｍ
   １由来の２−ヒドロキシアク２ビノン蓄積能を有する変
   異株と該蓄積能を有しないが、培養によって培地中の２
   −ヒドロキシアクラビノンを２−ヒドロキシアクラシノ
   マイシンＡに変換する能力を有する菌株をプロトプラス
   ト融合による交配に付し、その子孫よシ選択された２−
   ヒドロキシアクラシノマイシンＢの生産能を有する微生
   物。