JP3902530B2 - 新規抗生物質キガマイシン類とその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌活性と抗腫瘍活性または抗癌活性とを示す新規抗性物質キガマイシン (Kigamicin) 類、詳しくはキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよびキガマイシンEあるいはこれらの塩に関する。
【０００２】
また、本発明はそれらのキガマイシン類の製造法に関する。さらに本発明は、キガマイシン類またはそれらの塩を有効成分とする医薬組成物、特に抗菌剤及び抗腫瘍剤組成物に関する。さらに、本発明は新規抗生物質キガマイシン類を生産する特性を持つ新規な微生物としてアミコラトプシス sp. ML630−mF1株を包含する。
【０００３】
なお、本明細書では、キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンD、キガマイシンEの少くとも一つまたは全部、あるいはそれらの少くとも2つの混合物を、総括的にキガマイシン類(a kigamicin)と称することがある。
【０００４】
【従来の技術】
種々な多数の抗菌物質が知られており、また種々な多数の抗腫瘍性物質が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
細菌感染症および癌の化学療法において、従来知られているまたは使用されている既知の化合物とは、異なる化学構造を有し且つ優れた活性を示す新しい化合物の発見または創製をすることは常に望まれており、そのための研究が行われている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の要望に応えることができる抗菌活性及び抗腫瘍活性を持つ新規な抗生物質を提供することを目的に、従来より有用な抗生物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その結果、土壌試料から新規な微生物としてアミコラトプシス属に属する菌株を分離することに成功し、またこの菌株が新しい構造骨格を有する抗生物質の少くとも5種を生産していることを見い出した。これらの新規抗生物質を単離して且つそれらの化学構造を決定することに成功し、総括的にキガマイシンと命名した。さらに、単離された5種の抗生物質をキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンD、キガマイシンEとそれぞれ命名した。更に、これらの新規抗生物質が薬剤耐性菌（メチシリン耐性菌等）をふくんだグラム陽性の細菌に抗菌活性を示し、また癌細胞の増殖に対して抑制活性を示すことを見い出した。
【０００７】
すなわち、第1の本発明においては、次の一般式（I）：
〔式中、RはキガマイシンAでは次式
の糖鎖を示し、キガマイシンBでは次式
の糖鎖を示し、キガマイシンCでは次式
の糖鎖を示し、キガマイシンDでは次式
の糖鎖を示し、またキガマイシンEでは次式
の糖鎖を示す〕で表される化合物である、抗生物質キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンD、およびキガマイシンE、あるいはこれらキガマイシン類の製薬学的に許容される塩が提供される。
【０００８】
一般式（I）で表されるキガマイシン類は、酸性物質であり、その製薬学的に許容される塩としては、第４級アンモニウム塩などの有機塩基との塩、あるいは各種金属との塩、例えばナトリウムのようなアルカリ金属との塩があり、これらの塩も上記の抗菌活性と抗腫瘍活性を有する。
【０００９】
次に、本発明の抗生物質キガマイシンA、B、C、DおよびEの理化学的性状を記載する。
（1）次式（Ia）
で表される抗生物質キガマイシンAの理化学的性状は次のとおりである。
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：225℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −153.0°（c 1.00、メタノール ）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 4.46分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：666.30 (M＋H)＋ 664.34 (M−H)−
G) 分子式：C34H35NO13
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図１に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (47200)、236 (43900)、254 (43600)、280 (34600)、341 (19100)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (47300)、 236 (46600)、254 (47400)、280 (37400)、341 (21300)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (30900)、366 (20000)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図２に示す。
νmax(cm− 1) 2935、2873、1654、1619、1587、1486、1469、1436、1361、1257、1193、1166、1122、1064、941、871、804、619、431、412
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図３に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図４に示す。
【００１０】
（2）次式（Ib）
で表される抗生物質キガマイシンBの理化学的性状は次のとおりである。
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：225℃
C) 比旋光度：濃度が不足して測定が不正確なので記載しない。
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 7.99分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：780.4 (M＋H)＋ 778.4 (M−H)−
G) 分子式：C40H45NO15
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図５に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (53300)、 236 (51400)、254 (50900)、280 (40500)、341 (22200)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (57000)、 236 (54500)、254 (56900)、280 (43600)、341 (24900)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (37000)、366 (23400)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図６に示す。
νmax (cm− 1) 2946、2867、2834、1617、1486、1440、1361、1332、1274、1257、1203、1170、1126、1060、977、944、875、757、622、430
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図７に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図８に示す。
【００１１】
（3）次式（Ic）
で表される抗生物質キガマイシンCの理化学的性状は次のとおりである。
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：210℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −154.0°（c 1.00、メタノール）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 7.74分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：810.4(M＋H)＋ 808.4 (M−H)−
F) 高分解能マススペクトル：実験値 832.27626(M＋Na)＋
計算値 832.27925
G) 分子式：C41H47NO16
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図９に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (23400)、 236 (21800)、254 (21000)、280 (16600)、341 (10500)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (22700)、 236 (21800)、254 (22200)、280 (17600)、341 (9700)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (14200)、366 (8500)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図10に示す。
νmax(cm− 1) 2946、2877、2830、1648、1619、1583、1486、1467、1442、1363、1276、1205、1170、1103、1062、944、877、804、624、418
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図11に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図12に示す。
【００１２】
（4）次式（Id）
で表される抗生物質キガマイシンDの理化学的性状は次のとおりである。
【００１３】
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：210℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −190.6°（c 1.00、メタノール ）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 11.69分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：954.6(M＋H)＋ 952.4 (M−H)−
G) 分子式：C48H59NO19
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図13に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (36200)、 236 (32900)、254 (31700)、280 (24800)、341 (13300)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (34300)、 236 (32700)、254 (33400)、280 (25900)、341 (15000)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (21000)、366 (13300)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図14に示す。
νmax(cm− 1) 2975、2938、2873、2832、1619、1585、1467、1442、1276、1203、1166、1105、1062、989、944、802、622、470、447、406
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図15に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図16に示す。
【００１４】
（5）次式（Ie）
で表される抗生物質キガマイシンEの理化学的性状は次のとおりである。
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：210℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −175.2°（c 1.00、メタノール ）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 16.49分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：1098.6 (M＋H)＋ 1096.6 (M−H)−
F) 高分解能マススペクトル：実験値 1120.43568(M＋Na)＋
計算値 1120.43654
G) 分子式：C55H71NO22
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図1７に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (38900)、 236 (35100)、254 (33100)、280 (26500)、341 (14300)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (37300)、 236 (35100)、254 (35300)、280 (16700)、341 (15600)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (22500)、366 (13700)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図18に示す。
νmax(cm− 1) 2975、2935、2834、1650、1619、1583、1469、1442、1376、1311、1276、1203、1162、1105、1062、989、944、877、804、620
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図19に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図20に示す。
【００１５】
さらに、本発明による一般式（I）の抗生物質キガマイシン類の生物学的性質を次に記載する。
【００１６】
A) 抗菌活性
本発明による抗生物質キガマイシン類の各種細菌に対する最低発育阻止濃度は、次の表1にしめす通りである。この抗菌スペルトルは日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラーヒントン寒天培地で倍数希釈法により測定した。
【００１７】
B）癌細胞増殖抑制活性
各種の癌細胞を用いて癌細胞の増殖を50％抑制するキガマイシンDの濃度(IC50値)を、ＭＴＴ法（「Journal of Immunological Methods」 65巻、55−60頁 (1983年) 参照）で測定した。その結果を表２に示す。
【００１８】
さらに、キガマイシン類は膵臓癌細胞PANC−1細胞に対する殺細胞効果について、通常の細胞培養の条件下より栄養飢餓状態で細胞死を惹起する作用が強い。キガマイシンA、B、C、DおよびEで得た試験の結果を図21に示した。キガマイシンCとDの場合、通常の培地を使用した場合は10μg/mlで100％の細胞死を来たしたが、栄養飢餓状態では0.1g/mlで100％の細胞死を惹起した。固形がんでは、血管新生が追い付かずに栄養飢餓状態にあると考えられ、栄養条件のいい正常部位と比べてキガマイシンは選択的な制癌活性を示すと考えられる。
【００１９】
上記表１の結果から明らかなように、本発明による抗生物質キガマイシン類は、各種の細菌に対して抗菌活性を有することから抗菌剤として有用である。また、表２および図21の結果から明らかなように、キガマイシン類は各種の癌細胞の増殖を抑制する抗腫瘍活性または抗癌活性を有するから抗腫瘍剤または抗癌剤として有用である。
【００２０】
さらに第２の本発明によれば、アミコラトプシス sp. ML630 − mF1 株（独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP − 10016 として寄託）を栄養培地に培養し、培養物から請求項１に記載のキガマイシンA、B、C、DまたはEの少くとも一つを採取することを特徴とする、抗生物質キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよび（または）キガマイシンEの製造法を提供される。
【００２１】
第２の本発明の方法で使用されるキガマイシン生産菌は、アミコラトプシスML630−mF1株である。
このキガマイシン生産菌は平成13年６月、微生物化学研究所において、三重県鳥羽市の土壌より分離された放線菌で、ML630−mF1の菌株番号が付された。
【００２２】
ML630−mF1株の菌学的性状は下記のとおりである。
1．形態
基生菌糸はよく分技し、ジグザグ状を呈する。また分断が認められる。気菌糸は比較的長く、直状あるいは不規則な曲状に伸長し、円筒形の胞子に分断する。また、気菌糸が絡まり、胞子のう様を呈する場合がある。胞子の表面は平滑で、大きさは約0.4 〜 0.6 × 0.8 〜 1.9ミクロンである。輪生技、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
【００２３】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Container Corporation of America の color harmony manual）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地２、27℃培養）
うす黄茶［2 le, Mustard］−うす茶［3 le, Cinnamon］の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
（２）オートミール寒天培地（ISP−培地３、27℃培養）
無色−うす黄［2 gc, Bamboo］の発育上に、白の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培地４、27℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP−培地５、27℃培養）
うす黄［2 gc, Bamboo］−うす黄茶［2 le, Mustard］の発育上に、白−茶白［3 cb, Sand］の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
（５）チロシン寒天培地（ISP−培地７、27℃培養）
うす黄［2 gc, Bamboo］−うす黄茶［2 le, Mustard］の発育上に、白−黄味白［2 cb, Ivory Tint］の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
（６）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
【００２４】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0％、L−アスパラギン 0.05％、リン酸水素二カリウム 0.05％、ひも寒天 3.0％、ｐＨ7.0）を用い、10℃、20℃、24℃、27℃、30℃、37℃及び45℃の各温度で試験した結果、１０℃、45℃での生育は認められず、20℃−37℃の範囲で生育した。生育至適温度は30℃付近である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ISP−培地４、27℃培養）
27日間の培養でスターチの加水分解は認められない。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ISP−培地６；チロシン寒天培地、ISP−培地７； いずれも27℃培養）
いずれの培地においても陰性である。
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地、ISP−培地９、27℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、myo−イノシトール、Ｄ−マンニトールを利用して発育し、ラムノース、ラフィノースは利用しない。
Ｌ−アラビノース、シュクロースもおそらく利用しない。
（５）硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリウム含有ペプトン水、ISP−培地８、
27℃培養）
硝酸塩の還元性は判然としないが、おそらく陰性である。
【００２５】
４．菌体成分
（１）細胞壁組成
メソ型の２、６−ジアミノピメリン酸を含有する。
（２）全菌体中の還元糖
アラビノース、ガラクトースを含み、A型である。
（３）イソプレノイド・キノン
主要なメナキノンとして、ＭＫ−９(H4）を含有する。
（４）リン脂質
ホスファチジルエタノールアミンを含み、ホスファチジルコリン及び未知のグルコサミン含有リン脂質を含まず、ＰII型を示す。
（５）ミコール酸
含有しない。
【００２６】
５．16SrRNA遺伝子解析
16SrRNA遺伝子の部分塩基配列（1239 nt）を決定し、DNAデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ML630−mF1株の塩基配列は以下に示したとおり、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属放線菌の16SrRNA遺伝子と高い相同性を示した。Amycolatopsis albidoflavus (98%)、A. rubidus (98%)、A. mediterranei (97%)、A. azurea (97%) 及びA. coloradensis (97%) 等である。なお、カッコ内は塩基配列の相同値を表記した。
【００２７】
以上の性状を要約すると、ML630−mF1株は、その形態上、基生菌糸はよく分枝し、分断を認める。気菌糸は直状あるいは曲状で、円筒形の胞子に分断する。輪生技、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。種々の培地で、うす黄−うす黄茶の発育上に白の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。メラニン様色素は生成せず、硝酸塩の還元反応はおそらく陰性、スターチの水解性は認められない。
ML630−mF1株の菌体成分は、細胞壁にメソ型の２、６−ジアミノピメリン酸を含有し、全菌体中の還元糖はＡ型、主要なメナキノンはＭＫ−９(Ｈ４）で、リン脂質はPII型である。ミコール酸を含有しない。
16SrRNA遺伝子の部分塩基配列を公知菌株のデータと比較したところ、アミコラトプシス属放線菌の塩基配列と高い相同性を示した。
【００２８】
以上の結果より、ML630−mF1株はアミコラトプシス（Amycolatopsis、文献、International Journal of Systematic Bacteriology、36巻、29−37頁、1986年）属に属するものと考えられる。そこで、ML630−mF1株をアミコラトプシス・エスピー（Amycolatopsis sp.）ML630−mF1とする。
なお、ML630−mF1株は、独立行政法人 産業技術総合研究所に寄託申請し、平成14年６月７日、FERM P−18875として受託された。
また、アミコラトプシス sp.ML630 − mF1 株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約の規約下に FERM BP − 10016 の受託番号で寄託されてある。
【００２９】
第2の本発明の方法を実施するに当たっては、アミコラトプシス属に属するキガマイシン生産菌を栄養培地に接種し、この培地中で培養する。ここで用いる栄養培地は、前記の生産菌が資化できる炭素源と窒素源を栄養成分として含有するものである。
【００３０】
その栄養源としては、通常微生物の栄養源として通常使用されるもの、例えば炭素源、窒素源、無機塩などの同化できる栄養源を使用できる。例えば、ぶどう糖、麦芽糖、糖密、デキストリン、グリセリン、澱粉などの炭水化物や、大豆油、落花生油などの油脂のごとき炭素源、ならびにペプトン、肉エキス、綿実粉、大豆粉、酵母エキス、カゼイン、コーン・スチープ・リカー、NZ−アミン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの窒素源、さらに燐酸二カリウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの無機塩が使用でき、必要により微量金属例えばコバルト、鉄などを添加することができる。栄養源としては、その他、抗生物質キガマイシンを生産するのに使用菌が利用しうるものであればいずれの公知の栄養源でも使用できる。
【００３１】
培地における上記のごとき栄養源の配合割合は特に制約されるものでなく、広範囲に亘って変えることができ、使用するキガマイシン類の生産菌によって、最適の栄養源の組成及び配合割合は、当事者であれば簡単な小規模実験により容易に決定することができる。また、上記の栄養源からなる栄養培地は、培養に先立ち殺菌することができ、この殺菌の前又は後で、培地のpHを6−8の範囲、特にpH6.5−7.5の範囲に調節するのが有利である。
【００３２】
かかる栄養培地でのキガマイシン類の生産菌の培養は、一般の放線菌による抗生物質の製造において通常使用されている方法に準じて行なうことができる。通常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常攪拌しながら及び／又は通気しながら行なうことができる。また、培養方法としては静置培養、振とう培養、通気攪拌をともなう液内培養のいずれも使用可能であるが、液体培養がキガマイシンの大量生産に適している。
【００３３】
使用しうる培養温度はキガマイシン類の生産菌の発育が実質的に阻害されず、該抗生物質を生産しうる範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用する生産菌に応じて適宜選択できるが、特に好ましいのは25−30℃の範囲内の温度を挙げることができる。
【００３４】
培養は通常はキガマイシン類が十分に蓄積するまで継続することができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、使用温度、使用生産菌株などにより異なるが、通常72−120時間の培養で目的の抗生物質を得ることができる。
【００３５】
培養中の新規抗生物質キガマイシン類の蓄積量はスタヒロコッカス・アウレウス・スミスを使用して、通常の抗生物質の定量に用いられる円筒平板法により定量することができる。
【００３６】
かくして、培養物中に蓄積されたキガマイシン類は、これを培養物から採取する。培養後、必要により、濾過、遠心分離などのそれ自体公知の分離方法によって菌体を除去した後、その濾液を有機溶媒、特に酢酸ブチルなどを用いた溶媒抽出や、吸着やイオン交換能を利用したクロマトグラフィー、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーを単独でまたは、組み合わせて使用することにより単離精製して採取することができる。吸着やイオン交換能を有するクロマトグラフィー用担体としては、活性炭、シリカゲル、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂もしくは各種のイオン交換樹脂を用いることができる。また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により菌体から目的の抗生物質を抽出し、上記と同様に単離精製することができる。かくして、前記した特性を有する新規抗生物質キガマイシン類が得られる。
【００３７】
さらに、第3の本発明では、前記に記載の一般式（I）で表されるキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよびキガマイシンEの少くとも1つ、またはその製薬学的に許容される塩を有効成分にして含有し、また製薬学的に許容される担体を配合されて含有することを特徴とする、医薬組成物が提供される。
【００３８】
さらに、第3の本発明に係る医薬組成物は抗菌剤組成物、あるいは抗腫瘍剤組成物であることができる。
【００３９】
この医薬組成物においては、有効成分としての一般式（I）のキガマイシン類あるいはその塩は製薬学的に許容できる常用の固体または液体担体、例えばエタノール、水、デンプン等と混和されている形の組成物であることができる。
【００４０】
また、第4の本発明では、新規な微生物として、上記の一般式（I）のキガマイシン類を生産する特性をもつアミコラトプシス sp. ML630−mF1株（FERM BP − 10016）が提供される。
【００４１】
【発明の実施の形態】
次に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
【実施例１】
抗生物質キガマイシンA、B、C、DおよびEの製造
ポテトスターチ2％、グルコース2％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.25％、トーストソーヤミール2％、炭酸カリウム0.32％、硫酸銅0.0005％、塩化マンガン0.0005％、硫酸亜鉛0.005％を含む液体培地（pH7.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110mlずつ分注し、常法により120℃で20分滅菌した。この滅菌した培地に寒天斜面培地に培養したアミコラトプシスML630−mF1株（FERM BP − 10016）を接種し、その後30℃で5日間回転振とう培養した。これにより種母培養液を得た。
【００４３】
ガラクトース2％、デキストリン2％、ソイペプトン１％、コーンスティープリカー0.5％、グリセロール１％、硫酸アンモニウム.0２％、炭酸カリウム0.2％を含む液体培地（pH7.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110mlずつ分注し、常法により120℃で20分滅菌後、この滅菌された液体培地に上記種母培養液をそれぞれ2mlずつ接種し、27℃で4日間回転振とう培養した。
【００４４】
培地10リットルを用いて、このようにして得られた培養液を遠心分離し、菌体を分離した。培養ろ液8.6リットルは、1N塩酸を添加してpHを2.0に調整して酢酸ブチル8.6リットルで抽出し、酢酸ブチル層を無水硫酸ナトリウムにより脱水した。
【００４５】
菌体は、メタノール900 mlを加え、撹拌後濾過した。このメタノール溶液は減圧下で200mlまで濃縮した。これを1N塩酸を添加してpHを2.0に調整して、酢酸ブチルで200 mlで二度抽出し、酢酸ブチル層は無水硫酸ナトリウムにより脱水した。
【００４６】
上記の二つの酢酸ブチル層を合わせ減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣（約4.1 g）をクロロホルム100 mlと水100 mlで撹拌し、クロロホルム層を濃縮乾固して1.51 g、不溶物として528 mgを得た。それぞれシリカゲル60N（フラッシュクロマトグラフィー用、関東化学）のカラムクロマトグラフィーを行った。クロロホルム層から得た1.51 gは、210 gのシリカゲル60Nを充填したカラム（径5.5 cm）に、不溶物の528 mgは70 gのシリカゲル60Nを充填したカラム（径3.5 cm）にチャージした。それぞれクロロホルム−メタノール混液で展開し、薄層クロマトグラフィーで分析して同一成分を溶出する２活性画分を得た。フラクション186−250を濃縮乾固し、934.9 mg、フラクション186−250を濃縮乾固し、107 mgの固形物を得た。前者の一部の294.8 mgを９分割して、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した。
【００４７】
分画31−39を集め減圧下に濃縮乾固して37.2 mgのキガマイシンC、分画46−60を集め168.3 mgのキガマイシンDおよび分画76−94を集め減圧下に濃縮乾固して28.1 mgのキガマイシンEを得た。
【００４８】
シリカゲルクロマトグラフィーのフラクション186−250を濃縮乾固して得た107 mgの固体物質を４分割して、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した。その分画26−30を集め減圧下に濃縮乾固して36.1 mgのキガマイシンAを得た。
【００４９】
培地３リットルを用いた別の培養からは、同様な精製法を行い、高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した時、分画35−36を集め減圧下に濃縮乾固して1.9 mgのキガマイシンCを得た。分画39−41を集め1.9 mgのキガマイシンBを得た。また分画51−56を集め46.6 mgのキガマイシンD、および分画82−86を集め12.9 mgのキガマイシンEを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】キガマイシンA (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図２】キガマイシンAのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図３】キガマイシンAの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】キガマイシンAの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図５】キガマイシンB (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図６】キガマイシンBのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図７】キガマイシンBの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図８】キガマイシンBの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図９】キガマイシンC (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図１０】キガマイシンCのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図１１】キガマイシンCの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１２】キガマイシンCの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図１３】キガマイシンD (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図１４】キガマイシンDのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図１５】キガマイシンDの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１６】キガマイシンDの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図１７】キガマイシンE (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図１８】キガマイシンEのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図１９】キガマイシンEの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図２０】キガマイシンEの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図２１】キガマイシンA〜Eの栄養条件を異にするPANC−1細胞に対する効果の比較である。
黒四角の線は栄養飢餓条件での培養の場合を示す
白丸の線は通常の培養の場合を示す
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌活性と抗腫瘍活性または抗癌活性とを示す新規抗性物質キガマイシン (Kigamicin) 類、詳しくはキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよびキガマイシンEあるいはこれらの塩に関する。
【０００２】
また、本発明はそれらのキガマイシン類の製造法に関する。さらに本発明は、キガマイシン類またはそれらの塩を有効成分とする医薬組成物、特に抗菌剤及び抗腫瘍剤組成物に関する。さらに、本発明は新規抗生物質キガマイシン類を生産する特性を持つ新規な微生物としてアミコラトプシス sp. ML630−mF1株を包含する。
【０００３】
なお、本明細書では、キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンD、キガマイシンEの少くとも一つまたは全部、あるいはそれらの少くとも2つの混合物を、総括的にキガマイシン類(a kigamicin)と称することがある。
【０００４】
【従来の技術】
種々な多数の抗菌物質が知られており、また種々な多数の抗腫瘍性物質が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
細菌感染症および癌の化学療法において、従来知られているまたは使用されている既知の化合物とは、異なる化学構造を有し且つ優れた活性を示す新しい化合物の発見または創製をすることは常に望まれており、そのための研究が行われている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の要望に応えることができる抗菌活性及び抗腫瘍活性を持つ新規な抗生物質を提供することを目的に、従来より有用な抗生物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その結果、土壌試料から新規な微生物としてアミコラトプシス属に属する菌株を分離することに成功し、またこの菌株が新しい構造骨格を有する抗生物質の少くとも5種を生産していることを見い出した。これらの新規抗生物質を単離して且つそれらの化学構造を決定することに成功し、総括的にキガマイシンと命名した。さらに、単離された5種の抗生物質をキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンD、キガマイシンEとそれぞれ命名した。更に、これらの新規抗生物質が薬剤耐性菌（メチシリン耐性菌等）をふくんだグラム陽性の細菌に抗菌活性を示し、また癌細胞の増殖に対して抑制活性を示すことを見い出した。
【０００７】
すなわち、第1の本発明においては、次の一般式（I）：
【０００８】
一般式（I）で表されるキガマイシン類は、酸性物質であり、その製薬学的に許容される塩としては、第４級アンモニウム塩などの有機塩基との塩、あるいは各種金属との塩、例えばナトリウムのようなアルカリ金属との塩があり、これらの塩も上記の抗菌活性と抗腫瘍活性を有する。
【０００９】
次に、本発明の抗生物質キガマイシンA、B、C、DおよびEの理化学的性状を記載する。
（1）次式（Ia）
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：225℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −153.0°（c 1.00、メタノール ）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 4.46分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：666.30 (M＋H)＋ 664.34 (M−H)−
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図１に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (47200)、236 (43900)、254 (43600)、280 (34600)、341 (19100)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (47300)、 236 (46600)、254 (47400)、280 (37400)、341 (21300)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (30900)、366 (20000)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図２に示す。
νmax(cm− 1) 2935、2873、1654、1619、1587、1486、1469、1436、1361、1257、1193、1166、1122、1064、941、871、804、619、431、412
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図３に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図４に示す。
【００１０】
（2）次式（Ib）
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：225℃
C) 比旋光度：濃度が不足して測定が不正確なので記載しない。
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 7.99分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：780.4 (M＋H)＋ 778.4 (M−H)−
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図５に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (53300)、 236 (51400)、254 (50900)、280 (40500)、341 (22200)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (57000)、 236 (54500)、254 (56900)、280 (43600)、341 (24900)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (37000)、366 (23400)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図６に示す。
νmax (cm− 1) 2946、2867、2834、1617、1486、1440、1361、1332、1274、1257、1203、1170、1126、1060、977、944、875、757、622、430
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図７に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図８に示す。
【００１１】
（3）次式（Ic）
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：210℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −154.0°（c 1.00、メタノール）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 7.74分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：810.4(M＋H)＋ 808.4 (M−H)−
F) 高分解能マススペクトル：実験値 832.27626(M＋Na)＋
計算値 832.27925
G) 分子式：C41H47NO16
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図９に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (23400)、 236 (21800)、254 (21000)、280 (16600)、341 (10500)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (22700)、 236 (21800)、254 (22200)、280 (17600)、341 (9700)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (14200)、366 (8500)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図10に示す。
νmax(cm− 1) 2946、2877、2830、1648、1619、1583、1486、1467、1442、1363、1276、1205、1170、1103、1062、944、877、804、624、418
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図11に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図12に示す。
【００１２】
（4）次式（Id）
【００１３】
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：210℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −190.6°（c 1.00、メタノール ）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 11.69分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：954.6(M＋H)＋ 952.4 (M−H)−
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図13に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (36200)、 236 (32900)、254 (31700)、280 (24800)、341 (13300)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (34300)、 236 (32700)、254 (33400)、280 (25900)、341 (15000)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (21000)、366 (13300)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図14に示す。
νmax(cm− 1) 2975、2938、2873、2832、1619、1585、1467、1442、1276、1203、1166、1105、1062、989、944、802、622、470、447、406
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図15に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図16に示す。
【００１４】
（5）次式（Ie）
A) 外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B) 融点：210℃
C) 比旋光度：[α]D 24 −175.2°（c 1.00、メタノール ）
D) HPLCでの保持時間（Retention time）値： 16.49分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E) マススペクトル(m / z)：1098.6 (M＋H)＋ 1096.6 (M−H)−
F) 高分解能マススペクトル：実験値 1120.43568(M＋Na)＋
計算値 1120.43654
G) 分子式：C55H71NO22
H) 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図1７に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (38900)、 236 (35100)、254 (33100)、280 (26500)、341 (14300)
(点線) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 217 (37300)、 236 (35100)、254 (35300)、280 (16700)、341 (15600)
(破線) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax nm (ε) 280 (22500)、366 (13700)
I) 赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図18に示す。
νmax(cm− 1) 2975、2935、2834、1650、1619、1583、1469、1442、1376、1311、1276、1203、1162、1105、1062、989、944、877、804、620
J) 1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図19に示す。
K) 13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図20に示す。
【００１５】
さらに、本発明による一般式（I）の抗生物質キガマイシン類の生物学的性質を次に記載する。
【００１６】
A) 抗菌活性
本発明による抗生物質キガマイシン類の各種細菌に対する最低発育阻止濃度は、次の表1にしめす通りである。この抗菌スペルトルは日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラーヒントン寒天培地で倍数希釈法により測定した。
B）癌細胞増殖抑制活性
各種の癌細胞を用いて癌細胞の増殖を50％抑制するキガマイシンDの濃度(IC50値)を、ＭＴＴ法（「Journal of Immunological Methods」 65巻、55−60頁 (1983年) 参照）で測定した。その結果を表２に示す。
さらに、キガマイシン類は膵臓癌細胞PANC−1細胞に対する殺細胞効果について、通常の細胞培養の条件下より栄養飢餓状態で細胞死を惹起する作用が強い。キガマイシンA、B、C、DおよびEで得た試験の結果を図21に示した。キガマイシンCとDの場合、通常の培地を使用した場合は10μg/mlで100％の細胞死を来たしたが、栄養飢餓状態では0.1g/mlで100％の細胞死を惹起した。固形がんでは、血管新生が追い付かずに栄養飢餓状態にあると考えられ、栄養条件のいい正常部位と比べてキガマイシンは選択的な制癌活性を示すと考えられる。
【００１９】
上記表１の結果から明らかなように、本発明による抗生物質キガマイシン類は、各種の細菌に対して抗菌活性を有することから抗菌剤として有用である。また、表２および図21の結果から明らかなように、キガマイシン類は各種の癌細胞の増殖を抑制する抗腫瘍活性または抗癌活性を有するから抗腫瘍剤または抗癌剤として有用である。
【００２０】
さらに第２の本発明によれば、アミコラトプシス sp. ML630 − mF1 株（独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP − 10016 として寄託）を栄養培地に培養し、培養物から請求項１に記載のキガマイシンA、B、C、DまたはEの少くとも一つを採取することを特徴とする、抗生物質キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよび（または）キガマイシンEの製造法を提供される。
【００２１】
第２の本発明の方法で使用されるキガマイシン生産菌は、アミコラトプシスML630−mF1株である。
このキガマイシン生産菌は平成13年６月、微生物化学研究所において、三重県鳥羽市の土壌より分離された放線菌で、ML630−mF1の菌株番号が付された。
【００２２】
ML630−mF1株の菌学的性状は下記のとおりである。
1．形態
基生菌糸はよく分技し、ジグザグ状を呈する。また分断が認められる。気菌糸は比較的長く、直状あるいは不規則な曲状に伸長し、円筒形の胞子に分断する。また、気菌糸が絡まり、胞子のう様を呈する場合がある。胞子の表面は平滑で、大きさは約0.4 〜 0.6 × 0.8 〜 1.9ミクロンである。輪生技、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。
【００２３】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Container Corporation of America の color harmony manual）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地２、27℃培養）
うす黄茶［2 le, Mustard］−うす茶［3 le, Cinnamon］の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
（２）オートミール寒天培地（ISP−培地３、27℃培養）
無色−うす黄［2 gc, Bamboo］の発育上に、白の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培地４、27℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP−培地５、27℃培養）
うす黄［2 gc, Bamboo］−うす黄茶［2 le, Mustard］の発育上に、白−茶白［3 cb, Sand］の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
（５）チロシン寒天培地（ISP−培地７、27℃培養）
うす黄［2 gc, Bamboo］−うす黄茶［2 le, Mustard］の発育上に、白−黄味白［2 cb, Ivory Tint］の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
（６）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸を着生し、可溶性色素は認められない。
【００２４】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0％、L−アスパラギン 0.05％、リン酸水素二カリウム 0.05％、ひも寒天 3.0％、ｐＨ7.0）を用い、10℃、20℃、24℃、27℃、30℃、37℃及び45℃の各温度で試験した結果、１０℃、45℃での生育は認められず、20℃−37℃の範囲で生育した。生育至適温度は30℃付近である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ISP−培地４、27℃培養）
27日間の培養でスターチの加水分解は認められない。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ISP−培地６；チロシン寒天培地、ISP−培地７； いずれも27℃培養）
いずれの培地においても陰性である。
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地、ISP−培地９、27℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、myo−イノシトール、Ｄ−マンニトールを利用して発育し、ラムノース、ラフィノースは利用しない。
Ｌ−アラビノース、シュクロースもおそらく利用しない。
（５）硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリウム含有ペプトン水、ISP−培地８、
27℃培養）
硝酸塩の還元性は判然としないが、おそらく陰性である。
【００２５】
４．菌体成分
（１）細胞壁組成
メソ型の２、６−ジアミノピメリン酸を含有する。
（２）全菌体中の還元糖
アラビノース、ガラクトースを含み、A型である。
（３）イソプレノイド・キノン
主要なメナキノンとして、ＭＫ−９(H4）を含有する。
（４）リン脂質
ホスファチジルエタノールアミンを含み、ホスファチジルコリン及び未知のグルコサミン含有リン脂質を含まず、ＰII型を示す。
（５）ミコール酸
含有しない。
【００２６】
５．16SrRNA遺伝子解析
16SrRNA遺伝子の部分塩基配列（1239 nt）を決定し、DNAデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ML630−mF1株の塩基配列は以下に示したとおり、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属放線菌の16SrRNA遺伝子と高い相同性を示した。Amycolatopsis albidoflavus (98%)、A. rubidus (98%)、A. mediterranei (97%)、A. azurea (97%) 及びA. coloradensis (97%) 等である。なお、カッコ内は塩基配列の相同値を表記した。
【００２７】
以上の性状を要約すると、ML630−mF1株は、その形態上、基生菌糸はよく分枝し、分断を認める。気菌糸は直状あるいは曲状で、円筒形の胞子に分断する。輪生技、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められない。種々の培地で、うす黄−うす黄茶の発育上に白の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。メラニン様色素は生成せず、硝酸塩の還元反応はおそらく陰性、スターチの水解性は認められない。
ML630−mF1株の菌体成分は、細胞壁にメソ型の２、６−ジアミノピメリン酸を含有し、全菌体中の還元糖はＡ型、主要なメナキノンはＭＫ−９(Ｈ４）で、リン脂質はPII型である。ミコール酸を含有しない。
16SrRNA遺伝子の部分塩基配列を公知菌株のデータと比較したところ、アミコラトプシス属放線菌の塩基配列と高い相同性を示した。
【００２８】
以上の結果より、ML630−mF1株はアミコラトプシス（Amycolatopsis、文献、International Journal of Systematic Bacteriology、36巻、29−37頁、1986年）属に属するものと考えられる。そこで、ML630−mF1株をアミコラトプシス・エスピー（Amycolatopsis sp.）ML630−mF1とする。
なお、ML630−mF1株は、独立行政法人 産業技術総合研究所に寄託申請し、平成14年６月７日、FERM P−18875として受託された。
また、アミコラトプシス sp.ML630 − mF1 株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約の規約下に FERM BP − 10016 の受託番号で寄託されてある。
【００２９】
第2の本発明の方法を実施するに当たっては、アミコラトプシス属に属するキガマイシン生産菌を栄養培地に接種し、この培地中で培養する。ここで用いる栄養培地は、前記の生産菌が資化できる炭素源と窒素源を栄養成分として含有するものである。
【００３０】
その栄養源としては、通常微生物の栄養源として通常使用されるもの、例えば炭素源、窒素源、無機塩などの同化できる栄養源を使用できる。例えば、ぶどう糖、麦芽糖、糖密、デキストリン、グリセリン、澱粉などの炭水化物や、大豆油、落花生油などの油脂のごとき炭素源、ならびにペプトン、肉エキス、綿実粉、大豆粉、酵母エキス、カゼイン、コーン・スチープ・リカー、NZ−アミン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの窒素源、さらに燐酸二カリウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの無機塩が使用でき、必要により微量金属例えばコバルト、鉄などを添加することができる。栄養源としては、その他、抗生物質キガマイシンを生産するのに使用菌が利用しうるものであればいずれの公知の栄養源でも使用できる。
【００３１】
培地における上記のごとき栄養源の配合割合は特に制約されるものでなく、広範囲に亘って変えることができ、使用するキガマイシン類の生産菌によって、最適の栄養源の組成及び配合割合は、当事者であれば簡単な小規模実験により容易に決定することができる。また、上記の栄養源からなる栄養培地は、培養に先立ち殺菌することができ、この殺菌の前又は後で、培地のpHを6−8の範囲、特にpH6.5−7.5の範囲に調節するのが有利である。
【００３２】
かかる栄養培地でのキガマイシン類の生産菌の培養は、一般の放線菌による抗生物質の製造において通常使用されている方法に準じて行なうことができる。通常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常攪拌しながら及び／又は通気しながら行なうことができる。また、培養方法としては静置培養、振とう培養、通気攪拌をともなう液内培養のいずれも使用可能であるが、液体培養がキガマイシンの大量生産に適している。
【００３３】
使用しうる培養温度はキガマイシン類の生産菌の発育が実質的に阻害されず、該抗生物質を生産しうる範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用する生産菌に応じて適宜選択できるが、特に好ましいのは25−30℃の範囲内の温度を挙げることができる。
【００３４】
培養は通常はキガマイシン類が十分に蓄積するまで継続することができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、使用温度、使用生産菌株などにより異なるが、通常72−120時間の培養で目的の抗生物質を得ることができる。
【００３５】
培養中の新規抗生物質キガマイシン類の蓄積量はスタヒロコッカス・アウレウス・スミスを使用して、通常の抗生物質の定量に用いられる円筒平板法により定量することができる。
【００３６】
かくして、培養物中に蓄積されたキガマイシン類は、これを培養物から採取する。培養後、必要により、濾過、遠心分離などのそれ自体公知の分離方法によって菌体を除去した後、その濾液を有機溶媒、特に酢酸ブチルなどを用いた溶媒抽出や、吸着やイオン交換能を利用したクロマトグラフィー、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーを単独でまたは、組み合わせて使用することにより単離精製して採取することができる。吸着やイオン交換能を有するクロマトグラフィー用担体としては、活性炭、シリカゲル、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂もしくは各種のイオン交換樹脂を用いることができる。また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により菌体から目的の抗生物質を抽出し、上記と同様に単離精製することができる。かくして、前記した特性を有する新規抗生物質キガマイシン類が得られる。
【００３７】
さらに、第3の本発明では、前記に記載の一般式（I）で表されるキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよびキガマイシンEの少くとも1つ、またはその製薬学的に許容される塩を有効成分にして含有し、また製薬学的に許容される担体を配合されて含有することを特徴とする、医薬組成物が提供される。
【００３８】
さらに、第3の本発明に係る医薬組成物は抗菌剤組成物、あるいは抗腫瘍剤組成物であることができる。
【００３９】
この医薬組成物においては、有効成分としての一般式（I）のキガマイシン類あるいはその塩は製薬学的に許容できる常用の固体または液体担体、例えばエタノール、水、デンプン等と混和されている形の組成物であることができる。
【００４０】
また、第4の本発明では、新規な微生物として、上記の一般式（I）のキガマイシン類を生産する特性をもつアミコラトプシス sp. ML630−mF1株（FERM BP − 10016）が提供される。
【００４１】
【発明の実施の形態】
次に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
【実施例１】
抗生物質キガマイシンA、B、C、DおよびEの製造
ポテトスターチ2％、グルコース2％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.25％、トーストソーヤミール2％、炭酸カリウム0.32％、硫酸銅0.0005％、塩化マンガン0.0005％、硫酸亜鉛0.005％を含む液体培地（pH7.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110mlずつ分注し、常法により120℃で20分滅菌した。この滅菌した培地に寒天斜面培地に培養したアミコラトプシスML630−mF1株（FERM BP − 10016）を接種し、その後30℃で5日間回転振とう培養した。これにより種母培養液を得た。
【００４３】
ガラクトース2％、デキストリン2％、ソイペプトン１％、コーンスティープリカー0.5％、グリセロール１％、硫酸アンモニウム.0２％、炭酸カリウム0.2％を含む液体培地（pH7.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110mlずつ分注し、常法により120℃で20分滅菌後、この滅菌された液体培地に上記種母培養液をそれぞれ2mlずつ接種し、27℃で4日間回転振とう培養した。
【００４４】
培地10リットルを用いて、このようにして得られた培養液を遠心分離し、菌体を分離した。培養ろ液8.6リットルは、1N塩酸を添加してpHを2.0に調整して酢酸ブチル8.6リットルで抽出し、酢酸ブチル層を無水硫酸ナトリウムにより脱水した。
【００４５】
菌体は、メタノール900 mlを加え、撹拌後濾過した。このメタノール溶液は減圧下で200mlまで濃縮した。これを1N塩酸を添加してpHを2.0に調整して、酢酸ブチルで200 mlで二度抽出し、酢酸ブチル層は無水硫酸ナトリウムにより脱水した。
【００４６】
上記の二つの酢酸ブチル層を合わせ減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣（約4.1 g）をクロロホルム100 mlと水100 mlで撹拌し、クロロホルム層を濃縮乾固して1.51 g、不溶物として528 mgを得た。それぞれシリカゲル60N（フラッシュクロマトグラフィー用、関東化学）のカラムクロマトグラフィーを行った。クロロホルム層から得た1.51 gは、210 gのシリカゲル60Nを充填したカラム（径5.5 cm）に、不溶物の528 mgは70 gのシリカゲル60Nを充填したカラム（径3.5 cm）にチャージした。それぞれクロロホルム−メタノール混液で展開し、薄層クロマトグラフィーで分析して同一成分を溶出する２活性画分を得た。フラクション186−250を濃縮乾固し、934.9 mg、フラクション186−250を濃縮乾固し、107 mgの固形物を得た。前者の一部の294.8 mgを９分割して、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した。
【００４７】
分画31−39を集め減圧下に濃縮乾固して37.2 mgのキガマイシンC、分画46−60を集め168.3 mgのキガマイシンDおよび分画76−94を集め減圧下に濃縮乾固して28.1 mgのキガマイシンEを得た。
【００４８】
シリカゲルクロマトグラフィーのフラクション186−250を濃縮乾固して得た107 mgの固体物質を４分割して、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した。その分画26−30を集め減圧下に濃縮乾固して36.1 mgのキガマイシンAを得た。
【００４９】
培地３リットルを用いた別の培養からは、同様な精製法を行い、高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した時、分画35−36を集め減圧下に濃縮乾固して1.9 mgのキガマイシンCを得た。分画39−41を集め1.9 mgのキガマイシンBを得た。また分画51−56を集め46.6 mgのキガマイシンD、および分画82−86を集め12.9 mgのキガマイシンEを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】キガマイシンA (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図２】キガマイシンAのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図３】キガマイシンAの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】キガマイシンAの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図５】キガマイシンB (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図６】キガマイシンBのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図７】キガマイシンBの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図８】キガマイシンBの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図９】キガマイシンC (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図１０】キガマイシンCのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図１１】キガマイシンCの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１２】キガマイシンCの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図１３】キガマイシンD (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図１４】キガマイシンDのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図１５】キガマイシンDの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１６】キガマイシンDの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図１７】キガマイシンE (10 μg/ml) の紫外線吸収スペクトルである。
実線：メタノール溶液中のスペクトル
点線：0.01N HCl−メタノール溶液中のスペクトル
破線：0.01N NaOH−のメタノール溶液中のスペクトル
【図１８】キガマイシンEのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図１９】キガマイシンEの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図２０】キガマイシンEの重クロロホルム溶液(内部標準：トリメチルシラン)にて測定した炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図２１】キガマイシンA〜Eの栄養条件を異にするPANC−1細胞に対する効果の比較である。
黒四角の線は栄養飢餓条件での培養の場合を示す
白丸の線は通常の培養の場合を示す
Claims (6)
- 次の一般式（I）：
〔式中、RはキガマイシンAでは次式
の糖鎖を示し、キガマイシンBでは次式
の糖鎖を示し、キガマイシンCでは次式
の糖鎖を示し、キガマイシンDでは次式
の糖鎖を示し、またキガマイシンEでは次式
の糖鎖を示す〕で表される化合物である、抗生物質キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンD、およびキガマイシンE、あるいはこれらキガマイシン類の製薬学的に許容される塩。 - アミコラトプシス sp. ML630 − mF1 株（独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP − 10016 として寄託）を栄養培地に培養し、培養物から請求項１に記載のキガマイシンA、B、C、DまたはEの少くとも一つを採取することを特徴とする、抗生物質キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよび（または）キガマイシンEの製造法。
- 請求項1に記載の一般式（I）で表されるキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよびキガマイシンEの少くとも１つ、またはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、また製薬学的に許容される担体を配合されて含有することを特徴とする、医薬組成物。
- 抗菌剤組成物である、請求項３に記載の組成物。
- 抗腫瘍剤組成物である、請求項３に記載の組成物。
- 請求項１に記載の一般式（I）で表される抗生物質キガマイシンA、B、C、DおよびEを生産する特性を持つアミコラトプシスsp. ML630−mF1株（受託番号 FERM BP − 10016）。
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