WO2004057011A1 - 抗生物質カプラザマイシンｄ、ｇ、ｄ１およびｇ１とその製造法 - Google Patents

抗生物質カプラザマイシンｄ、ｇ、ｄ１およびｇ１とその製造法 Download PDF

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WO2004057011A1
WO2004057011A1 PCT/JP2002/013386 JP0213386W WO2004057011A1 WO 2004057011 A1 WO2004057011 A1 WO 2004057011A1 JP 0213386 W JP0213386 W JP 0213386W WO 2004057011 A1 WO2004057011 A1 WO 2004057011A1
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WO
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plazamycin
formula
represented
general formula
antibiotics
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PCT/JP2002/013386
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Tomio Takeuchi
Masayuki Igarashi
Hiroshi Naganawa
Masa Hamada
Original Assignee
Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai
Meiji Seika Kaisha, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibiotic having excellent antibacterial activity, caprazamycin D, plazamycin G, plazamycin D1, and caprazamycin Gl, or a pharmaceutically acceptable product thereof. About salt.
  • the present invention also relates to a method for producing plazamycin D, plazamycin G, plazamycin D1, and plazamycin G1.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, particularly an antibacterial composition, comprising at least one of plazamycin D, G, D1, and Gl or a salt thereof as an active ingredient. Furthermore, the present invention relates to Streptomyces sp. MK730, which has the property of being able to produce the novel antibiotics plazamycin D, G, D1 and G1 and the known antibiotics plazamycin A, B, C, E, F. -62F2, which comprises culturing Caprazamycins A, B, C, E and F and plazamycins D, G, D1 and G1.
  • Antibiotics such as rifampicin, kanamycin, streptomycin, biomycin, capreomycin, and cycloserine are used as antibacterial agents in chemotherapy for bacterial infections, particularly for acid-fast bacilli.
  • R is a tridecyl group in plazamycin A, 11-methyldodecyl group in plazamycin B, a dodecyl group in plazamycin C, and a pendecyl group in plazamycin E.
  • plazamycin F it is a 9-methyl-decyl group.
  • the stereochemistry of the leftmost sugar group contained in the molecule of the compound is undecided.
  • the present inventors have succeeded in determining their chemical structures by further analyzing these four new antibiotics.
  • the four new antibiotics were confirmed to be novel compounds having a common skeleton with the aforementioned plazamycins A, B, C, E, and F, and plazamycin D and plazamycin G, respectively.
  • the names were plazamycin Dl and plazamycin Gl. It has been found that these new compounds are represented by the following formulas (Ia), (Ib), (Ila) and (lib).
  • the novel antibiotic, cabrazamycin D, G, D1, and G1 which was discovered and isolated by the present inventors, is now known in terms of chemical structure with any one of the liposidemycins. Different things. We also found that none of the known chemically synthesized compounds were similar to plazamycins. Therefore, it was confirmed that the force plazamycins D, G, Dl and G1 obtained by the present inventors were novel compounds.
  • R is plazamycin D with a 10-methyl-pentadecyl group— (CH 2 ) 9 CH (CH 3 ) 2 , cuff.
  • R is 9—methylone desiri! ⁇
  • a I ⁇ product shown by a (CH2> is 8 CH (CHa) CH 2 CH 3 ], antibiotic forces Plaza mycin D and force Purazama leucine G or a pharmaceutically acceptable salt thereof, Provided.
  • the first plazamycin D and G of the general formula (I) according to the present invention include the plazamycin D of the following formula (la) and the plazamycin G of the following formula (lb).
  • a compound represented by the formula: plazamycin G that is, a compound of the general formula (I) in which R is a 9-methyl-1-decyl group.
  • R is a 10-methyl-pentadecyl group (CH 2 ) 9 CH (CH 3 ) 2 for plazamycin D 1
  • R is a 9-methyl didecyl group for plazamycin G 1
  • one (CH2) 8 CH (CH 3 ) is a compound represented by CH 2 CH is 3
  • the force Plaza MY Singh D 1 and forces Plaza hygromycin G 1 or acceptable salts thereof as pharmaceutical is provided You.
  • the plazamycins D 1 and G 1 represented by the general formula (II) according to the present invention are the plazamycin D 1 of the following formula (Ila) and the plazamycin G1 of the following formula (lib): Include.
  • the first force plazamycin D of the formula (la) according to the present invention has the following physicochemical properties.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the power plazamycin D of the first invention is an amphoteric substance, and its pharmaceutically acceptable salts include salts with an organic base such as a quaternary ammonium salt, or salts with various metals, for example. Examples thereof include salts with alkali metals such as sodium salts, addition salts with organic acids such as acetic acid, and addition salts with inorganic acids such as hydrochloric acid.
  • the plazamycin G of formula (lb) according to the present invention exhibits the following physicochemical properties.
  • the Rf value of the silica gel 60 F 254 (Merck) thin-layer chromatography developed with a mixed solvent of butanol-methanol-water (4: 1: 2) is 0.41.
  • the power plazamycin G of the first invention is an amphoteric substance, and its pharmaceutically acceptable salts include salts with organic bases such as quaternary ammonium salts, and salts with various metals, for example. Examples thereof include salts with alkali metals such as sodium salts, addition salts with organic acids such as acetic acid, and addition salts with various inorganic acids such as hydrochloric acid.
  • the second force plazamycin D1 of the formula (Ila) according to the present invention exhibits the following physicochemical properties.
  • the second power plazamycin D 1 of the present invention is an amphoteric substance, and its pharmaceutically acceptable salts include salts with organic bases such as quaternary ammonium salts, and salts with various metals, for example, sodium. Examples thereof include salts with alkali metals such as salts, addition salts with organic acids such as acetic acid, and addition salts with various inorganic acids such as hydrochloric acid.
  • the second force plazamycin Gl of the formula (lib) according to the present invention exhibits the following physicochemical properties.
  • plazamycin G1 of the present invention is an amphoteric substance, and its pharmaceutically acceptable salts include salts with organic bases such as quaternary ammonium salts, and salts with various metals, for example, sodium salts. And an addition salt with an organic acid such as acetic acid, or an addition salt with various inorganic acids such as hydrochloric acid.
  • the liposidemycin ZLM shown in WO 97/41248 described above has the following general formula ( ⁇ )
  • Liposidemycin ⁇ _ ( ⁇ ) and C- (II) shown in WO 97/41248 have the following general formula (C)
  • Ri has the meaning shown in Table 2 below according to Table 1 of WO 97/41248, and has the molecular formula and molecular weight shown in Table 2. It is a compound.
  • liposidemycin X- (III), Y- (III), Z- (III), C- (III), V- (III), A- (III), G- (III) s ⁇ - ( ⁇ ), K- (III) and N- (III) have the following general formula (D)
  • Ri has the meaning shown in Table 3 below according to Table 1 of WO 97/41248, and has the molecular formula and molecular weight shown in Table 3. It is a compound. 3_ Furthermore, liposidemycin A- (IV) and C- (IV) have the following general formula (E)
  • Ri has a meaning shown in Table 4 below]
  • the power plazamycins D and G represented by the general formula (I) according to the first invention and the caprazamicin D 1 and G1 represented by the second formula (ID) according to the second invention are Biological properties: plazamycin D, cuff Razamycin G, plazamycin D1, and plazamycin G1 include acid-resistant bacteria, including drug-resistant bacteria, and drug-resistant bacteria Shows antibacterial activity against Gram-positive bacteria.Plasmamycin D, G, D1 and G1 against these bacteria were tested for antibacterial activity as follows.
  • the antibacterial spectrum of plazamycin D against various microorganisms was measured by a multiple dilution method on 1% glycerin-supplemented agar medium based on the Japanese Society of Chemotherapy standard method. The results are shown in Table 5 below.
  • the antimicrobial vector of plazamycin D against various microorganisms other than those shown in Table 5 was measured by the multiple dilution method on Mura 'Hinton agar medium based on the standard method of the Japanese Chemotherapy Society. Table 6 shows the results.
  • Test Example 5 The antibacterial spectrum of plazamycin Dl against various microorganisms was measured on a standard agar medium supplemented with 1% glycerin by a multiple dilution method based on the standard method of the Japanese Society of Chemotherapy. Table 9 shows the results.
  • Staphylococcus ⁇ areus MS9610 3.13
  • Staphylococcus aureus FDA209P 3.13 Staphylococcus' Aureus Smith 3.13 Staphylococcus aureus MS9610 3.13
  • the compound belongs to the genus Streptomyces and has the general formula
  • the bacteria producing the antibiotics plazamycin D, G, Dl and Gl used in the third method of the present invention are plazamycins D, G, Dl having the aforementioned physicochemical and biological properties. As long as it has the ability to produce Gl, it can be used regardless of its species and can be selected from a wide range of microorganisms. Among such microorganisms, specific preferable examples of bacteria producing the antibiotic plazamycin include, in March 1997, the Institute of Microbial Chemistry, which was isolated from soil of Hawaii and Oahu birds. Among the actinomycetes, there is a strain with the strain number of MK730-62F2.
  • the bacteriological properties of the MK730-62F2 strain are described below.
  • the MK730-62F2 strain elongates aerial mycelium longer than the branched base hypha and forms a spiral of 5 to 10 turns at its tip.
  • the mature spore chain links 10 to 50 oval spores, with a spore size of about 0.5 to 0.6 X 0.8 to 1.0 microns.
  • the surface of the spores is smooth. Rotating branches, fungal hyphae, sporangia, and motile spores are not found.
  • Glucose'asparagine agar medium (glucose 1.0%, asparagine 0.05%, dipotassium phosphate 0.05%, string agar 2.5%, pH7.0), 10 ° C, 20 ° C, 24 ° C, 27 ° C, 30 ° C ° C, 37 ° Cs Tested at each temperature of 45 ° C and 50 ° C. As a result, this strain grew in the range of 20 ° C to 37 ° C except for 10 ° C, 45 ° C and 50 ° C. . The optimum growth temperature is around 30-37 ° C.
  • Starch hydrolysis (starch / inorganic salt agar medium, ISP-medium 4, culture at 27 ° C) Starch hydrolysis was observed around 3 days after cultivation, and its action is moderate.
  • Nitrate reduction reaction peptone water containing 0.1% potassium nitrate, ISP-medium 8, negative at 27 ° C.
  • peptogenesis started around day 7 after culture and was completed on day 14.
  • strain MK730-62F2 elongates aerial hyphae with helix formation from the branched basal hyphae.
  • the spore surface is smooth.
  • aerial hyphae of grayish white to light gray are formed.
  • No soluble pigment is found other than melanin-like pigment.
  • the optimum growth temperature is around 30-37 ° C.
  • the production of melanin-like pigment is positive, and starch has moderate water dissolving power.
  • the 2,6-diaminopimelic acid contained in the cell wall was of the LL-type, and the main menaquinones in the cells were MK-9CH8) and MK-9 (H6).
  • MK730-62F2 strain is considered to belong to the genus Streptomvces. So, as a result of searching the known species of closely related, Sutorebutomi Seth: Iasu evening Tokuromoge Hus (Streptomvces diastatochromogenes Mata ⁇ , International Journal of Systematic j3actenology s 22 , 290 Sada, 1972), Streptomyces ⁇ resist Maishi prefix ( Streptomvces resistomycificus ⁇ Literature, International Journal of Systematic _Bactenolog ⁇ 18 Vol. 1 1 5 Sada, 1968 , P.
  • the MK730-62F2 strain was compared in It showed properties similar to those of all species.
  • the Streptomyces-resistomificus differed from the MK730-62F2 strain in that it exhibited a yellow-brown to brown-black shade of development, the soluble pigment was brownish, and the skim milk was not peptoneized.
  • Streptomyces corinus shows that the form of aerial hyphae is straight or loop-shaped, and does not peptone skim milk.
  • Streptomyces aurantioglyceus has a soluble pigment that is tinged with tea and a simple gelatin.
  • the MK730-62F2 strain cannot be identified as a strain of Streptomyces dias mugenus. Therefore, the MK730-62F2 strain was named Streptomyces' S (Streptomvces sp.) MK730-62F2.
  • the MK730-62F2 strain was transferred to Tsukuba-Higashi 1-chome, 1-1, Ibaraki, Japan, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), located at Chuo No. 6 (April 1, 2001, (Renamed as the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) and deposited on November 27, 1998 as FERM P-17067.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • the MK730-62F2 strain was deposited at the depository under the terms of the Pust Treaty under the accession number of FERM BP-7218.
  • the antibiotic plazamycin D, G, Dl, Gl is produced as follows.
  • the production of the antibiotic plazamycin D, G, Dl and Gl can be carried out using a production bacterium that produces at least one of plazamycin D, G, Dl, and Gl (hereinafter simply plazamycin D).
  • D, G, Dl, and Gl-producing bacteria) in a nutrient medium and cultured at a temperature favorable for the production of the antibiotic force plazamycin D, G, Dl, and Gl.
  • Culture of strains producing plazamycin D, G, Dl, Gl yields a culture containing the antibiotic plazamycin D, G, Dl, and Gl.
  • a medium that can be used for culturing actinomycetes is used.
  • a nutrient source for example, commercially available nitrogen sources such as soy flour, peptone, yeast extract, meat extract, corn 'stip' liquor, and ammonium sulfate are used. Can be used.
  • carbon sources such as tomato paste, glycerin, starch, glucose, galactose, dextrin, and the like, and carbon sources such as fat can be used.
  • inorganic salts such as salt and calcium carbonate can be added for use.
  • a trace amount of metal salt can be added as needed.
  • a microorganism belonging to the genus Streptomyces and capable of producing the antibiotic plazamycin D, G, Dl, Gl is used. Specifically, it was determined by the inventors that our isolated Streptomyces sp.MK730-62F2 (FEEM BP-7218) produces the antibiotic forces plazamycin D, G, D1 and Gl. As already clarified, other strains that can produce carbazamycin D, G, Dl, and Gl can be isolated from nature by conventional methods for isolating antibiotic-producing bacteria.
  • plazamycin D, G ⁇ D1, and G1 producing bacteria including Streptomyces sp.MK730-62F2 are subjected to irradiation and other mutation treatments, resulting in antibiotic plazamycin 0, G, and Dl.
  • plazamycin D, G, D1, and Gl it is necessary to aerobically culture plazamycin D, G, Dl, and Gl-producing bacteria belonging to the genus Streptomyces in an appropriate medium.
  • Conventional means can be used to collect the desired plazamycin D, G, Dl, Gl from the culture.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it can produce these antibiotics without substantially inhibiting the growth of force plazamycin D, G, Dl, and Gl-producing bacteria.
  • the cultivation temperature can be appropriately selected depending on the used plazamycin D, G, Dl, and Gl producing bacteria, but preferably includes a temperature in the range of 25 to 30 ° C.
  • plazamycin D, G, D1 and G1 The production of plazamycin D, G, D1 and G1 by this MK730-62F2 strain It usually peaks in 3 to 9 days, but generally continues until sufficient antimicrobial activity has been imparted to the medium.
  • the time course of the titers of plazamycin D, G, Dl, and G1 in this culture can be determined by HPLC or by testing mycobacterium-smegmatis or mycobacterium bark. Can be measured by a cylindrical plate method.
  • at least one of power brazamycins D, G, D1 and G1 is collected from the culture obtained as described above. Power plaza my machine.
  • the means used for collecting metabolites produced by microorganisms can be appropriately used.
  • plazamycins were extracted by solvent extraction using an appropriate organic solvent and elution by cell disruption, and the same mixture as above was obtained from the resulting mixture of plazamycins.
  • plazamycin D, G, D1, and G1 can be isolated and collected.
  • the aforementioned antibiotic powers plazamycin D, G, D1 and G1 are obtained separately or as a mixture of two or more.
  • Streptomyces sp. Strain MK730-62F2 (FERM BP-7218) described above for the third method of the present invention, when cultured, only produces plazamycin D, G, Dl, and Gl according to the present invention. Alternatively, it can also produce known forces plazamycins A, B, C, E and F.
  • Antibiotics plazamycin A, B, C, D, E, F and G, and cabrazamycin D 1 and 2 characterized in that they consist of separately collecting each of mycins D, G, Dl and Gl. A method for producing Gl is provided.
  • the force plazamycins D and G represented by the general formula (I) and the force plazamycin D 1 and G 1 represented by the general formula (II), or a combination thereof A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier in admixture with the active ingredient is provided.
  • the power plazamycin D or G of the general formula (I) or the power plazamycin D 1 or G 1 of the general formula (II) as an active ingredient is pharmaceutically acceptable. It can be in the form of a composition containing an acceptable conventional liquid carrier such as ethanol, aqueous ethanol, water, physiological saline, or a solid carrier such as crystalline cellulose, starch and the like.
  • force plazamycin D or G of the general formula (I), force plazamycin D l or Gl of the general formula ( ⁇ ) or a salt thereof is orally administered.
  • plazamycin D or G of general formula (I), or plazamycin D 1 of general formula (II) or Gl or its salt is mixed with a conventional pharmaceutically acceptable solid or liquid carrier, and the resulting mixture is formed into powders, tablets, capsules, suspensions, mouth drops, etc. Can be used as a preparation.
  • the proportion of G, Dl or Gl will depend on the dosage form, but for example, a convenient power brazamycin content percentage should be in the range of about 2-90% by weight of the dosage unit.
  • a desirable form of the injection preparation is a sterile aqueous solution or a sterile lyophilized agent containing the aforementioned plazamycin as an active ingredient.
  • the liquid carrier used here is preferably, for example, water, physiological saline, ethanol, aqueous ethanol, glycerol, propylene glycol, vegetable oil or the like.
  • the dose of plazamycin D, G, Dl or Gl or a salt thereof used as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention depends on the type of bacterial infection to be treated, the purpose of treatment and the degree of symptoms. different. Optimal doses of plazamycin D, G, D1 or Gl can be determined by appropriate preliminary tests by a specialist.
  • Figure 1 shows the ultraviolet absorption spectrum of plazamycin D in methanol.
  • FIG. 2 shows the infrared absorption spectrum of plazamycin D measured by the KBr tablet method.
  • FIG. 3 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured at room temperature in a solution of plazamycin D in deuterated methanol.
  • FIG. 4 shows a C-13 nuclear magnetic resonance spectrum at 125 MHz measured in deuterated methanol solution of force plazamycin D at room temperature.
  • Figure 5 shows the UV absorption spectrum of plazamycin G in a methanol solution.
  • FIG. 6 shows the infrared absorption spectrum of plazamycin G measured by the KBr tablet method.
  • FIG. 7 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured at room temperature in a solution of plazamycin G in deuterated methanol.
  • FIG. 8 shows a C 13 nuclear magnetic resonance spectrum at 125 MHz measured in a heavy solution of plazamycin G at room temperature.
  • Fig. 9 shows the UV absorption spectrum of methanol in plazamycin D1. Show.
  • FIG. 10 shows the infrared absorption spectrum of plazamycin D1 measured by the KBr tablet method.
  • FIG. 11 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured at room temperature in a deuterated methanol solution of force plazamycii D 1.
  • FIG. 12 shows a C 13 nuclear magnetic resonance spectrum at 125 MHz measured in a heavy methanol solution of plazamycin D 1 at room temperature.
  • FIG. 13 shows the ultraviolet absorption spectrum of plazamycin G1 in a methanol solution.
  • FIG. 14 shows the infrared absorption spectrum of plazamycin G1 measured by the KBr tablet method.
  • FIG. 15 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured at room temperature in a solution of plazamycin G 1 in deuterated methanol.
  • FIG. 16 shows a 13 C nuclear magnetic resonance spectrum at 125 MHz measured in a solution of force plazamycin G 1 in deuterated methanol at room temperature.
  • Streptomyces' SB M730-62F2 (deposited under accession number FE hired BP-7218) cultured on an agar slant medium was galactose 2% dextrin 2%, glycerin 1%, pactositol (Difco) 1%
  • a liquid medium (adjusted to pH 7.4) containing 0.5% corn 'Steep' liquor, 0.2% ammonium sulfate and 0.2% calcium carbonate is dispensed into Erlenmeyer flasks (500ml volume) in 110ml increments at 120 ° C by the usual method.
  • the medium was inoculated for 20 minutes with. After inoculation, this was subjected to rotary shaking culture at 30 ° C for 2 days to obtain a seed culture.
  • the culture solution thus obtained was centrifuged to separate the bacterial cells from 12 liters of the culture filtrate. Next, add 6 liters of methanol to the cells and mix well, and then use the known antibiotics, plazamycin A, B, C, E, and F, and the new antibiotics plazamycin D, G, D1 and Gl were extracted with methanol. (In the following, these antibiotics plazamycins A, B, C, D, E, F, G, Dl and G1 are collectively referred to as caprazamycins May be written).
  • the culture filtrate and the bacterial cell extract were combined, and 18 liters of the mixed solution obtained in this merger was used as an aromatic synthetic adsorbent Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, Japan).
  • the column was passed through a 750 ml column to adsorb plazamycins.
  • chloroform-form-medium-mono-water 4: 1: 0.1
  • chloroform-methanol-methanol-water (2: 1: 0.2)
  • (1: 1: 0.2) was developed sequentially using 1.35 liters of each mixed solution.
  • the eluate from the gel gel was fractionated by fraction collector 20 fractions of 20 g for fraction Nos. 1 to 53 and 19 g for fractions 54 to 117.
  • the active fractions containing plazamycin A, B, C, D, E, F and G were eluted in fractions Nos. 66 to 83, and plazamycin; D1 and G1 in fractions 84 to 144.
  • the active fraction containing was eluted.
  • Fractions Nos. 66 to 83 containing this plazamycin A, B, Cs D, E, F and G were collected and concentrated to dryness under reduced pressure, and plazamycin A, B, C, D, E, F and 625.3 mg of a crude product containing G was obtained. Further, fractions Nos.
  • plazamycin A (56.9 mg)
  • plazamycin B (90.3 mg)
  • plazamycin C (19.7 mg)
  • plazamycin A mixture containing D and Caprazamycin G (162.9 mg)
  • plazamycin E (30.3 mg)
  • plazamycin F (25.5 mg)
  • plazamycin D contains plazamycin D and plazamycin G obtained above
  • the mixture of 162.9mg HPLC CAPCELLPAK C18, ⁇ 20 X250mm N manufactured by Shiseido
  • plazamycin G was eluted after 55-69 minutes and plazamycin G was eluted 48-53 minutes after development with 50% acetonitrile water—0.025% trifluoroacetic acid (flow rate: 9.0 ml / min) as the developing solvent.
  • Each active fraction was collected and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain plazamycin D (69.7 mg) and plazamycin G (39.0 mg).
  • the mixture is developed by using HPLC (CAPCELLPAK C18, ⁇ 20 ⁇ 250 mm, manufactured by Shiseido) with 44% acetonitrile water—0.025% trifluoroacetic acid (flow rate: 9.0 ml / min) as a developing solvent.
  • HPLC CAPCELLPAK C18, ⁇ 20 ⁇ 250 mm, manufactured by Shiseido
  • trifluoroacetic acid flow rate: 9.0 ml / min
  • Plazamycin D1 was eluted after 46-52 minutes
  • cabrazamycin G1 was eluted after 41-44 minutes.
  • These eluted fractions were collected and separately concentrated under reduced pressure to dryness to obtain plazamycin Dl (54.1 mg) and plazamycin Gl (57.6 mg).
  • the power plazamycins D 1 and G 1 of the general formula (I) and the power plazamycins D 1 and G 1 of the general formula (II) obtained as the novel antibiotics are as follows: Each has excellent antimicrobial activity against various acid-fast bacteria, bacteria and their drug-resistant strains. Thus, the plazamycins D, G, Dl and Gl according to the present invention are effective and useful for treating acid-fast bacterium and bacterial infections.

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Description

明 細 書
抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D 1および G1とその製造法
郷
本発明は、 すぐれた抗菌活性を有する新規な抗生物質である力プラザマイシン (caprazamycin) D、 力プラザマイシン G、 力プラザマイシン D 1およびカプラ ザマイシン G l、 またはそれらの製薬学的に許容される塩に関する。 また本発明 は、 力プラザマイシン D、 力プラザマイシン G、 力プラザマイシン D 1および力 プラザマイシン G1の製造法に関する。
さらに本発明は、 力プラザマイシン D、 G、 D 1および Gl、 あるいはそれらの 塩の少なくとも一つを有効成分とする医薬組成物、 特に抗菌性組成物に関する。 さらにまた、 本発明は新規抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D 1および G1な らびに既知の抗生物質力プラザマイシン A、 B、 C、 E、 Fを生産できる特性を 持つストレプトミセス ·エスピー MK730-62F2を培養することから成る、 カプラ ザマイシン A、 B、 C、 Eおよび Fならびに力プラザマイシン D、 G、 D 1およ び G1の製造方法を包含する。
皆景抟術
細菌感染症の化学療法、 特に抗酸性菌の感染症の化学療法において、 リファン ピシン、 カナマイシン、 ストレプトマイシン、 バイオマイシン、 カプレオマイシ ン、 サイクロセリン等の抗生物質が抗菌剤として使用されている。
細菌感染症の化学療法において、 感染症の原因となる細菌が薬剤耐性になるこ とは重大な問題である。 特に抗酸性菌の感染症の化学療法において用いられるリ ファンピシン、 カナマイシン、 ストレプトマイシン、 バイオマイシン、 カプレオ マイシン、 サイクロセリン等に対して、 耐性を有する抗酸性菌が出現して社会的 問題となっている。 従って、 薬剤耐性の抗酸性菌の感染症の治療に有効な新しい 化学療法剤が強く望まれている。 また、 化学療法が確立していない非定型抗酸性 菌の感染症の治療に有効な新しい化学療法剤も強く望まれている。
そのため、 従来使用されている既知の抗菌性抗生物質とは異なり、 新規な化学 構造を有し且つ高い抗菌作用などの優れた性質を示す新規な合成化合物および新 規な抗生物質の発見または創製をすることが強く望まれている。 本発明者らは、 上記の要望に応え得る優れた抗菌活性を持つ新規な抗生物質を提供することを目 的として種々の研究を行ってきた。
先に、 本発明者らは、 ストレプトミセス 'エスピー MK730-62F2株（プダぺス ト条約下に FERM BP-7218の受託番号で寄託） により生産されるところの、 抗 酸性菌に対し強い抗菌力を示す抗生物質、 力プラザマイシン A、 B、 C、 Eおよ び？1を提供している〔PCT出願 PCT/JP00/05415号の国際公開 WO 01/12643A1 号公報 （2001 年 2月 22 日発行）、 ならびにその対応の米国特許出願
SN.10/049,970および欧州特許出願 No.00951962.0、 参照〕。
力プラザマイシン A、 B、 C, Eおよび Fは、 次の一般式 （A)
Figure imgf000004_0001
〔式中、 Rは力プラザマイシン Aではトリデシル基であり、 力プラザマイシン B では 11—メチルードデシル基であり、力プラザマイシン Cではドデシル基であり、 力プラザマイシン Eではゥンデシル基であり、 そして力プラザマイシン Fでは 9 ーメチルーデシル基である〕 で示される化合物であり、 該化合物の分子中に含ま れる左端の糖基の立体化学は未定である。
なお、 前記の力プラザマイシン A、 B、 C、 E、 Fの化学構造と関連した構造 骨格を持つ物質として、 ストレプトミセス · sp SN-1061M株 (FERM BP-5800) の発酵生産物である公知の抗生物質リポシドマイシン （liposidomycin) A、 B、 C (特開昭 61-282088号）およびリポシドマイシン G、 H (特開平 2'306992号)、 ならびにその他のリポシドマイシン類〔 he Journal of Antibiotics 51卷 7号 647 〜654頁（1998); The Journal of Antibiotics, 52卷 3号 281〜287頁（1999); Journal of the American Chemical Society, 110卷 13号 4416〜4417頁 (1988); The Journal of Organic Chemistry, 57卷 24号 6392〜6403頁 (1992); PCT国際 公開 WO 97/41248号およびその対応の欧州特願公開 EP 1001035A1公報参照〕 が知られている。
前記の PCT国際公開 WO 97/41248号明細書には、実際に単離されて収得され た具体的な新規ィ匕合物として、 リポシドマイシン Z、 L、 Μ、 Κ、 Ν、 Α-(Πΰ、 c-(in)、 x-Cin)、 γ-(πϋ、 ζ-απ)、 c-(in)、 ν-(ιπ)、 Α-(ΠΙ)、 G-(III)、 Μ-(ΙΠ)、 Κ-(ΙΙΙ)、 Ν-(ΙΙΙ)、 A-0V)および C-0V)の計 17個の化合物があげられている （該
WO 97/41248号明細書の第 1表、 参照）。
細菌感染症、 特に耐性菌の感染症の治療に有効である優れた抗菌活性を有する 新規な抗生物質を求める要望は、 依然として強く、 その要望に応えるための研究 は多くの研究者により続けられている。
日 Sの閲示
本発明者らは前記の力プラザマイシン A、 B、 C；、 E、 Fの発見に続いて、 新 規で有用な抗生物質を発見すべく研究を行った。 その結果、 今回、 前記のストレ ブトミセス 'エスピー MK730-62F2株は、新しい 4種の抗生物質を前記の力ブラ ザマイシン A、 B、 C、 E、 Fとは別個に生産していることを、 本発明者らは見 · い出した。 これらの 4種の新しい抗生物質を単離して収得することに本発明者ら は成功した。 これら 4種の新しい抗生物質は抗酸性菌並びにその薬剤耐性菌に対 して優れた抗菌活性を持つことを今回知見した。
本発明者らは、 さらにこれら 4種の新しい抗生物質を分析することにより、 そ れらの化学構造を決定することに成功した。 そしてそれら 4種の新しい抗生物質 が前記の力プラザマイシン A、 B、 C、 E、 Fと共通な骨格を有する新規な化合 物であることを確認し、 それぞれ力プラザマイシン D、 力プラザマイシン G、 力 プラザマイシン D l、 力プラザマイシン G lと命名した。これら新規化合物がそれ それ後記の式 （Ia)、 式 （Ib)、 式 （Ila) および式 （lib) により表されることを 知見した。 しかも、 今回、 本発明者らによって発見および単離された新規抗生物質、 カブ ラザマイシン D、 G、 D 1および G1 は、 既知にリポシドマイシン類の何れの一 つとも、 化学構造の点ですベて異なることを知見した。 さらに、 化学的に合成さ れた既知の化合物には、 力プラザマイシン類に類似する化合物は無いことも確か めた。 従って、 本発明者らによって今回得られた力プラザマイシン D、 G、 D l および G1が新規化合物であることを確認できた。
従って、 第 1の本発明においては、 次の一般式 （I )
Figure imgf000006_0001
〔式中、 Rは力プラザマイシン Dでは 10—メチルーゥンデシル基— (CH2)9CH(CH3)2 であり、 カフ。ラサ イシン Gでは Rは 9—メチル一ゥンデシリ！^一 (CH2>8CH(CHa)CH2CH3 である〕で示されるィ匕合物である、抗生物質力プラザマイシン Dおよび力プラザマ イシン G、 あるいはそれらの製薬学的に許容できる塩が提供される。
第 1の本発明による一般式 （I ) で示される力プラザマイシン Dおよび Gは、 下記の式 （la) の力プラザマイシン Dおよび下記の式 （lb) の力プラザマイシン Gを包含する。
( 1 ) 次式 (la)
Figure imgf000007_0001
で示される力プラザマイシン D、 すなわち一般式（I)で Rが 10—メチル—ゥン デシル基である場合の化合物。
(2) 次式 (lb)
Figure imgf000007_0002
で示される力プラザマイシン G、 すなわち一般式 (I) で Rが 9—メチル一ゥン デシル基である場合の化合物。
さらに、 第 2の本発明においては、 次の一般式 （Π) (ID
Figure imgf000008_0001
〔式中、 Rは力プラザマイシン D 1では 10—メチルーゥンデシル基 一 (CH2)9CH(CH3)2であり、力プラザマイシン G 1では Rは 9—メチル一ゥンデシ ル基一 (CH2)8CH(CH3)CH2CH3である〕で示される化合物である、 力プラザマイ シン D 1および力プラザマイシン G 1、あるいはそれらの製薬学的に許容できる塩 が提供される。
第 2の本発明による一般式 （II) で示される力プラザマイシン D 1 および G 1 は、 下記の式 (Ila)の力プラザマイシン D 1および下記の式 （lib) の力プラザマイ シン G1を包含する。
( 1 ) 次式 （Ila)
(Ha)
Figure imgf000008_0002
で示される力プラザマイシン D l、 すなわち一般式 （II) で が 10—メチル—ゥ ンデシル基である場合の化合物。
( 2 ) 次式 （lib)
Figure imgf000009_0001
で示される力プラザマイシン G 1、 すなわち一般式 (II) で Rが 9一メチル一ゥン デシル基である場合の化合物。
第 1の本発明による式 （la) の力プラザマイシン Dは下記の理化学的性状を示 す。
( 1) 外観：無色粉末
(2) 分子式： C52H85N5022
(3) 高分解能質量分析 (HRFABMS：陽イオンモード）
実験値： 1132.5776(M+H)+
計算値： 1132.5764
(4) 比旋光度： [ひ ] D23 -3.0° ( c 1、 メタノール)
(5) 紫外線吸収スぺクトル （メタノール中）：添付図面の図 1に示す。
え max nm ( ε )： 262 (9,200)
(6) 赤外線吸収スぺクトル：添付図面の図 2に示す。
(7) プロトン核磁気共鳴スぺクトル
500MHz において重メタノール中で室温にて測定したブロン N M Rスぺクト ルは添付図面の図 3に示す。
(8) 炭素 13核磁気共鳴スぺクトル
125MHzにおいて重メタノール中で室温にて測定した炭素 13NMRスぺクトル は添付図面の図 4に示す。
(9) 溶解性
メタノール、 ジメチルスルホキシド (DMSO)、 水に可溶であり、 アセトン、 酢 酸ェチルに不溶である。
(10) T L C
シリカゲル 6 0 F 254 (メルク社製） の薄層クロマトグラフィー上でブ夕ノール —メタノ一ル一水 (4 : 1 : 2)の混合溶媒で展開したときの 値は 0.41である。 第 1の本発明の力プラザマイシン Dは両性物質であり、 その製薬学的に許容で きる塩としては、 第 4級アンモニゥム塩などの有機塩基との塩、 あるいは各種金 属との塩、 例えばナトリウム塩のようなアルカリ金属との塩、 あるいは酢酸など の有機酸との付加塩、 あるいは塩酸のような無機酸との付加塩があげられる。 本発明による式 （lb) の力プラザマイシン Gは、 下記の理化学的性状を示す。
( 1) 外観：無色粉末
(2) 分子式： C52H85N5022
(3) 高分解能質量分析 (HRFABMS：陽イオンモード）
実験値 1132.5769(M+H)+
計算値 1132.5764
(4) 比旋光度： [ひ] D23 -42° (c 0.61, メタノール）
(5) 紫外線吸収スぺクトル （メタノール中）：添付図面の図 9に示す。
Amax nm (£)： 262 (9,000)
(6) 赤外線吸収スぺクトル：添付図面の図 1 0に示す。
(7) プロトン核磁気共鳴スペクトル
500MHz において重メタノール中で室温にて測定したプロトン NMRスぺク トルは添付図面の図 1 1に示す。
(8)炭素 13核磁気共鳴スぺクトル
125MHzにおいて重メ夕ノ一ル中で室温にて測定した炭素 13NMRスぺクトル は添付図面の図 12に示す。
(9) 溶解性
メタノール、 DMSO、 水に可溶であり、 アセトン、 酢酸ェチルに不溶である。
(10) T L C
シリカゲル 6 0 F254 (メルク社製） の薄層クロマトグラフィー上でブ夕ノール —メタノール一水 (4： 1 ： 2)の混合溶媒で展開したときの Rf値は 0.41である。 第 1の本発明の力プラザマイシン Gは両性物質であり、 その製薬学的に許容で きる塩としては、 第 4級アンモニゥム塩などの有機塩基との塩、 あるいは各種金 属との塩、 例えばナトリウム塩のようなアルカリ金属との塩、 あるいは酢酸など の有機酸との付加塩、あるいは塩酸のような各種無機酸との付加塩があげられる。 第 2の本発明による式（Ila) の力プラザマイシン D 1は下記の理化学的性状を 示す。
(1) 外観：無色粉末
(2) 分子式： C43H69N5018
(3) 高分解能質量分析 (HRFABMS：陽イオンモード）
実験値： 944.4686 (M+H)+
計算値： 944.4716
(4) 比旋光度： [ひ] D25 +13.9° (c 0.91、 メタノール）
(5) 紫外線吸収スぺクトル （メタノール中）：添付図面の図 5に示す。
Ama 腿（£)： 262 (8，300)
(6) 赤外線吸収スぺクトル：添付図面の図 6に示す。
(7) プロトン核磁気共鳴スぺクトル
500MHz において重メタノール中で室温にて測定したプロトン NMRスぺク トルは添付図面の図 7に示す。
(8) 炭素 13核磁気共鳴スぺクトル
125MHzにおいて重メタノール—重水 (=10： 1)の混合溶媒中で室温にて測定し た炭素 13NMRスぺクトルは添付図面の図 8に示す。
(9) 溶解性
メタノール、 DMSO、 水に可溶であり、 アセトン、 酢酸ェチルに不溶である。 ( 10) T L C
シリ力ゲル 6 0 F 254 (メルク社製） の薄層ク口マトグラフィ一上でブ夕ノ一ル
—メタノ一ルー水 (4： 1 ： 2)の混合溶媒で展開したときの Rf値は 0.41である。 第 2の本発明の力プラザマイシン D 1 は両性物質であり、 その製薬学的に許容 できる塩としては、 第 4級アンモニゥム塩などの有機塩基との塩、 あるいは各種 金属との塩、 例えばナトリウム塩のようなアルカリ金属との塩、 あるいは酢酸な どの有機酸との付加塩、 あるいは塩酸のような各種無機酸との付加塩があげられ る。
第 2の本発明による式 （lib) の力プラザマイシン G lは、 下記の理化学的性状 を示す。
( 1) 外観：無色粉末
(2) 分子式： C43H69N5Oi8
(3) 高分解能質量分析 (HRFABMS：陽イオンモード）
実験値 944.4720 (M+ED+
計算値 944.4716
(4) 比旋光度： [ひ] D25 +14.6° ( C 0.91、 メタノール）
(5) 紫外線吸収スぺクトル （メタノール中）：添付図面の図 13に示す。
Amax nm ( ε )： 262 (8,300)
(6) 赤外線吸収スぺクトル：添付図面の図 14に示す。
(7) プロトン核磁気共鳴スペクトル
500MHz において重メタノール中で室温にて測定したプロトン N M Rスぺク トルは添付図面の図 15に示す。
(8) 炭素 13核磁気共鳴スぺクトル
125MHzにおいて重メ夕ノ一ル中で室温にて測定した炭素 13NMRスぺクトル は添付図面の図 16に示す。
(9) 溶解性
メタノール、 DMSO、 水に可溶であり、 アセトン、 酢酸ェチルに不溶である。
( 10) T L C
シリ力ゲル 6 0 F 254 (メルク社製） の薄層クロマトグラフィ一上でブ夕ノ一ル —メタノール一水 (4 : 1 : 2)の混合溶媒で展開したときの: Rf値は 0.41である。 第 2の本発明の力プラザマイシン G1は両性物質であり、 その製薬学的に許容 できる塩としては、 第 4級アンモニゥム塩などの有機塩基との塩、 あるいは各種 金属との塩、 例えばナトリウム塩のようなアルカリ金属との塩、 あるいは酢酸な どの有機酸との付加塩、 あるいは塩酸のような各種無機酸との付加塩があげられ る。
なお、前記の WO 97/41248号明細書に示されるリポシドマイシン Z L M Κ Νは、 次の一般式 （Β )
Figure imgf000013_0001
〔式中、 は、 WO 97/41248号明細書の第 1表によれば、 下記の表 1に示され る意味をもつ〕 で表される化合物であり、 表 1に示される分子式と分子量をもつ 化合物である。
Figure imgf000013_0002
また、 WO 97/41248号明細書に示されるリポシドマイシン Α_(Π)および C-(II) は、 次の一般式 （C)
Figure imgf000014_0001
〔式中、 Riは WO 97/41248号明細書の第 1表によれば、下記の表 2に示される 意味をもつ〕 で表される化合物であり、 表 2に示される分子式と分子量をもつ化 合物である。
表 2
Figure imgf000014_0003
さらに、 リポシドマイシン X-(III)、 Y-(III)、 Z-(III)、 C-(III)、 V-(III)、 A-(III)、 G-(III)s Μ-(ΙΠ)、 K-(III)、 N-(III)は、 次の一般式 （D )
Figure imgf000014_0002
〔式中、 Riは WO 97/41248号明細書の第 1表によれば、下記の表 3に示される 意味をもつ〕 で表される化合物であり、 表 3に示される分子式と分子量をもつ化 合物である。 3_
Figure imgf000015_0002
さらにまた、 リポシドマイシン A-(IV)および C-(IV)は、 次の一般式 （ E )
Figure imgf000015_0001
〔式中、 R iは WO 97/41248号明細書の第 1表によれば、 下記の表 4に示される 意味をもつ〕 で表される化合物であり、 表 4に示される分子式と分子量をもつ化 合物である。
表 4
八マ
リポシドマイシン類 分子式 '刀 'チ里
リポシドマイシン A- (【V) C38H57N5Ow G15H25 807
リポシドマイシン G-(【V) 783 本発明による力プラザマイシン D、 G、 D 1および G1 は、 前記に示された既 知のリポシドマイシン類の何れにも合致しないことが明らかに認められる。
第 1の本発明による前記の一般式 （I ) で示された力プラザマイシン Dおよび Gならびに第 2の本発明による一般式 (IDで示されるカプラザマイシン D 1 およ び G1 は、 後記の生物学的性質を有する。 すなわち、 力プラザマイシン D、 カフ。 ラザマイシン G、 力プラザマイシン D 1および力プラザマイシン G1 は、 薬剤耐 性菌を含めて、 抗酸性菌、 ならびに薬剤耐性菌を含めてグラム陽性の細菌に対し て抗菌活性を示す。 これらの細菌に対する力プラザマイシン D、 G、 D 1および G 1の抗菌活性を次のとおり試験した。
試験例 1
各種の微生物に対する力プラザマイシン Dの抗菌スぺクトルは日本化学療法学 会標準法に基づき、 1 %グリセリン加普通寒天培地上で倍数希釈法により測定し た。 その結果を次の表 5に示す。
力プラザマイシン の 供圍,、 試 菌 最小■¾育阻止濃度
( μ g/ml)
マイコバクテリゥム'スメグマティス ATGG607 1.56
マイコバクテリゥム■スメグマティス ATCC607 0.78
PM-R (パロモマイシン耐性）
マイコバクテリゥム 'スメグマティス ATGG607 0.78
VM- R (バイオマイシン耐性）
マイコバク亍リウ厶'スメグマティス ATGG607 0.78
CPM-R (力ブレオマイシン耐性)
マイコバクテリゥム 'スメグマティス ATGG607 0.78
ST - R (ストレブトスライシン耐性）
マイコバク亍リウム.スメグマティス ATCC607 0.78
KM - R (カナマイシン耐性）
マイコバク亍リウム'スメグマティス ATCC607 0.78
SM-R (ストレプトマイシン耐性）
マイコバクテリゥム 'スメグマティス ATCC607 0.78
RFP-R (リファンピシン耐性）
マイコバクテリゥム 'フレイ 0.39
マイコバクテリゥ厶 'バケ ATCC15483 0.39
マイコバク亍リウム 'フォーツイツム 1.56 試験例 2
表 5に示されたもの以外の各種の微生物に対する力プラザマイシン Dの抗菌ス ベクトルを、 日本化学療法学会標準法に基づき、 ミュラ ' ヒントン寒天培地上で 倍数希釈法により測定した。 その結果を表 6に示す。 魁
Figure imgf000018_0001
各種の微生物に対する力プラザマイシン Gの抗菌スぺクトルは日本化学療法学 会標準法に基づき、 1 %グリセリン加普通寒天培地上で倍数希釈法により測定し た。 その結果を表 7に示す。
Figure imgf000019_0001
表 7に示されたもの以外の各種の微生物に対する力プラザマイシン Gの抗菌ス ベクトルを、 日本化学療法学会標準法に基づき、 ミュラ ·ヒントン寒天培地上で 倍数希釈法により測定した。 その結果を表 8に示す c 表 8
Figure imgf000020_0001
試驗例 5 各種の微生物に対する力プラザマイシン D lの抗菌スぺクトルは日本化学療法 学会標準法に基づき、 1 %グリセリン加普通寒天培地上で倍数希釈法により測定 した。 その結果を表 9に示す。
表 9
Figure imgf000021_0001
試験例 6
表 9に示されたもの以外の各種の微生物に対する力プラザマイシン D 1の抗菌 スペクトルを、 日本化学療法学会標準法に基づき、 ミュラ ' ヒントン寒天培地上 で倍数希釈法により測定した。 その結果を表 10に示す。
¾ 1 0 力プラザマイシン D1の
供 試 菌 最小発育阻止濃度
( β g/ml)
スタフイロコッカス 'ァウレウス FDA209P 3.13
スタフイロコッカス 'ァウレウススミス 6.25
スタフイロコッカス'ァゥレウス MS9610 3.13
(多剤耐性）
スタフイロコッカス 'ァウレウス No.5 6.25
(メチシリン耐性） スタフイロコッカス'ァゥレウス No.17 6.25
(メチンリノ賺 1·性） スタンイロコッカス- ,ウレウス MS 16526 12.5
(メチシリン耐性） スタフイロコッカス-ァゥレウス TY-04282 3.13
(メチシリン耐性） ミクロコッカス 'ルテウス FDA16 6.25 ミクロコッカス 'ルテウス PCI1001 12.5
バチルス，アントラシス 1.56 バチルス■ズブチリス NRRLB-558 6.25 バチルス'ズブチリス PCI219 12.5
バチルス'セレウス ATCC 10702 1.56 コリネパクテリゥ厶 'ボビス 1810 6.25 ェシエリヒア'コリ NIHJ >100 試験例 7
各種の微生物に対する力プラザマイシン Glの抗菌スぺクトルは日本化学療法 学会標準法に基づき、 1 %グリセリン加普通寒天培地上で倍数希釈法により測定 した。 その結果を表 11に示す。
表 1 1_
力プラザマイシン G1の 供 試 菌 最小発育阻止濃度
( β g/ml)
マイコバク亍リウム 'スメグマティス ATGG607 1.56
マイコバクテリゥ厶■スメグマティス ATGG607 0.78
PM-R (ノ ロモマイシン耐性）
マイコバクテリゥ厶 'スメグマティス ATCC607 0.78
VM - R (パイォマイシン耐性）
マイコバク亍リウム.スメグマティス ATCC607 0.39
CPM-R (力ブレオマイシン耐性）
マイコノヽク丁リゥム ·スメクマ丁イス ATCC607 0.39
ST - R (ストレプ卜ス イシ 耐 1 '牛）
マイコバク亍リウ厶-スメグマティス ATGG607 0.39
KM- R (カナマイシン耐性）
マイコバクテリゥム -スメグマティス ATGG607 0.39
SM-R (ストレプトマイシン耐性）
マイコバクテリゥム -スメグマティス ATCC607 0.78
RFP- R (リファンピシン耐性）
マイコバクテリゥ厶'フレイ 0.39 マイコ /くクテリゥム■ /くケ ATCC15483 0.20
マイコバクテリゥム 'フォーツイツム 6.25 鍵例 8 表 11に示されたもの以外の各種の微生物に対する力ブラザマイシン D 1の抗菌 スペクトルを、 日本化学療法学会標準法に基づき、 ミュラ ' ヒントン寒天培地上 で倍数希釈法により測定した。 その結果を表 12に示す。
表 1 2 力プラザマイシン G1の
1¾ @Λ 菌 最小発育阻止濃度
( μ g/ml)
スタフイロコッカス-ァウレウス FDA209P 3.13 スタフイロコッカス 'ァウレウススミス 3.13 スタフイロコッカス-ァゥレウス MS9610 3.13
(多剤耐性）
スタフイロコッカス.ァゥレウス ο.5 3.13
(メチシリン耐性）
スタフイロコッカス.ァゥレウス ο.17 3.13
(メナンリン而 ί性）
スタフイロコッカス · ,ウレウス MS16526 6.2D
(メチシリン耐性）
スタフイロコッカス-ァゥレウス TY-04282 3.13
(メチシリン耐性）
ミクロコッカス'ルテウス FDA16 6.25 ミクロコッカスりレ亍ウス PGI1001 12.5 バチルス'アントラシス 0.78 バチルス'ズブチリス NRRLB- 558 1.56 バチルス'ズブチリス PGI219 12.5 バチルス-セレウス ATCC10702 3.13 コリネバク亍リウム-ポビス 1810 3.13 ェシエリヒア 'コリ N【HJ >100 さらに、 第 3の本発明によると、 ストレプトミセス属に属して、 前記の一般式
(1)で表される力プラザマイシン Dおよび力プラザマイシン G、ならびに一般式 (II)で表される力プラザマイシン D 1および力プラザマイシン G 1の少くとも一つ を生産する生産菌を培養し、 その培養物から、 力プラザマイシン D、 G、 D lお よび Glの少くとも一つを採取することを特徴とする、 抗生物質力プラザマイシ D、 G、 D lおよび （または） Glの製造方法が提供される。
第 3の本発明の方法で使用する抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D lおよび Gl類の生産菌は、 前述した理化学的性質および生物学的性質を有する力プラザ マイシン D、 G、 D l、 Glを生産する能力を有するものであれば、 その種を問わ ず使用できて、 広範な微生物から選ぶことができる。 かかる微生物のうち、 抗生 物質力プラザマイシン類の生産菌の具体的な好適の一例には、 本発明者らにより 平成 9年 3月、 微生物化学研究所において、 ハワイ、 オアフ鳥の土壌より分離さ れた放線菌で、 MK730-62F2の菌株番号が付された菌株がある。
以下に MK730-62F2株の菌学的諸性質について記載する。
1. 形態
MK730-62F2株は、 分枝した基生菌糸より、 比較的長い気菌糸を伸長し、 その 先端に 5〜； 10回転のらせんを形成する。 成熟した胞子鎖は 10〜50個の卵円形の 胞子を連鎖し、 胞子の大きさは約 0.5〜0.6 X0.8〜1.0ミクロンである。 なお、 胞 子の表面は平滑である。 輪生枝、 菌束糸、 胞子のう、 および運動性胞子は認めら れない。
2. 各種培地における生育状態
色の記載について [ ] 内に示す色の標準は、 コンテイナ一 'コ一ポレーショ ン ·ォプ ·ァメリカのカラー ·ハーモニー 'マニュアル (Container Corporation oi America の color haxmony manual) 用いた。
(1) シュクロース■硝酸塩寒天培地 （27°C培養）
うす黄 [2ea, Lt Wheat] の発育上に、 白の気菌糸をうつすらと着生し、 溶解 性色素は認められない。
(2) グリセリン .ァスパラギン寒天培地 （ISP-培地 5、 27°C培養）
うす黄 [2ea， Lt Wheat]〜うす黄茶 [2ng, Dull Gold]の発育上に、灰白 [3dc, Natural] 〜明るい灰 [d] の気菌糸を着生する。 溶解性色素は認められない。 (3) スターチ '無機塩寒天培地 （ISP-培地4、 27°C培養）
うす黄 [2ea, Lt Wheat]〜うす黄茶 [21g， Mustard Tan] の発育上に、 白〜明る い灰 [d] の気菌糸を着生する。 溶解性色素は認められない。
(4) チロシン寒天培地 （ISP-培地 7ヽ 27°C培養）
うす黄茶 [2le, Mustard〜2ng, Dull Gold]の発育上に、灰白 [b, Oyster White 〜3dc， Natural] の気菌糸を着生し、 暗い茶の溶解性色素を産生する。
(5) イースト ·麦芽寒天培地 （ISP-培地 2、 27°C培養）
うす黄茶 [2ie, Lt Mustard Tai！〜 3ic， Lt Amber]の発育上に、 灰白 [b， Oyster White] 〜明るい灰 [d] の気菌糸を着生する。 溶解性色素は認められない。
(6) オートミール寒天培地 （ISP-培地 3、 27°C培養）
うす黄 [2ea, Lt Wheat] の発育上に、 灰白 [3dc, Natural] 〜明るい灰 [d] の気菌糸を着生し、 溶解性色素は認められない。
3. 生理学的性質
( 1)生育温度範囲
グルコース'ァスパラギン寒天培地（グルコース 1.0%、ァスパラギン 0.05%、 リン酸二カリウム 0.05%、 ひも寒天 2.5%、 pH7.0)を用い、 10°C、 20°C、 24°C、 27°C、 30°C、 37°Cs 45°Cおよび 50°Cの各温度で試験した結果、 本菌株は 10°C、 45°Cおよび 50°Cを除き、 20°Cから 37°Cの範囲で生育した。生育至適温度は、 30 〜37°C付近である。
(2) スターチの加水分解 （スターチ ·無機塩寒天培地、 ISP-培地 4、 27°C培養） 培養後 3日目頃よりスターチの加水分解を認め、 その作用は中等度である。
(3) メラニン様色素の生成（トリプトン 'イースト■ブロス、 ISP-培地 1；ぺプ トン■ィ一スト '鉄寒天培地、 ISP-培地 6；チロシン寒天培地、 ISP-培地 7；い ずれも 27°C培養）
I、ずれの培地でも陽性である。
(4)炭素源の利用性 （プリ ドハム ·ゴトリ一ブ寒天培地、 ISP-培地 9、 27°C培
D—グルコース、 L—ァラビノース、 D—フルクト一ス、 シュクロース、 イノ シトール、ラムノース、ラフイノ一スおよび D—マンニト一ルを利用して発育し、 D—キシロースもおそらく利用する。
(5) 硝酸塩の還元反応 （0.1%硝酸カリウム含有ペプトン水、 ISP-培地 8、 27°C 陰性である。
(6) ゼラチンの液化 （単純ゼラチン、 20°C培養；グルコース 'ペプトン 'ゼラ チン、 27°C培養）
単純ゼラチンは、 培養後 40 日間の観察で液化を認めなかった。 グルコース · ペプトン ·ゼラチンの場合、 培養後 40日頃に弱い液化を示した。
(7) 脱脂牛乳の凝固 ·ペプトン化 （10%スキムミルク、 37°C培養）
凝固することなく、培養後 7日目頃よりぺプトン化が始まり、 14日目には完了 した。
以上の性状を要約すると、 MK730-62F2株は、 分枝した基生菌糸より、 らせん 形成を有する気菌糸を伸長する。 胞子の表面は平滑である。 種々の培地で、 うす 黄〜うす黄茶の発育上に、 灰白〜明るい灰の気菌糸を着生する。 溶解性色素は、 メラニン様色素以外は認められない。生育至適温度は 30〜37°C付近である。メラ ニン様色素の生成は陽性、 スターチの水解性は中等度である。 なお、 細胞壁に含 まれる 2,6—ジアミノピメリン酸は LL—型であり、菌体中の主要なメナキノンは MK-9CH8)および MK-9(H6)であった。
これらの性状より MK730-62F2株は、 ストレプトミセス (Streptomvces) 属 に属すると考えられる。 そこで、 近縁の既知菌種を検索した結果、 ストレブトミ セス ·： ィァス夕トクロモゲ不ス (Streptomvces diastatochromogenes 又献、 International Journal of Systematic j3actenologys 22 、 290貞、 1972年)、 ストレプトミセス■レジストマイシフィクス (Streptomvces resistomycificus^ 文 献、 International Journal of Systematic _Bactenolog ヽ 18卷ヽ 1り 5貞、 1968年)、 ス トレフ °ト ¾>セス . コリヌス (Streptomvces coi]inus、 又献、 International Journal of Systematic Bacteriology^ 18巻、 100頁、 1968年)およびストレプト ミセス ■ ァウランティォグ'リセウス (Streptomvces auratitio grissus、 文献、 International Journal of Systematic Bacterio logyヽ 18巷、 297頁、 1968年,か あげられた。 次に上記 4種の本研究所保存菌株と MK730-62F2株を実地に比較 検討した。 その成績を次の表 13に示す。
表 13 ストレノ卜 セス■丁ィストレクト セス "レン 八ス 口平ノ太つ、八ス •χ ノ " フ
IMC S-0712 IMC S-0212
(ISP5449) (ISP5133) 気菌糸の形態 らせん 波状〜らせん らせん 胞子の表面 平滑 平滑 平滑 気菌糸の色 灰白〜明るい灰 明るい灰 白〜灰 発育の色 うす黄〜うす黄茶 うす黄〜うす黄茶 フす 茶〜 黒 溶解性色素 一 ― 一〜茶を帯びる メラニン様色素の生成
ISP-培地 1 (+) + +
ISP-培地 6 + + +
ISP-培地 7 ( +) + (+)
硝酸塩の還元 一 一
スターチの加水分解 + + +
脱脂牛乳の凝固 一 ― ―
脱脂牛乳のペプトン化 + (+ ) 一
単純ゼラチンの液化 一 (+ ) ―
グルコース'ペプトン. (+) (+) (+)
ゼラチンの液化
炭素源の利用性 *
L—ァラビノース + + +
D—キシロース (+) + (+ )
D—グルコース + + +
D—フラク卜ース + + +
スクロース + + +
イノシ I -ール + + +
ラムノース + + +
ラフイノ一ス + + +
D—マンニ! ル + + + * +：利用、 （+ )：おそらく利用、 （士）：利用の存否が判然としない。 表 1 3 (続き)
Figure imgf000029_0001
*+:利用、 （+) ：おそらく利用、 士:利用の存否が判然としない。
以上の表 13から明らかなように、 MK730-62F2株は上言 3の表 13で比較され たいずれの種の性状とも類似した性状を示した。 しかし、 ストレプトミセス - レ ジストマイシフィクスは発育の色調がうす黄茶〜茶黒を呈し、 溶解性色素が茶を 帯び、脱脂牛乳をペプトン化しない点で、 MK730-62F2株と相違していた。また、 ストレプトミセス 'コリヌスは気菌糸の形態が直状〜ループ状を示し、 脱脂牛乳 をペプトン化しない点で、 またストレプトミセス ·ァウランティォグリセウスは 溶解性色素が茶を帯び、 単純ゼラチンを液化し、 硝酸塩を還元する点で、 MK730-62F2株と区別された。一方、 ストレプトミセス .ディアスタトクロモゲ ネスは単純ゼラチンの液化が陽性を示すほかは、 MK730-62F2株とよく類似して いた。
しかし、 現時点では MK730-62F2株をストレプトミセス ·ディアス夕トク口 モゲネスのー菌株であると同定できない。そこで、 MK730-62F2株をストレプト ミセス 'エスピー (Streptomvces sp.) MK730-62F2と命名した。
なお、 MK730-62F2株を日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1、 中央第 6に 在る産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（2001年 4月 1日に、独立行政 法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターと改称） に寄託申請し、 1998 年 11月 27日、 FERM P-17067として受託された。 また、 2000年 7月 12日の 移管受託日でプダぺスト条約の規約下に MK730-62F2株は FERM BP-7218の受 託番号で前記の寄託所に寄託された。
第 3の本発明の方法においては、 抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D l、 G l の製造は次の通り行われる。 すなわち、 抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D l および G lの製造は、 力プラザマイシン D、 G、 D l、 G lの少なくとも一つを生 産する生産菌（以下では、単に力プラザマイシン D、 G、 D l、 Gl生産菌という） を栄養培地中に接種し、 抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D l、 G lの生産に良 好な温度で培養することによって行われる。 力プラザマイシン D、 G、 D l、 G l 生産菌の培養により、 抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D lおよび G l を含む 培養物が得られる。
このような培養に用いる栄養培地としては、 放線菌の培養に利用しうるものが 使用される。 栄養源として、 例えば市販されている大豆粉、 ペプトン、 酵母ェキ ス、 肉エキス、 コーン 'スティ一プ' リカー、 硫酸アンモニゥム等の窒素源が使 用できる。 また、 トマトペースト、. グリセリン、 でん粉、 グルコース、 ガラクト —ス、 デキストリン等の炭水ィ匕物あるいは脂肪などの炭素源が使用できる。 さら に食塩、 炭酸カルシウム等の無機塩を添加して使用できる。 その他必要に応じて 微量の金属塩を添加することができる。 これらのものは、 力プラザマイシン D、 G、 D l、 G l生産菌が利用し、 抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D l、 Glの 生産に役に立つものであればよく、 公知の放線菌の培養材料はすべて用いること ができる。
抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D l、 Glの生産は、 ストレプトミセス属に 属して抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D l、 Glの生産能を有する微生物が使 用される。 具体的には、 本発明者らの分離したストレプトミセス ·エスピー MK730-62F2(FEEM BP- 7218)が抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D 1および Gl を生産することは、 本発明者らによってすでに明らかにされているが、 カブ ラザマイシン D、 G、 D l、 Glの生産できるその他の菌株は、 抗生物質生産菌の 単離の常法によって自然界より分離することが可能である。 また、 ストレブトミ セス ·エスピー MK730-62F2 を含めて、 力プラザマイシン D、 Gヽ D 1、 G1生 産菌を放射線照射その他、 変異処理にかけることより、 抗生物質力プラザマイシ ン0、 G、 D l、 Glの生産能を高める余地も残っている。 さらに遺伝子工学的手 法によって抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D l、 G lの生産も可能である。 力プラザマイシン D、 G、 D 1、 G 1の生産のための種母を得るためにとしては、 寒天培地上、 MK730-62F2株の斜面培養から得た生育物を使用する。抗生物質力 プラザマイシン D、 G、 D 1 および Glの製造に当たっては、 ストレプトミセス 属に属する力プラザマイシン D、 G、 D l、 Gl生産菌を適当な培地で好気的に培 養するのが好ましい。 その培養液から目的の力プラザマイシン D、 G、 D l、 Gl を採取するのには常用の手段を用いることができる。 培養温度は、 力プラザマイ シン D、 G、 D l、 Gl生産菌の発育が実質的に阻害されずにこれらの抗生物質を 生産しうる範囲であれば、 特に制約されるものでない。 培養温度は、 使用する力 プラザマイシン D、 G、 D l、 Gl生産菌に応じて適当に選択できるが、 好ましく は、 25〜30°Cの範囲内の温度を挙げることができる。
この MK730-62F2株による力プラザマイシン D、 G、 D 1および G 1の生産は、 通常は 3ないし 9日間で最高に達するが、 一般に充分な抗菌活性が培地に付与さ れるまで続ける。 この培養液中の力プラザマイシン D、 G、 D l、 G1の力価の経 時変化は、 HPLC法によって、 またはマイコバクテリゥム -スメグマティスある いはマイコバクテリゥム ·バケを被検菌とする円筒平板法により測定できる。 第 3の本発明の方法においては、 上記のようにして得られた培養物から力ブラ ザマイシン D、 G、 D 1および G1の少くとも一つを採取する。 力プラザマイシ ン。、 G、 D l、 G1の採取法としては、 微生物の生産する代謝物を採取するのに 用いられる手段を適宜利用することができる。 例えば、 水と混ざらない有機溶媒 による抽出の手段、 各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する手段、 ゲルろ 過法、 向流分配を利用したクロマトグラフィー等を、 単独または組み合わせて利 用することによって、 培養物から力プラザマイシン D、 G、 D 1および G1 をそ れぞれ単独に、 またはそれらの何れか 2つまたはそれ以上の混合物として採取で ぎる。
また、 分離した菌体からは、 適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法ゃ菌体破碎に よる溶出法により力プラザマイシン類を抽出し、 得られた力プラザマイシン類の 混合物から、 前記と同様に力プラザマイシン D、 G、 D 1および G1 を単離して 採取することができる。 かくして、 前記した抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D 1 および G1 が別々にまたは 2つまたはそれ以上の混合物として得られる。 な お、 同時に産生された力プラザマイシン A、 B、 C、 E、 Fからの力プラザマイ シン D、 G、 D l、 G1の分離と、 力プラザマイシン D、 G、 D lおよび G lの相 互の分離とは、 後記の実施例で例示されるように、 適当な展開溶媒を用いる高速 液体クロマトグラフィー ( H P L C) によって行うことができる。
なお、第 3の本発明方法について前記したストレプトミセス sp. MK730-62F2 株 (FERM BP-7218)は、 これを培養すると、 本発明による力プラザマイシン D、 G、 D l、 Glを生産するばかりでなく、 既知の力プラザマイシン A、 B、 C、 E および Fも生産することができる。
従って、 第 4の本発明においては、 既知の抗生物質力プラザマイシン A、 B、 C、 Eおよび Fならびに前記の一般式 ( I ) で示される抗生物質力プラザマイシ ン Dおよび力プラザマイシン G、 ならびに前記の一般式 (II) で示される抗生物 質力プラザマイシン D lおよび力プラザマイシン Gl を生産する特性を持つスト レプトミセス 'エスピー MK730-62F2 (独立行政法人 産業技術総合研究所 特 許生物寄託セン夕一にプダぺスト条約の規約下に FERM BP-7218の受託番号で 寄託された菌株） を、 好気的条件下で培養し、 さらにその培養物から、 抗生物質 力プラザマイシン A、 B、 C、 Eおよび F、 ならびに抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D lおよび Gl をそれぞれ別々に採取することから成ることを特徴とす る、 抗生物質力プラザマイシン A、 B、 C、 D、 E、 Fおよび G、 ならびにカブ ラザマイシン D 1および Glの製造方法が提供される。
なお、 第 4の本発明方法は、 第 3の本発明方法と同じ要領で実施できる。
さらに、 第 5の本発明では、 一般式 （I ) で示される力プラザマイシン Dおよ び Gならびに一般式 (II)で示される力プラザマイシン D 1および G 1の少なくとも 一つ、 またはそれの製薬学的に許容できる塩を有効成分として含有し、 また製薬 学的に許容される担体を、有効成分と混和して含有する医薬組成物が提供される。 第 5の本発明による医薬組成物においては、 有効成分としての一般式（I)の力 プラザマイシン Dまたは G、あるいは一般式 (II)の力プラザマイシン D 1または G 1 を、 製薬学的に許容できる常用の液状担体、 例えばエタノール、 含水エタノー ル、 水、 生理食塩水、 もしくは固体担体、 例えば結晶セルロース、 でん粉等と混 和して含有する組成物の形であることができる。
第 5の本発明の医薬組成物で用いる有効成分である一般式（I)の力プラザマイ シン Dまたは G、 あるいは一般式 (Π)の力プラザマイシン D lまたは Glあるいは その塩は、 経口的に投与できる。 あるいはそれらは点鼻、 静脈内または筋肉内ま たは皮下内注射、 もしくは腹腔内投与などにより非経口的にも投与することがで ぎる。
経口投与用の場合には、 第 5の本発明の医薬組成物では、 有効成分としての一 般式 （I) の力プラザマイシン Dまたは G、 あるいは一般式 (II)の力プラザマイシ ン D 1または Gl、あるいはその塩を、薬学的に許容できる慣用の固体または液体 状の担体と混和して、 その得られた混合物を散剤、 錠剤、 カプセル剤、 懸濁剤、 シ口ツプ剤等の形で製剤とすることができる。
第 5の本発明の医薬組成物に配合される有効成分としての力プラザマイシン D、 G、 D l または Glの割合は、 剤形によって異なるが、 例えば、 好都合な力ブラ ザマイシン含量割合は、 投与単位物の重量の約 2〜90%の範囲にあるのがよい。 第 5の本発明の組成物を注射用に製剤する場合には、 望ましい注射製剤の形態 には、 有効成分としての前記の力プラザマイシンを含む無菌の含水溶液あるいは 無菌の凍結乾燥剤がある。 ここに用いる液体担体は例えば水、 生理食塩水、 エタ ノール、 含水エタノール、 グリセロール、 プロピレングリコール、 植物油などで あるのが好ましい。
本発明の医薬組成物において有効成分として用いられる力プラザマイシン D、 G、 D lまたは Gl、 あるいはその塩の投与量は、 治療すべき細菌感染症の種類、 治療の目的および症状の程度などによって異なる。 力プラザマイシン D、 G、 D 1または G lの最適な投与量は専門家による適当な予備試験で決定できる。
阅而の簡 な 朋
第 1図は力プラザマイシン Dのメ夕ノール溶液中の紫外線吸収スぺクトルを示 す。
第 2図は力プラザマイシン Dの K B r錠剤法で測定した赤外線吸収スぺクトル を示す。
第 3図は力プラザマイシン Dの重メタノール溶液中にて室温で測定した 500MHzにおけるプロトン核磁気共鳴スぺクトルを示す。
第 4図は力プラザマイシン Dの重メタノール溶液中にて室温で測定した 125MHzにおける炭素 13核磁気共鳴スぺクトルを示す。
第 5図は力プラザマイシン Gのメ夕ノール溶液中の紫外線吸収スぺクトルを示 す。
第 6図は力プラザマイシン Gの K B r錠剤法で測定した赤外線吸収スぺクトル を示す。
第 7図は力プラザマイシン Gの重メタノール溶液中にて室温で測定した 500MHzにおけるプロトン核磁気共鳴スぺクトルを示す。
第 8図は力プラザマイシン Gの重メ夕ノ一ル溶液中にて室温で測定した 125MHzにおける炭素 13核磁気共鳴スぺクトルを示す。
第 9図は力プラザマイシン D 1のメタノール溶液中の紫外線吸収スぺクトルを 示す。
第 1 0図は力プラザマイシン D 1の K B r錠剤法で測定した赤外線吸収スぺク トルを示す。
第 1 1図は力プラザマイシ D 1 の重メタノール溶液中にて室温で測定した 500MHzにおけるプロトン核磁気共鳴スぺクトルを示す。
第 1 2図は力プラザマイシン D 1 の重メタノール溶液中にて室温で測定した 125MHzにおける炭素 13核磁気共鳴スぺクトルを示す。
第 1 3図は力プラザマイシン G 1のメタノール溶液中の紫外線吸収スぺクトル を示す。
第 1 4図は力プラザマイシン G1の KB r錠剤法で測定した赤外線吸収スぺク トルを示す。
第 1 5図は力プラザマイシン G 1 の重メタノール溶液中にて室温で測定した 500MHzにおけるプロトン核磁気共鳴スぺクトルを示す。
第 1 6図は力プラザマイシン G 1 の重メタノール溶液中にて室温で測定した 125MHzにおける炭素 13核磁気共鳴スぺクトルを示す。
» 施する めの幕 の形熊
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
麵列 1
抗生物質力プラザマイシン D、 G、 D 1および G 1の製造
寒天斜面培地に培養したストレブトミセス 'エスビー M 730-62F2 (受託番号 FE雇 BP-7218で寄託） を、 ガラクト一ス 2% デキストリン 2%、 グリセリン 1%、 パクトソィ トン （ディフコ社製） 1%、 コーン 'スティープ' リカー 0.5%、 硫酸アンモニゥム 0.2%、炭酸カルシウム 0.2%を含む液体培地（p H7.4に調整） を三角フラスコ （500ml容） に 110mlずつ分注して常法により 120°Cで 20分滅 菌した培地に接種した。接種後、これを 30°Cで 2日間にわたり回転振とう培養し、 種母培養液を得た。
トマトペースト （力ゴメ社製） 2.4%、 デキストリン 2.4%、 酵母エキス （オリ ェンタル社製） 1.2%,塩ィ匕コバルト 0.0006% ( p H7.4に調整）の組成の培地 15 リットルをタンク培養槽 (30リヅトル容） 中に調製し、 滅菌後に生産培地として 用いた。 この生産培地に、 上記の種母培養液を 2 %量で接種し、 27°C、 1分間あ たり空気通気量 15 リヅトル、 200rpmの撹拌速度を用いる培養条件で 6日間夕 ンク培養した。
このようにして得られた培養液を遠心分離して培養ろ液 12 リットルと菌体を 分離した。 つづいて、 菌体に 6 リ ヅトルのメタノールを加えてよく撹拌し、 菌体 から既知の抗生物質力プラザマイシン A、 B、 C、 Eおよび F、 ならびに新規抗 生物質力プラザマイシン D、 G、 D 1および G lをメタノールで抽出した（なお、 以下では、 これら抗生物質力プラザマイシン A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 D l および G 1 を総称的に力ブラザマイシン類 caprazamycins と記述することがあ る）。前記の培養ろ液と菌体抽出液（メタノール抽出液） を合わせて、 この合併で 得られた混合液 18 リヅトルを芳香族系合成吸着剤ダイヤイオン HP-20 (日本、 三菱化学株式会社製）のカラム 750mlに通過させ、 力プラザマイシン類を吸着さ せた。
力ブラザマイシン類を吸着、含有するダイヤイオン HP-20のカラムに脱イオン 水、 50%メ夕ノール水、 80%メ夕ノ一ル水、 80%ァセトン水、 ァセトンを各 2.25 リットル順次通過させた。 力プラザマイシン類は、 80%ァセトン水での溶出画分 中に多く溶出された。 また、 50%メタノール水溶出画分および 80%メタノール水 溶出画分にも力プラザマイシン類が含まれていたので、 両者を合わせて再度、 ダ ィャイオン HP-20カラム （750ml) に通過させ、 これにより力プラザマイシン類 をカラムの吸着剤に吸着させた。 次いでカラムに 80%メタノール水 2.25 リヅト ルを通過させた。 その後、 カラムから 80%ァセトン水 2.25 リヅトルで溶出させ た。この 80%ァセトン水での溶出液を先の 80%ァセトン水溶出画分に合わせ、得 られた混合物を減圧下で濃縮乾固して力プラザマイシン類を含む粗精製物 lO.lg を得た。
この力プラザマイシン類を含む粗精製物の 10. lgをクロ口ホルム一メタノール ( 1： 2) の混合溶媒の 50mlに溶解して、 その溶液にキーゼルグール （メルク社 製、 Axt.10601) 50mlを加え溶媒を減圧下で濃縮乾固した。 このように力プラザ マイシン類をキーゼルグールに吸着させて得られた固体残渣を、 シリ力ゲルカラ ム （内径 54mm X長さ 200nmi) の上にのせ、 クロマトグラフィーを行った。 こ の際には、 展開溶媒としてクロ口ホルム一メ夕ノール一水 （4:1:0.1)、 クロロホ ルム一メタノール一水 （2:1:0.2)、 クロ口ホルム一メ夕ノ一ルー水 （1:1:0.2) の 各混合液の各 1.35リツトルを用い、 順次に展開を行った。
フラクションコレクタ一によって、 シリ力ゲル力ラムからの溶出液を、 フラク シヨン No. 1〜53では 20gずつ分画し、フラクション No.54〜： 117では 19gづっ 分画して集めた。こうして、フラクション No.66〜83に力プラザマイシン A、B、 C、 D、 E、 Fおよび Gを含む活性画分が溶出され、 フラクション No.84〜； 144 に力プラザマイシン； D 1および G1 を含む活性画分が溶出された。 この力プラザ マイシン A、 B、 Cs D、 E、 Fおよび Gを含むフラクション No.66〜83を集め て減圧下で濃縮乾固し、 力プラザマイシン A、 B、 C、 D、 E、 Fおよび Gを含 む粗精製物 625.3mgを得た。 また、 フラクション No.54〜： 117を集めて減圧下で 濃縮乾固し、 力プラザマイシン D 1および G1を含む粗精製物 1.28gを得た。 次にまず、 力プラザマイシン A、 B、 C、 Ds E、 Fおよび Gを含む粗精製物 について各成分の単離と精製を行った。 前記の粗精生物 625.3mg にメタノール 5mlを加えて溶解して、 得られた溶液を 5°Cの冷暗下に静置すると、 力プラザマ イシン A、 B、 C、 D、 E、 F、 Gを含む析出沈殿画分の 537.3mgを得た。 つづ いて、 この力プラザマイシン A、 B、 C、 D、 E、 F、 Gを含む析出沈殿 Hi分を HPLC (CAPCELLPAK C18 ^ 20 X 250mms 資生堂製)を用い精製した。 この HPLC では、 展開溶媒として 50%ァセ トニト リル水— 0.05%ぎ酸 （流 速: 12.0ml/min) により展開すると、 61〜68分後に力プラザマイシン Aが溶出さ れ、 52〜60分後に力プラザマイシン Bが溶出され、 39〜41分後に力プラザマイ シン Cが溶出され、 30-38分後に力プラザマイシン Dおよび力プラザマイシン G を含む混合物、 25〜28分後に力プラザマイシン Eが溶出され、 また 22〜25分後 に力プラザマイシン Fが溶出された。 それぞれの活性分画を集めて、 減圧下で濃 縮乾固することにより、 力プラザマイシン A (56.9mg)、 力プラザマイシン B (90.3mg)s 力プラザマイシン C (19.7mg)、 力プラザマイシン Dおよびカプラ ザマイシン Gを含む混合物 (162.9mg), 力プラザマイシン E (30.3mg) および 力プラザマイシン F (25.5mg) を得た。
さらに、 上記で得られた力プラザマイシン Dおよび力プラザマイシン Gを含む 混合物を 162.9mgを HPLC (CAPCELLPAK C18, ^ 20 X250mmN 資生堂製） を用いて精製した。 この HELCでは、 展開溶媒として 50%ァセトニトリル水— 0.025%トリフルォロ酢酸 （流速: 9.0ml/min) により展開すると、 55〜69分後に 力プラザマイシン Dヽ 48〜53分後に力プラザマイシン Gが溶出された。それぞれ の活性分画を集めて、 減圧下で濃縮乾固することにより、 力プラザマイシン D (69.7mg) および力プラザマイシン G (39.0mg) を得た。
さらに、上記で得られた力プラザマイシン D 1および G 1を含む粗精製物 1.28g について HPLC (CAPCELLPAK C 18, ø 20 X 250mm, 資生堂製） を用いて各 成分の単離と精製を行った。 この HPLCで展開溶媒として 45%ァセトニトリル 水— 0.05%トリフルォロ酢酸 （流速: 12.0ml/min) により展開すると、 36〜49分 後に力プラザマイシン G1 および D 1 が溶出され、 これらの溶出液を集めて減圧 下で濃縮乾固することにより、力プラザマイシン D 1および力ブラザマイシン G 1 の混合物を 187mg得た。 さらに、 該混合物を、 HPLC (CAPCELLPAK C18, φ 20 X 250mm,資生堂製）を用い、展開溶媒として 44%ァセトニトリル水— 0.025% トリフルォ口酢酸（流速: 9.0ml/min)により展開することから成る HPLCにかけ ると、 46〜52分後に力プラザマイシン D 1が溶出され、 また 41〜44分後にカブ ラザマイシン G 1 が溶出された。 これら溶出画分を集めて、 別々に減圧下で濃縮 乾固することにより、 力プラザマイシン D l (54.1mg) および力プラザマイシン G l ( 57.6mg) を得た。
産業卜の利用 τ能' I'牛
以上に説明したとおり、 本発明により、 新規な抗生物質として得られた一般式 一般式（I )の力プラザマイシン Dおよび G、 ならびに一般式 (II)の力プラザマイ シン D 1および G1 は、 それぞれに、 各種の抗酸性菌、 細菌およびそれらの薬剤 耐性菌株に対してすぐれた抗菌活性を有する。 従って、 本発明による力プラザマ イシン D、 G、 D lおよび G l は抗酸性菌および細菌の感染症を治療するのに有 効であって有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 次の一般式 （ I )
Figure imgf000039_0001
〔式中、 Rは力プラザマイシン Dでは 10—メチル一ゥンデシル基一 (CH2)9CH(CH3)2 であり、 力プラザマイシン Gでは I ま 9—メチルーゥンデシル基
- (CH2)8CH(CH3)C¾CH3である〕で示される化合物である、 抗生物質力プラザ マイシン Dおよび力プラザマイシン G、 あるいはそれらの製薬学的に許容できる
2 . 次式 （la)
( la)
Figure imgf000039_0002
で示される力プラザマイシン D、 すなわち請求の範囲 1に示される一般式 （I ) の化合物で Rが 10—メチル—ゥンデシル基である場合の化合物である、請求の範 囲 1に記載の抗生物質。
3 . 次式 （lb)
Figure imgf000040_0001
で示される力プラザマイシン G、 すなわち請求の範囲 1に示される一般式 （I ) の化合物で; が 9—メチル—ゥンデシル基である場合の化合物である、 請求の範 囲 1に記載の抗生物質。
4 . 次の一般式 （II)
(Π)
Figure imgf000040_0002
〔式中、 Rは力プラザ イシン D1では 10—メチル—ゥンデシル基— (CH2)9CH(CH3)2 であり、 力プラザマイシン G 1では: Rは 9—メチル一ゥンデシル基 一 (CH2)8CH(CH3)CH2CH3である〕で示される化合物である、 力プラザマイシン D 1および力プラザマイシン G 1、 あるいはそれらの製薬学的に許容できる塩。
5 . 次式 （Ila)
Figure imgf000041_0001
で示される力プラザマイシン D 1、 すなわち請求の範囲 4に示される一般式 (IDの 化合物で： が 10—メチル—ゥンデシル基である場合の化合物である、請求の範囲 4に記載の抗生物質。
6 . 次式 （lib)
Figure imgf000041_0002
N-CH3 o人.'
N ( l ib) で示される力プラザマイシン G 1、 すなわち請求の範囲 4に示される一般式 (II)の 化合物で Rが 9—メチル—ゥンデシル基である場合の化合物である、 請求の範囲 4に記載の抗生物質。
7 . ストレプトミセス属に属して、 請求の範囲 1に記載の一般式 （I ) で示される抗生物質力プラザマイシン Dおよび力プラザマイシン G、 ならびに請 求の範囲 4に記載の一般式 （II) で示される抗生物質力プラザマイシン D 1 およ び力プラザマイシン G1の少くとも一つを生産する生産菌を培養し、 その培養物 から、 力プラザマイシン D、 G、 D 1および G1 の少くとも一つを採取すること を特徴とする、 抗生物質力プラザマイシン D、 力プラザマイシン G、 力プラザマ イシン D 1および （または） 力プラザマイシン G1の製造方法。
8 . 力プラザマイシン D、 G、 D 1および G1の少くとも一つを生産する 菌として、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにブダぺ スト条約の規約下に FERM BP-7218の受託番号で寄託されてあるストレプトミ セス ·エスピー MK730-62F2を使用する、 請求の範囲 7に記載の方法。
9 . 既知の抗生物質力プラザマイシン A、 B、 C、 Eおよび Fならびに 請求の範囲 1に記載の一般式 （ェ） で示される抗生物質力プラザマイシン Dおよ び力プラザマイシン G、 ならびに請求の範囲 4に記載の一般式 （II) で示される 抗生物質力プラザマイシン D 1および力プラザマイシン G1 を生産する特性を持 っストレブトミセス 'エスピー MK730-62F2 (独立行政法人 産業技術総合研究 所 特許生物寄託センターにプダぺスト条約の規約下に FERM BP-7218の受託 番号で寄託された菌株） を、 好気的条件下で培養し、 さらにその培養物から、 抗 生物質力プラザマイシン A、 Bs C、 Eおよび Fならびに抗生物質力プラザマイ シン D、 G、 D 1および G1 をそれぞれ別々に採取することから成ることを特徴 とする、 抗生物質力プラザマイシン A、 B、 C、 D、 E、 Fおよび G、.ならびに 力プラザマイシン D lおよび G lの製造方法。
1 0 . 請求の範囲 1に記載の一般式 （ I ) で示される抗生物質力プラザマ イシン Dおよび力プラザマイシン G、 ならびに請求の範囲 4に記載の一般式（II) で示される抗生物質力プラザマイシン D 1および力プラザマイシン G1 の少なく とも一つ、 あるいはその製薬学的に許容できる塩を有効成分として含有し、 また 製薬学的に許容される担体を、 有効成分と混和して含有する医薬組成物。
1 1 · 抗細菌性組成物である請求の範囲 1 0に記載の組成物。
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