KR930003107B1

KR930003107B1 - 항종양 항생물질 화합물

Info

Publication number: KR930003107B1
Application number: KR1019850004273A
Authority: KR
Inventors: 에이. 매트슨 제임스; 에이. 부슈 제임스
Original assignee: 브리스톨-마이어스 스퀴브 캄파니; 이삭 쟈코 브스키
Priority date: 1984-06-18
Filing date: 1985-06-17
Publication date: 1993-04-19
Also published as: PT80656A; ZA852370B; GB8515256D0; DE3521436A1; NL8501708A; GR851452B; GB2160529A; AU4048085A; FI80475B; IE58629B1; JPS6122099A; GB2160529B; FR2568892A1; DK272985A; ES8609485A1; JPH0158200B2; MY100478A; KR860000382A; SE8502996D0; IT8521156A0

Abstract

내용 없음.

Description

항종양 항생물질 화합물

본 발명은 본 명세서에서 산드라마이신이라고 명명한 신규한 환상뎁시펩티드 항종양 항생물질 및 신규한 미생물인, 노카르디 오이데스(Nocardiodes)종의 균주 C49.009, ATCC39419(한국기탁번호 : KFCC-10143, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁년원일 : 1985년 5월 20일)의 발효에 의한 이 물질의 제조방법에 관한 것이며, 또한 신규한 항종양 항생제를 함유하는 약제학적 조성물 및 상기 항종양 항생물질을 항균제 및 항종양제로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 발효에 의해 산드라마이신을 제조하는데 이용되는 신규한 미생물 그 자체에 관한 것이다.

BBM-928로서 표시되는 항종양 항균복합체와, 나중에 악티노마두라속의 신규한 종인 것으로 판정되어 악티노마두라 루조넨시스 신종(Actinomadura luzonensis nov.sp.)이라고 불려졌던 균주 G-455-101(ATCC31491)로 표시되는 신규 방사선균의 균주를 발효시켜서 이 물질을 제조하는 방법이, 1982년 11월 23일자로 허여된 고시야마등의 미합중국 특허 제4,360,458호에 공개되어 있다[참조 : 저널. 안티비오틱스(J.Antibiotics), 33(10), 1098-1102(1980)].

BBM-928 성분의 생성, 분리, 특성 및 항종양 활성이 문헌[저널 안티비오틱스(J.Antibiotics), 33(10), 1087-1097(1980)]에 공개되어 있다. BBM-928 복합체의 주요 성분인 BBM-928A, B, C 및 D[지금은 루조펩틴(luzopeptin)A, B, C 및 D라고 각각 부름]의 구조는 1984년 5월 29일자로 허여된 고시야마등의 미합중국 특허 제4,451,456호에 공개되어 있으며 그 구조식은 다음과 같다 :

루조펩틴 A, B, C 및 D는 발색단으로서 3-하이드록시-6메톡시퀴날딜산 및 세가지 성분간의 구조적 차이점이 테트라하이드로피리다진 잔기중의 하이드록실그룹의 아세틸화의 정도에서만 존재하는 4-하이드록시-2,3,4,5-테트라하이드로피리다진-3-카복실산을 포함한다는 구조적 특성을 가지고 있다.

본 발명은 본 명세서에서 산드라마이신으로서 지칭한 다음 구조식을 가지는 신규환 환식 뎁시펩타이드 항종양 항생물질 및 산드라마이신을 현저히 순수한 형태로 제조, 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

신규한 항생물질 산드라마이신은 미생물에 의해 생성된 산드라마이신을축적하여 배양육즙으로부터 항생물질 산드라마이신을 주거하는, 임시로 노카르디오이데스 속의 한 종으로서 분류된 신규한 미생물의 발효에 의해서 얻는다. 바람직한 산드라마이신-생성 미생물은 멕시코에서 수거된 토양시료에서 분리된 노카르디오이데스 종 균주 C49,009와 이의 돌연변이체들이다. 이 균주는 메릴랜드 로크빌에 있는 어메리칸 타입 컬춰콜렉션(American Type Culture Collection)에 ATCC39419로 기탁되어 있고, KFCC-10143(기탁기관 : 한국종군협회, 기탁년월일 : 1985년 5월 20일)로 한국종균협회에 기탁되어 있다.

미생물

다음은 항종양 항생물질 산드라마이신을 생성하는 바람직한 미생물에 관한 일반적인 설명이다.

[형태]

균주번호, C49,009는 기질과 기생균사체(폭 0.4㎛)를 형성하며 기질균사체는 길고, 가지가 잘 나 있으며, 일주일후에는 짧은 섬사(필라멘트)나 막대로 분열된다. 균주번호 C49,009는 계속적인 배양시 기생균사체를 형성시키는 능력을 상실하는 경향이 있다. 기생균사체의 균사는 성글게 가지가 나 있다. 현미경 관찰결과 기생균사는 최초에는 얼마간 지그자그형이다가, 뒤에 반투명균사와 함께 분리되는 길고, 곧은 사슬의 분절포자상 원통형분절(0.5×1 내지 3㎛)로 발전한다. 아포(芽胞)상 분절의 표면은 부드럽다. 균주번호 C49,009는 그람양성이며 산내성이 아니다. 포자낭, 운동성의 아포 및 균핵은 관찰되지 않는다.

[세포벽 조성물과 전세포의 당성분]

균주번호 C49,009의 세포벽은 문헌[비.베커등의 Appl. Microbiol.,13,236-243(1965) 및 티. 야마구찌의 J. Bacteriol., 89,441-453(1965)]에 기재되어 있는 방법에 따른 세포벽중에 특징적인 아미노산 성분으로서 LL-디아미노피멜린산과 글리세린을 함유하고 있다. 전세포 가수분해물은 문헌[엠.피.리체발리어등의 Biol. Actinomycetes Related Organisms, 11, 78-92(1976)]에 기재된 절차에 따라 측정한 바와 같이 글루코스, 만노스 및 리보스의 존재를 나타내지만 어떤 특징적인 당은 결핍되어 있다. 앞서 언급한 세포벽 조성물과 전세포의 당성분은 균주번호 C49,009가 세포벽형 I의 방사균종임을 나타내는 것이다.

[배양 및 생리학적 특성]

균주번호 C49,009는 특수한 생활상태에 있는 호기성 방사균이며, 대부분의 공지된 배지중에서 잘 자란다. 기생균사체는 ISP배지 제3, 5 및 7번 및 Czapek의 자당-질산염 한천상에서 풍부히 또는 적당히 형성되지만, ISP배지 제2 및 6번 또는 베네트의 한천과 같은 영양섭취가 풍부한 배지상에서는 성글게 형성된다. 기생균사체의 색조상은 백색이다. 메라노이드와 기타 독특한 색소는 현재까지 시험된 모든 공지된 배지(descriptive media)중에서는 생성되지 않는다. 성장력이 있는 균사체의 가장자리의 대비색조상은 노란색뿐이다. 그것은 28℃에서 최적성장을 나타내고, 15℃ 및 37℃에서 알맞게 성장되나 5℃나 45℃에는 성장되지 않는다. 젤라틴과 전분은 분해된다. 티로시나제 반응은 음성적이다. 7% NaCl이나 0.01% 리소짐의 존재하에서는 성장이 억제된다 균주번호 C49,009의 배양 및 생리학적 특성은 표 1과 2에 각각 나타낸다. 균주번호 C49,009는 성장시 대부분 당을 이용하고, 탄소공급원의 이용은 표 3에 나타나 있다.

[표 1]

* 3주간 28℃에서 배양후 관찰된 것

** 약어 : G=성장, R=대비색조상, A=기생균사체, D=분사성 색소

*** 색깔과 괄호내의 숫자는 센트로이드 색체로 예시된 "겔리, 케리 엘 및 디.비.주드의 ISCC-NBS 색체명 차-트. 미국상무성 Cir.553, 워싱턴, 디.씨., 1975년 11월"에 있는 색표준에 따른 것이다.

[표 2]

* 아라이, 티.(Arai, T.) 및 와이. 미까미(Y. MIkami)의 "Chromogenicity of streptomyces" Apple. Microbiol., 23, 402-406(1972)

[표 3]

3주간 28℃에서 배양후 관찰.

기본배지 : 프리드함-고트리브의 무기배지.

약어 : + ; 양성이용, - ; 음성이용.

[계통]

균주번호 C49,009는 이 균주의 그람양성 반응, 비-내산성, 기질 균사체의 절단, 백색 기생균사체의 형성, 기생균사체의 전부분에 걸친 분절포자상 분절 및 어떤 독특한 색소를 형성하는 능력이 없다는 점에 특징이 있다. LL-디아미노피멜린산과 글리세린은 존재하지만, 세포벽내에 특수한 당의 부재에 따라 이들 특징은 균주번호 C49,009를 노카르디오이데스 속으로 분류하고 있다[참조 : H. Prauser, Intl. J. Syst. Bacteriol., 25, 58-65(1976)]. 균주번호 C49,009는 노카르디오프시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei, 사카로폴리스포라 히르수타(Saccharopolyspora hirsuta)와, 세포벽의 특수 아미노산이나 당중의 노카르디아속의 모든 비정형종을 포함하고 문헌[알. 이. 고르돈 등의 J. Gen. Microbiol., 109, 69-78(1978)]에 기재되어 있고, 동 문헌의 표 4에 나타낸 바와 같은 특수한 생리학적 성질이 있는 기생균사체-형성 노카르디오형 방선균과는 구별된다. 균주번호 C49,009는 또한, 포자형성의 노카르디-형 형태학에서의 스트랩토 마이세스속 ; 예컨대, 짧은 필라멘트나 막대로 분열된 균주번호 C49,009 단편의 기질균사와 구별된다. 균주번호 C49,009의 분절포자상 분절은 그 형성 위치, 정돈된 균사초 및 특수한 포자벽이 없다는 점에서 스트렙토마이세스의 포자와 구별할 수 있다.

[표 4]

약어 : + ; 양성특성, - ; 음성특성

일련의 분류-특이성 파지에 대한 민감도 윤곽으로 노카르디오이데스 속의 균주와 스트렙토마이세스나 노카르디아(Nocardia)와 같은 관련 속을 구분하게 된다[참조 : 에이취, 프라우서 ; 런던, 뉴욕 및 샌프란시스코에서 발행된 Academic Press(1976)에서 엠. 굳 펠로우등의 "노카르디의 생태학에 있어서" 노카르디형 유기체에서의 숙주-파지관계(Host-phage relationslips in nocardioform organisms, "In the Biology of the Nocardiae")]. 이들 방선균 파지에 대한 균주번호 C49,009의 감응도는 시험되지 않았다. 그 이유는 그 파지를 우리가 입수할 수 없기 때문이었다. 배양과 생리학적 특징에 근거하여 세계의 여러지역에서 수거된 토양시료에서 분리한 노카르디오이데스 속의 17개 균주들은 단일종인 노카르디오이데스 알부스로 분류되었다. 균주번호 C49,009는 L-아라비노스와 이노시틀의 이용에 있어서는 노카르디디오이데스 알부스와 다르지만, 전체적인 배양 및 생리학적 특성에 있어서는 후자와 유사하다. 그러므로, 균주번호 C49,009는 임시로 노카르디오이데스 속의 종으로서 분류되었다.

본 발명은 특수한 균주번호 C49,009의 이용이나 상기 설명에 일치하는 유기체에 제한되는 것이 아니다는 것을 알 수 있다. 특히 본원은 X-방사선, 자외선 방사선, 질소겨자에 의한 처리, 파지노출 및 이와 유사한 방법과 같은 공지된 방법에 의해서 상기 유기체로부터 생성될 수 있는 다른 산드라마이신 생성균주 또는 상기 유기체의 돌연변이체를 포함하려는 것이다.

[항생물질의 생성]

산드라마이신은 노카르디오이데스종(Nocardioides sp.) 균주번호 C49,009(ATCC 39419)(한국기탁번호 : KFCC-10143, 기탁기관 ; 한국종균협회, 기탁년원일 : 1985년 5월 20일)나 이의 돌연변이체를 통상적인 영양배지중에서 배양시킴으로써 생성한다. 유기체를 공지된 영양공급원, 즉, 동화할 수 있는 탄소와 질소의 공급원 및 임의의 무기염과 기타 공지된 성장인자를 함유하는 영양배지중에서 성장시킨다. 한정된 량을 생산하기 위해서 표면배양물과 병들을 사용할 수도 있지만 항생물질을 생성하기 위해서는 수침호기성 조건을 이용하는 것이 바람직하다.

영양배지는 정제된 상태이거나 조잡한 상태의 글리세롤, 글루코스, 슈크로스(자당), 만노스, 프락토스, 옥수수전분, 말토스, 만니톨, 몰라세스 등과 같은 하나나 그 이상의 동화할 수 있는 탄소공급원을 포함하고 있어야 한다. 영양배지는 또한 콩죽, 생선죽, 맥아추출물, 효모추출물, 펩톤, 글루텐죽, 면실배아죽, 콩가루, 아마인죽, 면실가루, 카제인, 가수분해 단백질물질, 질산염, 암모늄염, 요소 등과 같은 하나 혹은 그 이상의 동화할 수 있는 질소공급원도 포함하고 있어야 한다. 염화나트륨, 인산칼륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘과 같은 영양무기염들과 구리, 아연, 망간, 철 등과 같은 극미량의 중금속염들의 영양배지에 첨가될 수 있다.

발효온도는 15℃ 내지 약 37℃ 범위이어야 하고, 약 25℃ 내지 약 30℃ 범위인 것이 바람직하다. 발효배지의 pH는 약 5 내지 약 10.5 범위이어야 하고, 그 바람직한 범위는 약 6 내지 약 8.5이다. 보통 산드라마이신의 최적 생성은 온도에 따라 약 2 내지 9일 사이에 얻어진다. 탱크발효가 실시될 경우에는, 사면배양물, 토양배양물, 또는 미생물의 동결건조된 배양물로 육즙배지를 접종하여 영양육즙중에서 성장력이 있는 접종물을 생성하는 것이 바람직하다. 이 방법으로 활성있는 접종물을 얻은 후, 발효탱크 배지에 무균상태로 옮겨 놓는다.

[산드라마이신의 분리]

발효가 완결될때, 산드라마이신을 배양배지로부터 회수하고, 다음 흐름도에 예시된 다단계절차에 따라 현저히 순수한 형태로 분리시킨다.

흐름도에 관하여 상세히 설명하면, 노카르디오이데스 종 균주번호 C49,009의 발효에 의하여 생성된 전육즙을 처음에는 물과 혼합할 수 없는 유기용매, 바람직하게는 에틸아세테이트로 추출한다. 디칼라이트(Dicalite)(규조토에 대한 캘리포니아 토란스, 그레프코 인코퍼레이티드의 상표)와 같은 여과 보조제를 그 추출 혼합물에 첨가한 후, 그 혼합물을 여과하여 불용물을 제거하는 것이 바람직하다. 여과후, 유기상을 추출 혼합 여과액으로부터 분리시키고 증발시켜 농축시키면 상기 항생제의 조추출물이 수득된다. 이 조추출물을 스켈리솔브 B(헥산이성체에 대한 스켈리 오일캄파니의 상표)와 같은 지방족 탄화수소 용매와 약 10%의 메타놀중 물 사이에서 분액시킨다. 수성 메타놀상을 물량을 추가하여 희석하고 생성된 약 25%물의 메타놀 용액을 사염화탄소와 같은 유기용매로 추출한다. 수성 메타놀상을 다시 물로 희석하고 생성된 약 35%물의 메타놀 용액을 클로로포름과 같은 유기용매로 추출한다. 이 사염화탄소 추출물들을 혼합하고 진공중에서 증발시키면 잔사 A가 수득된다. 클로로포름 추출물을 합하여 진공중에서 증발시키면 잔사 B가 수득된다. 잔사 A와 B를 합하여 저 내지 고극성 유기용매를 사용하여 디칼라이트와 같은 규조토를 함유하는 칼럼으로 색층분석한다. 항생물질을 함유하는 적합한 유분을 합하여 진공중에서 증발시키면 잔사 C가 수득한다. 용출제로서, 클로로포름 대 클로로포름중의 5% 메타놀의 선형구배를 사용하여 실시예 3, C단계에서 후술하는 바와 같이, 잔사 C의 실리카겔 저압 액체칼럼 색층분석이나 잔사 D, D', E 및 E'의 중압 고성능 액체 색층분석에 의해서 추가로 정제할 수 있다. 적절한 유분을 증발건조시키면 산드라마이신이 수득되며, 적절한 용매계로 재결정시키면 순수한 결정성 산드라마이신이 수득된다.

[산드라마이신의 구조]

산드라마이신은 발색단으로서 3-하이드록시 퀴놀린 핵과 피페콜린산 잔기를 함유하는 환식 뎁시펩타이드 항종양 항생물질이다. 스펙트럼과 화학적 분석에서, 산드라마이신은 다음 구조식을 갖는 것으로 판명되었다 ;

산드라마이신은 융점 208-212℃, 분자식 C₆₀H₇₆O₁₆N₁₂및 분자량 1221.3312의 백색 결정성 고체이다. 그것은 탄소, 수소, 질소 및 산소 원소로 구성되어 있다. 원소분석 자료는 다음과 같다.

C₆₀H₇₆O₁₆N₁₂ㆍ8H₂O에 대한 원소분석

계산치 : C ; 52.78, H ; 6.79, N ; 12.31, 0(차액으로) 28.12

실측치 : C ; 52.58, H ; 6.27, N ; 12.29 0(차액으로) 28.86

산드라마이신의 고분해능의 질량 스펙트럼은 크라토스 앰에스-50 분광계와 에프에이 B 이온화에 의해서 판정하였다. 그 관측된 질량은 다음과 같다.

(M+H)⁺이온에 대한 계산치 : 1221.5579

(M+H)⁺이온에 대한 실측치 : 1221.5571

KBr중에서 펠릿화할 경우 산드라마이신의 적외선 흡수 스펙터럼은 역수 센티미터로 표시되는 다음 진동수에서 특이한 밴드를 나타낸다 :

3500,3340,2970,2940,2880,1748,1660,1640,1598,1520,1468,1445,1420,1336,1290,1265,1235,1172,1138,1092,1055,1018,922,885,855 및 838.

산드라마이신의 자외선 흡수 스펙트럼은 중성, 산성 및 염기성 조건하에 메타놀(0.01798g/1)중에서 측정한다. 관찰된 흡수 최대치 및 흡수 성능은 다음과 같다 :

nm으로 λ최대치(a)

CH₃OH에서 : 356(8.1), 296(7.5), 229(62.8), 217(63.7)

CH₃OH-HCl에서 : 356(8.3), 306(8.1), 228(58.4), 210(62.3)

CH₃OH-NaOH에서 : 395(9.2), 301(7.2), 246(59.8).

중수소화된 클로로포름중에 용해된 산드라마이신의 양성자 자기 공명 스펙트럼을 내부 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하고 360MHz에서 조작하는 부르커 모델 WM-360 분광계를 사용하여 측정한다. 관측된 화학적 변위(δ값), 커플링상수(Hz로 표시한 J값) 및 무늬설명은 다음과 같다 :

11.75(s. 2H, Ar-OH), 9.58(d, J=7.39,2H,ser NH), 8.55(bs, 2H, gly NH), 7.82(bs, 2H, Ar-H⁸), 7.72(m, 2H, Ar-H⁵), 7.63(s, 2H, Ar-H⁴), 7.52(m, 4H, Ar-H⁵및 Ar-H⁷), 5.60(pip의 m, 2H, αH), 5.56(d, J=17.58, 2H, sar αCH), 5.28(m, 2H, ser

CH), 5.01(d, J=12.79, 2H, ser βCH), 4.88(d, J=12.79, 2H, val

CH), 4.45(bd, J=12.79,4 ser βCH 및 gly

CH), 4.07(pip의 bd, J=15.99, 4H, εH 및 gly

CH), 3.76(pip의 bd, J=12.79, 2H, εH), 3.58(d, J=17.58, 2H, sar CH), 3.14(s, 6H, N-CH₃), 2.96(s, 6H, N-CH₃), 2.06(m, 2H, val βCH), 1.82(pip의 bs, 4H, βCH), 1.68(pip의 bm, 4H, γCH), 1.57(pip의 bm, 4H, δCH), 0.94(d, J=6.37, 6H, val-CH₃), 080(d, J=6.37, 6H, val-CH₃).

중수소화된 클로로포름중에 용해된 산드라마이신의 탄소-13 자기 공명 스펙트럼을 내부 표준으로서, 테트라메틸실란을 사용하고, 22.5MHz에서 조작하는 제올 모델 FX90Q 분광계를 사용하여 측정한다. 각각의 화학적 변위가 두개의 탄소원자를 나타내는 관찰된 화학적 변위(ppm 값)와 할당(assignments)은 다음과 같다 :

산드라마이신을 루조펩틴 A, B 및 C와 구별하는 산드라마이신의 중요한 구조적 특징은 3-하이드록시-6-메톡시퀴날딘산 및 4-치환된 테트라하이드로피리다진-3-카복실산 그룹 대신에 각각 3-하이드록시퀴날딘산과 피페콜린산 잔기가 존재한다는 점이다.

[산드라마이신의 생물학적 활성]

산드라마이신의 항균활성은 일련의 두배의 한천 희석방법에 의해서 측정한다. 그 결과는 루조펩틴 A와 에키노마이신의 활성과 비교하여 표 5에 표시되어 있다. 표 5에 나타나 있는 바와같이, 산드라마이신은 바실루스(Bacillus), 스브틸리스(subitlis) 및 스태필로그코쿠스(staphylococcus) 아우레우스(aureus)와 같은 그람-양성 유기체에는 물론 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 패칼리스(faecalis)에도 강한 억제 작용이 있다.

[표 5]

산드라마이신은 또 이식 가능한 쥐 종양 P-388 백혈병에 대하여도 시험하였고 그 결과는 표 6에 나타나 있다. 일반적으로 이용된 방법은 국립암연구소[암의 화학치료 보고 3부, 3, 1-103(1972)]의 공정 성적표에 따른 것이다. 필수적인 실험의 세부사항은 표 6의 아랫부분에 주어져 있다. 두가지의 상이한 투약 양생법을 시험한다. 즉 1일에 1회 용량 및 5일간 매일 투여, 두가지 계획으로, 최적용량은 약 0.2mg/kg/주사인 것으로 보인다.

[표 6]

종양접종물 : 복강내로 이식된 10⁶복수증 세포

숙주 : CDF₁암컷 생쥐

평가 : MST=중간생존시간

효과 : %T/C≥(처리된 MST/대조군 MST)×100

표준 : %T/C=125 현저한 항종양 활성

AWC : 평균중량변화(gr)(처리된-대조군)(4일에)

상기에서 제시한 항균성 및 생쥐 종양자료에 의해서 지적된 바와같이, 산드라마이신은 항생물질로서 유용하고, 또한 P-388백혈병과 같은 포유동물의 악성종양의 억제용 항종양제로서도 유용하다.

본 발명은 그 범위내에 불활성의 약제학적으로 허용되는 담체나 희석제와 배합된 유효한 항균량 또는 종양 억제량의 산드라마이신을 함유하는 약제학적 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 또한 다른 활성있는 항균제와 항종양제를 함유할 수도 있고, 바람직한 투여 경로용으로 적합한 어떤 약제학적 형태로든지 제조할 수 있다. 이들 조성물의 예는 정제, 캡슐제, 환제, 분말제 및 고립제와 같은 경구투여용 고체 조성물 및 멸균용액제, 현탁제 또는 에멀죤제와 같은 비경구 투여용 제제를 포함한다. 이들은 또한 멸균수, 생리염수 혹은 어떤 다른 멸균 주사매질중에 사용 직전에 용해시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 제조될 수 있다.

항균제로서 사용될경우, 산드라마이신이나 이의 약제학적 조성물은 활성성분의 농도가 치료되는 특수 유기체에 대한 최소 억제농도보다 더 크도록 투여된다. 항종양제로서 사용될 경우 주어진 포유동물 숙주에 대한 산드라마이신의 최적의 투여량과 양생법은 본 분야의 전문가에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 물론, 사용되는 산드라마이신의 실질적인 투여량은 제형화된 특이한 조성물, 사용방법 및 치료되는 특수상태, 숙주 및 질병에 따라 변동할 것이라는 것을 알 수 있다. 환자에 연령, 체중, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배설속도, 증상, 약제의 배합, 반응 감도 및 질병의 경중을 포함하는 약제의 작용을 변경하는 많은 인자들이 고려될 수 있을 것이다.

다음 실시예들은 단지 예를들어 설명하기 위한 목적으로 제시된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 스켈리솔브 B는 이성체 헥산을 함유하고 있으며, 비점이 60-69℃인 시중 구입가능한 석유용매(스켈리오일 캄퍼니)이다. 디 칼라이트는 캘리포니아 토르란스의 그레프코 인코퍼레이티드에서 제조된 규조토이다. 달리 지적되지 않은 한 아래의 모든 온도는 섭씨 온도이다.

[실시예 1]

산드라마이신의 발효

A. 진탕-플라스크 발표

노카르디오이데스 종인 균주번호 C49,009, ATCC39419(한국기탁번호 :KFCC-10143, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁년월일 : 1985년 5월 20일)를 보유하여 효모-맥아 추출물 한천의 한천사면상의 배양 시험관에 옮긴다.

이 배지는 4.0g의 글루코스, 4.0g의 효모 추출물, 10.0g의 맥아 추출물 및 20.0g의 한천으로 구성되어 있으며, 탈이온수를 가하여 1ℓ가 되게 한 것이다. 각각을 옮겨서 한천사면 배양물을 27℃에서 7일간 배양시킨다. 그 생성파지용 접종물을 제조하기 위해서, 사면배양물에서 성장된 균사체들을 30.0g의 글루코스, 10.0g의 콩분말, 10.0g의 면실배아죽과 3.0g의 CaCO₃로 구성되며 탈리온수를 가하여 1ℓ로 만든 멸균배지중 100ml가 들어있는 500ml엘렌메이어 플라스크에 옮긴다. 이 영양 배양물을 5.1cm 직경의 원형으로, 210회전/분으로 운행되는 가이로타리(Gyrotary) 타이어 진탕기(모델 G53, 뉴 브룬스위크 사이언티픽 캄파니 인코퍼레이티드)에서 48시간 동안 27℃에서 배양시킨다. 4ml의 영양 배양물을 20.0g의 슈크로스 10.0g의 콩분말, 10.0g의 면실죽과 5.0CaCO₃로 구성되며 탈이온수를 가하여 1ℓ로 한 멸균생성배지가 들어 있는 500ml의 엘렌마이어 플라스크에 옮긴다. 그 생성 배양물을 250회전/분으로 조작한 영양 배양물용으로 사용되는 진탕기상에서 27℃하에 배양시킨다. 96시간이 되었을때, 산드라마이신을 분리하기 위해서 생성 배양물을 수거한다.

B. 벤취-톱(Bench-top) 발효

벤취-톱 발효기에서 산드라마이신을 생성하기 위해서, 실시예1A에서 설명한 것과 같은 영양 배양물 400ml를 탈이온수 1ℓ당 40g의 옥수수전분 20g의 아마인숙, 1g의(NH₄)₂SO₄및 5g의 CaCO₃로 구성되는 생성배지 10ℓ가 들어있는 발효기(마이크로젠 모델 에스 에프-116, 뉴 브룬스 위크 사이언티픽 캄퍼니, 인코퍼레이티드)에 옮긴다. 27℃로 온도를 유지시키고, 교반속도는 300회전/분이고, 공기유속은 8ℓ/분이다. 202시간 배양후, 산드라마이신을 배양물에서 분리시킨다.

C. 탱크 발효

산드라마이신의 시험(pilot) 공장 생산을 위해서 2ℓ의 영양을 배양물(실시예 1A의 일반절차에 의해서 제조됨)을 탈이온수 1ℓ당 40g의 옥수수전분, 20g의 아마인숙 1g의 (NH₄)₂SO₄및 5g의 CaCO₃로 이루어진 생성 배지 30ℓ가 들어있는 발효기에 옮긴다. 배양온도는 26.5℃이고, 공기유속은 80ℓ/분이며, 교반속도는 375회전/분이고, 배압은 1기압이다. 183시간 후, 산드라마이신을 분리하기 위해서 탱크 발효율을 수거한다.

[실시예 2]

산드라마이신의 분리 및 정제

A단계 : 추출

전체 발효 원료육즙(~8ℓ)을, 바닥에 꼭지가 장치된(꼭대기 직경이 48cm이고, 바닥직경이 44cm이며, 높이가 55cm인)20ℓ인 폴리에틸렌 탱크에 옮긴다. 같은 체적의 에틸아세테이트를 첨가한다. 이 혼합물을 30분간 호조건의 혼합속도로 공기구동 교반기에 의해 교반시킨다. 약 6ℓ(2kg)의 디칼라이트를 가하고 혼합한다. 이 혼합물을 제12번 부크너깔대기에 설치되어 있는 디칼리이트 패드상에서 여과시킨다. 여액을 진공제거 장치가된 19ℓ용액병에 수거한다. 매트를 2ℓ의 에틸아세테이트로 세척하고, 여액을 20ℓ분액에 깔대기에 옮기고 상을 분리시킨다.

에틸아세테이트 추출물을 제거하고 연속적인 공급장치가 장치된 실험실용 크기의 유리순환 증발기에서 약 1ℓ로 농축시킨다. 농축물을 로타리 증발기중에서 진공하에 점성 오일로 되도록 추가 증발시켜서 1.94g의 조추출물을 얻는다.

B단계 : 조추출물의 액체-액체 분리

A단계에서 얻은 조추출물(1.94g)의 200ml의 메타놀과 200ml의 스켈리솔브 B의 혼합물중에 용해시킨다. 두개-상의 용액을 1ℓ분액 깔대기에 옮겨 22ml의 물로 희석시킨다. 혼합물을 진탕하고 생성된 상을 분리시킨다. 수성 메타놀(하부상)을 제 2 의 1ℓ분액 깔대기에 옮겨 200ml의 스켈리솔브 B의 부분 표본으로 두번이상 추출한다. 스켈리솔브 B는 동일용량의 10%메타놀 수용액으로 미리 포화시켜 놓았던 것이다. 수성 메타놀상을 44ml의 물로 희석시키고 사염화탄소 200ml씩으로 세번 추출한다.

사염화탄소는 앞서 동일 용적의 25% 메타놀 수용액으로 포화시켜 두었다. 수성 메타놀상을 41ml의 물로 희석시켜 클로로포름 200ml씩으로 세번 추출한다. 클로로포름은 미리 동일 용적의 35% 메타놀 수용액으로 포화시킨다. 사염화탄소 추출물을 합하여 로타리 증발기에서 진공하에 증발건조시키면 595mg의 잔사 A가 수득된다. 클로로프롬 추출물을 합하여 로타리 증발기중에서 진공하에 증발ㆍ건고시키면 458mg의 잔사 B가 수득된다.

C단계 : 잔사 A와 B의 분쇄

B단계에서 얻은 잔사 A(547mg)와 잔사B(389mg)을 합하여 2부의 클로로포름-1부의 메타놀의 혼합물 30ml중에 용해시킨다. 디칼라이트(17.4g)을 이 용액에 가한 다음 스켈리솔브 B 200ml를 가하여 슬러리를 생성시킨다. 용매를, 로타리 증발기를 사용하여 진공하에 증발시킨다.

잔류분말을 500ml의 톨루엔 중에 슬러리화시키고 내부직경 4.1cm×45.7m 섬광 색층 분석기 칼럼에 충전시킨다. 디 칼라이트를 가압(N₂-5.7Psi)유동에 의해 베드에 충전시킨다. 충전용매가 베드표면에 도달할 때 유동을 중지하고 칼럼에 가압을 중지한다. 오타와 모래의 층 ~2cm)을 그 표면에 가한다. 그 다음 칼럼을 다음의 용출성 계열물질인 톨루엔(500ml) ; 디에틸에테르(500ml) ; 염화메틸렌(500ml) ;클로로포름(500ml) ; 에틸아세테이트(500ml) ; 아세토니트릴(500ml) ; 테트라하이드로푸란(500ml) 및 메타놀(500ml)을 사용하여 가압 질소 유동에 의해 용출시킨다. 톨루엔 용출제와 충전여액을 합하여(~1ℓ), 로타리 증발기에서 진공하에 증발건고시키면 0.699g의 잔사 C가 수득된다.

D단계 : 단사 C의 칼럼 색층 분석

2.0cm 내부직경×30cm의 글렌코 칼럼을 클로로포름중의 웰름(Woelm) 실리카겔(0.060-0.200mm, 170-230메쉬) 37g으로 슬러리 충전시킨다. C단계에서의 잔사 C(0.699g)을 5ml의 클로로포름중에 용해시키고 컬럼의 꼭대기에 투입한다. 이 시료를 충전된 베드내로 여과되도록 한다. 칼럼 꼭대기와 실리카겔 베드간의 공극을 펴준 오타와 모래로 충전시킨다. 칼럼을 글렌코 구배 용출장치에 연결하고 클로로포름 대 클로로포름의 5% 메타놀 용액의 2ℓ선형 구배에 의해 용출을 개시하여 20×100ml 유분을 수거한다. 각 유분을 로타리 증발기중에서 진공하에 증발ㆍ건고시킨다. 그 잔사를 3ml의 클로로포름 2부-메타놀 1부에 용해시킨다. 각 유분의 부분 표본(2μℓ)을 아날테크 실리카겔 GHLF 박층 색층분석(TLC)판에 반점을 찍는다. 이 판을 클로로포름 5% 메타놀 용액으로 용출시키고 254nm 및 366nm의 자외선으로 현시시킨다. 유분 6이 균등질인 것으로 판정된다. 유분 6에서 얻은 결정성 잔사를 클로로포름-메타놀로 재결정시키면 215mg의 산드라마이신이 수득된다. 이 물질을 클로로포름-메타놀로 재결정시키면 순수한 산드라마이신(융점 : 208-212℃)188mg이 수득된다.

C₆₀H₇₆O₁₆N₁₂ㆍ8H₂O에 대한 원소분석

계산치 : C ; 52.78, H ; 6.79, N ;12.31

실측치 : C ; 52.58, H ; 6.29, N : 12.29

[실시예 3]

산드라마이신의 대규모 분리 및 정제

A단계 : 조추출물의 추출 및 액상 분리

실시예2, A단계 및 B단계에 기재된 전체 분리공정을 반복할 때, 전체 발효육즙(~8ℓ)에서 1.12g의 잔사 A와 3.03g의 잔사 B가 수득된다.

B단계 : 잔사 A와 B의 분쇄

A단계에서 얻은 잔사A(1.12g)를 약 300ml의 클로로포름 2부-메타놀 1부중에 용해시킨다. 디 칼라이트(20g)을 그 용액에 가한다. 용매를 로타리 증발기에서 진공하에 증발건고시키다. 잔사를 300ml의 톨루엔중에 슬러리화시키고 다시 증발ㆍ건고시킨다. 이것을 두번 반복한다.

생성된 잔사를 300ml의 스켈리솔프 B중에 슬러리화 시키고 로타리 증발기에서 증발ㆍ건고시킨다. 이것을 두번 반복한다. 디 칼라이트 잔사를 300ml의 스켈리솔브 B에 슬러리화시키고 4.1cm 내직경×45.7cm섬광색층 분석 칼럼에 충전시킨다. 디 칼라이트를 가압(N₂-5.7Psi) 유동에 의해 베드중에 충전시킨다. 오타와 모래의 층(~2cm)을 베드에 충전시킨다. 다음의 용출성 계열 ; 즉 스켈리솔브 B(500ml) ; 톨루엔(500ml) ; 디에틸에테르(500ml) ; 염화메틸렌(500ml) ; 클로로포름(500ml) ; 에틸아세테이트(500ml) ; 아세토니트릴(500ml) ; 테트라하이드로푸란(500ml) 및 메타놀 (500ml)로 가압질소 유동시켜 용출을 개시한다. 톨루엔 용출제를 로타리 증발기에서 진공하에 증발ㆍ건고시키면 9127mg의 잔사 D가 수득된다.

본 명세서에서 사용되는 잔사 A를 3.03g의 잔사 B로 대체시키는 것외에는 상기 개설한 전체공정을 반복함으로써 톨루엔 용출제로부터 766.7mg의 잔사 E를 생성시킨다.

본 명세서에 수득하여 사용한 잔사 A와 B를 각각 1.5g 및 1.97g의 잔사 A'와 B'로 대체시키는 것을 제외하고는 실시예3, A단계 및 B단계에서 전술한 전체공정을 반복함으로써 993.9mg의 잔사 D' 및 693mg의 잔사 E'를 톨루엔 용출액으로부터 각각 수득한다.

C단계 : 잔사 D와 E의 칼럼 색층 분석

2.0cm 내경×30cm글렌코 칼럼을 클로로포름중의 40g의 윌름 실리카겔(0.063-0.200mm, 70-230메쉬) 용액으로 슬러리 충전시킨다. 컬럼을 중압 HPLC계에 삽입하고 클로로포름으로 평형을 유지시킨다. B단계에서의 잔사 D, D', E 및 E'를 합하고(약 3.366g), 6ml의 클로로포름중에 용해시킨다. 용액을 15ml시료 루프(loop)에 주입한다. 시료 루프를 중압 HPLC계에 삽입하고, 이 시료를 200ml의 클로로포름으로 칼럼속에 펌핑해 넣는다. 2ℓ의 선형구배의 클로로포름 대 5%메타놀의 클로로포름 용액으로 용출을 개시하여 17×117ml의 유분을 수거한다. 각 유분에서의 부분 표면(6ℓ)을 용출제로서 5%메타놀의 클로로포름용액을 사용하여 TLC로 분석하고 366nm의 광으로 현지시킨다. 유분 5와 6을 합하여 증발ㆍ건고시키면 2.166g의 잔사 F가 수득된다. 7 내지 12유분을 합하여 로타리 증발기에서 진공하에 농축ㆍ건고시킨다. 그 잔사(953mg)를 6ml의 클로로포름중에 용해시키고 클로로포름 대 1.5% 메타놀의 클로로포름 용액의 2ℓ의 선형구배를 사용하여 상기와 같이 다시 색층 분석시키면 20×100ml 유분이 수거된다. 유분 9 내지 20을 합하여 로타리 증발기에는 증발ㆍ건고시키면 860mg의 잔사 G가 수득된다.

잔사 F와 G를 합하여 클로로포름-메타놀로 재결정시키면 실시예 2에서 분리된 생성물로 같은 1.985g의 순수한 산드라마이신의 수득된다.

Claims

상당한 량의 산드라마이신이 생성되어, 배양배지에 축적될때까지, ATCC제39419호(한국기탁번호 : KFCC-10143, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁년월일 : 1985년 5월 20일)와 동일한 특성을 가지는, 산드라마이신 생성 균주인 노카르 디오이데스 신종(Nocardioides sp. nov.) 또는 이들의 돌연변이체를, 동화할 수 있는 탄소 및 질소공급원을 함유하는 배양배지중에서 침수 호기성 조건하에 배양시킴을 특징으로 하여, 다음 구조식의 항종양 항생물질 산드라마이신을 제조하는 방법 :
제 1 항에 있어서, 배양배지로부터 산드라마이신을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.