DE3521436A1 - Antitumor-antibiotikum, verfahren zu dessen herstellung und dieses antibiotikum enthaltendes pharmazeutisches mittel - Google Patents

Description

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR. VVSRNER KlNZEBACH DR. ING. WOLFRAM BUNTE ₍,_ΒΒ.-ι·7β)

REITSTÖTTER. KINZEBACH Λ PARTNER PATENTANWÄLTE POSTFACH 780. Ο-βΟΟΟ MÜNCHEN 43 ZUGELASSENE VERTRETER BEIM

EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

TELEFON Ό89Ι 2 71 SS 63 CABLES: PATMONOIAL MÜNCHEN

TELEX OS2152O8 ISAR D TELEKOP: (Ο88) 271 6O03 (GR. Il * III) BAUERSTRASSE 22. D-βΟΟΟ MÜNCHEN

München, den 14.06.1985

UNSERE AKTE ^, ₂g Q₄₃

OUR REF: '

BETREFF: RE

Bristol-Myers Company

5 Park Avenue *

New York, N.Y. 10154
USA

Antitumor-Antibiotikum, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses Antibiotikum enthaltendes pharmazeutisches Mittel

n-ROOrt μΓινγηρνι αϊ pn?rpiru τβό

M/26 04 3 . If-

Die Erfindung betrifft ein Antitumor-Antibiotikum, ein Verfahren zu dessen Herstellung und ein pharmazeutisches Mittel, das dieses Antibiotikum enthält.

Das erfindungsgemäße Antitumor-Antibiotikum ist ein cyclisches Depsipeptid und wird im folgenden als Sandramycin bezeichnet. Sandramycin kann man durch Fermentation eines neuen Mikroorganismus, Nocardioides Species-Stamm C4 9 009, ATCC 39419 herstellen. Das erfindungsgemäße Antitumor-Antibiotikum stellt einen antimikrobiellen und einen Antitumor-Wirkstoff dar. Die Erfindung ist auch auf den neuen Mikroorganismus selbst gerichtet, der bei der fermentativen Herstellung von Sandramycin eingesetzt wird.

In der US-PS 4 360 458 ist ein antibakterieller Antitumor-Komplex beschrieben, der mit BBM-928 bezeichnet ist, Diese Druckschrift beschreibt auch die Herstellung dieses Komplexes mittels Fermentation eines neuen Actinomycetes-Stammes, der mit Stamm G-455-101 (ATCC 31491) bezeichnet ist. Dieser Stamm wurde später als ein neuer Species des Genus Actinomadura bestimmt und mit Actinomadura luzonensis nov. sp. (man vergleiche J. Antibiotics, 33 (10), 1098-1102(1980)) bezeichnet.

Die Herstellung, Isolierung, Charakterisierung und Beschreibung der Antitumor-Aktivität der BBM-928 Bestandteile sind in J. Antibiotics, 33(10), 1087-1097 (1980) offenbart. Die Strukturen von 928A, B, C und D (sind neuerdings mit Luzopeptin A, B, C und D bezeichnet), welche die Hauptbestandteile des BBM-928-Komplexes dar-

M/26 043

Γ

stellen, sind in der US-PS 4 451 456 beschrieben und besitzen die folgende Strukturformeln:

H₃C CH₃

ΟΗ ;*

CH₃ H₃C C-OH CO-NH-CH₂-CO-N-Ch₂-CO-N-CH 1

C0-NH-CH-C0-N^V^OR1 CH₂

O CO

I CH-N-CO-Ch₂-N-CO-CH₂-NH-CO

HO-C CH₃ CH₃ H₃CCH₃

Luzopeptin A B C D

-COCH₃ -COCH₃

H
-COCH₂CH₃ -COCH₃

Die Luzopeptine A, B, C und D weisen Struktureinheiten auf, wie 3-Hydroxy-6-methoxychinaldinsäure als das Chromophor und 4-Hydroxy-2,3,4,5-tetrahydropyridazin-3-carbonsäure, wobei der strukturelle Unterschied zwischen den drei Komponenten lediglich in dem Ausmaß der Acetylierung der Hydroxygruppe in den Tetrahydropyridazin-Einheiten liegt.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues cyclisches Depsipeptid, das ein Antitumor-Antibiotikum darstellt und als Sandramycin bezeichnet ist und folgende Struktur-

M/26 043

G-

formel besitzt:

CH,

CH, CH, CH

0-NHCH₂-CO- N-CH₂-CO-N-CH

CO

CH₂

CH-N-Co-CH₂-N-CO-CH₂NH-CO

N-CO-CH-NHO

CH CH₁^CH,

CH,

CH,

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung, Isolierung und Reinigung von Sandramycin in im wesentlichen reiner Form.

Das antibiotische Sandramycin erhält man durch Fermentation eines neuen Mikroorganismus, der vorläufig als ein Species des Genus Nocardioides klassifiziert wird. Bei der Fermentation sammelt sich das durch diesen Mikroorganismus hergestellte Sandramycin an, das man dann aus der Kulturbrühe gewinnt. Ein bevorzugter, Sandramycin produzierender Mikroorganismus ist der Nocardioides sp.-Stamm C49 009, der aus einer in Mexiko gesammelten Bodenprobe isoliert wurde, und die Mutanten davon. Dieser Stamm ist in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der Nr. ATCC 39419 hinterlegt worden.

M/26 043

Nachfolgend ist eine allgemeine Beschreibung des bevorzugten, das Antitumor-Antibiotikum Sandramycin produzierende Mikroorganismus gegeben.

Morphologie
10

Der Stamm Nr. C49 00 9 bildet sowohl Substrat- als auch Luftmyzele (0,4 um Breite). Das Substratmyzel ist lang, gut verzweigt und fragmentiert in kurze Filamente oder nach einer Woche in Stäbchen. Der Stamm-Nr. C4 9 009

¹^ neigte dazu, bei fortgesetzter Kultivierung seine Fähigkeit zur Bildung eines Luftmyzels zu verlieren. Die Hyphen des Luftmyzels verzweigen dünn. Bei mikroskopischer Beobachtung stellt man fest, daß die Lufthyphen am Anfang eine mehr oder wenig stark ausgeprägte Zickzack-Form besitzen und sich zu langen, geraden Ketten mit Arthrosporen-ähnlichen zylindrischen Segmenten (0,5 χ 1 bis ^v3um) entwickeln, welche später mit durchsichtigen Hyphen abgetrennt werden. Die Oberfläche der sporenähnlichen Segmente ist glatt. Der stamm Nr.C49 009 ist gram-positiv und nicht säurebeständig. Ein Sporangium, motile Sporen und ein Sclerotium werden nicht beobachtet.

Zellwandzusammensetzung und Zuckerbestandteile der Gesamtzelle

Die Zellwand des Stammes Nr. C4 9 009 enthält LL-Diaminopimelinsäure und Glycin als charakteristische Aminosäurenbestandteile in der Zellwand gemäß den von B. Becker et al.inAppl. Microbiol. 13, 236-243 (1965) und

M/26 043 λ.

T. Yamaguchi in J. Bacteriol. 89, 441-453 (1965) beschriebenen Verfahren. Das Hydrolysat der gesamten Zelle enthält Glucose, Manose und Ribose, jedoch keinen diagnostischen Zucker/bestimmt nach den Verfahren, die von M.P. Lechevalier et al. in Biol. Actinomycetes Related Organisms, 11, 78 - 9 2 (1976) beschrieben sind. Die Zusammensetzung der zuvor genannten Zellwand und die Zuckerbestandteile der Gesamtzelle deuten darauf hin, daß der Stamm Nr. C4 9 009 ein Actinomycetes Species vom Zellwandtyp I ist.

Kulturelle und physiologische Charakteristika

Der Stamm Nr. C4 9 009 ist ein obligater aerober Actinomycete und wächst auf den meisten beschriebenen Medien gut. Das Luftmyzel ist auf ISP Medium Nos. 3, 5 und 7 und auf Czapek's Sucrose-Nitrat-Agar üppig bis mäßig ausgebildet, während es auf nährstoffreichen organischen Medien, wie ISP Medium Nos. 2 und 6 oder Bennett's Agar spärlich ausgebildet ist. Das Luftmyzel besitzt eine weiße Farbe. Melanoide oder andere eindeutige Pigmente werden auf allen bisher untersuchten beschreibenden Medien nicht produziert. Die Rückseitenfarbe des vegetativen Myzels ist geringfügig gelblich. Der Stamm wächst bei 28°C optimal und bei 15°C und 37°C mäßig, jedoch bei 5°C und 45 C nicht. Gelatine und Stärke werden zersetzt. Die Tyrosinasereaktion ist negativ. In Gegenwart von 7% NaCl oder 0,01 % Lysozym wird das Wachstum inhibiert. Die kulturellen und physiologischen Charakteristika des Stammes Nr. C49 009 sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Der Stamm Nr. C4 9 009 verwertet die meisten Zucker zum Wachstum. Die Ver-

Μ/26. Ό43

c Wertung der Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 1

Kulturelle Charakteristika des Stammes Nr. C4 9 009*

15 Trypton-Hefe-Extraktbrühe (ISP Nr. 1) G: mäßig; flockige, schwachgelbe

Sedimente D: kein

Sucrose-Nitrat-Agar 20 (Czapek¹s Agar) G: üppig

R: gelbweiß (92)*** bis dunkelgräulichgelb (91) A: mäßig, weiß (263) D: schwachgelb (87)

2 5 Glucose-Asparagin -Agar

Glycerin-Asparagin -Agar (ISP Nr. 5)

G: gering R: gelblichweiß (92) bis blaßgelb (89)

A: gering, weiß (263) D: keine

G: mäßig R: hellgelb (86) bis schwachgelb (87)

A: mäßig, weiß (263) D: kein

M/26

Fortsetzung Tabelle 1

352U36

Anorganische Salze/Stärke-Agar (ISP Nr. 4)

Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7)

G: mäßig

R: blaßgelb (89) bis schwachgelb (87)

A: gering, weiß (263) D: kein

G: üppig R: blaßgelb (89) bis dunkelgelb (88)

A: mäßig, weiß (263) D: kein

Nähragar

G: mäßig

R: blaßgelb (89)

A: mäßig, weiß (263)

D: kein

Hefeextrakt - Malzextrakt· Agar (ISP. Nr. 2)

G: üppig

R: blaßgelb (89) bis schwachgelb (87)

A: gering, weiß (263) D: kein

Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3)

G: mäßig

R: gelblichweiß (92) bis schwachgelb (87)

A: mäßig, weiß (263) D: kein

35 2 H36

M/26

-M-

Fortsetzung Tabelle 1

° Bennett's Agar

G: mäßig

R: blaßgelb (89) bis dunkelgelb (88)

A: kärglich bis gering, weiß (263)

D: kein

Pepton-Hefeextrakt-Eisen-igar (ISP Nr. 6)

G: gering R: schwach-orangegelb (73) bis

hell-orangegelb (70) A: kärglich, weiß (263) D: kein

²⁰ beobachtet nach 3-wöchiger Inkubation bei 38⁰C

Abkürzungen: G = Wachstum (growth)

R = Rückseitenfarbe (reverse color) A = Luftmyzel (aerial mycelium) 25 D= diffusionsfähiges Pigment (diffusible pigment)

die in den Klammern angegebenen Farben und Zahlen beziehen sich auf den Farbstandard in "Kelly, K.L. und D.B. Judd: ISCC-NBS color-name charts illustrated with Centroid colors. U.S. Dept. of Comm. Cir. 553, Washington, D.C., Nov., 1975".

M/26 043

/ο
■Jit

Tabelle 2

Physiologische Charakteristika des Stammes Nr. C49 009

Test

Ansprechen

Verwendetes Verfahren oder Medium

Temperaturbereich des
Wachstums

maximales Wachstum bei
28⁰C; mäßiges Wachstum
bei 15°C und 37⁰C; kein
Wachstum bei 5⁰C und
45⁰C.

Bennett's Agar

Gelatineverflüssigung

verflüssigt 1% Malzextrakt, 0,4% Hefeextrakt, 0,4% Glucose, 20% Gelatine

Stärkehydrolyse

Reaktion in Magermilch

hydrolysiert koaguliert Stärke-Agar-Platte

Difco-Magermilch

Bildung melanoider
Pigmente

negativ Tyrosin-Agar; Pepton-HefeextrakteiserrAgar und Trypton-Hefeextraktbrühe

Tyrosinasereaktion

Nitratreduktion

negativ negativ Arai's-Verfahren

Czapek's Sucrose-Nitratbrühe

M/26 043

.fib ■

352U36

Fortsetzung Tabelle 2

Test

Ansprechen Verwendetes Verfahren oder Medium

Nitratreduktion

pH-Toleranz

negativ

Wachstum bei pH 5,0 bis pH 10,5. Kein Wachstum bei pH 4,5. 0,5% Hefextrakt, 1% Gluose, 0,5% KNO,, 0,1% CaCO₃

Hefeextrakt-Malzextrakt

Toleranz gegenüber NaCl

Wachstum bei 5% NaCl oder weniger. Kein Wachstum bei 7% NaCl. Basalmedium: 1% Hefeextrakt, 2% lösliche Stärke, 1,5% Agar

Toleranz gegenüber Lysozym

empfindlich, jedoch teilweise resistent (Wachstum einiger Kolonien bei 0,01% Lysozym)

Trypticase-Sojabrühe + 1,5% Agar

Arai, T. und Y. Mikami, "Chromogenicity of Streptomyces", Appl. Microbiol., 23, 402-406 (1972)

M/26 043 ·fi\-

Tabelle 3

Verwertung von Kohlenhydrate durch den Stamm C49 009

Glycerin +

D(-)-Arabinose +

L (+)-Arabinose

D-Xylose +

D-Ribose +

L-Rhamnose +

D-Glucose +

D-GaI ac to se +

D-Fructose +

D-Mannose + L (-)-Sorbose

Sucrose +

Lactose +

Cellobiose +

Melibiose +

Trehalose +

Raffinose +

D(+)-Melezitose +

lösliche Stärke ⁺ Cellulose
Dulcit

Inosit +

D-Mannit + D-Sorbit Salicin

beobachtet nach 3-wöchiger Inkubation bei 28⁰C.

Basalmedium: Pridham-Gottlieb's anorganisches Medium Abkürzungen: +: positive Verwertung, -: negative Verwertung

M/26 043 . _

Taxonomie

Der Stamm Nr. C49 009 ist charakterisiert durch seine gram-positive Reaktion, seine nicht säurebeständige Natur, Fragmentierung des Substratmyzels, Bildung eines

¹^ weißen Luftmyzels, Arthrosporen-ähnlicher Segmentierung in Gesamtteile des Luftmyzels und Fehlen der Fähigkeit zur Bildung von eindeutigen Pigmenten. Diese Charakteristika sowie die Tatsache, daß LL-Diaminopimelinsäure und Glycin ,jedoch kein diagnostischer Zucker, in der Zellwand vorhanden sind, ermöglichen es, den Stamm Nr. C49 009 dem Genus Nocardioides (H. Prauser, Intl. J. Syst. Bacteriol., 26, 58-65 (1976)) zuzuordnen. Der Stamm Nr. C49 009 unterscheidet sich von den Luftmyzel bildenden Nocardioform Actinomycetes, inklusive Norcardiopsis dassonvillei, Saccharopolyspora hirsuta und allen hetereologen Species des Genus Nocardia, hinsichtlich der diagnostischen Aminosäure oder des diagnostischen Zuckers der Zellwand und hinsichtlich der diagnostischen physiologischen Eigenschaften wie beschrieben von R.E.

Gordon et al, J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978) und wie in der Tabelle 4 gezeigt. Der Stamm Nr. C49 006 unterscheidet sich vom Genus Streptomyces ferner hinsichtlich seiner sporogenen Morphologie vom Nocardiae-Typ. So fragmentieren beispielsweise die Substrathyphen des Stammes Nr. C49 009 in kurze Filamente oder Stäbchen. Die Arthrosporen ähnlichen Segmente des Stammes Nr. C49 009 sind von den Sporen von Streptomyces hinsichtlich der Stelle der Bildung, des Arrangements in der Hyphenhülle und der Abwesenheit einer eindeutigen Sporenwand unterscheidbar.

M/26 043

Tabelle 4

Diagnostische physiologische Charakteristika

des Stammes C49 009
10

Säurebeständigkeit

Zersetzung von:
Adenin

Casein +

Hypoxanthin

Tyrosin +

Harnstoff

Xanthin

Beständigkeit gegenüber:
Lysozym
Rifampicin +

Hydrolyse von:

Aesculin +

Hippurat +

Stärke +

Säure aus:

D(-)-Arabinose +

L(+)-Arabinose

352H36

) M/26 043 _n

Fortsetzung Tabelle

Erythrit Glucose Inosit Lactose D-Melezitose IQ Melibiose Methyl- ci-Glucosid Raffinose

Verwertung von: 5 Benzoat Citrat Mucat Succinat Tartrat

Nitrit aus Nitrat

überleben bei 5O⁰C, 8 Stunden

Abkürzungen: +: positives Charakteristikum -: negatives Charakteristikum

Das Sensitivitätsprofil gegenüber einer Reihe von Taxon-spezifischen Phagen unterscheidet die Stämme des Genus Norcardioides von den verwandten Genera, wie Streptomyces oder Norcardia (man vergleiche H. Prauser, Host phage relationships in nocardioform organisms; "In the Biology of the Nocardiae", Edit. M. Goodfellow et al, London, New York und San Francisco, Academic Press (1976)).

3521A36

M/26 04 3

Die Sensisivität des Stammes Nr. C49 009 gegenüber diesen Actinophagen wurde nicht untersucht, da diese Phagen nicht zur Verfügung standen. Auf Basis der kulturellen und physiologischen Charakteristika wurden die 17 Stämme des Genus Norcardioides, die aus Bodenproben isoliert worden waren, welche an verschiedenen Plätzen der Welt gesammelt wurden, einem einzelnen Species, Norcardioides albus, zugeordnet. Der Stamm Nr. C4 9 009 unterscheidet sich von Norcardioides albus in Bezug auf die Verwertung von L-Arabinose und Inosit, ist jedoch Norcardioides albus hinsichtlich der Gesamtheit der kulturellen und physiologischen Charakteristika ähnlich. Der Stamm Nr. C49 009 wurde daher vorläufig als ein Species des Genus Norcardioides klassifiziert.

°ie vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung des bestimmten Stammes Nr. C49 009 oder auf Organismen beschränkt, welche unter die oben angegebene Beschreibung fallen. Erfindungsgemäß sind auch weitere Sandramycinproduzierende Stämme oder Mutanten dieser Organismen umfaßt, die aus dem beschriebene Organismus gemäß bekannten Verfahren, beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, Behandlung mit Stickstofflost, Ausetzen gegenüber Phagen und dergleichen, produziert werden können.

Produktion des Antibiotikums

Sandramycin stellt man her, indem man Norcardioides sp. Stamm Nr. C49 009 (ATCC 39419) oder einen Mutanten davon in einem üblichen Nährmedium kultiviert. Den Organismus

ι/ 352H36

M/26 043

Ά-

zieht man in einem Nährmedium, das bekannte Nährquellen, d.h. assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewünschtenfalls anorganische Salze und andere bekannte Wachstumfaktoren, enthält. Vorzugsweise arbeitet man bei submersen aeroben Bedingungen, um große Mengen des Antibiotikums herzustellen, obwohl man zur Herstellung geringerer Mengen auch Oberflächenkulturen und Flaschen einsetzen kann.

Das Nährmedium sollte eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Glucose, Sucrose, Mannose, Fructose, Maisstärke, Maltose, Mannit, Molassen und dergleichen, entweder in gereinigter oder in roher Form enthalten. Das Nährmedium sollte auch eine oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen, wie beispielsweise Sojabohnenmehl, Fischmehl, Maisextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamen- Embryomehl, Sojamehl, Leinsamenmehl, Baumwollsamenmehl, Casein, hydrolysierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff und dergleichen, enthalten. Anorganische Nährsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat und Spuren von Schwermetallsalzen, wie Kupfer, Zink, Mangan, Eisen und dergleichen, können ebenfalls zu dem Nährmedium hinzugefügt werden.

Die Fermentationstemperatur soll zwischen 15⁰C bis etwa 27⁰C, vorzugsweise zwischen etwa 25°C und etwa 30⁰C, liegen. Der pH des Fermentationsmediums sollte zwischen etwa 5 bis 10,5 und vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 8,5 liegen. Gewöhnlich erhält man eine optimale Produktion

3g von Sandramycin nach etwa 2 bis 9 Tagen, je nach der

M/26 043

- 20·

Temperatur. Führt man eine Tankfermentation durch, dann ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe zu produzieren, indem man das Medium der Brühe mit einer Schräg-/oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des Mikroorganismus impft. Nach-

Q dem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten halt, transferiert man es aseptisch zum Medium des Fermentationstanks.

,c Isolierung von Sandramycin

Nachdem die Fermentation vollständig ist, gewinnt man

Sandramycin aus dem Kulturmedium und isoliert es in einer

im wesentlichen reinen Form nach dem nachstehend erläuterten nährstufigen Verfahren.

M/26 043 352U36

Gesamte Ferraentationsbrühe

1) Extrahieren mit Ethylacetat

2) Vermischen mit Diatomeenerde, Filtrieren

3) Abtrennen der Phasen und Verdampfen

Verbrauchte
wässrige Phase

Skellysolve B-Phase, verwerfen

Roher antibiotischer Extrakt

1) Extrahieren mit wässrigem Methanol und Skellysolve B und Trennen der Phasen

Wasser-Methanol (1:9)-Phase

1) Verdünnen mit Wasser

Wasser-Methanol (1:3)-Phase

T) Extrahieren mit Tetrachlorkohlenstoff und Verdampfen

Rückstand A Wasser-Methanol (1:3)-Phase

1) Verdünnen mit Wasser

M/26 043

-2Θ

Wasser-Methanol (7:13)-Phase

1) Extrahieren mit Chloroform und und Verdampfen

Rückstand B

Wasser-Methanol (7:13) Phase, verwerfen

1) Säulenchromatographie der Rückstände A und B unter Verwendung eines Diatomeenerdeträgers

2) Toluolfraktion-Verdampfen

Y Rückstand C

1) Silikagel-Chronatographie

2) Elution mit einem linearen Gradienten

Sandramycin

1) ümkristallisation

gereinigtes Sandramycin

352U36

M/2.6 043 η

Nachstehend wird obiges Schema näher erläutert.

Die gesamte Brühe der Fermentation von Norcardioides sp. Stamm Nr. C49 009 extrahiert man zuerst mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und vorzugsweise mit Ethylacetat. Vorzugsweise gibt man eine Filterhilfe, wie Dicalit (Handelsname der Grefco Inc., Torrance, Ca., für Diatomeenerde) zu der Extraktionsmischung zu und filtriert die Mischung dann, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Nach dem Filtrieren trennt man die organische Phase von dem Filtrat der Extraktionsmischung und konzentriert durch Verdampfen, wobei man den Rohextrakt dieses Antibiotikums erhält. Den Rohextrakt verteilt man zwischen einem aliphatischen Kohlenwasserstoff lösungsmittel , wie Skellysolve¹B (Handelsname Skelly Oil Co. für isomere Hexane) und etwa 10% Wasser in Methanol. Die wässrige Methanolphase verdünnt man mit weiterem Wasser und extrahiert die erhaltene, etwa 25% Wasser enthaltene Methanollösung mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Tetrachlorkohlenstoff. Die wässrige Methanolphase verdünnt man weiter mit Wasser und extrahiert die erhaltene, etwa 35% Wasser enthaltene Methanollösung mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform. Die Tetrachlorkohlenstoffextrakte vereinigt man und engt im Vakuum zum Rückstand A ein.

Die Chloroformextrakte vereinigt man und engt im Vakuum zum Rückstand B ein. Die Rückstände A und B vereinigt man und chromatographiert an einer Säule, die Diatomeenerde, beispielsweise Dicalit, enthält, wobei man organische Lösungsmittel mit einer niedrigen bis hohen Polarität verwendet. Die geeigneten, das Antibiotikum enthaltenden Fraktionen, vereinigt man und engt im Vakuum

3521

Μ/26 043

zum Rückstand C ein. Den Rückstand C kann man mittels Flüssigkeits-Chromatographie an einer Silikagel-Säule bei niedrigem Druck weiter reinigen. Die Rückstände D, D¹, E und E¹ kann man mittels HPLC bei mittleren Druck weiter reinigen. Dies ist nachstehend im Beispiel 3, Stufe C beschrieben, wobei man unter Einsatz eines linearen Gradienten von Chloroform bis 5% Methanol in Chloroform als Eluierungsmittel arbeitet. Die geeigneten Fraktionen engt man zur Trockne ein und erhält Sandramycin. Nach ümkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittelsystem erhält man reines kristallines Sandramycin.

Struktur von Sandramycin

25

Sandramycin ist cyclisches Depsipeptid mit Antitumor-Eigenschaften und antibiotischen Eigenschaften, das einen 3-Hydroxychinolinkern als Chromophor und eine Pipecolinsäureeinheit enthält. Auf Basis der Spektraldaten und anhand der chemischen Analyse wurde Sandramycin die folgende Strukturformel zugeordnet:

CH,

CH, CH,

CK CH₁

1 CO-NHCH₂-CO- N-CH₂-CO-N-CH

CONH-CH-CO-N CH,

CO

CH-N-CO-CH₂-N-CO-Ch₂NH-CO CH, CH,

αί, CH,

Μ/26 043 ,,

Sandramycin ist ein weißer kristalliner Feststoff mit einem Schmp. von 208 bis 212°C mit folgender Bruttoformel: ^C6o^H76°16^N12 ^un(^ einem Molekulargewicht von 1221.3312. Es ist aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff zusammengesetzt. 10

Die Elementaranalyse ergab folgendes:

Analyse für C_cr.E_ncO. ,N_{1 o} ·8Η_ο0 bU /bib u ζ

	C	,78	6	H	12	N	O (durch	Differenz)
berechnet:	52	,58	6	,79	12	,31	28	,12
gefunden:	52		,27	,29	28	,86

Ein Massenspektrum mit hoher Auflösung von Sandramycin wurde mit Hilfe eines Kratos MS-50-Spektrometers und mittels FAB-Ionisation aufgenommen. Es wurde folgende Masse bestimmt:

berechnet für {M+H)⁺-Ion: 1221.5579 gefunden für (M+H)⁺-Ion: 1221.5571

Das von einem KBr-Pressling aufgenonmene Infrarotspektrum von Sandramycin zeigt charakteristische Banden bei folgenden Frequenzen (ausgedrückt in cm ):

3500, 3340, 2970, 2940, 2880, 1748, 1660, 1640, 1598, 1520, 1468, 1445, 1420, 1336, 1290, 1265, 1235, 1172, 1138, 1092, 1055, 1018, 922, 885, 855 und 838.

^ 352U36

M/26 043

Das UV-Absorptionsspektrum von Sandramycin wurde in Methanol (0,01798 g/l) bei neutralen, sauren und basischen Bedingungen aufgenommen. Es wurden die Absorptionsmaxima und das Absorptionsvermögen bestimmt:

^Amax ⁱⁿ

in CH₃OH : 356(8.1), 296(7.5), 229(62.8), 217(63.7) in CH OH-HCl : 356(8.3), 306(8.1), 228(58.4), 210(62.3) in CH OH-NaOH : 395(9.2), 301(7.2), 246(59.8).

Ein Protonen-NMR-Spektrum von Sandramycin (gelöst in Deuterochloroform) wurde mit einem Bruker WM-360 Spektrometer bei 360 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard aufgenommen. Es wurden folgende chemische Verschiebungen (6-Werte) und Kopplungskonstanten (J-Werte in Hz) gefunden. Ferner sind die Muster beschrieben:

11.75(s, 2H, Ar-OH), 9.58(d, J=6.39, 2H, Ser NH), 8.55(bs, 2H, GIy NH), 7.82(bs, 2H, Ar-H⁸), 7.72(m, 2H, Ar-H⁵), 7.63(s, 2H, Ar-H⁴), 7.52(m, 4H, Ar-H⁶ _und Ar-H⁷), 5.60 (m, 2H, aHvon RLp.), 5.56(d, J=17.58, 2H Sar ctCH) , 5.28(m, 2H, Ser aCH) , 5.01(d, J=12.79, 2H, ser BCH), 4.88(d, J=12.79, 2H, val aCH), 4.45(bd, J=12.79, 4H, ser BCH und _Gly <*CH) , 4.07(bd, J=15.99, 4H, ε Η von Pip. und Gly aCH) , 3.76(bd, J=12.79, 2H, εΗ von Pip.) , 3.58 (d, J=17.58, 2H, sar CH), 3.14(s, 6H, N-CH₃), 2.96(s, 6H, N-CH ), 2.06(m, 2H, VaI BCH), 1.82(bs, 4H, ßCH und Pip.), 1.68(bm, 4H, von Pip.), 1.57 (bm, 4H, 6CH von Pip.), O.'94(d, J=6.37, 6H, VaI-CH₃), 0.80(d, J=6.37, 6H, VaI-CH₃).

« 352H36

M/26 043

^λ1

Ein C-NMR-Spektrum von Sandramycin (gelöst in Deutero chloroform) wurde mit einem Jeol FX90Q-Spektrometer bei

22,5 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als 5

interner Standard aufgenommen. Es wurden die folgenden chemischen Verschiebungen (ppm-Werte) aufgenommen, wobei jede chemische Verschiebung für 2 Kohlenstoffatome steht. Die Zuordnung ist wie folgt:

Nr.	Chemische Ver	Zuordnung	Carbonyl	C-3
	schiebung (ppm)		Carbonyl	C-2
1	171.73	Carbonyl	C-8a
2	168.54	Carbonyle	C-4a
3 ·	168.37	Carbonyl	C-8
4,5	166.91, 166.91	3-Hydroxychinolin	C-7
6	165.39		C-5
7	153.04		C-6
8	140.64		C-4
9	133.87		aCH
10	131.22		ßCH
11	128.61		YCH3
12	127.64		YCH3
13	126.23		NCH3
14	125.58	N-Methyl-valin	aCH2
15	119.45		aCH
16	61.43		N-CH3
17	27.90		aCH
18	18.58
19	17.82	Glycin
20	29.42	Sarcosin
21	49.79
22	41.02	Serin
23	34.08
24	51.74

M/26 043 -28"

Nr. Chemische Ver- Zuordnung Schiebung (ppm)

SCH₂

Pipecolinsäure aCH

ß-CH.

25	61.11
26	48.49
27	27.90
28	19.34
29	24.11
30	43.07

C-CH₂

Sandramycin unterscheidet sich in Bezug auf folgende Strukturmerkmale von den Luzopeptinen A, B und C. Sandramycin enthält 3-Hydroxychinaldinsäure und Pipecolinsäureeinheiten anstatt der 3-Hydroxy-6-methoxychinaldinsäureund den in4-Stellung substituierten Tetrahydropyridazin-S-carbonsäure-Gruppen.

Biologische Aktivität von Sandramycin

Die antibakterielle Aktivitäten von Sandramycin wurden mit Hilfe der Serien-Zweifach-Agar-Verdünnungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt und den Aktivitäten von Luzopeptin A und Echinomycin gegenübergestellt. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, inhibiert Sandramycin gram-positive Organismen, wie Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus sowie Streptococcus faecalis, stark.

352H36

M/26 043 _7A

Tabelle 5

Antimikrobielle Aktivität von Sandramycin

Minimale inhibierende Konzentration (MIC) 10

Testorganismus Sandramycin Luzopeptin A Echinomycin

JL subtilis (Rec. +)

A22508-2 0.024 0.195 0.049

B. subtilis (Rec.-)

A22509-2-2	0.012	0.049	*	12.5	<0.003
S. aureus 209P-A9497	0.012	0.098	0.012
S. aureus (Echinomycin
re si stent) A9628	0.098	0.098	0.78
Strep, faecalis A9611	0.024	0.195	0.012
L·. coli A15119-	12.5	12.5	12.5
L·. colJr (Actinomycin
sensitiv ) A21780
(AS-19)	12.5	6.25

Sandramycin wurde auch gegenüber transplantierbaren

Mäusetumoren (P-388 Leukemia) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Die verwendete Methodologie folgt im wesentlichen den Richtlinien des National Cancer Institute (Cancer Chemotherapy Rep. Part 3,3, 1-103 (1972)). Die wesentlichen experimentellen Details sind am Ende der Tabelle 6 aufgeführt. Die Tests wurden

M/26 043

2% -ΙΟ

bei zwei unterschiedlichen Dosierungsschemata durchgeführt: Einzelne Dosis am Tag 1 bzw. täglich 5 Tage lang. Die optimale Dosis scheint bei beiden Dosierungen bei etwa 0,2 mg/kg/Injektion zu liegen.

10	Tabelle 6	MST Tage	Wirkung MST % T/C	AWC g Tag 4	über lebende Tag 5
		-toxisch 11.5	toxisch 128	-2.8 -1.3	0/6 6/6
Ver- binduna		10.0	111	-1.6	6/6
Sandramycin		11.0	122	-0.7	6/6
	Wirkung von Sandramycin auf P-388 Leukemia	14.5	161	-1.4	6/6
	Dosis, ΊΡ Behandlungs plan ' mq/kq/inj.	11.0	122	-0.9	6/6
	d.1 3.2 1.6	10.0	111	-0.6	6/6
	0.8	9.5	106	-0.2	6/6
	0.4	toxisch 6.0	toxisch 67	-1.7 -1.4	2/6 5/6
	0.2	11.0	122	-1.3	6/6
Sandramycin	0.1	12.0	133	-1.7	5/6
	0.05	11.5	128	-0.8	6/6
	0.025	8.5	94	-1.8	6/6
	d. 1 ->5 1.6 0.8	10.0	111	-1.4	5/5
	0.4	10.5	117	-0.9	6/6
	0.2	9.0		0.2	10/10
	0.1
Kontrolle	0.05
0.025
0.0125
Kochsalz lösung

M/26 043

352H36

5 TumorinokuIum: Wirt:
Bewertung:

Wirkung:

Kriterien AWC:

10 -AscitESzellen implantiert i.p.

weibliche CDF₁-Mäuse

MST - Mittlere Überlebenszeit (median

survival time) % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle)

χ 100 % T/C = 125 wurde als signifikante

Antitumor-Aktivitat betrachtet durchschnittliche Gewichtsänderung (behandelt/Kontrolle) in g am Tag 4 (average weight change)

Aus obigen antimikrobiellen Daten und den Daten, die anhand von Tumoren bei Mäusen ermittelt wurden, geht her-2Q vor, daß Sandramycin als Antibiotikum und auch als Antitumormittel zur Inhibierung maligner Tumore, wie P-388 Leukemia, bei Säugetieren wirksam ist.

Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische Mittel, die Sandramycin gegebenenfalls zusammen mit einem inerten pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthalten. Sandramycin ist dabei vorzugsweise in einer wirksamen antimikrobiellen oder Tumor-inhibierenden Menge vorhanden. Diese Mittel können auch andere wirksame antimikrobiell oder Antitumor-Wirkstoffe enthalten und können in jeder für den gewünschten Verabreichungsweg geeigneten pharmazeutischen Form vorliegen. Als Beispiele derartiger Mittel kann man feste Mittel zur oralen Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate; flüssige Mittel zur oralen Verabreichung, wie

*> 352H36

^M/26 °⁴³ u

Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elexiere; und Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, nennen. Die Mittel können auch als sterile, feste Mittel formuliert werden, die in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen, injizierbaren Medium kurz vor der Verwendung gelöst werden können.

Bei Verwendung als antimikrobiellen Wirkstoff verabreicht man Sandramycin oder ein Sandramycin enthaltendes pharmazeutisches Mittel derart, daß die Konzentration des aktiven Bestandteils größer ist als die für den bestimmten zu behandelten Organismus erforderliche minimale Konzentration. Setzt man Sandramycin als Antitumor-Wirkstoff zur Behandlung eines bestimmten Säugetieres (Mensch oder Tier) ein, dann kann der Fachmann ohne Schwierigkeiten die optimalen Dosierungen und Dosierungsschemata für Sandramycin bestimmen. Dabei ist natürlich zu berücksichtigen, daß die eingesetzte Sandramycin-Dosis von der eingesetzten Formulierung, der Verabreichungsart, dem bestimmten Situs, dem Wirt und der zu behandelnden Krankheit abhängt. Dabei sind viele Faktoren zu berücksichtigen, wie Alter, Gewicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Verabreichungsweg, Ausscheidungsrate, Zustand des Patienten, Arzneimittelkombinationen, Empfindlichkeiten und Schwere der Krankheit.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Skellysolve B ist ein im Handel erhältliches Petrolether-Lösungsmittel (Skelly Oil Co.), das isomere

M/26 043 ,_s3.

Hexane aufweist und einen Sp. von 60 - 69°C besitzt. Dicalit ist eine Diatomeenerde, die von Grefco, Inc., Torrance, California hergestellt wird. Alle Temperaturangaben beziehen sich auf ⁰C, soweit nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Fermentation von Sandramycin

A. Schüttelflaschen-Fermentation

Nocardioides sp. Stamm Nr. C49 009, ATCC 39419, wurde in Kultur-Teströhrchen am Leben erhalten und auf Agarschrägkultüren aus Hefe-Malzextraktagar transferiert. Dieses Medium besteht aus 4,0 g Glucose, 4,0 g Hefeextrakt, 10,0 g Malzextrakt und 20,0 g Agar, aufgefüllt mit entsalztem Wasser auf 1 1. Nach jedem Transfer wurde die Agarschrägkultur 7 Tage bei 27°C inkubiert. Zur Herstellung eines Inokolums für die Produktionsphase wurde das gewachsene Myzel von der Schrägkultur in ein 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, der 100 ml eines sterilen Mediums enthielt, das aus 30,0 g Glucose, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Baumwollsamen-Embryomehl und 3,0 g CaCOot aufgefüllt mit entsalztem Wasser auf 1 1, bestand . Diese vegetative Kultur wurde 48 Stunden bei 27°C auf einem Schüttler (Gyrotory tier shaker; Model G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.; einge-

M/26 043 -3^.

stellt auf 210 U/m, einen Kreis mit einem Durchmesser von 5,1 cm beschreibend) inkubiert. 4 ml der vegetativen Kultur wurden in einen· 500 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert, der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums enthielt, das aus 20,0 g Sucrose, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Leinsamenmehl und 5,0 g CaCO₃, aufgefüllt mit entsalztem Wasser auf 1 1, bestand . Die Produktionskultur wurde auf einem Schüttler, der auch für die vegetative Kultur eingesetzt worden war, bei 250 U/m und 27°C inkubiert. Nach 96 Stunden wurde die Produktionskultur aufgearbeitet, um Sandramycin zu isolieren.

B. Bench-top-Fermentation

Zur Herstellung von Sandramycin in einem Bench-top-Fermenter überführt man 400 ml der im Beispiel 1A beschriebenen vegetativen Kultur mit 10 1 eines Produktionsmediums, das 40 g Maisstärke, 20 g Leinsamenmehl, 1 g (NH₄J₂SO₄ und 5 g CaCO₃ pro 1 entsalztem Wasser enthält, in einen Fermenter (Microgen Model SF-116, New Brunswick Scientific Co., Inc.). Die Temperatur wurde bei 27°C gehalten. Es wurde mit 300 U/m geschüttelt. Die Luftflußrate betrug 8 l/min. Es wurde 202 Stunden inkubiert. Danach wurde Sandramycin aus der Kultur isoliert.

C. Tank-Fermentation

Für die Herstellung von Sandramycin mit einer Pilotanlage wurden 2 1 der vegetativen Kultur (hergestellt nach dem im Beispiel 1A beschriebenen allgemeinen Verfahren) in einen Fermenter überführt, der 30 1 eines Produktions-

352H36

ι Μ/26 043

-U-

mediums enthielt, das aus 40 g Maisstärke, 20 g Leinsamenmehl, 1 g (NH₄J₂SO₄ und 5 g CaCO₃ pro 1 entsalztem Wasser bestand . Die Temperatur betrug 26,5°c; die Luftflußrate 80 l/min. Es wurde mit 375 U/min, geschüttelt. Der Rückdruck betrug 1 Atmosphäre. Nach 183 Stunden wurde die Tank-Fermentation aufgearbeitet, um Sandramycin zu isolieren.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung von Sandramycin

Stufe A: Extraktion

Die gesamte Brühe (**> 8 1) der Rohfermentation wurde in einen 20 1 Polyethylentank (oberer Durchmesser 58 cm, Bodendurchmesser 44 cm, 55 cm hoch) überführt, der am

Boden mit einem Hahn ausgestattet war. Ein gleiches 25

Volumen Ethylacetat wurde zugegeben. Die Mischung wurde mit einem mit Luft angetriebenen Rührer bei einer guten Mischungsgeschwindigkeit 30 Minuten gerührt. Etwa 6 (2 kg) Dicalit wurden zugegeben und vermischt. Die Mischung wurde auf ein Dicalit-Kissen gegeben, das sich

in einem Büchner-Trichter Nr. 12 befand. Das Filtrat wurde in einer 19-1-Flasche gesammelt, die mit einem Vakuumanschluß ausgestattet war. Der Filterkuchen wurde mit 2 1 Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde in einen 20 1 Scheidetrichter gegeben, so daß sich die Phasen trennen konnten. Der Ethylacetatextrakt wurde entfernt

352H36

M/26 043 ^

und in einem Umlaufverdampfer aus Glas (Laboratoriumsgröße), der mit einem kontinuierlichen Zulauf ausgestattet war, auf etwa 1 1 konzentriert. Das Konzentrat wurde weiter in einem Rotationsverdampfer im Vakuum zu einem viskosen öl eingeengt. Ausbeute 1,94 g an Rohextrakt.

Stufe B: Flüssig-Flüssig-Verteilung des Rohextraktes

Der in Stufe A erhaltene Rohextrakt (1,94 g) wurde in einer Mischung aus 200 ml Methanol und 200 ml Skellysolve B gelöst. Die zweiphasische Lösung wurde in einen 1 1 Scheidetrichter überführt und mit 22 ml Wasser verdünnt. Nach Schütteln konnten sich die erhaltenen Phasen voneinander trennen. Die wässrige Methanolphase (untere Phase) wurde in einen zweiten 1 1 Scheidetrichter überführt und zwei weitere Male mit 200 ml Aliquots Skellysolve B extrahiert. Die Skellysolve B war zuvor mit einem gleichen Volumen von 10% Wasser in Methanol gesättigt worden. Die wässrige Methanolphase wurde mit 44 ml Wasser verdünnt und 3 χ mit 200 ml Tetrachlorkohlenstoff extrahiert.

Der Tetrachlorkohlenstoff war zuvor mit einem gleichen Volumen von 25 % Wasser in Methanol gesättigt worden. Die wässrige Methanolphase wurde mit 41 ml Wasser verdünnt und 3 χ mit 200 ml Chloroform extrahiert. Das Chloroform war zuvor mit einem gleichen Volumen von 35% Wasser in Methanol gesättigt worden. Die Tetrachlorkohlenstoffextrakte wurden vereinigt und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt, Ausbeute 59 5 g an Rückstand A. Die Chloroformextrakte wurden vereinigt und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt, Ausbeute 458 g an Rückstand B.

M/26 043 Z\

Stufe C; Verreibung der Rückstände A und B

Die in Stufe B erhaltenen Rückstände A (547 mg) und B (389 mg) wurden vereinigt und in 30 ml aus 2 Teilen Chloroform-1 Teil Methanol gelöst. 17,4 g Dicalit wurde zu der Lösung hinzugegeben. Dann wurde eine Aufschlämmung hergestellt, in dem 200 ml Skellysolve B zugegeben wurden. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers abgezogen. Das zurückbleibende Pulver wurde in 500 ml Toluol aufgeschlämmt und in eine Flash-Chromatographie-Säule gepackt (4,1 cm Innendurchmesser χ 45,7 cm). Das Dicalit wurde unter Druck (N₂~5,7 psi) in ein Bett gepackt. Sobald das zum Packen verwendete Lösungsmittel die Bettoberfläche erreichte, wurde der Fluß gestoppt und der Druck aus der Säule abgelassen. Eine Schicht aus Ottawa-Sand ( ^ 2 cm) wurde auf die Oberfläche gegeben. Die Säule wurde dann mit Hilfe unter Druck stehenden Stickstoffs mit den folgenden elutropen Lösungsmitteln eluiert: Toluol (500 ml); Diethylether (500 ml); Methylenchlorid (500ml ); Chloroform (500 ml).; Ethylacetat (500 ml); Acetonitril (500 ml); Tetrahydrofuran (50 0 ml) und Methanol (500 ml). Das Toluol-Eluierungsmittel und das zum Packen verwendete Filtrat wurden vereinigt ( r-y 1 1) und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt, Ausbeute 0,699 g an Rückstand C.

Stufe D: Säulenchromatographie des Rückstandes C

Eine 2,0 cm Innendurchmesser χ 30 cm Glenco-Säule wurde in Form einer Aufschlämmung mit 37 g Woelm-Silikagel

M/26 043 - IQ, -

(0,060-0,200 mm; 70-230 mesh (0,21 - 0,06mm lichte Maschenweite)) in Chloroform gepackt. Der Rückstand C (0,699 g) aus Stufe C wurde in 5 ml Chloroform gelöst und oben auf die Säule gegeben. Die Probe konnte in das gepackte Bett perkolieren. Das Leervolumen zwischen dem Kolonnenkopf und dem Silikagelbett wurde mit Standard-Ottawa-Sand gefüllt. Die Säule wurde mit einem Glenco-Gradienten-Elutions-Apparat verbunden. Es wurde mit 2 unter Verwendung eines linearen Gradienten (beginnend mit Chloroform; zum Schluß 5 % Methanol in Chloroform) eluiert, wobei 20 χ 100 ml Fraktionen gesammelt wurden. Jede Fraktion wurde in einem Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 3 ml aus 2 Teilen Chloroform- 1 Teil Methanol gelöst. Aliquots (2 μΐ) jeder Fraktion wurden auf Analtech-Silikalgel GHLF-Dünnschichtchromatographieplatten (TLC) gegeben. Die Platten wurden mit 5% Methanol in Chloroform eluiert. Die Sichtbarmachung erfolgte mit Hilfe von UV-Licht von 254 nm und 366 nra. Die Fraktion 6 wurde als homogen bewertet. Der kristalline Rückstand aus der Fraktion 6 wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert; Ausbeute 215 mg Sandramycin. Dieses Material wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert, Ausbeute 188 mg reines Sandramycin, Schmp. 208 - 212⁰C

	Analyse für C6(	3H76°1	6N1	2*	8H2O	6	H	1	N	,31
30						6	,79	1	2	,29
			C				,29		2
	berechnet:	52	,78
	gefunden:	52	,58

352U36

M/26 043

- ja-

Beispiel 3

Isolierung und Reinigung von Sandramycin im größeren Maßstab

Stufe A; Extraktion und Flüssigverteilung des Rohextrakts

Nach Wiederholung der im Beispiel 2, Stufen A und B beschriebenen allgemeinen Isolationsverfahren wurden 1,12 g des Rückstandes A und 3,03 g des Rückstandes B

aus der gesamten Fermentationsbrühe (/^S 1) erhalten.

Stufe B; Verreibung der Rückstände A und B

Der in Stufe A erhaltene Rückstand A (1,12 g) wurde in etwa 300 ml aus 2 Teilen Chloroform-1 Teil Methanol gelöst. 20 g Dicalit wurde zu der Lösung gegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum in einem Rotationsverdampfer bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wurde

in 300 ml Toluol aufgeschlämmt und wiederum zur Trockne eingeengt. Dies wurde ein zweitesmal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde in 300 ml Skellysolve B aufgeschlämmt und in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Dies wurde ein zweitesmal wiederholt. Der

Dicalitrückständ wurde in 300 ml Skellysolve B aufgeschlämmt und in eine 4,1 cm Innendurchmesser χ 45,7 cm Flash-Chromatographie-Säule gepackt. Das Dicalit wurde unter Druck (N_-Fluß; 5,7 psi) in ein Bett gepackt. Eine Schicht aus Ottawa—Sand (/v2 cm) wurde auf das Bett gepackt. Die Elution wurde unter Stickstoffdruck (Fluß) be-

M/26 043

gönnen, wobei folgende Lösungsmittel gemäß folgender elutroper Reihenfolge eingesetzt wurde: Skellysolve B (500 ml); Toluol (500 ml); Diethylether (500 ml); Methylenchlorid (500 ml); Chloroform (500 ml); Ethylacetat (500 ml); Acetonitril (500 ml); Tetrahydrofuran (500 ml) und Methanol (500 ml). Das Toluol-Eluierungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockne eingeengt, Ausbeute 912,7 mg an Rückstand D.

Das oben näher beschriebene allgemeinen Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde der dort eingesetzte Rückstand A durch 3,03 g Rückstand B ersetzt. Es wurden so 766,7 mg eines Rückstandes E aus dem Toluol-Eluierungsmittel erhalten.

Die im Beispiel 3, Stufen A und B beschriebenen allgemeinen Verfahren wurden wiederholt, jedoch wurden die dort erhaltenen und eingesetzten Rückstände A und B durch jeweils 1,5 und 1,97 g der Rückstände A¹ und B¹ ersetzt. Es wurden so 993,9 mg an Rückstand D¹ und 693 mg an Rückstand E¹ aus dem Toluol-Eluierungsmittel erhalten.

Stufe C: Säulenchromatographie der Rückstände D und E

Ein 2,0 cm Innendurchmesser χ 30 cm Glenco-Säule wurde in Form einer Aufschlämmung mit 40 g Woelm-Silikagel (0,063 - 0,200 mm, 70 - 230 mesh (0,21 - 0,06 mm lichte Maschenweite)) in Chloroform gepackt. Die Säule wurde in ein HPLC-System für mittleren Druck eingesetzt und mit Chloroform äquilibriert. Die Rückstände D, D¹

352U36

M/26 043 -

E und E¹ aus Stufe B wurden vereinigt (etwa 3,366 g) und in 6 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde in eine 15 ml Probenschleife eingezogen. Die Probenschleife wurde in das HPLC-System für mittleren Druck eingesetzt und die Probe wurde mit 200 ml Chloroform auf die Säule gepumpt. Es wurde mit 2 1 im linearen Gradieten von Chloroform bis 5 % Methanol in Chloroform eluiert, wobei 17 χ 117 ml Fraktionen gesammelt wurden. Aliquots (6 μΐ) jeder Fraktion wurden dünnschichtchromatographisch untersucht, wobei 5% Methanol in Chloroform als Eluierungsmittel eingesetzt wurde. Die Sichtbarmachung erfolgt mit Licht von 366 nm. Die Fraktionen 5 und 6 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt, Ausbeute 2,166 g an Rückstand F. Die Fraktionen 7 bis 12 wurden vereinigt und im Vakuum mit Hilfe eines Rotations-Verdampfers zur Trockne eingeengt. Der Rest (953 mg) wurde in 6 ml Chloroform gelöst und wiederum wie oben beschrieben mit 2 1 im linearen Gradienten von Chloroform bis 1,5 % Methanol in Chloroform chromatographiert, wobei 20 χ 100 ml Fraktionen gesammelt wurden. Fraktionen 9 bis 20 wurden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt, Ausbeute 860 mg an Rückstände

Die Rückstände F und G wurden vereinigt und aus gO Chloroform-Methanol umkristallisiert, Ausbeute 1,985 g reines Sandramycin, das mit dem im Beispiel 2 isolierten Produkt identisch war.

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Antitumor-Antibiotikum Sandramycin mit folgender Strukturformel:

   OH

   CH,

   CH₁ CH,

   CH,

   CO-NHCHrCO-N-CH₂-CO-N-CH

   ONH-CH-CO-N^N CH₂ I J

   CO L^N-CO-CH-NHO

   CH-N-CO-CH₁-N-CO-CHjNH-CO

   CH, tH,

   Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums Sandramycin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Sandramycin produzierenden Stamm von Nocardioides sp. nov. mit den identifizierenden Charakteristika von ATCC 39419 oder einen Mutanten davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Kulturmedium kultiviert.

   25

   30

   5 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Sandramycin aus dem Kulturmedium isoliert.

   4. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus 10 Nocardioides sp. ATCC Nr. 39419.

   5. Pharmazeutisches Mittel enthaltend Sandramycin gemäß Anspruch 1, gewünschtenfalls zusammen mit einem pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel.

   6. Verwendung von Sandramycin gemäß Anspruch 1, zur

   Bekämpfung von Tumoren und bakteriellen Infektionen bei Mensch und Tier.

   35