DE3521436C2

DE3521436C2 -

Info

Publication number: DE3521436C2
Application number: DE3521436A
Authority: DE
Inventors: James A. Fayetteville N.Y. Us Matson; James A. Fayetteville N.Y. Us Bush
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1984-06-18
Filing date: 1985-06-14
Publication date: 1993-08-05
Also published as: BE902670A; FI80475B; IT1191622B; SE8502996D0; FI80475C; GB2160529B; LU85953A1; US4582639A; GB8515256D0; SE464524B; AU584075B2; IE58629B1; JPH0158200B2; DE3521436A1; PT80656A; ZA852370B; AU4048085A; ATA178285A; ES544289A0; KR930003107B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Antitumor-Antibiotikum, ein Verfahren zu dessen Herstellung und ein pharmazeutisches Mittel, das dieses Antibiotikum enthält.

Das erfindungsgemäße Antitumor-Antibiotikum ist ein cyclisches Depsipeptid und wird im folgenden als Sandramycin bezeichnet. Sandramycin kann man durch Fermentation eines neuen Mikroorganismus, Nocardioides Species-Stamm C 49 009, ATCC 39 419 herstellen. Das er findungsgemäße Antitumor-Antibiotikum stellt einen antimikrobiellen und einen Antitumor-Wirkstoff dar. Die Erfindung ist auch auf den neuen Mikroorganismus selbst gerichtet, der bei der fermentativen Herstellung von Sandramycin eingesetzt wird.

In der US-PS 43 60 458 ist ein antibakterieller Anti tumor-Komplex beschrieben, der mit BBM-928 bezeichnet ist. Diese Druckschrift beschreibt auch die Herstellung dieses Komplexes mittels Fermentation eines neuen Actinomycetes- Stammes, der mit Stamm G-455-101 (ATCC 31491) bezeichnet ist. Dieser Stamm wurde später als ein neuer Species des Genus Actinomadura bestimmt und mit Actinomadura luzonensis nov. sp. (man vergleiche J. Antibiotics, 33 (10), 1098-1102 (1980) bezeichnet.

Die Herstellung, Isolierung, Charakterisierung und Be schreibung der Antitumor-Aktivität der BBM-928 Bestandteile sind in J. antibiotics, 33 (10), 1087-1097 (1980) offenbart. Die Strukturen von 92A, B, C und D (sind neuerdings mit Luzopeptin A, B, C und D bezeichnet), welche die Hauptbestandteile des BBM-928-Komplexes dar stellen, sind in der US-PS 44 51 456 beschrieben und besitzen die folgende Strukturformel:

Die Luzopeptine A, B, C und D weisen Struktureinheiten auf, wie 3-Hydroxy-6-methoxychinaldinsäure als das Chromophor und 4-Hydroxy-2,3,4,5-tetrahydropyridazin- 3-carbonsäure, wobei der strukturelle Unterschied zwischen den drei Komponenten lediglich in dem Ausmaß der Acetylierung der Hydroxygruppe in den Tetrahydro pyridazin-Einheiten liegt.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues cyclisches Depsipeptid, das ein Antitumor-Antibiotikum darstellt und als Sandramycin bezeichnet ist und folgende Struktur formel besitzt:

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Sandramycin.

Das antibiotische Sandramycin erhält man durch Fermentation eines neuen Mikroorganismus, der vorläufig als ein Species des Genus Nocardioides klassifiziert wird. Bei der Fermentation sammelt sich das durch diesen Mikroorganismus hergestellte Sandramycin an, das man dann aus der Kulturbrühe gewinnt. Dieser Sandramycin produzierende Mikroorganismus ist der Nocardioides sp.-Stamm C49 009, der aus einer in Mexiko gesammelten Bodenprobe isoliert wurde (selbstverständlich einschließlich der Mutanten davon, die Sandramycin produzieren). Dieser Stamm ist in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der Nr. ATCC 39419 hinterlegt worden.

Nachfolgend ist eine allgemeine Beschreibung dieses das Antitumor-Antibiotikum Sandramycin produzierende Mikroorganismus gegeben.

Morphologie

Der Stamm Nr. C49 009 bildet sowohl Substrat- als auch Luftmyzele (0,4 µm Breite). Das Substratmyzel ist lang, gut verzweigt und fragmentiert in kurze Filamente oder nach einer Woche in Stäbchen. Der Stamm-Nr. C49 009 neigte dazu, bei fortgesetzter Kultivierung seine Fähigkeit zur Bildung eines Luftmyzels zu verlieren. Die Hyphen des Luftmyzels verzweigen dünn. Bei mikro skopischer Beobachtung stellt man fest, daß die Luft hyphen am Anfang eine mehr oder wenig stark ausgeprägte Zickzack-Form besitzen und sich zu langen, geraden Ketten mit Arthrosporen-ähnlichen zylindrischen Segmenten (0,5%1 bis B∼3 µm) entwickeln, welche später mit durchsichtigen Hyphen abgetrennt werden. Die Ober fläche der soprenähnlichen Segmente ist glatt. Der Stamm Nr. C49 009 ist gram-positiv und nicht säurebe ständig. Ein Sporangium, motile Sporen und ein Sclerotium werden nicht beobachtet.

Zellwandzusammensetzung und Zuckerbestandteile der Gesamtzelle

Die Zellwand des Stammes Nr. C49 009 enthält LL-Diamino pimelinsäure und Glycin als charakteristische Aminosäuren bestandteile in der Zellwand gemäß den von B. Becker et al. in Appl, Microbiol. 13, 236-243 (1965) und T. Yamaguchi in J. Bacteriol. 89, 441-453 (1965) be schriebenen Verfahren. Das Hydrolysat der gesamten Zelle enthält Glucose, Mannose und Ribose, jedoch keinen diagnostischen Zucker, bestimmt nach den Verfahren, die von M. P. Lechevalier et al. in Biol. Actinomycetes Related Organisms, 11, 78-92 (1876) beschrieben sind. Die Zusammensetzung der zuvor genannten Zellwand und die Zuckerbestandteile der Gesamtzelle deuten darauf hin, daß der Stamm Nr. C49 009 ein Actinomycetes Species vom Zellwandtyp I ist.

Kulturelle und physiologische Charakteristika

Der Stamm Nr. C49 009 ist ein obligater aerober Actinomycet und wächst auf den meisten beschriebenen Medien gut. Das Luftmyzel ist auf ISP Medium Nr. 3, 5 und 7 und auf Czapek's Saccharose-Nitrat-Agar üppig bis mäßig ausgebildet, während es auf nährstoffreichen organischen Medien, wie ISP Medium Nr. 2 und 6 oder Bennett's Agar spärlich ausgebildet ist. Das Luftmyzel besitzt eine weiße Farbe. Melanoide oder andere eindeutige Pigmente werden auf allen bisher untersuchten beschreibenden Medien nicht produziert. Die Rückseitenfarbe des vegetativen Myzels ist geringfügig gelblich. Der Stamm wächst bei 28°C optimal und bei 15°C und 37°C mäßig, jedoch bei 5°C und 45°C nicht. Gelatine und Stärke werden zersetzt. Die Tyrosinasereaktion ist negativ. In Gegenwart von 7% NaCl oder 0,01% Lysozym wird das Wachstum inhibiert. Die kulturellen und physiologischen Charakteristika des Stammes Nr. C49 009 sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Der Stamm Nr. C49 009 verwertet die meisten Zucker zum Wachstum. Die Ver wertung der Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 1

Kulturelle Charakteristika des Stammes Nr. C49 009*)

Tabelle 2

Physiologische Charakteristika des Stammes Nr. C49 009

Tabelle 3

Verwertung von Kohlenhydrate durch den Stamm C49 009

Taxonomie

Der Stamm Nr. C49 009 ist charakterisiert durch seine gram-positive Reaktion, seine nicht säurebeständige Natur, Fragmentierung des Substratmyzels, Bildung eines weißen Luftmyzels, Arthrosporen-ähnlicher Segmentierung in Gesamtteile des Luftmyzels und Fehlen der Fähigkeit zur Bildung von eindeutigen Pigmenten. Diese Charakteristika sowie die Tatsache, daß LL-Diaminopimelinsäure und Glycin, jedoch kein diagnostischer Zucker, in der Zellwand vorhanden sind, ermöglichen es, den Stamm Nr. C49 009 dem Genus Nocardioides (H. Prauser, Intl. J. Syst. Bacteriol., 26, 58-65 (1976)) zuzuordnen. Der Stamm Nr. C49 009 unterscheidet sich von den Luftmyzel bildenden nocardioformen Actinomycetes, inklusive Norcardiopsis dassonvillei, Saccharopolyspora hirsuta und allen hetereologen Species des Genus Nocardia, hinsichtlich der diagnostischen Aminosäure oder des diagnostischen Zuckers der Zellwand und hinsichtlich der diagnostischen physiologischen Eigenschaften wie beschrieben von R.E. Gordon et al, J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978) und wie in der Tabelle 4 gezeigt. Der Stamm Nr. C49 006 unterscheidet sich vom Genus Streptomyces ferner hinsichtlich seiner sporogenen Morphologie vom Nocardiae-Typ. So fragmentieren beispielsweise die Substrathyphen des Stammes Nr. C49 009 in kurze Filamente des Stammes Nr. C49 009 sind von den Sporen von Streptomyces hinsichtlich der Stelle der Bildung, des Arrangements in der Hyphenhülle und der Abwesenheit einer eindeutigen Sporenwand unter scheidbar.

Tabelle 4

Diagnostische physiologische Charakteristika des Stammes C49 009

Das Sensitivitätsprofil gegenüber einer Reihe von Taxon-spezifischen Phagen unterscheidet die Stämme des Genus Norcardioides von den verwandten Genera, wie Streptomyces oder Norcardia (man vergleiche H. Prauser, Host phage relationships in nocardioform organisms; "In the Biology of the Nocardiae", Edit. M. Goodfellow et al, London, New York und San Francisco, Academic Press (1976)).

Die Sensisivität des Stammes Nr. C49 009 gegenüber diesen Actinophagen wurde nicht untersucht, da diese Phagen nicht zur Verfügung standen. Auf Basis der kulturellen und physiologischen Charakteristika wurden die 17 Stämme des Genus Norcardioides, die aus Bodenproben isoliert worden waren, welche an verschiedenen Plätzen der Welt gesammelt wurden, einem einzelnen Species, Norcardioides albus, zugeordnet. Der Stamm Nr. C49 009 unterscheidet sich von Norcardioides albus in bezug auf die Verwertung von L-Arabinose und Inosit, ist jedoch Norcardioides albus hinsichtlich der Gesamtheit der kulturellen und physiologischen Charakteristika ähnlich. Der Stamm Nr. C49 009 wurde daher vorläufig als ein Species des Genus Norcardioides klassifiziert.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung des bestimmten Stammes Nr. C49 009 beschränkt. Erfindungsgemäß sind auch Sandramycin- produzierende Mutanten dieses Stammes umfaßt, die gemäß be kannten Verfahren, beispielsweise durch Röntgenbe strahlung, UV-Bestahlung, Behandlung mit Stickstofflost, Ausetzen gegenüber Phagen und dergleichen, produziert werden können.

Produktion des Antibiotikums

Sandramycin stellt man her, indem man Norcardioides sp. Stamm Nr. C49 009 (ATCC 39419) oder eine entsprechende Mutante davon in einem üblichen Nährmedium kultiviert. Den Organismus zieht man in einem Nährmedium, das bekannte Nährquellen d. h. assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewünschtenfalls anorganische Salze und andere be kannte Wachstumsfaktoren, enthält. Vorzugsweise arbeitet man bei submersen aeroben Bedingungen, um große Mengen des Antibiotikums herzustellen, obwohl man zur Her stellung geringerer Mengen auch Oberflächenkulturen und Flaschen einsetzen kann.

Das Nährmedium soll eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Glucose, Sucrose, Mannose, Fructose, Maisstärke, Maltose, Mannit, Molassen und dergleichen, entweder in gereinigter oder in roher Form enthalten. Das Nährmedium soll auch eine oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen, wie beispiels weise Sojabohnenmehl, Fischmehl, Maisextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Casein, hydrolysierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff und dergleichen, enthalten. Anorganische Nährsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calcium carbonat und Spuren von Schwermetallsalzen, wie Kupfer, Zink, Mangan, Eisen und dergleichen, können ebenfalls zu dem Nährmedium hinzugefügt werden.

Die Fermentationstemperatur soll zwischen 15°C bis etwa 27°C, vorzugsweise zwischen etwa 25°C und etwa 30°C, liegen. Der pH des Fermentationsmediums sollte zwischen etwa 5 bis 10,5 und vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 8,5 liegen. Gewöhnlich erhält man eine optimale Produktion von Sandramycin nach etwa 2 bis 9 Tagen, je nach der Temperatur. Führt man eine Tankfermentation durch, dann ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe zu produzieren, indem man die Brühe mit einer Schräg-/oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des Mikroorganismus impft. Nach dem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, transferiert man es aseptisch zum Medium des Fermentationstanks.

Isolierung von Sandramycin

Nachdem die Fermentation vollständig ist, gewinnt man Sandramycin aus dem Kulturmedium und isoliert es in einer im wesentlichen reinen Form nach dem nachstehend er läuterten mehrstufigen Verfahren.

Nachstehend wird obiges Schema näher erläutert.

Die gesamte Brühe der Fermentation von Norcardioides sp. Stamm Nr. C49 009 extrahiert man zuerst mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und vor zugsweise mit Ethylacetat. Vorzugsweise gibt man eine Filterhilfe, wie Dicalit (Diatomeenerde), zu der Extraktions mischung zu und filtriert die Mischung dann, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Nach dem Filtrieren trennt man die organische Phase von dem Filtrat der Extraktions mischung und konzentriert durch Verdampfen, wobei man den Rohextrakt dieses Antibiotikums erhält. Den Rohextrakt verteilt man zwischen einem aliphatischen Kohlenwasser stofflösungsmittel, wie Skellysolve B (isomere Hexane), und etwa 10% Wasser in Methanol. Die wäßrige Methanolphase verdünnt man mit weiterem Wasser und extrahiert die erhaltene, etwa 25% Wasser enthaltende Methanollösung mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Tetrachlorkohlenstoff. Die wäßrige Methanolphase verdünnt man weiter mit Wasser und extrahiert die erhaltene, etwa 35% Wasser enthaltende Methanollösung mit einem organischen Lösungsmittel, bei spielsweise Chloroform. Die Tetrachlorkohlenstoffextrakte vereinigt man und engt im Vakuum zum Rückstand A ein. Die Chloroformextrakte vereinigt man und engt im Vakuum zum Rückstand B ein. Die Rückstände A und B vereinigt man und chromatographiert an einer Säule, die Diatomeen erde, beispielsweise Dicalit, enthält, wobei man organische Lösungsmittel mit einer niedrigen bis hohen Polarität verwendet. Die geeigneten, das Antibiotikum ent haltenden Fraktionen, vereinigt man und engt im Vakuum zum Rückstand C ein. Den Rückstand C kann man mittels Flüssigkeits-Chromatographie an einer Silikagel- Säule bei niedrigem Druck weiter reinigen. Die Rück stände D, D′, E und E′ kann man mittels HPLC bei mittleren Druck weiter reinigen. Dies ist nachstehend im Beispiel 3, Stufe C beschrieben, wobei man unter Einsatz eines linearen Gradienten von Chloroform bis 5% Methanol in Chloroform als Eluierungsmittel arbeitet. Die geeigneten Fraktionen engt man zur Trockne ein und erhält Sandramycin. Nach Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittelsystem erhält man reines kristallines Sandramycin.

Struktur von Sandramycin

Sandramycin ist cyclisches Depsipeptid mit Antitumor- Eigenschaften und antibiotischen Eigenschaften, das einen 3-Hydroxychinolinkern als Chromophor und eine Pipecolinsäureeinheit enthält. Auf Basis der Spektral daten und anhand der chemischen Analyse wurde Sandramycin die folgende Strukturformel zugeordnet:

Sandramycin ist ein weißer kristalliner Feststoff mit einem Schmp. von 208 bis 212°C mit folgender Brutto formel: C₆₀H₇₆O₁₆N₁₂ und einem Molekulargewicht von 1221.3312. Es ist aus den Elementen Kohlenstoff, Wasser stoff, Stickstoff und Sauerstoff zusammengesetzt.

Die Elementaranalyse ergab folgendes:

Ein Massenspektrum mit hoher Auflösung von Sandramycin wurde mit Hilfe eines Kratos MS-50-Spektrometers und mittels FAB-Ionisation aufgenommen. Es wurde folgende Masse bestimmt:

berechnet für (M+H)⁺-Ion: 1221.5579
gefunden für (M+H)⁺-Ion: 1221.5571

Das von einem KBr-Pressling aufgenommene Infrarotspektrum von Sandramycin zeigt charakteristische Banden bei folgenden Frequenzen (ausgedrückt in cm^-1):
3500, 3340, 2970, 2940, 2880, 1748, 1660, 1640, 1598, 1520, 1468, 1445, 1420, 1336, 1290, 1265, 1235, 1172, 1138, 1092, 1055, 1018, 922, 885, 855 und 838.

Das UV-Absorptionsspektrum von Sandramycin wurde in Methanol (0,01798 g/l) bei neutralen, sauren und basischen Bedingungen aufgenommen. Es wurden die Absorptionsmaxima und das Absorptionsvermögen bestimmt:

λ_max in nm (a)
in CH₃OH:
356(8.1), 296(7.5), 229(62.8), 217(63.7)
in CH₃OH-HCl:	356(8.3), 306(8.1), 228(58.4), 210(62.3)
in CH₃OH-NaOH:	395(9.2), 301(7.2), 246(59.8)

Ein Protonen-NMR-Spektrum von Sandramycin (gelöst in Deuterochloroform) wurde mit einem Bruker WM-360 Spektrometer bei 360 MHz unter Verwendung von Tetra methylsilan als interner Standard aufgenommen. Es wurden folgende chemische Verschiebungen (δ-Werte) und Kopplungskonstanten (J-Werte in Hz) gefunden. Ferner sind die Muster beschrieben:

11.75 (s, 2H, Ar-OH), 9.58 (d, J=6.39, 2H, Ser NH), 8.55(bs, 2H, Gly NH), 7.82(bs, 2H, Ar-H⁸), 7.72(m, 2H, Ar-H⁵), 7.63(s, 2H, Ar-H⁴), 7.52(m, 4H, Ar-H⁶ und Ar-H⁷), 5.60(m, 2H, αH von Pip.), 5.56(d, J=17.58, 2H Sar αCH), 5.28(m, 2H, Ser αCH), 5.01(d, J=12.79, 2H, Ser βCH), 4.88(d, J=12.79, 2H, val αCH), 4.45(bd, J=12.79, 4H, Ser βCH und Gly αCH), 4.07(bd, J=15.99, 4H, εH von Pip. und Gly αCH), 3.76(bd, J=12.79, 2H, εH von Pip.), 3.58(d, J=17.58, 2H, Sar CH), 3.14(s, 6H, N-CH₃), 2.96(s, 6H, N-CH₃), 2.06(m, 2H, Val βCH), 1.82(bs, 4H, βCH und Pip.), 1.68(bm, 4H, γCH von Pip.), 1.57(bm, 4H, δCH von Pip.), 0,94(d, J=6.37, 6H, Val-CH₃), 0.80(d, J=6.37, 6H, Val-CH₃).

Ein ¹³C-NMR-Spektrum von Sandramycin (gelöst in Deutero chloroform) wurde mit einem Jeol FX90Q-Spektrometer bei 22,5 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard aufgenommen. Es wurden die folgenden chemischen Verschiebungen (ppm-Werte) aufgenommen, wobei jede chemische Verschiebung für 2 Kohlenstoffatome steht. Die Zuordnung ist wie folgt:

Sandramycin unterscheidet sich in bezug auf folgende Strukturmerkmale von den Luzopeptinen A, B und C. Sandramycin enthält 3-Hydroxychinaldinsäure und Pipecolinsäureeinheiten anstatt der 3-Hydroxy-6-methoxy chinaldinsäure und den in 4-Stellung substituierten Tetra hydropyridazin-3-carbonsäure-Gruppen.

Biologische Aktivität von Sandramycin

Die antibakteriellen Aktivitäten von Sandramycin wurden mit Hilfe der Serien-Zweifach-Agar-Verdünnungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammenge faßt und den Aktivitäten von Luzopeptin A und Echinomycin gegenübergestellt. Wie aus Tabelle 5 ersicht lich ist, inhibiert Sandramycin gram-positive Organismen, wie Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus sowie Streptococcus faecalis, stark.

Tabelle 5

Antimikrobielle Aktivität von Sandramycin

Minimale inhibierende Konzentration (MIC)

Sandramycin wurde auch gegenüber transplantierbaren Mäusetumoren (P-388 Leukemia) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Die verwendete Methodologie folgt im wesentlichen den Richtlinien des National Cancer Institute (Cancer Chemotherapy Rep. Part 3, 3, 1-103 (1972)). Die wesentlichen experimentellen Details sind am Ende der Tabelle 6 aufgeführt. Die Tests wurden bei zwei unterschiedlichen Dosierungsschemata durchge führt: Einzelne Dosis am Tag 1 bzw. täglich 5 Tage lang. Die optimale Dosis scheint bei beiden Dosierungen bei etwa 0,2 mg/kg/Injektion zu liegen.

Tabelle 6

Wirkung von Sandramycin auf P-388 Leukemia

Tumorinokulum:
10⁶-Asciteszellen implantiert i. p.
Wirt:	weibliche CDF₁-Mäuse
Bewertung:	MST - Mittlere Überlebenszeit
Wirkung:	% T/C=(MST behandelt/MST Kontrolle)×100
Kriterien	% T/C=125 wurde als signifikante Antitumor-Aktivität betrachtet
AWC:	durchschnittliche Gewichtsänderung (behandelt/Kontrolle) in g am Tag 4 (average weight change)

Aus obigen antimikrobiellen Daten und den Daten, die an hand von Tumoren bei Mäusen ermittelt wurden, geht her vor, daß Sandramycin als Antibiotikum und auch als Antitumormittel zur Inhibierung maligner Tumore, wie P-388 Leukemia, bei Säugetieren wirksam ist.

Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische Mittel, die Sandramycin gegebenenfalls zusammen mit einem inerten pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungs mittel enthalten. Sandramycin ist dabei vorzugsweise in einer wirksamen antimikrobiellen oder Tumor-inhibierenden Menge vorhanden. Diese Mittel können auch andere wirksame antimikrobielle oder Antitumor-Wirkstoffe enthalten und können in jeder für den gewünschten Verabreichungsweg geeigneten pharmazeutischen Form vorliegen. Als Beispiele derartiger Mittel kann man feste Mittel zur oralen Verab reichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate; flüssige Mittel zur oralen Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elexiere; und Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, nennen. Die Mittel können auch als sterile, feste Mittel formuliert werden, die in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen, injizier baren Medium kurz vor der Verwendung gelöst werden können.

Bei Verwendung als antimikrobiellen Wirkstoff verabreicht man Sandramycin oder ein Sandramycin enthaltendes pharmazeutisches Mittel derart, daß die Konzentration des aktiven Bestandteils größer ist als die für den bestimmten zu behandelten Organismus erforderliche minimale Konzentration. Setzt man Sandramycin als Antitumor-Wirk stoff zur Behandlung eines bestimmten Säugetieres (Mensch oder Tier) ein, dann kann der Fachmann ohne Schwierigkeiten die optimalen Dosierungen und Dosierungs schemata für Sandramycin bestimmen. Dabei ist natürlich zu berücksichtigen, daß die eingesetzte Sandramycin- Dosis von der eingesetzten Formulierung, der Verab reichungsart, dem bestimmten Situs, dem Wirt und der zu behandelnden Krankheit abhängt. Dabei sind viele Faktoren zu berücksichtigen, wie Alter, Gewicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Verabreichungsweg, Ausscheidungsrate, Zustand des Patienten, Arzneimittel kombinationen, Empfindlichkeiten und Schwere der Krank heit.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Skellysolve B ist ein im Handel erhältliches Petrolether-Lösungsmittel, das isomere Hexane aufweist und einen Sp. von 60-69°C besitzt. Dicalit ist eine Diatomeenerde. Alle Temperaturangaben beziehen sich auf °C, soweit nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1 Fermentation von Sandramycin A. Schüttelflaschen-Fermentation

Nocardioides sp. Stamm Nr. C49 009, ATCC 39419, wurde in Kultur-Teströhrchen am Leben erhalten und auf Agar schrägkulturen aus Hefe-Malzextraktagar transferiert. Dieses Medium besteht aus 4,0 g Glucose, 4,0 g Hefe extrakt, 10,0 g Malzextrakt und 20,0 g Agar, aufgefüllt mit entsalztem Wasser auf 1 l. Nach jedem Transfer wurde die Agarschrägkultur 7 Tage bei 27°C inkubiert. Zur Herstellung eines Inokolums für die Produktionsphase wurde das gewachsene Myzel von der Schrägkultur in ein 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, der 100 ml eines sterilen Mediums enthielt, das aus 30,0 g Glucose, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Baumwollsamen-Embryomehl und 3,0 g CaCO₃, aufgefüllt mit entsalztem Wasser auf 1 l, bestand. Diese vegetative Kultur wurde 48 Stunden bei 27°C auf einem Schüttler (Gyrotory tier shaker; Model G53; einge stellt auf 210 U/m, einen Kreis mit einem Durchmesser von 5,1 cm beschreibend) inkubiert. 4 ml der vegetativen Kultur wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert, der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums enthielt, das aus 20,0 g Gazehavase, 10,0 g Sojamehl, 10,0 g Lein samenmehl und 5,0 g CaCO₃, aufgefüllt mit entsalztem Wasser auf 1 l, bestand. Die Produktionskultur wurde auf einem Schüttler, der auch für die vegetative Kultur eingesetzt worden war, bei 250 U/m und 27°C inkubiert. Nach 96 Stunden wurde die Produktionskultur aufgearbeitet, um Sandramycin zu isolieren.

B. Bench-top-Fermentation

Zur Herstellung von Sandramycin in einem Bench-top- Fermenter überführt man 400 ml der im Beispiel 1 be schriebenen vegetativen Kultur mit 10 l eines Produktions mediums, das 40 g Maisstärke, 20 g Leinsamenmehl, 1 g (NH₄)₂SO₄ und 5 g CaCO₃ pro l entsalztem Wasser ent hält, in einen Fermenter (Microgen Model SF-116). Die Temperatur wurde bei 27°C gehalten. Es wurde mit 300 U/m geschüttelt. Die Luftflußrate betrug 8 l/min. Es wurde 202 Stunden inkubiert. Danach wurde Sandramycin aus der Kultur isoliert.

C. Tank-Fermentation

Für die Herstellung von Sandramycin mit einer Pilotanlage wurden 2 l der vegetativen Kultur (hergestellt nach dem im Beispiel 1A beschriebenen allgemeinen Verfahren) in einen Fermenter überführt, der 30 l eines Produktions mediums enthielt, das aus 40 g Maisstärke, 20 g Lein samenmehl, 1 g (NH₄)₂SO₄ und 5 g CaCO₃ pro l entsalztem Wasser bestand. Die Temperatur betrug 26,5°C; die Luftflußrate 80 l/min. Es wurde mit 375 U/min. ge schüttelt. Der Rückdruck betrug 1 Atmosphäre. Nach 183 Stunden wurde die Tank-Fermentation aufgearbeitet, um Sandramycin zu isolieren.

Beispiel 2 Isolierung und Reinigung von Sandramycin Stufe A: Extraktion

Die gesamte Brühe (∼ 8 l) der Rohfermentation wurde in einen 20 l Polyethylentank (oberer Durchmesser 58 cm, Bodendurchmesser 44 cm, 55 cm hoch) überführt, der am Boden mit einem Hahn ausgestattet war. Ein gleiches Volumen Ethylacetat wurde zugegeben. Die Mischung wurde mit einem mit Luft angetriebenen Rührer bei einer guten Mischungsgeschwindigkeit 30 Minuten gerührt. Etwa 6 l (2 kg) Dicalit wurden zugegeben und vermischt. Die Mischung wurde auf ein Dicalit-Kissen gegeben, das sich in einem Büchner-Trichter Nr. 12 befand. Das Filtrat wurde in einer 19-l-Flasche gesammelt, die mit einem Vakuumanschluß ausgestattet war. Der Filterkuchen wurde mit 2 l Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde in einen 20 l Scheidetrichter gegeben, so daß sich die Phasen trennen konnten. Der Ethylacetatextrakt wurde entfernt und in einem Umlaufverdampfer aus Glas (Laboratoriumsgröße), der mit einem kontinuierlichen Zulauf ausgestattet war, auf etwa 1 l konzentriert. Das Konzentrat wurde weiter in einem Rotationsverdampfer im Vakuum zu einem viskosen Öl eingeengt. Ausbeute 1,94 g an Rohextrakt.

Stufe B: Flüssig-Flüssig-Verteilung des Rohextraktes

Der in Stufe A erhaltene Rohextrakt (1,94 g) wurde in einer Mischung aus 200 ml Methanol und 200 ml Skellysolve B gelöst. Die zweiphasische Lösung wurde in einen 1 l Scheidetrichter überführt und mit 22 ml Wasser verdünnt. Nach Schütteln konnten sich die erhaltenen Phasen vonein ander trennen. Die wäßrige Methanolphase (untere Phase) wurde in einen zweiten 1 l Scheidetrichter überführt und zwei weitere Male mit 200 ml Skellysolve B extrahiert. Die Skellysolve B war zuvor mit einem gleichen Volumen von 10% Wasser in Methanol gesättigt worden. Die wäßrige Methanolphase wurde mit 44 ml Wasser verdünnt und 3× mit 200 ml Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Der Tetrachlorkohlenstoff war zuvor mit einem gleichen Volumen von 25% Wasser in Methanol gesättigt worden. Die wäßrige Methanolphase wurde mit 41 ml Wasser ver dünnt und 3× mit 200 ml Chloroform extrahiert. Das Chloroform war zuvor mit einem gleichen Volumen von 35% Wasser in Methanol gesättigt worden. Die Tetrachlor kohlenstoffextrakte wurden vereinigt und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt, Aus beute 595 g an Rückstand A. Die Chloroformextrakte wurden vereinigt und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt, Ausbeute 458 g an Rückstand B.

Stufe C: Verreibung der Rückstände A und B

Die in Stufe B erhaltenen Rückstände A (547 mg) und BB (389 mg) wurden vereinigt und in 30 ml aus 2 Teilen Chloroform-1 Teil Methanol gelöst. 17,4 g Dicalit wurde zu der Lösung hinzugegeben. Dann wurde eine Aufschlämmung hergestellt, in dem 200 ml Skellysolve B zugegeben wurden. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers abgezogen. Das zurückbleibende Pulver wurde in 500 ml Toluol aufge schlämmt und in eine Flash-Chromatographie-Säule gepackt (4,1 cm Innendurchmesser ×45,7 cm). Das Dicalit wurde unter Druck (N₂-5,7 psi) in ein Bett gepackt. Sobald das zum Packen verwendete Lösungsmittel die Bettoberfläche erreichte, wurde der Fluß gestoppt und der Druck aus der Säule abgelassen. Eine Schicht aus Ottawa-Sand (∼ 2 cm) wurde auf die Oberfläche gegeben. Die Säule wurde dann mit Hilfe unter Druck stehenden Stickstoffs mit den folgenden elutropen Lösungsmitteln eluiert: Toluol (500 ml); Diethylether (500 ml); Methylenchlorid (500 ml); Chloroform (500 ml); Ethylacetat (500 ml); Acetonitril (500 ml); Tetrahydro furan (500 ml) und Methanol (500 ml). Das Toluol- Eluierungsmittel und das zum Packen verwendete Filtrat wurden vereinigt (∼ 1 l) und im Vakuum in einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt, Ausbeute 0,699 g an Rückstand C.

Stufe D: Säulenchromatographie des Rückstandes C

Eine 2,0 cm Innendurchmesser ×30 cm Glenco-Säule wurde in Form einer Aufschlämmung mit 37 g Woelm-Silikagel (0,060-0,200 mm; 70-230 mesh (0,21-0,06 mm lichte Maschenweite)) in Chloroform gepackt. Der Rückstand C (0,699 g) aus Stufe C wurde in 5 ml Chloroform gelöst und oben auf die Säule gegeben. Die Probe konnte in das gepackte Bett perkolieren. Das Leervolumen zwischen dem Kolonnenkopf und dem Silikagelbett wurde mit Standard- Ottawa-Sand gefüllt. Die Säule wurde mit einem Glenco- Gradienten-Elutions-Apparat verbunden. Es wurde mit 2 l unter Verwendung eines linearen Gradienten (beginnend mit Chloro form zum Schluß 5% Methanol in Chloroform) eluiert, wobei 20×100 ml Fraktionen gesammelt wurden. Jede Fraktion wurde in einem Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 3 ml aus 2 Teilen Chloro form- 1 Teil Methanol gelöst. Aliquots (2 µl) jeder Fraktion wurden auf Analtech-Silikalgel GHLF-Dünnschicht chromatographieplatten (TLC) gegeben. Die Platten wurden mit 5% Methanol in Chloroform eluiert. Die Sichtbarmachung erfolgte mit Hilfe von UV-Licht von 254 nm und 366 nm. Die Fraktion 6 wurde als homogen bewertet. Der kristalline Rückstand aus der Fraktion 6 wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert; Ausbeute 215 mg Sandramycin. Dieses Material wurde aus Chloroform-Methanol umkristallisiert, Ausbeute 188 mg reines Sandramycin, Schmp. 208-212°C.

Analyse für C₆₀H₇₆O₁₆N₁₂ · 8 H₂O

berechnet: C 52,78, H 6,79, N 12,31;
gefunden: C 52,58, H 6,29, N 12,29.

Beispiel 3 Isolierung und Reinigung von Sandramycin im größeren Maßstab Stufe A: Extraktion und Flüssigverteilung des Rohextrakts

Nach Wiederholung der im Beispiel 2, Stufen A und B beschriebenen allgemeinen Isolationsverfahren wurden 1,12 g des Rückstandes A und 3,03 g des Rückstandes B aus der gesamten Fermentationsbrühe (∼ 8 l) erhalten.

Stufe B: Verreibung der Rückstände A und B

Der in Stufe A erhaltene Rückstand A (1,12 g) wurde in etwa 300 ml aus 2 Teilen Chloroform-1 Teil Methanol ge löst. 20 g Dicalit wurde zu der Lösung gegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum in einem Rotationsver dampfer bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wurde in 300 ml Toluol aufgeschlämmt und wiederum zur Trockne eingeengt. Dies wurde ein zweitesmal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde in 300 ml Skellysolve B aufge schlämmt und in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Dies wurde ein zweitesmal wiederholt. Der Dicalitrückstand wurde in 300 ml Skellysolve B aufge schlämmt und in eine 4,1 cm Innendurchmesser ×45,7 cm Flash-Chromatographie-Säule gepackt. Das Dicalit wurde unter Druck (N₂-Fluß; 5,7 psi) in ein Bett gepackt. Eine Schicht aus Ottawa-Sand (∼2 cm) wurde auf das Bett ge packt. Die Elution wurde unter Stickstoffdruck (Fluß) be gonnen, wobei folgende Lösungsmittel gemäß folgender elutroper Reihenfolge eingesetzt wurde:
Skellysolve B (500 ml); Toluol (500 ml); Diethylether (500 ml); Methylenchlorid (500 ml); Chloroform (500 ml); Ethylacetat (500 ml); Acetonitril (500 ml); Tetrahydro furan (500 ml) und Methanol (500 ml). Das Toluol- Eluierungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockne eingeengt, Ausbeute 912,7 mg an Rückstand D.

Das oben näher beschriebene allgemeinen Verfahren wurde wiederholt, jedoch wurde der dort eingesetzte Rückstand A durch 3,03 g Rückstand B ersetzt. Es wurden so 766,7 mg eines Rückstandes E aus dem Toluol-Eluierungsmittel erhalten.

Die im Beispiel 3, Stufen A und B beschriebenen allge meinen Verfahren wurden wiederholt, jedoch wurden die dort erhaltenen und eingesetzten Rückstände A und B durch jeweils 1,5 und 1,97 g der Rückstände A′ und B′ ersetzt. Es wurden so 993,9 mg an Rückstand D′ und 693 mg an Rückstand E′ aus dem Toluol-Eluierungsmittel erhalten.

Stufe C: Säulenchromatographie der Rückstände D und E

Ein 2,0 cm Innendurchmesser ×30 cm Glenco-Säule wurde in Form einer Aufschlämmung mit 40 g Woelm-Silikagel (0,063-0,200 mm, 70-230 mesh (0,21-0,06 mm lichte Maschenweite)) in Chloroform gepackt. Die Säule wurde in ein HPLC-System für mittleren Druck eingesetzt und mit Chloroform äquilibriert. Die Rückstände D, D′ E und E′ aus Stufe B wurden vereinigt (etwa 3,366 g) und in 6 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde in eine 15 ml Probenschleife eingezogen. Die Probenschleife wurde in das HPLC-System für mittleren Druck eingesetzt und die Probe wurde mit 200 ml Chloroform auf die Säule gepumpt. Es wurde mit 2 l im linearen Gradienten von Chloroform bis 5% Methanol in Chloroform eluiert, wobei 17×117 ml Fraktionen gesammelt wurden. Aliquots (6 µl) jeder Fraktion wurden dünnschichtchromatographisch untersucht, wobei 5% Methanol in Chloroform als Eluierungsmittel eingesetzt wurde. Die Sichtbarmachung erfolgt mit Licht von 366 nm. Die Fraktionen 5 und 6 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt, Ausbeute 2,166 g an Rückstand F. Die Fraktionen 7 bis 12 wurden vereinigt und im Vakuum mit Hilfe eines Rotations verdampfers zur Trockne eingeengt. Der Rest (953 mg) wurde in 6 ml Chloroform gelöst und wiederum wie oben beschrieben mit 2 l im linearen Gradienten von Chloroform bis 1,5% Methanol in Chloroform chromatographiert, wobei 20×100 ml Fraktionen gesammelt wurden. Fraktionen 9 bis 20 wurden vereinigt und in einem Rotationsver dampfer zur Trockne eingeengt, Ausbeute 860 mg an Rückstand G.

Die Rückstände F und G wurden vereinigt und aus Chloroform-Methanol umkristallisiert, Ausbeute 1,985 g reines Sandramycin, das mit dem im Beispiel 2 isolierten Produkt identisch war.

Claims

1. Nocardioides sp. ATCC 39419.

2. Antitumor-Antibiotikum Sandramycin mit folgender Strukturformel:

3. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums Sandramycin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardioides sp. ATCC 39419 oder einen Sandarmycin- produzierenden Mutanten, der aus diesem Stamm gemäß bekannten Verfahren produziert werden kann, unter submersen aeroben Bedingungen in einem assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Kulturmedium kultiviert und das Sandramycin aus dem Kulturmedium isoliert.

4. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend Sandramycin gemäß Anspruch 2, gewünschtenfalls zusammen mit einem pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel.