DE2746209C2

DE2746209C2 -

Info

Publication number: DE2746209C2
Application number: DE2746209A
Authority: DE
Inventors: Eiji Takarazuka Hyogo Jp Higashide; Mitsuko Takatsuki Osaka Jp Asai; Seiichi Kyoto Jp Tanida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-14
Publication date: 1990-10-31
Also published as: GR66051B; YU245377A; DE2746209A1; SE8302517L; IT7821818A0; PT67854A; ES472230A1; CS214749B2; PL122289B1; NL7711274A; IT1094308B; SE7711542L; SE446004B; IE46064B1; IE46064L; HU178359B; CA1107212A; GB1586688A; PH13381A; SE442873B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika, nämlich Antibiotika C-15003, und auf ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Antibiotika.

Es wurden verschiedene Bodenproben und andere Proben gesammelt und die daraus isolierten Mikroorganismen gesichtet. Dabei wurde festgestellt, daß diese Mikroorganismen teilweise ein neues Antibiotikum zu erzeugen vermögen, daß solche Mikroorganismen der Gattung Nocardia angehören und daß durch die Züchtung solcher Mikroorganismen in einem geeigneten Medium in der Kulturbrühe das oben bezeichnete Antibiotikum angereichert werden kann. Es wurde ferner festgestellt, daß aus diesem Antibiotikum Derivate hergestellt werden können. Diese Feststellungen haben zur Erfindung geführt.

Die Erfindung bezieht sich somit auf:

(1) Ein durch Anspruch 1 gekennzeichnetes Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C-15003, welche der folgenden allgemeinen Formel entsprechen:

worin

bedeutet.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der folgenden Formel:

welches darin besteht, daß man den Antibiotika C-15003-Komplex, bestehend aus folgenden Verbindungen der allgemeinen Formel:

worin

bedeutet, reduktiv hydrolysiert und das durch Anspruch 2 gekennzeichnet wird.

In der Beschreibung bedeutet die Bezeichnung "Antibiotikum C-15003" generell die drei Verbindungen der oben erwähnten allgemeinen Formel I als Gruppe oder eine Mischung von zwei oder drei der besagten Verbindungen. Mit Bezug auf die allgemeine Formel I wird die Verbindung, in welcher R den Rest

darstellt, in der Beschreibung als "Antibiotikum C-15003 P-3" oder nur "C-15003 P-3" bezeichnet. Die Verbindung, in welcher R den Rest -CO-CH₂-CH₂-CH₃ darstellt, wird als "Antibiotikum C-15003 P-3′" oder nur "C-15003 P-3′" bezeichnet. Die Verbindung, in welcher R den Rest

darstellt, wird in der Beschreibung als "Antibiotikum C-15003 P-4" oder nur "C-15003 P-4" bezeichnet und die Verbindung, in welcher R ein Wasserstoffatom bedeutet (womit diese Verbindung der allgemeinen Formel II entspricht), wird nachstehend als "Antibiotikum C-15003 P-0" oder nur "C-15003 P-0" bezeichnet.

Der das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes eines Mikroorganismus wurde als Actinomycetenstamm Nr. C-15003 bezeichnet, welcher aus dem Boden oder anderen Proben bei der Sichtung von ein Antibiotikum erzeugenden Mikroorganismen isoliert worden ist.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling & Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht. Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28°C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt sich zu Verzweigungen, und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium. Manche der Hyphen haben einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 µm und können sich in gewissen Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50-200×200-1000 µm), auf welchen weiteres Luftmycel wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, daß nur in wenigen Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen, während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale (0,8-1,2 µm×4,8-6,8 µm) und ellipsoidale (0,8-1,2 µm×1,0-2,0 µm) Körper, welche Arthrosporen ähneln, enthielten.

Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, daß diese Körper glatte Oberflächen haben.

2) Zellenzusammensetzung

Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP Nr. 1- Medium während 66 bis 90 Stunden bei 28°C unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, 421 (1964)] und der Methode nach M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 (1968)] wurden die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose deuteten.

3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigte ein verhältnismäßig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blaßgelb und in den letzteren Phasen hellgelblichlohfarben bis gelblichlohfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulvrig und zeigte im allgemeinen ein mäßiges Wachstum bei weißer bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomischen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.

Tabelle I Züchtungseigenschaften des Stammes Nr. C-15003 auf taxonomischen Medien

(A) Saccharosenitrat-Agar:
Wachstum (G): massig, leuchtendmelonengelb (3 ia)*) bis bernsteinlohfarben (3 lc)*), Bildung von coremiaähnlichen Gebilden
Luftmycel (AM): spärlich, weiß
Lösliches Pigment (SP): keines oder blaß gelblichlohfarben
(B) Glycerinnitrat-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*), Bildung von coremiaähnlichen Gebilden
AM: mäßig, weiß
SP: kein
(C) Glucose-Asparagin-Agar:
G: mäßig, hellringelblumenfarbig (3 pa)*) bis leuchtendgelb (2 pa)*)
AM: spärlich, weiß
SP: leuchtendgelb (2 pa)*)
(D) Glycerin-Asparagin-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiß
SP: kein
(E) Stärkeagar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellweizenfarbig (2 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kein
(F) Nähragar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis khakigelb (2 ga)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiß
SP: kein
(G) Calciummaleat-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellweizenfarbig (2 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kein
(H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:
G: mäßig, bernsteinfarbig (3 lc)*) bis leuchtend gelb (3 la)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kein
(I) Hafermehl-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis khakigelb (2 ga)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiß bis hellgelb
SP: kein
(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:
G: mäßig, khakigelb (2 ga)*)
AM: kein
SP: khakigelb (2 ga)*)
(K) Tyrosin-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellmelonengelb (3 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kamelfarben (3 ie)*)

*) Farbcode nach "Color Harmony Manual", 4. Auflage (Container Corporation of America, 1958)

4) Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich für das Wachstum lag bei 12 bis 38°C. Der Temperaturbereich, in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP Nr. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35°C.

Tabelle II

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. C-15003 waren die folgenden:

Temperaturbereich für das Wachstum:
12 bis 38°C
Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels:	20 bis 35°C
Verflüssigung von Gelatine:	positiv
Hydrolyse von Stärke:	positiv
Reduktion von Nitraten:	positiv	Peptonisierung von Milch:	positiv
Coagulierung von Milch:	negativ
Zersetzung von Casein:	positiv
Herstellung von Melanoid-Pigmenten:	negativ (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), positiv (Tyrosin-Agar)
Zersetzung von Tyrosin:	positiv
Zersetzung von Xanthin:	negativ
Zersetzung von Hypoxanthin:	negativ
Toleranz in bezug auf Lysozym:	positiv
Toleranz in bezug auf Natriumchlorid:	2%

5) Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen

Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology 56, (1948), 107] beschrieben ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1% Hefeextrakt untersucht. Dabei ließen sich die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte eruieren.

Tabelle III

Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm Nr. C-15003

6) Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular Biology, 3, 208 (1961)] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cytosin)- Gehalt des DNA betrug ungefähr 71 Mol-%.

Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.

Die obigen Eigenschaften des Stammes Nr. C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes" Bd. 2 [The Williams ans Wilkins Co., 1961]; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974"; und anderen Literaturstellen verglichen.

Es wurde angenommen, daß dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu schließen, daß dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen darstellt.

Der besagte Stamm Nr. C-15003 ist beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM)" unter der Nummer 3992, beim "Institute for Fermentation, Osake, (IFO)" unter der Nummer IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA" unter der Nummer 31281 registriert worden und kann von dort bezogen werden.

Während der Stamm Nr. C-15003, wie soeben erwähnt, eine neue Art der Gattung Nocardia ist, kann er, wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder unter dem Einfluß eines Mutagens. So sollten beispielsweise die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem Licht usw., durch Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind, sowie die Mutanten, die sich spontan aus dem Stamm ableiten, im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten Art betrachtet werden. So liefert beispielsweise der Stamm Nr. C-15003 durch verschiedene mutagene Behandlungen Mutanten, welche keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien, welche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben oder organgerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weißen Luftmycelien oder im wesentlichen ohne Luftmycelien.

Das Medium, welches für die Züchtung des den Antibiotika C-15003-Komplex erzeugenden Stammes verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, daß es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält. Vorzugsweise wird man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, welche durch den Stamm Nr. C-15003 assimiliert und verdaut werden, anorganische Stoffe, Spurennährmittel usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette und Öle, z. B. Sojabohnenöl, Specköl oder Hühneröl nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Baumwollsamenmehl, behandelte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat oder Ammoniumacetat verwendet werden. Das Medium kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze usw., Eisen-, Magnesium-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze, Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. und organische Salze, z. B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner kann das Medium zusätzlich verschiedene Aminosäuren, wie z. B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Methionin, Prolin etc. Peptide, z. B. Dipeptide, Tripeptide, Vitamine, z. B. die Vitamine B₁, B₂, Nicotinsäure, B₁₂, C, E, Nucleinsäuren, z. B. Purin, Pyrimidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine anorganische oder organische Säure, ein Alkali bzw. ein Puffermittel verwenden. Geeignete Mengen an Ölen, Fetten, oberflächenaktiven Mitteln können ebenfalls als schaumverhindernde Mittel zugesetzt werden.

Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submeren aeroben Bedingungen oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen. Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen hängen vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode und anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie bei 20 bis 35°C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr 7,0. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine solche von 23 bis 30°C bei einem anfänglichen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 anwenden. Auch die Inkubationsdauer schwankt je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Inkubation so lange fortsetzt, bis der Titer des gewünschten antibiotischen Produktes einen Maximalwert erreicht hat. Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr 48 bis 144 Stunden.

Das Wirkungsvermögen des Antibiotikums wurde mit Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus getestet. Dabei wurde der oben erwähnte Mikroorganismus auf einem Testmedium [20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt (Difco), 2 g Glucose, 1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarer Phosphatpuffer (pH 7,0)] bei 28°C während 44 bis 48 Stunden wachsen gelassen, worauf man das Wirkungsvermögen des Antibiotikums durch die Reihenverdünnungsmethode unter Beobachtung der Wachstumstrübung durch Aszites-Tumor- Zellen und durch Dünnschichtchromatographie, abgekürzt TLC, nach den weiter unten befindlichen Angaben bestimmt.

Die neuen Antibiotica C-15003 P-3, P-3′ und/oder P-4 wurden sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in der erzielten Kulturbrühe erhalten und angereichert.

Diese Substanzen sind auch durch TLC festgestellt worden. Die Fermentierungsbrühe wurde somit durch Filtrieren oder Zentrifugieren in Zellen und Filtrat aufgeteilt und das Filtrat mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Dann wurde den Zellen die gleiche Menge an 70%igem wäßrigen Aceton wie die Menge des Filtrates zugegeben, worauf man nach 1-stündigem Rühren bei 20°C die Suspension filtrierte. Das Aceton wurde aus dem Filtrat entfernt und das erhaltene wäßrige Filtrat mit Äthylacetat extrahiert. Jeder dieser Extrakte wurde im Volumenverhältnis 1 : 100 eingeengt und über einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Deutsche Bundesrepublik, Kieselgel 60 F₂₅₄, 0,25 mm, 20×20) (Lösungsmittelsystem: Chloroform und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 9 : 1) der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das Wirkungsvermögen wurde auf Grund der Intensität der bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 2537Å beobachteten Stellen bestimmt.

Die auf diese Weise in der Kulturbrühe erzeugten C-15003 P-3, P-3′ und/oder P-4 sind lipophile und neutrale Substanzen, welche sich durch bei der Gewinnung solcher mikrobiellen Metabolite normalerweise übliche Trenn- und Reinigungsmethoden isolieren lassen. So kann man so arbeiten, daß man sich die Unterschiede zwischen dem Antibiotikum und den Verunreinigungen bezüglich der Löslichkeit zu nutze macht. Man kann aber auch die fraktionierte Adsorptionsaffinität verschiedener Adsorptionsmittel, wie z. B. Aktivkohle, makroporöser, nichtionogener Harze, Kieselgel oder Aluminiumoxyd zur Anwendung bringen. Ferner kann man auch die Verunreinigungen mit Hilfe von Ionenaustauschharzen beseitigen.

Man kann aber schließlich auch andere Methoden oder aber die vorgenannten Methoden in geeigneter Kombination oder aber wiederholt anwenden.

Da, wie oben erwähnt, C-15003 P-3, P-3′ und P-4 sowohl im Filtrat als auch in den Zellen vorhanden sind, wird man die Antibiotika mit Hilfe eines solchen Adsorptionsmittels, sofern ein solches verwendet wird, entweder direkt oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle eines Filtrates oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle von mikrobiellen Zellen trennen und reinigen. Die Extraktion mit einem Lösungsmittel kann nach einer der folgenden Methode oder mit Hilfe einer anderen Methode, beispielsweise (1) durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturbrühe vor dem Abtrennen der Zellen und (2) durch Lösungsmittelextraktion der Zellen und des durch Filtrieren gewonnenen Filtrates, Zentrifugieren oder in anderer Weise, durchgeführt werden. Um das Filtrat und die Zellen unabhängig voneinander zu extrahieren, wird man die folgende Methode anwenden.

Für die Extraktion des Filtrates geeignete Lösungsmittel sind dem Prinzip nach mit Wasser nicht mischbare, organische Lösungsmittel, wie z. B. Fettsäureester, Äthylacetat oder Amylacetat, Alkohole, wie Butanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, und Ketone, z. B. Methylisobutylketon. Die Extraktion erfolgt bei einem dem neutralen pH-Wert nahen pH-Wert und die zuvor auf einen pH-Wert von 7 eingestellte Kulturflüssigkeit wird mittels Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf wird das Konzentrat mit einem nichtpolaren Lösungsmittel, nämlich Petroläther oder Hexan, versetzt und das rohe Produkt I, welches die wirksame Verbindung enthält, gewonnen. Da bei der Dünnschichtchromatographie zusätzlich zum Antibiotikum C-15003 eine gewisse Zahl von Stellen festgestellt werden, wird das Produkt I anschließend den folgenden Reinigungsverfahren unterzogen. Dabei zeigt sich, daß eine routinemäßige Reinigungsmethode, insbesondere die Adsorptionschromatographie, wertvoll ist, wobei für diesen Zweck eines der üblichen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminiumoxyd, ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz verwendet werden kann. Zur Reinigung des rohen Produktes I dient Kieselgel. Die Entwicklung erfolgt ausgehend von Petroläther und Hexan, während die Eluierung des Antibiotikums C-15003 durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, nämlich Äthylacetat, erfolgt. Man verwendet Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm) als Trägermittel und führt die Säulenchromatographie mit einer Mischung von Hexan und Äthylacetat durch, wobei der Hexananteil nacheinander zunimmt. Das Eluat wird gesammelt und durch TLC geprüft, wobei man die das Antibiotikum C-15003 enthaltenden Fraktionen sammelt und unter vermindertem Druck einengt. Hierauf versetzt man das Konzentrat mit Petroläther oder Hexan, wodurch das rohe Produkt II erhalten wird. Da dieses Produkt immer noch Verunreinigungen enthält, wird es in der nachstehend angegebenen Weise weiter gereinigt. So wird das Produkt II mit Hilfe einer zweiten Kieselgelsäule unter Verwendung eines andersartigen Lösungsmittelsystems gereinigt. Das für diesen Zweck verwendete Entwicklungssystem besteht aus dem halogenierten Kohlenwasserstoff, Chloroform, unter Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie dem Alkohol Methanol. Auf diese Weise läßt sich das Antibiotikum C-15003 isolieren. Die Reihenfolge der Lösungssysteme für diese erste und die zweite Kieselgelsäule kann auch umgekehrt werden.

Verwendet man für das Reinigen des rohen Produktes II ein makroporöses Adsorptionsharz, so erfolgt die Eluierung des Antibiotikum C-15003 mit einer Mischung von Wasser mit einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester. Als niederer Alkohol wird Methanol, und als niederes Keton Aceton verwendet. Man löst das rohe Produkt II in 60% wäßrigem Methanol und adsorbiert auf einer Säule von Diaion® HP-10 (vgl. Journal of Chemical Technology and Biotechn. Vol. 32 (1982) S. 109, 118, H. JISSAQ, S. CAZES, Thin-layer Chromatography Vol. 8, Nr. 16 (1985), S. 925-98. Mitsubishi Chemicals Adsorbents Diaiom Data Sheet, 4 P Series S. 1-10 Oktober 1976). Diese Säule wird anschließend mit 70%igem wäßrigem Methanol gewaschen und mit 90%igem wäßrigem Methanol eluiert. Auf diese Weise wird das Antibiotikum C-15003 aus der Säule eluiert.

Die das Antibiotikum C-15003 enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das getrocknete Produkt wird dann mit dem 5- bis 8-fachen Volumen Äthylacetat versetzt und das Gemisch stehengelassen, worauf sich Kristalle des Antibiotikums C-15003 ausscheiden. Diese Kristalle enthalten C-15003 P-3, P-3′ und P-4. Diese Verbindungen werden dann mit Hilfe eines Adsorptionsmittels der oben genannten Art voneinander getrennt. Verwendet man somit Kieselgel oder ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz und die oben erwähnten Lösungsmittel, so können die gewünschten Verbindungen fraktioniert eluiert werden. Verwendet man beispielsweise Kieselgel, so erfolgt die Entwicklung mittels Hexan, Äthylacetat oder einer Mischung von Chloroform und Methanol, wodurch C-15003 P-4, P-3′ und P-3 in der erwähnten Reihenfolge erhalten werden. Nach erfolgter Dünnschichtchromatographie werden die C-15003 P-4, P-3′ und P-3 entsprechenden Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und Äthylacetat den Konzentraten zugegeben. Auf diese Weise erhält man die entsprechenden Verbindungen in Form von Kristallen. Verwendet man ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz, so kann man eine stufenmäßige Eluierung mit schwankenden Verhältnissen an Alkohol, Keton oder Ester in bezug auf das Wasser anwenden. Bei Anwendung der stufenweisen Eluierungsmethode unter Verwendung von 60%igem wäßrigem Methanol und 95%igem wäßrigem Methanol unter Zugabe von 5% Natriumchlorid erhält man in der vorgenannten Reihenfolge C-15003 P-3, P-3′ und P-4. Nachdem man durch Dünnschichtchromatographie behandelt hat, wird jede Gruppe der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und aus Äthylacetat zum Auskristallisieren gebracht. Die isolierten Kristalle enthalten Äthylacetat als Kristallisierungslösungsmittel und zeigen nach dem Trocknen über Phosphorpentoxyd während 8 Stunden bei 70°C die nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Auf Grund der obigen Molekularformel und der nachstehend wiedergegebenen antimikrobiellen und tumorverhindernden Wirksamkeitswerte wurde das neue Antibiotikum mit den bekannten Gruppen von Antibiotika verglichen. In der Literatur ließ sich keine dem Antibiotikum C-15003 ähnliche Gruppe feststellen. Forschungen in bezug auf Substanzen, welche ähnliche Ultraviolettabsorptionswerte wie das vorliegende Antibiotikum liefern könnten und pflanzlichen oder natürlichen, organischen Ursprungs wären, führten zu den Maytansingruppen. Insbesondere auf Grund der in Frage kommenden Molekularformeln wurde vermutet, daß das Antibiotikum zur Maytansingruppe von Verbindungen, welche 2 Stickstoffatome enthalten, gehört. Maytansin wurde als eine Pflanzenkomponente erhalten. Hierüber wird in Journal of American Chemical Society 97, (1975), 5294 berichtet. Das Massenspektrum für Maytansin ist das folgende:

Die Werte m/e 485, 470 und 450 für C-15003 P-3, P-3′ und P-4 führen zur Überzeugung, daß diese Verbindungen eine identische Skelettstruktur mit jener von Maytansin haben mit dem Unterschied in der in 3-Stellung vorhandenen Acylgruppe. Es ergibt sich daraus eindeutig, daß die verschiedenen Komponenten des Antibiotikums C-15003 neue Verbindungen darstellen. Werden C-15003 P-3, P-3′ und P-4 mit einem Alkali behandelt und durch Gaschromatographie in bezug auf die in Freiheit gesetzten Carbonsäuren analysiert, so wird festgestellt, daß Isobuttersäure, Buttersäure und Isovaleriansäure aus C-15003 P-3, C-15003 P-3′ bzw. C-15003 P-4 erhältlich sind. Die Fig. 1 zeigt die Strukturen auf Grund der obigen Daten für C-15003 P-3, P-3′ und P-4.

Fig. 1

Biologische Wirkung A) Antimikrobielle Wirksamkeit

Mit Trypticase-Soja-Agar (BBL) als Versuchsmedium wurden die Hemmkonzentrationen gegenüber den weiter unten erwähnten Mikroorganismen mit Hilfe der Papierscheibenmethode festgestellt. Die Filterpapierscheiben (Toyo Seisakusho-dünner Typ) mit einem Durchmesser von 8 mm wurden jeweils mit 0,02 ml einer 300 µg/ml Lösung von C-15003 P-3, P-3′ oder P-4 imprägniert, worauf man diese Scheiben auf Platten anordnete, welche mit den weiter unten genannten Mikroorganismen beimpft waren, um die minimalen Hemmkonzentrationen festzustellen. Die erzielten Resultate zeigen, daß die Antibiotika in bezug auf die folgenden Mikroorganismen wirkungslos waren, nämlich Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Mycobacterium avium.

Andererseits wurde mit Agar-Platten, welche als Versuchsmedium 3,5 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g Monokaliumdihydrogenphosphat, 5 g Hefeextrakt (Difco), 10 g Glucose, 15 g Agar und 1000 ml destilliertes Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 enthielten, die Wachstumsverhinderung gegenüber Talaromyces avellaneus getestet. Bei diesem Testversuch lagen die minimalen Hemmkonzentrationen bei 3 µg/ml für C-15003 P-3 und P-3′ und 1,5 µg/ml für C-15003 P-4. Ferner wurde der wilde Stamm von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus auf einem Testmedium, bestehend aus 20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt, 2 g Glucose, 1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, bei 28°C während 44 bis 48 Stunden gezüchtet und hierauf die Hemmwirkung auf das Wachstum der antibiotischen Verbindungen in bezug auf diesen speziellen Mikroorganismus durch die Serienverdünnungsmethode bestimmt. Die Wachstumsinhibitoren trat bei 1µg/ml für C-15003 P-3 und P-3′ und bei 0,5 µg/ml für C-15003 P-4 ein.

Die fungizide bzw. fungistatische Wirksamkeit findet sich in der Tabelle V. Wie aus dieser Tabelle V hervorgeht, besitzt das Antibiotikum C-15003 eine Hemmwirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, welche Pflanzenkrankheiten verursachen. Die mit 0,02 ml einer 1000 µg/ml Lösung von C-15003 imprägnierten Filterpapierscheiben wurden auf mit den in der Tabelle V erwähnten Mikroorganismen inokulierte Platten gebracht.

Tabelle V

Antimikrobielle Spektren

B) Cytostatische Wirkung

Die therapeutischen Wirkungen von C-15003 P-3, P-3′ und P-4, nach einer 9-tägigen, intraperitonealen Dosierung in bezug auf P 388-Leukämie bei Mäusen (1×10⁶ Zellen/Tiere, nämlich Mäusen, wurden bestimmt. Die Resultate haben gezeigt, daß bezüglich des lebensverlängernden Verlaufes diese Verbindungen eine cytostatische Wirkung aufwiesen, welche, verglichen mit einer Dosismenge von 0,00625 mg/kg/Tag, einem Wert von 200% entsprach.

C) Toxizität

Bei einem akuten Toxizitätstest mit Mäusen als Testtiere, denen man intraperitoneal C-15003 P-3, P-3′ und P-4 injizierte, ergab sich mit diesen Antibiotika ein LD₅₀-Wert von mehr als 0,313 mg/kg.

Wie bereits erwähnt, zeichnet sich das Antibiotikum C-15003 durch eine starke Hemmwirkung gegenüber Fungi- und Protozoen aus. Darüber hinaus übt das Antibiotikum C-15003 bei mit Tumoren behafteten Säugetieren, z. B. Mäusen, eine lebensverlängernde Wirkung aus.

Das Antibiotikum C-15003 kann unter Beachten seiner Toxizität auch im Zusammenhang mit der bakteriellen Ökologie im Boden, in Belebtschlämmen, in der tierischen Körperflüssigkeit verwendet werden. Wünscht man daher wertvolle Bakterien aus einer Bodenprobe zu isolieren oder will man die Wirkungen von Bakterien unabhängig von jenen von Pilzen und Protozoen bei der Bearbeitung und Analyse von Belebtschlammsystemen, wie sie bei der Behandlung von Abwässern Verwendung finden, einschätzen, so kann man das neue Antibiotikum dazu einsetzen, um ein selektives Wachsen der bakteriellen Flora zu fördern, ohne ein gleichzeitiges Wachsen der Pilze und Protozoen zu begünstigen. Gemäß einem besonderen Beispiel kann man eine Probe einem flüssigen oder festen Medium und überdies 0,1 ml einer 10 bis 100 µg/ml-Lösung des Antibiotikums in einer 1%igen wäßrigen Methanollösung pro ml des Mediums zusetzen, worauf man eine Inkubation einleitet.

Es ergibt sich daher, daß C-15003 P-3, P-3′ und P-4 neue Verbindungen darstellen, welche die gleiche Skelettstruktur haben und überdies als Zwischenprodukte für die Herstellung von anderen pharmazeutisch wertvollen Verbindungen verwendet werden können. So kann man beispielsweise aus dem erfindungsgemäßen Antibiotikum durch Desacylierungsreaktion P-15003 P-0 (Maytansinol) mit einer Hydroxylgruppe in der 3-Stellung erhalten. Da sich die Acylgruppe in β-Stellung zur Carbonylgruppe befindet, kann man sich der üblichen reduktiven Hydrolysereaktion bedienen. Man kann daher mit Hilfe eines komplexen Metallhydrids, z. B. Lithium-Aluminiumhydrid (LiAlH₄), bei niedriger Temperatur von beispielsweise -20°C die O-Esterbindung in der 3-Stellung hydrolytisch spalten, ohne aber andere funktionelle Gruppen, z. B. die Carbonyl-, Epoxy-, Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindungen usw., zu beeinträchtigen, um auf diese Weise zu Maytansinol zu gelangen. Die physikalischen und chemischen Daten, welche man mit einer derweise erhaltenen Maytansinolprobe erzielt, sind in guter Übereinstimmung mit den Daten, welche man gemäß Kupchan et al, The Journal of American Chemical Society 97, (1975), 5294-6295 erzielt.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils Gew.-Teile, sofern nicht anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "%" bezieht sich auf "Gew./Vol.", sofern nicht anderes ausgesagt wird.

Beispiel 1

Nocardia Nr. C-15003 (IFO 13726; FERM 3992; ATCC 31281), welcher auf einem Medium (Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) gezüchtet worden war, wurde verwendet, um einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher 40 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums (2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1% rohes Sojabohnenmehl, 1% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Polypepton, 0,3% NaCl, 0,5% CaCO₃, pH 7,0) enthielt, zu beimpfen. Das geimpfte Medium wurde während 48 Stunden bei 28°C inkubiert, um ein Inokulum zu erhalten. 0,5 Vol.-Teile des so erhaltenen Inokulums wurden in einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher 40 Vol.-Teile eines Fermentiermediums enthielt, welches aus 5% Dextrin, 3% Maisquellflüssigkeit, 0,1% Polypepton und 0,5% Calciumcarbonat (pH 7,0) bestand, eingebracht und während 90 Stunden bei 28°C gezüchtet, um auf diese Weise ein Inokulum (Samenkultur) zu erhalten.

Wie nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus und C-15003 P-3 als Standardprobe festgestellt werden konnte, wies die obige Kultur einen Titer von 25 µg/ml auf.

Beispiel 2

10 Vol.-Teile des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Inokulums (Impfmaterial) wurden einem 2000 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter zugesetzt, welcher 500 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie oben enthielt, worauf man während 48 Stunden bei 28°C brütete. 500 Vol.-Teile der so erhaltenen Kultur wurden in einen 50 000 Vol.-Teile fassenden Tank aus rostfreiem Stahl eingetragen, welcher 30 000 Vol.-Teile Samenkulturmedium enthielt, worauf man die Züchtung unter Belüftung (30 000 Vol.-Teile/ Minute) bei 28°C züchtete und bei einem Innendruck von 1 kg/cm² bei 280 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) rührte, um auf diese Weise eine Samenkultur zu erhalten. Diese Kultur wurde zum Animpfen eines aus rostfreiem Stahl bestehenden Tanks mit einem Fassungsvermögen von 200 000 Vol.-Teilen verwendet, welcher 100 000 Vol.-Teile eines Fermentationsmediums ähnlicher Zusammensetzung wie im obigen Beispiel 1 enthielt, wobei eine Impfrate von 10% eingehalten wurde. Das angeimpfte Medium wurde unter Belüftung (100 000 Vol.-Teile/Minute) bei 28°C inkubiert und bei einem Innendruck von 1 kg/cm² während 90 Minuten bei 200 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) gerührt. Bei der Bestimmung des Titers in gleicher Weise wie in Beispiel 1 konnte man feststellen, daß die so erhaltene Kultur einen Titer von 25 µg/ml aufwies.

Beispiel 3

95 000 Vol.-Teile der nach den Angaben in Beispiel 1 erhaltenen Kultur wurden mit 2000 Teilen Hyflo-supercel® (Johnes and Manville Products, USA) versetzt und das Gemisch nach gründlichem Mischen über einem Druckfilter filtriert, wobei 85 000 Vol.-Teile Filtrat und 32 000 Teile feuchte Zellen erhalten wurden. Das Filtrat (85 000 Vol.-Teile) wurde gerührt und mit 30 000 Vol.-Teilen Äthylacetat extrahiert. Diese Maßnahme wurde ein weiteres Mal wiederholt. Die Äthylacetatschichten wurden gesammelt, zweimal mit jeweils 30 000 Vol.-Teilen Wasser gewaschen, durch Zugabe von 500 Teilen wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 Vol.-Teile eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen (53 Teile). Dieses rohe Produkt I wurde mit 100 Vol.-Teilen Äthylacetat verrührt, worauf die unlöslichen Bestandteile abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde mit 10 Teilen Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesreplublik, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt und das Äthylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Kieselgelsäule (400 Vol.-Teile) zugegeben. Dann wurde mit 500 Vol.-Teilen Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 3 : 1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 1 : 1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 1 : 3), 500 Vol.-Teilen Äthylacetat und 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Äthylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 50 : 1) eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 Vol.-Teilen gesammelt wurde.

1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne eingeengt, worauf man dem Konzentrat 0,1 Vol.-Teil Äthylacetat hinzugab. Dann wurde das Gemisch auf eine 2,5 cm über dem unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 60 F₂₅₄, 0,25 mm, 20×20) liegende Stelle aufgebracht und in einer Länge von ungefähr 17 cm mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 19 : 1) entwickelt. Nach erfolgter Entwicklung wurde mit ultraviolettem Licht (253 Å) das gewünschte Produkt festgestellt.

Die aktiven Fraktionen Nr. 23-28 mit Rf 0,6-0,65 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck jeweils auf ungefähr 20 Vol.-Teile eingeengt. Diese Konzentrate wurden jeweils mit 150 Vol.-Teile Petroläther versetzt, wobei man 15 Teile eines rohen Produktes II erhielt.

Beispiel 4

32 000 Teile der gemäß Beispiel 3 erhaltenen feuchten Zellen wurden unter Rühren mit 50 000 Vol.-Teilen 70%igem wäßrigen Aceton während 3 Stunden extrahiert und hierauf auf einem Druckfilter filtriert. Die Extraktion mittels 50 000 Vol.-Teilen 70%igem wäßrigem Aceton und die anschließende Filtrierung wurden einmal mehr wiederholt. Die Filtrate wurden gesammelt und das Aceton durch Einengen unter vermindertem Druck entfernt. Das entstandene, wäßrige System wurde durch eine Säule von 5000 Vol.-Teilen Diaion HP-10® hindurchgeleitet. Die Säule wurde mit 20 000 Vol.-Teilen Wasser und 50%igem wäßrigem Methanol gewaschen und anschließend mit 15 000 Vol.-Teilen 90%igem wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 3000 Vol.-Teile eingeengt und mit 3000 Vol.-Teilen Wasser und 3000 Vol.-Teilen Äthylacetat geschüttelt. Diese Arbeitsweise wurde einmal mehr wiederholt. Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Dann wurde Petroläther hinzugegeben und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gesammelt. Dieses Produkt wurde mittels einer Kieselgelsäure gereinigt, wobei man 8,0 Teile rohes Produkt II erhielt.

Beispiel 5

In 10 Vol.-Teilen Äthylacetat wurden 1,5 Teile des nach dem obigen Beispiel 3 erhaltenen rohen Produktes II gelöst und die Lösung gründlich mit 4 Teilen Kieselgel (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt. Das Äthylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 300 Vol.-Teilen Kieselgel eingeführt und die Säule zuerst mit 500 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 50 : 1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20 : 1) und 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (10 : 1) eluiert. Diese Eluate wurden in Fraktionen von 25 Vol.-Teilen gesammelt.

Jeweils 0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 0,05 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt und das Gemisch der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem: Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis 9 : 1) unterworfen.

Die bei 2537 Å absorbierenden Fraktionen Nr. 39 und 40 der Zone von RF 0,50-0,60 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde hierauf mit 2 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,150 Teile Antibiotikum C-15003 in Form von Kristallen erhielt.

Die obigen Kristalle des Antibiotikums C-15003 (0,150 Teile) wurden in 15 Vol.-Teilen Methanol gelöst und dann mit 0,300 Teilen Natriumchlorid und 15 Vol.-Teilen Wasser versetzt. Eine mit 200 Vol.-Teilen Diaion PH-10® gefüllte Säule wurde mit 600 Vol.-Teilen 50%igem wäßrigem Methanol, enthaltend 5% Natriumchlorid, beschickt. Die so hergestellte Lösung wurde durch eine Säule geführt und eine Gradienten-Eluierung unter Verwendung von 1500 Vol.-Teilen 60%igem wäßrigem Methanol, enthaltend 5% Natriumchlorid, und 1500 Vol.-Teilen 95%igem wäßrigem Methanol durchgeführt.

Das Eluat wurde in verschiedenen Fraktionen von jeweils 15 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion mittels Kieselgel durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Die Fraktionen 145 bis 153 enthielten C-15003 P-3, die Fraktionen 167 bis 180 enthielten C-15003 P-3′ und P-4 und die Fraktionen 185 bis 190 enthielten C-15003 P-4.

Jede Gruppe der Fraktionen wurde eingeengt und durch Zugabe von 50 Vol.-Teilen Wasser und 100 Vol.-Teilen Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde in einem Scheidetrichter geschüttelt und die wäßrige Schicht abgetrennt. Nach zweimaligem Waschen mit jeweils 50 Vol.-Teilen Wasser wurde die Äthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehen gelassen. Auf diese Weise erhielt man in jeder Gruppe der Fraktionen Kristalle. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet:

C-15003 P-3
0,070 Teile
C-15003 P-3′, P-4	0,018 Teile
C-15003 P-4	0,015 Teile

Die gemischten Kristalle von C-15003 P-3′ und P-4 (0,018 Teile) wurden in 0,3 Vol.-Teilen Äthylacetat gelöst und auf einer Linie in einem Abstand von 2,5 cm über dem unteren Rande einer Kieselgelglasplatte (Merck, Deutsche Bundesrepublik, Kieselgel 60 F₂₅₄ 0,25 mm, 20×20) aufgetragen, worauf man mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 19 : 1) entwickelte. Nach dieser Entwicklung auf ungefähr 18 cm wurde die Absorptionsbande bei Rf 0,68 (P-4) und Rf 0,65 (P-3′) abgeschabt und jede Bande unabhängig zweimal mit jeweils wenig Wasser enthaltendem Äthylacetat extrahiert. Der entstandene Äthylacetatextrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. unter vermindertem Druck eingeengt und stehen gelassen.

0,010 Teile der Kristalle von C-15003 P-4 und 0,003 Teile der Kristalle von C-15003 P-3′ wurden aus den Fraktionen mit Rf 0,68 bzw. Rf 0,65 erhalten.

Beispiel 6

1000 Vol.-Teile der Kultur gemäß Beispiel 2 wurden in einem Tank aus rostfreiem Stahl, welcher ein Fassungsvermögen von 200 000 Vol.-Teilen aufwies und 100 000 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums enthielt, geimpft und das angeimpfte Medium unter Belüftung (100 000 Vol.-Teile/ Minute) und unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute während 48 Stunden bei 28°C bebrütet, um eine Samenkultur zu erhalten. Diese Samenkultur wurde in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2 000 000 Vol.-Teilen, welcher 1 000 000 Vol.-Teile eines Fermentiermediums gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt, bei einer Transplantationsrate von 10% eingetragen. Die Züchtung erfolgte unter Belüftung (1 000 000 Vol.-Teile/Minute) bei 28°C während 90 Stunden unter Rühren bei 120 Umdrehungen pro Minute (1/3 DT) und bei einem Innendruck von 1 kg/cm². Die so entstandene Kultur wies beim Testen gemäß der Methode nach Beispiel 1 einen Titer von 20 µg/ml auf.

900 000 Vol.-Teile der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden mit 900 000 Vol.-Teilen Aceton versetzt und nach 1-stündigem Rühren mit 20 000 Teilen Hyflo-Supercel (Johnes & Manville, USA) versetzt. Dieses Gemisch wurde weiter gerührt und in einer Druckfiltermaschine filtriert.

1 700 000 Vol.-Teile des so erhaltenen Filtrates wurden mit 500 000 Vol.-Teilen Wasser versetzt und das Gemisch in einer Podbielniak-Vorrichtung (Podbielniak, Inc., USA) mit 1 000 000 Vol.-Teilen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 68 Teile des rohen Produktes I. Hierauf wurde dieses rohe Produkt nach den Angaben, wie sie in den Beispielen 3, 4 und 5 gemacht worden sind, gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 9,5 Teile C-15003 P-3, 0,300 Teile C-15003 P-3′ und 2,5 Teile C-15003 P-4.

Beispiel 7

In 1 Vol.-Teil Tetrahydrofuran wurden 0,015 Teile des Antibiotikums C-15003 in Form der gemäß Beispiel 5 erhaltenen Kristalle gelöst, worauf man auf -5°C kühlte und 0,012 Teile Lithiumaluminiumhydrid hinzugab. Die Mischung wurde 2 Stunden stehen gelassen, nach der Zugabe von 0,5 Vol.-Teilen einer 1%igen wäßrigen Schwefelsäurelösung wurde das Reaktionsgemisch mit 2 Vol.-Teilen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf erfolgte eine präparative Dünnschichtchromatographie mit Kieselgel, worauf die Zone mit Rf 0,25 bis 0,3 abgeschabt wurde. Dann wurde mit wenig Wasser enthaltendem Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf sich Kristalle ausschieden. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 0,010 Teile P-15003 P-0 vom Schmelzpunkt 174°C.

Elementaranalyse für C₂₈H₃₇ClN₂O₈:
Berechnet: C 59,52; H 6,60; N 4,96; Cl 6,27;
Gefunden: C 59,65; H 6,58; N 5,02; Cl 6,51.
IR: 1715, 1670, 1580 (cm^-1)
UV (nm): 232(32 750), 244 (sh, 30 850), 252 (31 650), 281 (5750), 288 (5700).

Bezüglich der Eigenschaften war dieses Produkt mit Maytansinol identisch.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika (C-15003) der folgenden allgemeinen Formel: worin R den Rest darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Nocardia Nr. C-15003, hinterlegt beim Institute for Fermentation, Osaka mit der Hinterlegungsnummer IFO 13726=ATCC 31281, in einem üblichen Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 35°C und einem anfänglichen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 so lange züchtet, bis die Antibiotika darin angereichert sind, worauf die Trennung und Isolierung der Einzelbestandteile unter Kontrolle der Anreicherung durch mikrobiologische oder physikalische Methoden erfolgt,

- indem man das Kulturfiltrat einer Lösungsmittelextraktion mittels Ethylacetat unterzieht, den Extrakt einer Gradienten-Chromatographie an Kieselgel mittels Hexan-Ethylacetat (3∼1 : 1∼3) als Eluent, einer Säulenchromatographie an Kieselgel mittels Chloroform- Methanol (50∼10 : 1) als Eluent und dann einer Säulenchromatographie an einer Diaion HP10 Säule (einem makro-porösen Styrol-Divinylbenzol- Copolymeren mit hydrophoben unpolaren, nicht- ionischen Eigenschaften und einer spezifischen Oberfläche von 501,3 m²/g und einem Porenvolumen von 0,64 ml/g, welches von Mitsubishi Chemical Industries vertrieben wird) mittels Methanol- Wasser (1,5∼1,9 : 1) als Eluent unterzieht, oder
- indem man die mikrobiellen Zellen einer Lösungsmittelextraktion mittels Aceton-Wasser (7 : 3) unterzieht, den Extrakt einer Säulenchromatographie an einer Diaion HP-10 Säule mittels Wasser- Methanol (9 : 1) als Eluent, einer Lösungsmittelextraktion mittels Ethylacetat als Eluent, einer Gradienten- Säulenchromatographie an Kieselgel mittels Hexan- Ethylacetat (3∼1 : 1∼3) als Eluent, einer Säulenchromatographie an Kieselgel mittels Chloroform- Methanol (50∼10 : 1) als Eluent und dann einer Säulenchromatographie an einer Diaion HP-10 Säule mittels Methanol-Wasser (1,5∼19 : 1) als Eluent unterzieht,

wobei man die Fraktionen der Verbindungen, worin R -COCH(CH₃)₂ (P-3) bedeutet und die Verbindung, worin R -COCH₂CH(CH₃)₂ (P-4) bedeutet und eine Mischung der Verbindungen, worin R -COCH₂CH₂CH₃ (P-3′) und (P-4) ist, nacheinander auffängt, getrennt aufarbeitet und daraus die Einzelverbindungen auf übliche Weise isoliert, erhält und man weiterhin die Mischung (P-3′, P-4) einer üblichen Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterzieht, wobei eine Trennung mittels UV-Licht kontrolliert und (P-3′) und (P-4) durch Eluieren und anschließende Isolierung erhalten werden.

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der folgenden Formel: dadurch gekennzeichnet, daß man den Antibiotika C-15003- Komplex, bestehend aus folgenden Verbindungen der allgemeinen Formel: worin R den Rest bedeutet, erhalten durch Züchtung von Nocardia Nr. C-15003 gemäß Anspruch 1 als Rohprodukt einer reduktiven Hydrolyse bei -20°C bis 0°C mittels eines komplexen Metallhydrids unterwirft.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Lithiumaluminiumhydrid als Metallhydrid und Tetrahydrofuran als Lösungsmittel arbeitet, mit Alkylacetat extrahiert und schließlich eine Dünnschichtchromatographie an Kieselgel/Äthylacetat/ Wasser durchführt.