DE2817113A1 - Hydroxynovobiocinartige verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Novobiocin stellt ein Antibiotikum dar, das sich zur Behandlung von Staphyiolcokkeninfektionen und von Infektionen des Urinaltrakts mit bestimmten Proteus-Stämmen eignet. Es zeigt keine Kreuzresistenz mit Penicillin und ist gegen penicillinresistente Staphylococcus aureus-Stämme aktiv. Novobiocin erhält man durch Fermentation mit Hilfe von Streptomyceten. Die Verfahren zur Herstellung, Reindarstellung und Reinigung von Novobiocin werden in der US-PS 3 049 534 beschrieben.

Dihydronovobiocin stellt ebenfalls ein Antibiotikum dar, das man durch Hydrieren von Novobiocin entsprechend den in der US-PS 3 175 944 geschilderten Maßnahmen erhält.

Wie bei sämtlichen Antibiotika ist es immer in hohem Maße von Vorteil, davon Derivate und Analoge herzustellen, da diese oftmals zu neuen Antibiotika erhöhter Wirksamkeit, weniger oder weniger schweren Nebenwirkungen und/oder eines anderen Spektrums antibiotischer Aktivität führen. So ist beispielsweise aus der US-PS 3 652 536 ein enzymatisches Verfahren zur Spaltung von Novobiocin unter Gewinnung von Novenamin bekannt. In der US-PS 3 890 297 ist ein selektives Verfahren zur N-Acylierung von Novenamin unter Bildung von Novobiocinanalogen mit antibakterieller Aktivität 'beschrieben.

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- ti -

Aus den US-PSen 2 525 411t 2 958 899» 2 945 064. 3 049 und 3 445 455» den GB-PSen 856 816 und 997 179 sowie den DE-PSen 1 088 982 und 1 076 144 sind weitere Novobiocinmodifikationen bekannt.

Keine der genannten literaturstellen ist jedoch mit einer Modifizierung der Isopentenylseitenkette am Benzamidoring befaßt. Soweit bekannt, führt lediglich eine Kombination der aus den US-PSen 3 652 536 und 3 890 297 bekannten Maßnahmen zu einer brauchbaren Methode zur Herstellung solcher Analoger.

Gegenstand der Erfindung sind hydroxynovobiocinartige Verbindungen der Formel:

in;

bzw. ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze» wobei den Parametern Rr-, Eo, Z und die später definierten Bedeutungen zukommen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von hydroxynovobiocinartigen Verbindungen der Formel:

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OH

welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

1) Sebekia benihana · DSM 1326 und/oder ihre novobiocinhydroxylierenden Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet;

2) mit der Sebekia benihana-Kultur eine Novobiocinverbindung der Formel:

in Berührung bringt und

3) die hydroxynovobiocinartige Verbindung der Formel (II)

worin R₁-, R₍,» Z und die im folgenden angegebene

5 ο

Bedeutung besitzen,
reindarstellt.

Im folgenden werden die einzelnen Parameter näher erläutert, Die jeweilige Erläuterung gilt für die gesamten vorhergehen-

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den und folgenden Ausführungen:

Rc und R_ß können gleich oder verschieden sein und beispielsweise für Wasserstoff- oder Halogenatome, Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoff atom (en) ,^{+ 1}Witro-, Cyano- oder Carboxylreste oder Reste der Formel -NR R₀ stehen.

o. Ja

R und R_ß können gleich oder verschieden sein und für Wasserstoffatome oder Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatom(en) stehen.

Unter Alkylresten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatom(en) sind beispielsweise Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Pentylreste oder deren Isomere zu verstehen.

Unter Alkenylresten mit 1 bis 5 Kohlenstoffatom(en) sind beispielsweise Propenyl-, 2-Butenyl- oder 3-Pentenylreste oder deren Isomere zu verstehen.

Unter Halogenatomen sind "Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatome¹¹ zu verstehen.

steht für eine Einfach- oder Doppelbindung.

Der Rest Z kann ein Wasserstoffatom oder einen Rest der Formel

•f) AlkenylrerVe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatom(en)

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in welcher R für einen Amino-, 2-Pyrryl-, 2-(5-Methyl)-pyrryl-, 2-Furyl- oder 2-(5-Methyl)-furylrest steht, darstellen.

Die Lyxosidformel steht für keine spezielle stereochemische .Beziehung. . ·

"Pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf Eigenschaften und/ oder Substanzen, die für den Patienten aus pharmakologisch/toxikologischen Gesichtspunkten und für den herstellenden Arzneimittelchemiker aus physikalisch-chemischen Gesichtspunkten hinsichtlich Zusammensetzung, Rezeptur, Stabilität, Akzeptabilität für den Patienten und biologische Verfügbarkeit annehmbar sind.

Sämtliche Temperaturangaben beziehen sich auf ⁰C.

TLC steht für Dünnschichtchromatographie.

SSB steht für ein Gemisch aus isomeren Hexanen,;

Unter einer "Salzlake" ist eine wäßrige gesättigte Natriumchloridlösung zu verstehen.

Dicalite 4200 bezeichnet eine von der Pa. Greico, Inc., Los Angeles, Californien/USA, vertriebene Diatomeenerde.

TYG steht für ein Nährmedium mit Trypton, Hefeextrakt und Glukose.

UCON bezeichnet ein. von der Fa. Union Carbide, New York, N.Y./USA vertriebenes Gemisch aus Polypropylenglykol und Polyäthylenglykol.

IR steht für Infrarotspektroskopie.

UV steht für UV-Spektroskopie.

NMK steht für Kernresonanzspektroskopie.

Bei Verwendung von Lösungsmittelpaaren wird das Verhältnis der Lösungsmittel untereinander als Volumenverhältnis (v/v) angegeben.

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Unter "Inberührungbringen" ist

1. der Zusatz einer novobiocinartigen Verbindung der Formel (i) zu einer wachsenden Kultur von Sebekia benihana oder

2. die Zugabe einer wachsenden Kultur von Sebekia benihana zu einem Fermentationsmaterial, in dem eine novobiocinartige Verbindung der Formel (I) entstanden ist,

zu verstehen.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wurde weitgehend untersucht und charakterisiert.

Es hat sich gezeigt, daß ein aus einer Bodenprobe isolierter ungewöhnlicher Actinomycet Eigenschaften aufweist, durch die er sich von beschriebenen Actinomycetengattungen unterscheiden läßt.

Als Actinomyceten charakterisierte Organismen sind in Teil "Actinomycetes and Related Organisms" in der 8.Ausgabe von Bergey's Manual (D. Gottlieb, 1974» Order 1, Actinomycetales Buchanan 1917» Seiten 657-659, in R.E. Buchanan und N.E. Gibbons (Herausgeber) Bergey's manual of determinative bacteriology, 8.Ausgabe, The Williams & Wilkins Co., Baltimore) beschrieben. Die neue Kultur ist aerob bis möglicherweise anaerob, bildet verzweigende Fäden mit einem Substratdurchmesser von 0,7 bis 0,9 μπι und Luft (0,6 μια)-Sporen in Ketten von in der Regel 10 oder weniger sowie Pseudosporangien mit glatten und rauhen Sporen. Die Kultur gehört zur Ordnung 1.

Actinomycetales Buchanan 1917

Der neue Organismus besitzt echte Myzelfäden, die intakt bleiben. Kolonien auf Agar sind eng begrenzt, erhaben und verschiedenartig gerollt bzw. gewickelt. Luftmyzel ist

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ORIGINAL INSPECTED

nicht reichlich vorhanden. Pseudosporangien lassen sich durch SEM nachweisen. Die Sporenabmessungen betragen 0,7 bis 1,1 χ 1,3 bis 1,8 μπι. Die Sporen sind in der Regel kreuzweise gefurcht. Eine Beweglichkeit konnte nicht nachgewiesen werden.

Andere einzigartige Eigenschaften bestehen in einer Zellwand der Type III (meso-DAP). In einer Zellwandpräparation lassen sich auch Asparginsäure, Glycin, Glutaminsäure, Alanin und zwei nicht identifizierte purpurartige Komponenten nachweisen. Ferner wurde ein Gesamtzellzuckermuster von Mannose und Madurose gefunden.

Als Artcharakteristikum werden Gesamtzellzuckermuster in Kombination mit Gesamtzeilwandmustern vorgeschlagen. Diese Kultur kann als ein Actino-madura sp. (T. Cross und M.Goodfellow, 1973, "Taxonomy and classification of the actinomycetes", Seiten 11 bis 112; G. Sykes und P.A.Skinner (Herausgeber) "The Actinomycetales: characteristics and practical importance", Academic Press Inc., New York; M.P. Lechevalier und H.A. Lechevalier, 1970 "A critical evaluation of the genera of aerobic actinomycetes", Seiten 393 bis 405; H. Prauser (Herausgeber) "The Actinomycetales", Gustav Fisher, Jena; H.Prauser, 1970 "Characters and genera arrangement in the Actinomycetales", Seiten 407 bis 418 und H. Prauser (Herausgeber) "The Actinomycetales", Gustav Fisher, Jena) bezeichnet werden, und zwar aufgrund ihrer Zellwandkomponenten meso-DAP und Madurose. Ihre sporangienartigen Körper, ihr Gesamtzellmuster und ihre allgemeinen Kultureigenschaften lassen jedoch vermuten, daß es sich um ein eigenartiges neues Mitglied der Familie Actinoplanaceae (J.N. Couch, 1955 "A new genus and family of the Actinomycetales, with a revision of the genus Actinoplanes", J. Elisha Mitchell in "Sci.Soc." 71, Seiten 148 bis 155; J.N. Couch und C.E. Bland, 1974

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"Family IV, Actinoplanaceae"; Couch 1955, Seiten 716 bis 718; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons (Herausgeber) "Bergey's manual of determinative bacteriology", 9.Ausgabe, The Williams and Wilkins Co., Baltimore; H.A. Lechevalier und M.P. Lechevalier aaO und H. Prauser aaO). Die Kultur läßt sich jedoch nicht in eine der beschriebenen Gattungen dieser Familie einordnen. Folglich wird die neue Gattung Sebekia der Familie Actinoplanaceae vorgeschlagen. Die Gattungsableitung erfolgt vom Familiennamen des einen Erfinders, der die Brauchbarkeit der Kultur untersucht hat. Der vorgeschlagene Artenname ist benihana. Dieser Name, der "rote Blume" bedeutet, soll das rote, blümchenartige Wachstum der Kultur bezeichnen.

Die Bezeichnung der neuen Gattung und Art basiert auf einem Einzelstamm. Sebekia ist die Gattungsart, Sebekia benihana (NRRL 11 111) ist die Artentype.· Dies steht in Übereinstimmung mit Abschnitt 4, "Nomenclatural Types and Their Designation of the Bacteriological Code (international Code of Nomenclature of Bacteria, 1966, herausgegeben vom Editorial Board of the Judicial Commission of the International Committee on Nomenclature of Bacteria, Int. J. Syst. Bacteriol., 16, Seiten 459 bis 490).

Beschreibung

Sebekia benihana Dietz und Li, neue Gattung, neue Art.

Farbeigenschaften: Luftwachstum: fahlrosa bis fahlgrau (in der Regel spärlich). Melaninnegativ. Aussehen auf einem Ektachromfilm: vgl. Tabelle I. Referenzfarbeigenschaften: vgl. Tabelle II. Die Kultur kann in die rote Farbgruppe von Tresner und Backus (vgl. H.D. Tresner und E.J. Backus, 1963 "System of color wheels for streptomacete taxonomy", "Appl. Microbiol." 11, Seiten 335 bis 33ü) eingeordnet werden.

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28Ϊ7113

Mikroskopische Eigenschaften: Sporenketten: kurz (in der Eegel weniger als 10 Sporen pro Kette) und gestreckt (RF im Sinne von Pridham und Mitarbeitern - vgl. T.G. Pridham» C.W. Hesseltine und E.G. Benedict, 1958 "A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups, Placement of strains in morphological sections" in "Appl. Microbiol." 6, Seiten 52 bis 79). Die Sporen sind ungewöhnlich langgestreckt und zeigen einen abgeflachten Mittelabschnitt. Bei Prüfung mittels Direktdurchlässigkeits-Elektronenmikroskopie (TEM) scheint es, als ob die Sporen zarte Stacheln aufweisen wurden. Ferner zeigen sich bei der Prüfung mittels TEM von Kohlenstoffrepliken und bei der Prüfung mit einem Direktabtastelektronenmikroskop kreuzartige Einkerbungen. Die kreuzartigen Einkerbungen sind derart, daß man bei der direkten TEM, die lediglich eine Sporensilhouette liefert, eine unrichtige Vorstellung von Stacheln gewinnt. Die kreuzförmigen Einkerbungen kommen offensichtlich von einer gewundenen Scheibe, die unter Sporenbildung zusammengezogen ist. Die Sporen scheinen sich vom Substrat und Lufthyphen herauszuheben. Die Endspore ist häufig knollig. Die Sporenketten scheinen auch an einem knollenartigen Auswuchs von den Lufthyphen oder vegetativen Hyphen zu beginnen. Aus den zusammenkommenden oder "kollidierenden" Hyphen scheinen sich Pseudosporangien zu bilden. Aus den Sporangien ragen Sporen mit glatter oder rauher Oberfläche heraus. Die beschriebenen Erscheinungen lassen sich am besten durch Untersuchungen von SEM-Stereopaaren feststellen.

Mikromonosporiumartige Sporen erscheinen auf dem Substratmyzel. Bewegliche Sporen wurden nicht festgestellt.

Wachstum auf Kohlenstoffverbindungen: Unter den von T.G. Pridham und D. Gottlieb, 1948 "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination", in J. Bacteriol., 56, Seiten 101

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"bis 114» beschriebenen Versuchsbedingungen ist das Wachstum auf dem Grundmedium plus D-Xylose, I-Arabinose, D-Fructose, D-Galactose, D-Glucose_f D-Mannose, Maltose» Itactose» Cellobiose, Raffinose, Dextrin, lösliche Stärke, Glycerin und Inosit gut, mäßig auf dem Grundmedium plus Ehamnose, Sucrose, Salicin, Natriumacetat und Natriumsuccinat, zweifelhaft auf dem Kontrollmedium (Grundmedium ohne zugesetzte Kohlenstoffverbindung) und auf dem Grundmedium plus Inulin, Dulcit, Mannit, Sorbit» Natriumtartrat und Natriumcitrat. Auf dem Basalmedium plus Phenol, Cresol, Natriumformiat, Natriumoxalat oder Natriumsalicylat ist kein Wachstum festzustellen.

Unter den von E.B. Shirling und D. Gottlieb "Methods for characterization of Streptomyces species" in Int. J. Syst. Bacteriol. 16, Seiten 313 bis 340 (1966) beschriebenen Versuch sbedingungen ist das Wachstum gut auf dem negativen Vergleichsmedium (lediglich Grundmedium). Auf dem Grundmedium plus zugesetzten Verbindungen ist das Wachstum gut bei positivem Vergleichsmedium (D-Glucose), D-Xylose und Inosit, mäßig auf L-Arabinose, Saccharose, D-Fructose, Rhamnose und Raffinose. Auf D-Mannit und Cellulose ist kein Wachstum festzustellen.

Gesamtζeilanalyse: Die Zellen werden in Trypton/Hefeextrakt-Brühe 72 h lang wachsen gelassen (vgl. A. Dietz, "Streptomyces steifisburgensis sp. n." in J. Bacteriol. 94i Seiten 2022 bis 2026 (1967) und E.B. Shirling und D. Gottlieb aaO). Als Hauptzellwandbestandteil läßt sich meso-Diaminopimellinsäure (meso-DAP) nachweisen, was diesen Mikroorganismus bei der Klassifizierung in die Zellwandklasse bzw. Type III einordnet. Beim Gesamtzeilzuckermuster werden Madurose und Mannose gefunden.

Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften: vgl. Tabelle III.

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¹⁷ 2 S17 11 3

TABELLE I

Aussehen von Sebekia benihana auf Ektachromfilm

Agarinediuui	Oberflächen	Umkehr
	farbe	farbe
Bennett's	rot-lohfarben	rot-lohfarben
Czapek's-Saccharose	farblos	farblos
Maltose/Trypton	rot-lohfarben	rot-lohfarben
Pepton/Eisen	rο t-1ohfarb en	gelb-1ohfarben
0,1 $> Tyrosin	rot	rot-lohfarben
Caseinstärke	Spuren rosa	fahlrosa bis rot

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Referenzfarbeigenschaften von Sebekia benihana

Agarmedium

Bennet' s-Agarmedium

Czapek's Saccharose-Agarmedium

Maltos-Trypton-Agarmedium

Hickey-Tresner**- Agarmedium

Bestim- Chipmung Nr.

ISCC-NBS Parbennamenkarten, die mit Schwerpunktfarben illustriert sind*

Färbung

S 29 m. y rosa schwach gelblich-rosa

bis 32 gy. y rosa gelblich rosa mit schwachen Graueinschlag

R 39 gy. r O rötlich orange mit schwachem Graueinschlag

P 33 br rosa bräunlich-rosa

9 pk weiß
9 pk weiß

rosa-weiß rosa-weiß

29 m. y rosa schwach gelblich-rosa bis 32 gy. y rosa gelblich-rosa mit schwachem Graueinschlag

39 gy. r O rötlich-orange mit schwachem Graueinschlag

33 br rosa bräunlich-rosa r

32 gy. y rosa gelblich-rosa mit schwachem Grau- -

einschlag

39 gy. r O rötlich-orange mit schwachem Grau--

einschlag ⁽

33 br rosa bräunlich-rosa

Fortsetzung TABELLE II;

Agarmedium

Hefeextrakt/MaIzextrakt-Agarmedium

(lSP-2)

Bestimmung

H P

CMp-Nr.

19 20 33

ISCC-N3S Färbennamenkarten» die mit Schwerpunktfarben illustriert sind*

gy. rot d. gy. rot "br rosa

Färbung

rot mit schwachem Graueinschlag rot mit dunklem Graueinschlag bräunlich-rosa

Hafermehl-Agarmedium (ISP-3)

I.gy.r Br rötlich-braun mit hellem Graueinschlag m, 0 schwach orange 1. Br hell-braun

Anorganische Salze/ Stärke-Agarmedium

(ISP-4)

Glycerin/Asparagin-Agarmedium (ISP-5)

S E P

S R

89 89

73 73

p. Y

P. I

fahlgelb
fahlgelb

fahlorangegelb fahlorangegelb

S = Oberfläche
R = Rückseite
P = Pigment

*K.Ii.Kelly und D.B.Judd "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names", U.S. Eept.Comm.Oirc. 553 (1955)

**R.J.Hickey und H.D.Tresner "A cobalt-containing medium for sporulation of Streptomyces species" in J. Bacteriol. 64, S.891 bis 892 (1952)

TABELLE III

Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften von Sebekia benihana

Agar

Medium

Oberfläche

Rückseite

Pepton/Eisen runzelig orange (V) fahl-orange

Calciummale- fahlgelb (V) atmedium

Glucose/Asparagin/ Magermilchmedium

fahlgelb (V) dunkelorange (V)

Tyrosin

Xanthin

rotlohfarben

orange (V)

Nährstärke/ orange (V)

Hefeextrakt/ himbeerfarben (V)

Malzextrakt- mit Spuren rosa

Medium "Luft"

Pepton/Hefe- fahlorange (V)

extrakt/

Eisen (ISP-6)-Medium

Tyrosin (ISP-7)-Medium

fahlpfirsichfarben "Luft" mit herausragendem Rot (V)

fahllohfarben

fahllohfarben orange

rotlohfarben orange

schmutziges

orange

maronenfarben

fahlοrangelohfarben

pfirsichfarben bis rot

sonstige Eigenschaften

fahllohfarbenes Pigment Melanin negativ

kein Pigment

Malat geht nicht in Lösung

sehr fahllohfarbenes Pigment fahllohfarbenes Pigment Casein geht während des Wachstums in Lösung

rotlohfarbenes Pigment das Tyrosin geht in Lösung

fahllohfarben

das Xanthin geht nicht in Lösung

kein Pigment
fahlrosa-lohfarbenes Pigment

fahlorange-lohfarbenes Pigment Melanin negativ

kein Pigment ==*

Melanin negativ =J

Fortsetzung TABELLE III:

Medium

Gelatine reines Nährmedium

Oberfläche

farblos (V) farbloser Oberflächenring

Rückseite

sonstige Eigenschaften

keine Verflüssigung keine Verflüssigung

Brühe synthetisches Nährnitratmedium

Nährnitratmedium

lackmusmilch

Spuren farbloses Häutchen kompaktes farbloses Bodenwachstum
Nitrat wird nicht reduziert

kompaktes farbloses Bodenwachstum
Nitrat wird nicht reduziert

keine Änderung

pH-Wert wie bei der Vergleichsprobe (6,4)

(V) = vegetatives Wachstum

Der erfindungsgemäß verwendete neue Mikroorganismus besteht - wie bereits erwähnt - aus Sebekia benihana. Eine seiner Eigenschaften besteht darin, daß i? den trans-Methyl rest der 3-Methyl-2-butenylseitenkette des Rings A von Novobiocin der Formel (I) zu hydroxylieren vermag. Der neue Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung m.b.H. München, Grisebachstraße 8, D-^400 Göttingen hinterlegt und erhielt

dort die Hinterlegungsnummer DSM 1326.

Der Mikroorganismus wird auf geneigten Agarpräparaten verschiedener Zusammensetzung (Hafermehlagar, Hickey-Tresner-Agar, TYG-Agar) gehalten, bei 4⁰C gelagert und in üblicher bekannter Weise monatlich übertragen . Vorzugsweise wird der Mikroorganismus auf einem Agar der folgenden Zusammensetzung gehalten: Trypton (0,5 %), Hefeextrakt (0,3 "/>), Glucose (2,0 °/>), Natriumphosphat, einbasisch (0,1 Jl), Magnesiumsulfat (0,02 $), Eisen(ll)-sulfat (0,002 %) und Agar (2 %) in entionisiertem Wasser (auf einem pH-Wert von 7,2 eingestellt).

Zur Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wird der Mikroorganismus in oder auf einem sterilen Medium, das seiner Entwicklung förderlich ist, wachsengelassen werden. In dem Kulturmedium sind Stickstoff- und Kohlenstofflieferanten enthalten. Sein pH-Wert ist in geeigneter Weise eingestellt. Ferner wird in dem Fachmann bekannter Weise für eine Zufuhr steriler Luft gesorgt.

Stickstoff in assimilierbarer Form ist von normalerweise bei Fermentationsvorgängen verwendeten Lieferanten, wie sie dem Fachmann bekannt sind, erhältlich. Solche Stickstofflieferanten sind beispielsweise Maiseinweichflüssigkeit, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakte, Torulahefe,

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Peptonr Trypton, lösliches und unlösliches pflanzliches oder tierisches Protein, Lactalbumin» Casein» Molke» Brennereirückstände, Aminosäuren, Nitrate und Ammoniumverbindungen, wie Ammoniumtartrat, -nitrat, -sulfat und dergleichen.

Verfügbarer Kohlenstoff wird von normalerweise bei Fermentationsvorgängen verwendeten und dem Fachmann bekannten Kohlenstofflieferanten zur Verfügung gestellt. Solche Kohlenstofflieferanten sind beispielsweise Glucose, !Fructose, Saccharose, Galactose, Maltose, Dextrin, Fleischextrakte, Peptone, Aminosäuren, Proteine, Fettsäuren, Glycerin, Natriumlactat, Molke und dergleichen. Diese Substanzen werden entweder in gereinigter Form oder als Molkekonzentrate, Maiseinweichflüssigkeit, Körnerfruchtmaische, Baumwollsaatmehl und dergleichen oder als Mischungen der genannten Substanzen zum Einsatz gebracht. Zahlreiche der genannten Kohlenstofflieferanten stellen auch Stickstofflieferanten dar.

Das Kulturmedium kann ferner natürlich vorhandene oder zugesetzte Mineralbestandteile, z.B. Calcium, Kupfer» Eisen, Kalium, Phosphor, Magnesium und dergleichen, z.B. Kaliumphosphat, Calciumchlorid, Eisen(ll.)-sulfat und Magnesiumsulfat enthalten.

Ferner kann das Kulturmedium einen Hefeextrakt, der die verschiedensten, das Wachstum des Mikroorganismus fördernden Nährstoffe, einschließlich von Vitaminen, liefert, enthalten.

Das bevorzugte Medium zur Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung ist ein TYG-Medium. Dieses dient zur Züchtung des Mikroorganismus vor Zusatz des Substrats und während des biologischen Umwandlungsverfahrens. Die Zusam-

B 0 9 8 A 6 /0 6

mensetzung des TYG-Mediums ist folgende: Bestandteil %

Trypton	0,5
Hefeextrakt	0,3
Glucose'	2,0

Das TYG-Medium wird in entionisiertem Wasser auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt.

Die Konzentrationen an den drei Bestandteilen eines TYG-Mediums können ohne Schwierigkeiten in dem Fachmann bekannter Weise etwas variiert werden.

Der Organismus wird gezüchtet, indem man ein Stück des Myzels von einem geneigten Agar homogenisiert und ein Teil der beim Homogenisieren erhaltenen Suspension in 100 ml des in einem 250 ml-Kolben befindlichen Wachstums- oder Züchtungsmediums einträgt. Der Organismus wird bei einer Temperatur von 20 bis 35⁰C vorzugsweise von 25 bis 28⁰C, wachsen gelassen, wobei mit einer Geschwindigkeit von bis 500 Upm gerüttelt wird. Andererseits kann der Kolben durch Durchperlenlassen von Luft belüftet werden. Das Wachstum dauert etwa 2 bis 4 Tage.

Nach einer geeigneten Wachstumsdauer, in der Regel nach 3 Tagen, kann

1) das Substrat zur biologischen Umwandlung zugesetzt,

2) ein Teil des gewachsenen Mikroorganismus zum Beimpfen einer Reihe kleiner Erlenmeyerkolben verwendet oder

3) der Gesamtinhalt der Rüttelflaschen zusammen mit dem Inhalt einer Anzahl weiterer kleiner Kolben in einen großen Fermentationstank überführt werden.

So kann beispielsweise ein Fermentationstank mit 10 1 Fer-

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mentationsmedium mit dem Inhalt von 2 bis 10 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml Inokulat beschickt werden. In der Regel wird in jeden Fermentationstank eines Fassungsvermögens von 10 1 ein Antischaummittel, z.B. das Handelsprodukt UCON in einer Menge von 1 bis 5 ml eingetragen. Während des Wachsens wird das Ferinentationsmedium mit 100 bis 400 üpm gerührt, mit 1 bis 5 1 Luft/min/10 1 Fermentationsmedium belüftet und auf einer Temperatur von 20° bis 35°» vorzugsweise von 25° bis 28⁰C gehalten. Nach 2 bis 4 Tagen, in der Regel 3 Tagen, kann der Inhalt des 10 1-Fermentationst ank s

1) zum Beimpfen eines grösseren Fermentationstanks verwendet oder

2) zur biologischen Umwandlung mit einer novobiocinartigen Verbindung der Formel (I) beschickt

werden.

Die erfindungsgemäss eine biologische Umwandlung erfahrenden Substrate sind novobiocinartige Verbindungen der Formel:

oder deren Salze, worin Rj-, Ro» Z und die angegebene Bedeutung besitzen.

Die unter die Formel (i) fallenden Novobiοcinverbindungen sind entweder dem Fachmann bekannt oder lassen sich nach dem

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Fachmann bekannten Verfahren ohne weiteres aus bekannten Verbindungen herstellen. So kann beispielsweise Novenamin mit verschiedenen p-Hydroxybenzoesäureanalogen N-acyliert werden (vgl. US-PS 3 890 297.

Vorzugsweise gelangen Verbindungen der Formel (I) zum Einsatz, in denen R_c für ein Wasserstoffatom steht und R_D einen Methylrest oder ein Chloratom darstellt.

Die Verbindung Novobiocin (US-PS 3 049 534) entspricht der Formel (I), worin Rf- ein Wasserstoff atom darstellt, Rg einen Methylrest bedeutet, einer Doppelbindung entspricht und Z für einen Rest der Formel:

CH₃O

OH

in welcher Rq eintiiAminorest bedeutet, steht.

Die Verbindung Dihydronovobiocin (vgl. US-PS 3 175 944) ist

mit Novobiocin identisch, mit der Ausnahme, daß für eine

Einfachbindung steht.

Die Verbindung Chlorbiocin (US-PS 3 682 886) ist mit Novobiocin identisch, jedoch mit der Ausnahme, daß Rq für ein Chloratom steht und Rq einen 5-Methylpyrrolrest darstellt.

Die Verbindung Novobiocinsäure (vgl. J.W. Hinman und Mitarbeiter in "J.A.C.S." Band 79, Seite 3789 (1957)) ist mit Novobiocin identisch, jedoch mit der Ausnahme, daß Z für ein Wasserstoffatom steht.

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NovoMocin_f Mhydronovobiocin, Chlorbiocin, Novobiocinsäure und die sonstigen novobiocinartigen Verbindungen der Formel (I) besitzen mindestens zwei saure Protonen. Wenn in der Formel (I) Z für ein Wasserstoffatom steht, gibt es mindestens drei saure Protonen. Wenn also novobiocinartige Verbindungen der Formel (I) mit einer verdünnten Base, z.B. einer 0,01 bis 0,5 m Natrium- oder Kaliumbicarbonatlösung reagieren gelassen wird, bilden sich Salze. Mit stärkeren Basen, z.B. 0,1 bis 0,5 m Natriumhydroxid, bilden sich, außer wenn Z ein Wasserstoffatom darstellt (wobei tris-Salze gebildet werden), Bissalze.

Die Substrate, nämlich die novobiocinartigen Verbindungen der Formel (I) werden dem Fermentationsmedium in Salzform in wässriger Lösung zugesetzt. Die Substratkonzentration kann 50 μg/ml bis zu 1500 μg/ml, vorzugsweise 100 bis 1000 μg/ml, betragen.

Ein Alternatiwerfahren der Sub st rat zugabe besteht darin, die novobiocinartige Verbindung der Formel (i) in Form der freien Säure in einer Mindestmenge eines organischen Verdünnungsmittels, z.B. eines Alkohols, von Dimethylformamid und dergleichen, zu lösen, um sie in dieser Form dem Fermentationsmedium zuzusetzen. Ein weiteres Alternatiwerfahren der Substratzugabe besteht in der Substraterzeugung durch Fermentation und anschließende Zugabe einer wachsenden Kultur von Sebekia benihana zu dem Fermentationsmaterial. Die Sebekia benihana-Kultur kann in dem Fermentationsmedium oder als zentrifugiertes Myzel zugesetzt werden. Nach diesem Verfahren, einer zweistufigen Fermentation, erhält man Hydroxynovobiocin der Formel (il) und Hydroxychlorbiocin der Formel (II) aus Fermentationsvorgängen zur Gewinnung von Novobiocin (US-PS 3 049 534) und Chlorbiocin (US-PS 3 682 886).

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Die biologische Umwandlung findet bei einer Temperatur von 20° bis 35°ι vorzugsweise von 25° bis 28⁰C, unter Bewegen mit 100 bis 500 Upm oder Rühren mit 100 bis 400 Upm sowie Belüften entweder durch Oberflächenkontakt in einer Rüttelflasche oder Durchleiten von 1 bis 5 1 Iuft/min/10 1 Fermentationsmedium in einem Fermentationstank.

Das Fortschreiten der biologischen Umwandlung wird durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Ein geeignetes dünnschichtchromatographisches System besteht aus Silikagel und Äthylacetat/Methanol im Verhältnis 4:1 als Fließmittel. Während der biologischen Umwandlung entsteht auf Kosten des Substrats eine stärker polare Verbindung» nämlich das Produkt der Formel (II). Je nach der Stärke des Myzelwachstums, der Temperatur, der Belüftung und dergleichen, und insbesondere der Substratkonzentration, d.h. der Konzentration an der novobiocinartigen Verbindung der Formel(I) dauert die biologische Umwandlung bis zum Erreichen maximaler Ausbeuten 3 bis mehr als 10 Tage.

Nach beendeter biologischer Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie, werden die gebildeten Reaktionsprodukte gesammelt und nach dem Fachmann bekannten Methoden gereinigt. Zu diesem Zweck wird die Fermentationsbrühe mit einer Säure, z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen, auf einen pH-Wert von 2 bis 5 eingestellt, worauf die Feststoffe abzentrifugiert werden. Andererseits kann die Fermentationsbrühe auch etwa mit 1/10 Volumen eines Filterhilfsmittels, z.B. des Handelsprodukts Dicalite 4 200, oder einer sonstigen Diatomeenerde, gemischt werden.

Bei Verwendung eines Filterhilfsmittels wird das Gemisch über ein Bett desselben Filterhilfsmittels filtriert. Der Filterkuchen wird dann mit einem organischen, mit Wasser

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nicht mischbaren Verdünnungsmittel, z.B. Athylacetat, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol, Toluol, Methylenchlorid, SSB oder Mischungen hiervon, extrahiert. Das erhaltene Piltrat wird dann nochmals mit demselben organischen Lösungsmittel, wie es auch bereits zur Extraktion des Kuchens verwendet wurde, extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten werden mit Salzlake gewaschen, über Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann gegebenenfalls unter Erwärmen im Vakuum eingeengt.

Ein Alternativgewinnungsverfahren für die Hydroxynovobiocine der Formel (II) besteht in der dem Fachmann bekannten Verwendung von Anionenaustauscherharzen.

Bei der Reindarstellung der erfindungsgemäss erhältlichen Produkte fallen in der Begel ölige Produkte an. Diese öligen Produkte werden in einer Mindestmenge eines organischen Verdünnungsmittels der beschriebenen Art oder einer Mischung solcher Verdünnungsmittel entweder allein oder zusammen mit geringen Mengen Methanol, Äthanol oder Aceton gelöst, worauf die jeweils erhaltene Lösung auf eine geeignete Silikagel- oder Aluminiumoxidsäule im Verhältnis von etwa 100 g Silikagel bzw. 30 g Aluminiumoxid/g Öl aufgegeben wird. Das Entwickeln der jeweiligen Säule erfolgt mit bekannten Lösungsmitteln. Vorzugsweise wird schrittweise eluiert, wobei man Lösungsmittelsysteme, wie Ä'thylacetat/ Methanol im Verhältnis 10:1 oder Chloroform/Aceton im Verhältnis 20:1 verwendet. Die einzelnen Fraktionen werden in der geschilderten Weise dünnschichtchromatographisch getestet. Durch Dünnschichtchromatographie als homogen ermittelte Fraktionen mit der stärken polaren Verbindung (geringere Ef-Werte) werden gesammelt und eingeengt, wobei man ein Hydroxynovobiocin der Formel (II) erhält.

Ein Alternatiwerfahren zur Reinigung des jeweiligen Öls be-

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steht in einer Gegenstromverteilung.

Die Hydroxynovobiocine der Formel (II) werden durch Protonen-Kernresonanzspektroskopie, UV-Spektroskopie, Elementaranalyse, C-13-Kernresonanzspektroskopie, IR-Spektroskopie und dergleichen identifiziert.

Die Hydroxynovobiocine der Formel (II) besitzen bei dem von L.J. Hanka und Mitarbeitern in "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", Seiten 565 bis 569 (1962) beschriebenen Test eine antibiotische Aktivität.

Die Hydroxynovobiocine der Formel (II) eignen sich in entsprechender Weise und auf entsprechenden Anwendungsgebieten wie die entsprechenden novobiocinartigen Mutterverbindungen der Formel (I), wobei jedoch die etwa 10mal höhere Konzentration als bei Novobiocin verwendet werden sollte (vgl. US-PSen 3 049 534, 3 175 944 und 3 682 886). Die hydroxynovobiocinartigen Verbindungen der Formel (II) eignen sich zum Sterilisieren von Glaswaren und Laborutensilien im Konzentrationsbereich von 0,01 bis 10,0 $>. Mit denselben Konzentrationen können Wände, Bankoberseiten und Flure von anfälligen Organismen gereinigt werden. Darüber hinaus eignen sich die hydroxynovobiocinartigen Verbindungen auch zur selektiven Abtötung anfälliger Organismen in Bodenproben vor dem Test auf Antibiotika. Schließlich eignen sich die Hydroxyverbindungen der Formel (II) auch noch zur Abtötung anfälliger Organismen in den Freßnäpfen von Tieren während Verdauungs- und Exkretionsstudien.

Die Hydroxynovobiocine der Formel (II) besitzen zwei saure Protonen und bilden folglich in der beschriebenen Weise Salze und Bissalze. Die pharmazeutisch akzeptablen Salze der betreffenden Verbindungen können in gleicher Weise wie die Mutterverbindungen in Form freier Säuren zum Einsatz gelangen.

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Nicht sämtliche Salze sind pharmazeutisch akzeptabel. Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Salze sind die Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium, sowie von Aminen, z.B. Ammoniak.

Die folgenden Beispiele" sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel

Biologische Umwandlung von Novobiocin der Formel (I) zu Hydroxynovobiocin der Formel (II) (in den Formeln I und II bedeuten: R,- und R„ Wasserst off atome; eine Doppelbindung und Z einen Rest der Formel:

CH₃O

worin Rq für einen Aminorest steht).

(a) Der Mikroorganismus

Sebekia benihana wird auf geneigtem Agar der folgenden Zusammensetzung gehalten: Trypton (0,5 #), Hefeextrakt (0,3 fi)t Glucose (2,0 $>), Natriumphosphat, einbasisch (0,1 fo), Magnesiumsulfat (0,02 $), Eisen(ll)-sulfat (0,002 #) und Agar (2 $) (auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt). Der geneigte Agar wird bei einer Temperatur von 4⁰C gelagert. Es findet eine monatliche Übertragung statt.

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(b) Wachstum des Mikroorganismus

Von dem geneigten Agar wird ein Stück Myzel entfernt, in 3 ml sterilen Wassers homogenisiert und zum Beimpfen von 100 ml desselben sterilen Mediums, wie es auch für den geneigten Agar verwendet wurde, das jedoch keinen Agar enthält, in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben verwendet.

Die Inkubation des Mikroorganismus erfolgt mittels eines Drehrüttlers, der mit 300 Upm läuft, bei 25° bis 28⁰C. Nach 2 Tagen ist ein starkes Myzelwachstum festzustellen.

(c) Das Substrat

Novobiocin (US-PS 3 049 534) wird in 0,1 m Natriumbicarbonatlösung gelöst. Danach werden 10 mg Novobiocin in die Schüttelflasche überführt, wobei die Novobiocinkonzentration im Permentationsmedium 100 μg/ml beträgt.

(d) Biologische Umwandlung

Nach Zugabe des Novobiocins wird die biologische Umwandlung bei 300 Upm und einer Temperatur von 25 bis 28⁰C ablaufen gelassen. Während einer 3-tägigen biologischen Umwandlung verschwindet das Substrat unter gleichzeitiger Ansammlung eines stärker polaren Produkts, nämlich von Hydroxynovobiocin der lOx-mel (II). Dies wird auf dünnschichtchromatographischem Wege auf Silikagel unter Verwendung von Äthylacetat/Methanol im Verhältnis 4:1 als Entwickler ermittelt. Bei diesem dünnschichtchromatographischeη System besitzt Novobiocin einen Rf-Wert von 0,46, Hydroxynovobiocin einen Rf-Wert von 0,24·

Beispiel

Biologische Umwandlung von Novobiocin der Formel (I) zu

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Hydroxynovobiocin der Formel (II) (in den Formeln I und II

bedeuten: Rr- und R_Q Wasserstoffatome; eine Doppelbin-

5 ö ———

dung und Z einen Rest der Formel:

CH₃

CH₃O

OH

worin Rq für einen Aminorest steht).

Entsprechend Beispiel 1 und unter Durchführung untergeordneter» nicht kritischer Änderungen wird die Züchtung in grösserem Mai3stab durchgeführt.

50 500 ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 200 ml sterilem TYG-Medium werden mit 10 ml eines 3 Tage alten Saatguts (5 °/> Inokulat) beimpft. Dieses Medium wird 2 Tage lang inkubiert. Danach wird Novobiocin in einer Endkonzentration von 150 ng/ml zugesetzt (insgesamt 1,5 g Novobiocin). Nach 2-tägiger Inkubation zeigt ein Dünnschichtchromatogramm, daß die biologische Umwandlung vollständig abgelaufen ist.

(e) Isolierung

Zu 9 1 Fermentationsbrühe eines pH-Werts von 1,6 wird so viel Salzsäure zugesetzt» daß sie einen pH-Wert von 5 erhält. Danach wird das Gemisch über das Filterhilfsmittel Dicalite 4 200 filtriert. Der Filterkuchen wird mit 2 1 Äthylacetat extrahiert, worauf das Filtrat zweimal mit jeweils 3 1 Äthylacetat extrahiert wird. Die organischen Schichten werden vereinigt, mit Salzlake gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter mildem Erwärmen im Vakuum eingeengt, wobei ein öliger Rückstand anfällt .

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(f) Reinigimg

Der in Stufe (e) angefallene ölige Rückstand wird in 4 ml Äthylacetat/Methanol im Verhältnis 10:1 gelöst, worauf die erhaltene Lösung auf eine 2,5 x 100 cm Silikagelsäule aufgegeben wird. Nun wird schrittweise eluiert bzw. eine Gradienteneluierung durchgeführt, wobei als Eluiermittel Mischungen aus Äthylacetat/Methanol im Verhältnis 9:1 bis 3:1 bei einer Fließgeschwindigkeit von 7 ml/min verwendet werden. Es werden 25 ml-Fraktionen aufgefangen.

Durch dünnschichtchromatographische Bestimmung als homogen erkannte Fraktionen, die eine stärker polare Substanz als das Substrat der Formel (I) enthalten, werden gesammelt und eingeengt, wobei man 130 mg Hydroxynovobiocin erhält.

(g) Identifizierung

Proton-Kernresonanzspektroskopie (1 $ TMS, dg-DMSO) 1,1, 1,3, 1,7, 2,2, 3,2 bis 3,7, 3,8, 4,1, 4,8 bis 5,8, 6,6, 6,ü bis 7,8 J.

C-13-Kernresonanzspektroskopie (1 % TMS, dg-DMSO) 8,5, 13,8, 22,9, 27,8, 28,7, 61,1, 66,5, 69,1, 70,6, 78,0, 81,1, 98,8, 99,5, 108,8, 112,0, 114,4, 115,7, 122,0,

123.0, 125,2, 127,0, 127,3, 130,0, 135,8, 151,4,

156.1, 156,5, 158,2, 162,2, 166,6 und 167,2 cf.

Beispiel

Biologische Umwandlung von Novobiocin der Formel (I) zu Hydroxynovobiocin der Formel (II) (in den Formel I und II bedeuten: Rr und Rq Wasserstoffatome; eine Doppelbindung und Z einen Rest der Formel:

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worin Rg für einen Aminorest steht).

Entsprechend den Beispielen 1 und 2 und unter Durchführung geringeri nicht kritischer Änderungen wird die Substratkonzentration von 100 bzw. 150 μg/πll auf 750 ng/inl erhöht und die biologische Umwandlung 10 Tage ablaufen gelassen. Das Produkt der biologischen Umwandlung ist Hydroxynovobiocin.

B e i s ρ i e 1

Biologische Umwandlung von Ghlorbiocin der Formel (I) zu Hydroxychlorbiocin der Formel (II) (in den Formeln I und II bedeuten: Rj- ein Wasserst off atom; R_ß ein Chloratom;
eine Doppelbindung und Z einen Rest der Formel:

worin R_g für einen 5-Methylpyrrylrest steht).

Entsprechend den Maßnahmen der Beispiele 1 und 2_f jedoch un-

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ter Ersatz des Novobiocins durch Chlorbiocin (vgl. US-PS 3 682 886), Inkubieren, des Substrats mit der Kultur -während 5 Tagen anstelle 3 Tage und unter Durchführung sonstiger untergeordneter, nicht-kritischer Variationen, erhält man Hydroxychlorbiocin.

Beispiel

Biologische Umwandlung von Dihydronovobiocin der Formel (I) zu Hydroxydihydronovobiocin der Formel (II) (in den Formeln

I und II bedeuten: R^ und R„ Wasserstoffatome; eine

Einfachbindung und Z einen Rest der Formel:

CH₃O

worin Rq für einen iminorest steht).

Entsprechend den Maßnahmen der Beispiele 1 und 2, jedoch unter Ersatz des Novobiocins durch Dihydronovobiocin (vgl, US-PS 3 175 944) und unter Durchführung sonstiger nichtkritischer Änderungen erhält man Hydroxydihydronovobiocin.

Beispiel

Biologische Umwandlung von Novobiocinsäure der Formel (I) in Hydroxynovobiocinsaure der Formel (II) (in den Formeln I und II bedeuten: R₁- und R„ Wasserstoff atome; eine Doppelbindung und Z ein Wasserstoffatom).

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Entsprechend den Maßnahmen der Beispiele 1, 2 und 3, jedoch unter Ersatz des Novobiocins durch Novobiocinsäure (vgl. "J.A.C.S.", Band 79, Seite 3789 (1957)) und unter Durchführung sonstiger untergeordneter nicht-kritischer Änderungen erhält man bei der biologischen Umwandlung Hydroxynovobiocinsäure.

Nach Beendigung der biologischen Umwandlung besitzt das Fermentationsmedium einen pH-Wert von 8,5. Nun wird so viel Salzsäure zugesetzt, daß die Fermentationsbrühe einen pH-Wert von 3 annimmt. Hierauf wird das Gemisch über das Filterhilfsmittel Dicalite 4 200 filtriert. Das Filterhilfsmittel wird nun zur Entfernung von Wasser und Produkt mit Aceton gewaschen, worauf das Aceton abgestreift wird. Nun werden das Filtrat und das Waschwasser mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Feststoff eingeengt.

Der erhaltene feste Verdampfungsrückstand wird in einer Mindestmenge Äthylacetat gelöst, worauf die erhaltene lösung auf eine2,5 x 100 cm Flüssigchromatographier-Silikagelsäule hohen Leistungsvermögens aufgegeben wird. Die Säule wird mit Äthylacetat bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min eluiert, wobei 24 ml-Fraktionen aufgefangen werden. Die durch Dünnschichtchromatographie als homogen erkannten Fraktionen, deren Rf-Wert einer stärker polaren Verbindung als das Substrat entspricht, werden gesammelt und eingeengt, wobei man 500 mg Hydroxynovobiocinsäure erhält.

Die Elementaranalyse der Verbindung CppHp-jNO, ergibt folgende Werte:

C HN

ber.: 64,20 5,12 3,41 gef.: 63,59 5,06 3,42

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Massenspektrum m/e - 411;

Protonen-Kernresonanzspektroskopie (1 ^c/> TMS, dgDMSO) 1,7, 2,2, 2,5, 3,3, 3,9» 6,8, 6,9, 7,5, 7,7, 7,8, 9,1, 10,1 und 10,4 ί.

Beispiel

Zweistufige Hydroxynovobiocin-Fermentation

Entsprechend den Maßnahmen der US-PS 3 049 534 wird Novobiocin auf fermentativem Wege hergestellt. Wenn eine Maximalnovobiocinproduktion erreicht ist und das Novobiocin zur Gewinnung fertig ist, wird eine wachsende Kultur von Sebekia benihana in einem wäßrigen Nährmedium zugesetzt. Danach wird das Gemisch entsprechend den Beispielen 1 und 2 so lange gerührt oder bewegt und belüftet, bis die Dünnschichtchromatographie die beendete biologische Umwandlung von Novobiocin zu Hydroxynovobiocin anzeigt. Das Hydroxynovobiocin wird entsprechend Beispiel 2 gewonnen und gereinigt.

Beispiel 8

Zweistufige Hydroxychlorbiocin-Fermentation

Entsprechend der US-PS 3 682 886 wird Ghlorbiocin auf fermentativem Wege hergestellt. Wenn eine maximale Chlorbiocinproduktion erreicht ist und das Chlorbiocin zur Gewinnung fertig ist, wird eine wachsende Kultur von Sebekia benihana in einem wäßrigen Nährmedium zugesetzt. Danach wird das Gemisch gemäß den Beispielen 1 und 2 so lange gerührt oder bewegt und belüftet, bis die Dünnschichtchromatographie die beendete biologische Umwandlung von ChlorbJocin zu Hydroxychlorbiocin anzeigt. Das Hydroxychlorbiocin wird entsprechend Beispiel 2 gewonnen und gereinigt.

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Auf folgende Definitionen sei "noch hingewiesen:

DAP entspricht Diaminopimelinsäure.

ISP steht für internationales Strepotmyceten-Project.

SEM steht für Abtastelektronenmikroskop.

TEM steht für Durchlässigkeitselektronenmikroskop.

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Claims (18)

Henkel, Kern, Feiler & Hänzel Patentanwälte THE UPJOHN COMPANY, Kalamazoo, Mich., V.St.A. Möhlstraße 37 D-8000 München 80 Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegramme: ellipsoid 3372 APR. !£78 PATENTANSPRÜCHE

1. Hydroxynovobioeinartige Verbindung der Formel:

(II)

worin "bedeuten:

R₁- und Ry, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff- oder Halogenatome, Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), Nitro-, Cyano- oder Carboxylreste oder Reste -NB, R_n* in welcher R und R_ß gleich oder verschieden sein und £üv Wasserstoffatome oder Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatom(en) stehen Icönnen;

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ORIGINAL INSPECTED

eine Einfach- oder Doppelbindung und Z ein Wasserstoffatom oder einen Rest der Formel

in welcher Rq einen Imino-» 2-Pyrryl-, 2-(5-Methyl)-pyrryl-t 2-Furyl- oder 2-(5-Methyl)-furylrest darstellt r
sowie deren pharmazeutisch akzeptable Salze.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» daß sie der angegebenen Formel entsprechen, worin Rjein Wasserstoffatom darstellt.

3. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet» daß sie der angegebenen Formel entsprechen» worin R₈ ein Chloratom darstellt.

4. Verbindung nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet» daß sie der angegebenen Formel entspricht, worin Z einen Rest der Formel:

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in welcher Rg für einen 5-Methylpyrrylrest steht, darstellt.

5. Verbindungen nach Anspruch 4» nämlich Hydroxychlorbiocin.

6. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie der angegebenen Formel entsprechen, worin Rg einen Methylrest darstellt.

7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie der angegebenen Formel entspricht, worin Z einen Rest der Formel:

CH₃

R₉-C-O OH 0

in welcher Rq für einen Aminorest steht, darstellt.

8. Verbindung nach Anspruch 7, nämlich Hydroxynovobiocin.

9. Verbindung nach Anspruch 7, nämlich Hydroxydihydronovobiocin.

10. Verbindungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie der angegebenen Formel entsprechen, worin Z für ein Wasserstoffatom steht.

11. Verbindung nach Anspruch 10, nämlich Hydroxynovobiocinsäure.

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12. Verfahren zur Herstellung hydronovobiocinartiger Verbindungen der Formel:

OH

(H)

oder ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man

1) Sebekia benihana DSM 1326 und/oder deren novobiocinhydroxylierende Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet;

2) eine Novobiocinverbindung der Formel:

mit der Sebekia benihana-Kultur in Berührung bringt und

3) die hydroxynovobiocinartige Verbindung der Formel

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(II), worin R^, R,., und Z die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, reindarstellt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als novobiocinartige Verbindung der Formel (i) Novobiocin verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als novobiocinartige Verbindung der Formel (I) Dihydronovobiocin verwendet.

15· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als novobiocinartige Verbindung der Formel (I) Chlorbiocin verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als novobiocinartige Verbindung der Formel (I) Novobiocinsäure verwendet.

17. Verfahren zur Herstellung von Hydroxynovobiooin, dadurch gekennzeichnet, daß man

1) durch Fermentation Novobiocin herstellt;

2) eine wachsende Kultur von Sebekia benihana

DSM 1326 und/oder ihren novobiocinhydroxylierenden Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium mit dem Fermentationsmaterial in Berührung bringt und

3) Hydroxynovob.iocin
reindarstellt.

18. Verfahren zur Herstellung von Hydroxychlorbiocin, dadurch gekennzeichnet, daß man

1) Chlorbiocin durch Fermentation herstellt;

2) eine wachsende Kultur von Sebekia benihana

DSM 1326 ' und/oder ihren novobiocinhydroxylierenden

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Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium mit dem Fermentationsmaterial in Berührung bringt und

3) das Hydroxychlorbiocin reindarstellt.

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