DE69005935T2

DE69005935T2 - Antiparasitisches Mittel.

Info

Publication number: DE69005935T2
Application number: DE90307708T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Dr Kojiima; Hiroshi Maeda; Satoshi Nishiyama; David Austen Dr Perry
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1989-07-26
Filing date: 1990-07-13
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2010-07-14
Also published as: IE902694A1; ES2062378T3; CA2021894C; PT94805B; CA2021894A1; EP0410615A1; HUT57832A; AU5984990A; KR930005872B1; HU904642D0; ZA905842B; JPH0368581A; NZ234644A; AU615620B2; IL95133A; DK0410615T3; KR910003111A; US5073567A; DE69005935D1; FI94262B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antiparasitikum, insbesondere ein neues Milbemycine betreffendes Makrolid, ein Verfahren zur Herstellung desselben und dieses enthaltende Zusammensetzungen.
Milbemycine sind eine bedeutende Gruppe von Breitband- Antiparasitika, die bei der Anwendung auf den Gebieten der Gesundheit von Tier und Mensch, der Landwirtschaft und des Gartenbaus anthelmintische, ektoparasitische, insektizide, antibakterielle, fungizide und wachstumsfördernde Aktivität aufweisen. Sie werden durch Fermentation bestimmter Mikroorganismen der Art Streptomyces unter aeroben Bedingunen in einem wässerigen oder festen Nährmedium, das anorganische Salze und assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, hergestellt. Beispielsweise liefert die Fermentation des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus spp aureolacrimosus B-41-146, wie in der Britischen patentschrift 1390336 beschrieben, eine kollektiv als B-41-Verbindungen bekannte Familie von Milbemycinen. Als weiteres Beispiel liefert die Fermentation von Streptomyces cyaneogriseus spp noncyanogenus, wie in der Europäischen patentschrift EP-A-0170006 beschrieben, eine andere Familie von Milbemycinen, die kollektiv als LL- F28249-Verbindungen bekannt sind.
Milbemycine betreffende Verbindungen sind in der EP-A- 0254583 beschrieben. Sie werden durch Fermentation von Streptomyces-Mikroorganismen, bekannt als Streptomyces E225 und Streptomyces E225B, erhalten.
Es wurde nunmehr ein neues Makrolid entdeckt, das hierin als UK-86.956 bezeichnet ist und durch Kultur eines neuen Mikroorganismus, Streptomyces griseochromogenes N859-124, wie nachstehend beschrieben, hergestellt werden kann. Die hochwirksame Verbindung UK-86.956-besitzt ein breites Aktivitätsspektrum gegen Insektenschädlinge, Milben, freilebende Nematoden und Endo- und Ektoparasiten, die Tiere und Menschen befallen.
Somit sieht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verbindung UK-86,956 vor, von der man glaubt, daß sie die Formel (I):
hat. UK-86.956 unterscheidet sich von der in der EP-A-0170006 beschriebenen Verbindung LL-F28249α dadurch, daß sie einen Hydroxysubstituenten an der C-22-Position und nicht an C-23 besitzt. Sie unterscheidet sich auch von den in der EP-A-0254583 geoffenbarten Verbindungen, indem sie an der Position 25 einen 1,3-Dimethylbut-1-enyl-Rest und keinen 1-Methylprop-1-enyl-Rest aufweist.
UK-86.956 kann durch submerse aerobe Fermentation in wässerigem Nährmedium oder durch Fermentation in festem Agar unter aeroben Bedingungen eines Mikroorganismus, der aus einer in Itoh City, Shizuoka Prefecture, Japan, genommenen Bodenprobe isoliert wurde, hergestellt werden. Dieser Mikroorganismus wurde am 29. Juni 1989 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA unter der Akzessionsnummer ATCC 53928 hinterlegt. Er ist hierin als Kultur N859-124 bezeichnet. Er wurde wie folgt charakterisiert:
Die Kultur N859-124 wurde von einem Schrägagar in ATCC #172-Brühe transferiert und vier Tage lang bei 28ºC auf einem Schüttelapparat gezogen. Sie wurde dann 20 Minuten lang zentrifugiert, dreimal mit sterilem Wasser gewaschen und auf im allgemeinen zur Identifizierung von Mitgliedern der Actinomyces verwendete Medien gepflanzt.
Die Kultur wurde bei 28ºC inkubiert, und die Ergebnisse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten abgelesen, meistens wurden sie nach 14 Tagen genommen. Die Farben wurde in der üblichen Terminologie beschrieben, die genauen Farbangaben erfolgten aber durch einen Vergleich mit Farb-Chips aus dem Color Harmony Manual, 4. Auflage. Die Verfahren der Ganzzellen-Aminosäure- und Zuckeranalysen sind in Becker, B. et al., Appl. Microbiol., 12: 421-423, 1964; und in Lechevalier, M.P., J. Lab., Clin. Med., 71: 934-944, 1968 beschrieben. Für Vergleichszwecke wurden die Typenstämme Streptomyces griseochromogenes ATCC 14511 und S. durhamensis ATCC 23194 von der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland gekauft.
Zur Charakterisierung der Kulturen und als Referenzen für ihre Zusammensetzung wurden folgende identifikationsmedien verwendet:
1. Trypton - Hefeextrakt-Brühe - (ISP #1-Medium, Difco).
2. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar - (ISP #2-Medium, Difco).
3. Haferffocken-Agar- (ISP #3-Medium, Difco).
4. Anorganische Salze-Stärke-Agar - (ISP #4-Medium, Difco).
5. Glycerin-Asparagin -Agar - (ISP #5-Medium, Difco).
6. Pepton - Hefeextrakt-Eisen-Agar - (ISP #6-Medium, Difco).
7. Czapek-Saccharose-Agar- S. A. Waksman, The Actinomycetes, Bd . 2, Medium No. 1, S. 328, 1961.
8. Glucose-Asparagin-Agar - Ibid, Medium No. 2, S. 328.
9. - Bennett - Agar - Ibid, Medium No. 30, S. 331.
10. Emerson - Agar - Ibid, Medium No. 28, S. 331.
11. Nähragar - Ibid, Medium No. 14, S . 330.
12. Gordon und Smith - Tyrosin-Agar - R. E. Gordon und M. M. Smith, J. Bacteriol. 69: 147-150, 1955.
13. Kasein-Agar - Ibid.
14. Calciuinmalat-Agar - S. A. Waksman, Bacteriol. Rev. 21: 1-29, 1957.
15. Gelatine- R. E. Gordon und J. M. Mihm, J. Bacteriol. 73: 15-27, 1957.
16. Stärke - Ibid
17. Organische Nitratbrühe Ibid.
18. Dextrose-Nitrat-Brühe - S. A. Waksman, The Actinomycetes, Bd. 2, Medium No. 1, S. 328, 1961, mit 3 g Dextrose als Substituent für 30 g Saccharose, ohne Agar.
19. Kartoffel-Karotten-Agar - M.P. Lechevalier, J. Lab. und Clinical Med. 71: 934-944, 1968, aber Verwendung von nur 30 g Kartoffeln, 2,5 g Karotten und 20 g Agar.
20. 2 % Leitungswasser-Agar.
21. Magermilch - Difco.
22. Zelluloseverbrauch -
a) H. L. Jensen, Proc. Linn. Soc. N.S.W. 55: 231-248, 1930.
b) M. Levine and H. W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, Medium No. 2511, 1930.
23. Kohlenwasserstoffverbrauch- ISP # 9-Medium, Difco.
24. Temperaturbereich - ISP #2-Medium plus 50 ml Kokosmilch pro Liter.

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

- Wachstum gut, weiß bis blaßgrau (fastgraue Serien 2 ba, 3 ba), erhabenes, glattes, oberirdisches Myzel gleich wie Oberfläche; Rückseite gelblich bis gelblichbraun (2 lc, 3 ic); lösliches gelbliches Pigment (2 lc).

Haferflocken-Agar

- Wachstum mäßig; grau, dunkelgrau bis rosagrau (fastgraue Serien 3 dc, 3 fe, 5 fe, 5 ih, 4 ig); schwach bis mäßig erhabenes, glattes, oberirdisches Myzel gleich wie Oberfläche; Rückseite gelblichgrau (1 1/2 gc, 1 1/2 ic); lösliches Pigment keines bis kremfarben (1 1/2 ca).

Anorganische Salze-Stärke-Agar

- Wachstum gut; blaßgrau, grau bis dunkelgrau (fastgraue Serien 3 dc, 3 fe, 3 ih); erhabenes, glattes, oberirdisches Myzel gleich wie Oberfläche; Rückseite blaßgelblich (2 ca, 2ea); lösliches Pigment kremfarben (2 ca).

Glycerin-Aspargin-Agar

- Wachstum schwach bis mäßig, fast weiß bis blaßgelblich (s ca, 2ea), leicht erhaben, glatt oder als isolierte Kolonien erscheinend, oberirdisches Myzel fast weiß; Rückseite blaßgelblich (2 ea, 2ca); kein lösliches Pigment.

Czapek-Saccharose-Agar

- Wachstum mäßig, kremfarben (2 ca) mit etwas blaßweißlichgrauem oberirdischem Myzel (fastgraue Serien 3 dc, 3 fe), dünn, glatt; Rückseite farblos bis kremfarben (2 ca); kein lösliches Pigment.

Glucose-Asparagin-Agar

- Wachstum gut; weiß, blaßgrau bis grau (fastgraue Serien 3 dc, 3 fe 3 cb); erhabenes, glattes, oberirdisches Myzel gleich wie Oberfläche; Rückseite gelblich (2 ga, 2 ia, 2 lc); lösliches Pigment blaßgelblich (2 ea).

Tyrosin-Agar nach Gordon und Smith

- Wachstum mäßig, dunkelbraun (3 nl), leicht erhaben, glatt bis körnig, kein oberirdisches Myzel; Rückseite dunkelbraun (3 nl); lösliches Pigment dunkelbraun (3 nl).

Kasein-Agar

- Wachstum gut, gelblich-grau bis orange-grau (2 ie, 2 Ig, 4 ie) mit etwas weißem oberirdischem Myzel zum Ende des Streifens hin, mäßig erhaben, gekräuselt; Rückseite gelblich (2 lc); lösliches Pigment dunkelbraun (3 ni).

Bennett-Agar

- Wachstum gut, weiß bis blaßgrau (fastgraue Serien 3 cb, 3 dc), erhaben, glatt, kann aber zum Rand hin leicht gekräuselt sein, mit Hyalin-Exsudat, oberirdisches Myzel gleich wie Oberfläche; Rückseite dunkelbraun (3 li); lösliches Pigment braun (3 ng).

Emerson-Agar

- Wachstum gut, gelblichgrau bis grau (2 ni, 2 li), erhaben, gekräuselt, kein oberirdisches Myzel; Rückseite dunkelbraun (3 ni, 3 li); lösliches Pigment dunkelbraun (3 nl, 3 pn).

Nähragar

- Wachstum schwach bis mäßig, braun (3 lg), dünn bis leicht erhaben, glatt oder als isolierte Kolonien erscheinend, kein oberirdisches Myzel; Rückseite braun (3 ie, 3 lg); lösliches Pigment gelblichbraun (3 ic, 3 le).

Calciummalat-Agar

- Wachstum mäßig, grau bis dunkelgrau (fastgraue Serien 3 fe, 3 ih), leicht erhaben, glatt, oberirdisches Myzel gleich wie Oberfläche; Rückseite blaßgrau bis grau (fastgraue Serien 3 dc, 3 fe); kein lösliches Pigment.

Gelatine-Agar

- Wachstum mäßig bis gut, weiß bis gelblichbraun (3 ec), mäßig erhaben, glatt bis gekräuselt, kein oberirdisches Myzel; Rückseite gelblich (2 ga, 2 ic); lösliches Pigment dunkelgelblich (2 ne).

Stärke-Agar

- Wachstum mäßig bis gut, dunkelgelblichgrün (1 1/2 ic, 1 1/2 le), mäßig erhaben, glatt bis gekräuselt, kein oberirdisches Myzel; Rückseite gelblich (2 ic); lösliches Pigment gelblichbraun (3 pe).

Kartoffel-Karotten-Agar

- Wachstum schwach bis mäßig; weiß, kremfarben bis blaßgrau (2 ca, fastgraue Serien 3 cb, 3 dc), dünn, glatt, mit weißem bis blaßgrauem oberirdischem Myzel; Rückseite farblos bis kremfarben (2 ca); kein lösliches Pigment.

Leitungswasser-Agar

- Wachstum schwach, blaßgrau (fastgraue Serien 3 cb, 3 dc), dünnes, glattes, oberirdisches Myzel blaßgrau; Rückseite farblos bis blaßgrau (fastgraue Serien 3 cb, 3 dc); kein lösliches Pigment.

Morphologische Eigenschaften

- Die morphologischen Beobachtungen erfolgten auf Haferflocken-Agar 14 Tage nach der Inkubation: Sporenmasse in Grau-Farbserien, Sporenketten in Schnittspiralen, eng oder leicht offen gewunden, mit bis zu 7 Windungen; 10 bis 50 Sporen pro Sporenkette; Sporophoren monopodisch verzweigt, selten verticilliumartig verzweigt; Sporen kugelförmig, oval bis elliptisch, 0,9-1,3 um Durchm. oder 1,2-1,8 x 0,9-1,3 um; stachelig, wie durch Rasterelektronenmikroskopie ermittelt.

Biochemische Eigenschaften

- Melanin erzeugt; kein Schwefelwasserstoff erzeugt; Gelatine verflüssigt; Stärke aufgeschlossen; Dextrosenitrat, aber kein organisches Nitrat, reduziert zu Nitrat; schwaches Wachstum auf Jensen-Zellulosebrühe, aber kein Wachstum auf Levin- und Schoenlein-Zellulosebrühe; keine Zersetzung auf beiden Zellulosebrühen; Klärung, aber keine Koagulation und keine Peptonisation auf Milch; Kaseinverdau positiv; Tyrosinverdau negativ; Calciummalatverdau negativ. Kohlenhydratverwertung: Glucose, Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Saccharose und Xylose verwertet; Rhamnose nicht verwertet. Temperaturverhältnisse Mäßiges Wachstum Gutes Wachstum Kein Wachstum

Zellwand-Analyse

- Die Ganzzellen-Hydrolysate enthielten LL- Diaminopimelinsäure und Glucose.
Die Kultur N859-124 ist gekennzeichnet durch die grauen Sporen in der Masse, die positive Melaninreaktion, die spiralförmigen Sporenketten und die stacheligen Sporen. Die Ganzzellen-Hydrolysate lassen auf das Vorhandensein von LL- Diaminopimelinsäure und das Fehlen von diagnostischen Zuckern schließen. Glucose, Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Saccharose, Xylose, aber keine Rhamnose werden verwertet. Somit gehört die Kultur zur Art Streptomyces.
Bei einem Vergleich mit den beschriebenen Gattungen von Streptomyces ist die Kultur N859-124 sehr ähnlich S. durhamensis ATCC 23194 und S. griseochromogenes ATCC 14511 hinsichtlich der Zuchteigenschaften sowie der morphologischen und biochemischen Eigenschaften. Demgemäß wurden die drei Kulturen nebeneinander verglichen, um ihre Verwandschaft zu bestätigen.
Die Kultur N859-124 war ähnlich S. durhamensis bei den meisten biochemischen Eigenschaften. Erstere unterscheidet sich von letzterer jedoch durch das Unvermögen, Schwefelwasserstoff zu erzeugen, durch die Fähigkeit, Dextrosenitrat zu Nitrit zu reduzieren, durch das Unvermögen, Milch zur Gerinnung und zur Peptonisierung zu bringen, und durch das Unvermögen, bei 45ºC zu wachsen. Einige der Kulturunterschiede wurden festgestellt. Beispielsweise zeigten Kolonien der Kultur N859-124 auf Haferflocken-Agar, anorganische Salze-Stärke-Agar und Glucose- Asparagin-Agar eine dunklere graue Farbnuance. Außerdem erzeugte auf Glycerin-Asparagin-Agar und Czapek-Saccharose-Agar die Kultur N859-124, aber nicht S. durhamensis weiße bzw. blaßgraue oberirdische Myzele.
Die Kultur N859-124 war identisch mit S. griseochromogenes bei der Melaninproduktion, der Gelatineverflüssigung, dem Stärkeaufschluß, der Nitratreduktion, der Reaktion auf Milch, dem Temperaturbereich für das Wachstum und dem Muster der Kohlenhydratverwertung. Eine Spur von Schwefelwasserstoff wurde von S. griseochromogenes, nicht aber von N859-124 erzeugt. Zwar zeigten beide Kulturen ähnliche morphologische und Zuchteigenschaften, doch wurden einige unbedeutendere Unterschiede in der Kultur festgestellt. Auf organische Salze-Stärke-Agar und Glucose-Asparagin-Agar waren Kolonien der Kultur N859-124 aufgrund der Sporulation eher grau als weiß. Bei der Kultur N859-124 wurde mehr weißes bis blaßgraues aberirdisches Myzel auf Czapek-Saccharose-Agar erzeugt. Die Kolonien der Kultur N859-124 waren eher glatt als gekräuselt auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar und breiteten sich auf Czapek-Saccharose-Agar weniger aus als jene von S. griseochromogenes.
Auf Basis der obengenannten Resultate wird die Kultur N859- 124 als neuer Stamm von Streptomyces griseochromogenes Fukunaga angesehen.
Die Kultivierung und Isolierung des Makrolids UK-86.956 kann unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie im allgemeinen zur Erzeugung von Antibiotika durch Fermentation angewendet werden. Die Kultivierung kann in einem wässerigen Nährmedium, das geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoff und Spurenelemente enthält, während eines Zeitraums von mehreren Tagen unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 24 bis 36ºC stattfinden. Wie bei den meisten Fermentationen variiert die Menge an UK-86.956 mit den veränderten Fermentationsbedingungen, insbesondere was die Nährstoffbestandteile, die Belüftungsbedingungen und den pH betrifft. Das Myzelprodukt wird dann mittels Zentrifugation oder Filtration gewonnen und mit Aceton oder Methanol extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird konzentriert, und die gewünschten Produkte werden in ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Ethylacetat, Chloroform, Butanol oder Methylisobutylketon, extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird konzentriert, und das Rohprodukt wird notwendigenfalls durch Chromatografie weiter gereinigt. Eine Endreinigung von UK 86.956 kann durch wiederholte Säulenchromatografie oder unter Anwendung einer Technik, wie der Umkehrphasen-HPLC, oder durch präparative Dünnschichtchromatografie erzielt werden.
Alternativ kann die Kultivierung auf Agarplatten aus einem geeigneten Medium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 24 bis 36ºC über mehrere Tage stattfinden. Das Agar mit dem Myzelwachstum wird dann mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, extrahiert, filtriert, und das Filtrat wird konzentriert. Die weitere Anreicherung und Abtrennung von UK-86.956 erfolgt dann wie oben beschrieben.
Somit schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, die mit UK-86.956 bezeichnet ist, welches die Kultivierung des Mikroorganismus N859-124 oder einer mutanten, genetisch transformierten oder rekombinanten Form desselben mit der Fähigkeit, besagte Verbindung zu produzieren, in wässeriger Submerskultur oder auf festem Agar- Kulturmedium, enthaltend eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, unter aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Erzielung einer gewinnbaren Menge dieser Verbindung umfaßt.
Der Ausdruck Mutante schließt jeden Mutantenstamm, der spontan oder durch die Anwendung bekannter Methoden, wie der Behandlung mit Ionenbestrahlung oder Ultraviolettlicht, und/oder chemischen Mutagenen, wie N-Methyl-N-nitrosourethan, Nitrosoguanidin und Ethanmethansulfat, etc., entsteht, ein. Genetisch transformierte und rekombinante Formen schließen Mutanten und genetische Varianten ein, die durch gentechnische Methoden, wie z.B. Rekombination, Transformation, Transduktion und Protoplastenfusion, etc. erzeugt werden. Die Erfindung betrifft auch die durch obiges Verfahren erzeugte UK-86.956.
Wie zuvor erwähnt, ist die erfindungsgemäße Verbindung ein hochwirksames Breitband-Antiparasitikum mit der besonderen Eignung als Anthelmintikum, Ektoparasitizid, Insektizid, Acarizid und wachstumsförderndes Mittel beim Tier.
So ist UK-86.956 bei der Behandlung einer Vielzahl von durch Endoparasiten verursachten Erkrankungen, insbesondere einschließlich Helminthiasis, geeignet, welche am häufigsten durch eine Gruppe von parasitären, als Nematoden beschriebenen Würmern verursacht wird und hohe wirtschaftliche Verluste bei Schweinen, Schafen, Pferden und Rindern nach sich ziehen sowie Haustiere und Geflügel befallen kann. Die Verbindung ist auch gegen andere Nematoden wirkungsvoll, die verschiedene Tiergattungen befallen, beispielsweise Dirofilaria bei Hunden, und verschiedene Parasiten, die Menschen infizieren können, einschließlich gastrointestinaler Parasiten, wie Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, und Parasiten, die im Blut oder in anderen Geweben und Organen gefunden werden, wie Fadenwürmer und die extraintestinalen Stadien von Strongyloides und Trichinella.
Die Verbindung ist auch bei der Behandlung von Infektionen von Tieren und Vögeln wertvoll, die durch Ektoparasiten, insbesondere einschließlich Arthropoden-Ektoparasiten, wie Zecken, Milben, Läuse, Flöhe, Schmeißfliegen, beißende Insekten und wandernde Zweiflüglerlarven, die Rinder und Pferde befallen können, bewirkt werden.
Die Verbindung ist auch ein Insektizid, das gegen Ungeziefer im Haushalt, wie Küchenschaben, Kleidermotten, Teppichkäfer und Hausfliegen, wirksam sowie nützlich gegen Insektenschädlinge von Lagergetreide und von landwirtschaftlichen Pflanzen, wie Spinnmilben, Blattläusen, Raupen, und gegen wandernde Geradflügler, wie Heuschrecken, sind.
Die Verbindung UK-86.956 kann als für den beabsichtigten speziellen Gebrauch und die spezielle Gattung des zu behandelnden Wirttieres und des betreffenden Parasits oder Insekts geeignete Formulierung verabreicht werden. Bei der Verwendung als Anthelmintikum wird die Verbindung vorzugsweise durch Injektion, entweder subkutan oder intramuskulär, verabreicht, alternativ kann sie aufgetropft oder oral in Form von Kapseln, Boli, Tabletten oder flüssigen Arzneien verabreicht werden oder als Implantat eingegeben werden. Auftropf- und Injektionsformulierungen werden auf herkömmliche Weise entsprechend der Standardpraxis in der Veterinärmedizin hergestellt. Kapseln, Boli oder Tabletten können hergestellt werden durch Mischen des aktiven Ingrediens mit einem geeigneten fein verteilten Verdünnungs- oder Trägermittel und zusätzlich ein zerfallsförderndes Mittel und/oder ein Bindemittel, wie Stärke, Laktose, Talk oder Magnesiumstearat, enthalten. Eine flüssig formulierte Arznei kann hergestellt werden durch Dispergieren des aktiven Ingrediens in einer wässerigen Lösung zusammen mit Dispergier- und Netzmitteln, und injizierbare Formulierungen können in Form einer sterilen Lösung oder Emulsion hergestellt werden. Diese Formulierungen variieren hinsichtlich des Gewichts der aktiven Verbindung je nach der Gattung des zu behandelnden Wirttieres, der Schwere und Art der Infektion und dem Körpergewicht des Wirts. Im allgemeinen wird bei der oralen Verabreichung eine Dosis von etwa 0,001 bis 10 mg pro kg Tierkörpergewicht, gegeben als Einzeldosis oder in aufgeteilten Dosen über einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen, zufriedenstellend sein, doch kann es natürlich Fälle geben, wo höhere oder niedrigere Dosisbereiche angezeigt sind, und auch diese fallen in den Rahmen der Erfindung.
Alternativ kann die Verbindung mit dem Tierfutter verabreicht werden, und für diesen Zweck kann ein konzentriertes Futteradditiv oder -vorgemisch zum Mischen unter das normale Tierfutter hergestellt werden.
Zur Verwendung als Insektizid und zur Behandlung von landwirtschaftlichen Schädlingen wird die Verbindung als Spray, Staub, Auftropfformulierung, Emulsion und dgl. gemäß der Standardpraxis in der Landwirtschaft aufgebracht.
Zur Verwendung als Wachstumsförderer oder zur Verbesserung des Verhältnisses von magearem Fleisch zu Fett bei Farm- oder Haustieren kann die Verbindung mit dem Tierfutter oder Trinkwasser verabreicht werden. Alternativ kann sie oral in Form von Kapseln, Boli, Tabletten oder flüssigen Arzneien sowie parenteral durch Injektion oder als Implantat verabreicht werden. Solche Formulierungen werden auf herkömmliche Weise gemäß der Standardpraxis in der Veterinärmedizin hergestellt.
Zur Verwendung beim Menschen wird die Verbindung als pharmazeutisch akzeptable Formulierung gemäß üblicher medizinischer Praxis verabreicht.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, wobei Beispiel 1 die Herstellung, Isolierung und Identifizierung von UK-86.956, Beispiel 2 die anthelmintische Aktivität von UK-86.956 und Beispiel 3 die insektizide Aktivität von UK-86.956 beschreibt.
In Beispiel 1 wurden Oxoidpepton und Oxoid Lab Lemco von Oxoid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, UK, beschafft.
Ultraviolettspektren wurden unter Verwendung eines Hewlett Packard 8452A Diodengruppenspektrofotometers aufgezeichnet.
Die Elektronenstoß-Massenspektroskopie wurde unter Verwendung eines VG-Massenspektrometers, Modell 7070F, durchgeführt.
Die FAB(Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopie wurde unter Verwendung eines VG-Massenspektrometers, Modell 7070E, durchgeführt. Proben wurden eingebracht unter Verwendung einer Matrix, bestehend aus Glycerin, Thioglycerin, Natriumchlorid und Wasser.
Die optische Drehung wurde auf einem Perkin Elmer 141 Polarimeter bestimmt.
Die Daten der kernmagnetischen Resonanzspektren wurden unter Verwendung eines General Electric GN500-Spektrometers erhalten.

Beispiel 1

Der Mikroorganismus Streptomyces griseochromogenes N859-124 (ATCC 53928) wurde bei 28ºC auf einem Schrägagar mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: Stärke 20 g/l, Glucose 10 g/l, Bacto-Casiton (von Difco Co., Detroit, USA) 5 g/l, Difco Hefeextrakt 5 g/l, Calciumcarbonat 1 g/l, Agar 20 g/l, eingestellt auf pH 7,1. Nach sieben Tagen wurde der oberirdische Wuchs zum Inokulieren von sechs 500 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, von denen jeder 100 ml eines Mediums mit folgender Zusammensetzung enthielt: Stärke 24 g/l, Oxoid-Pepton 5 g/l, Oxoid-Hefeextrakt 5 g/l, Calciumcarbonat 4 g/l, Lab Lemco 3 g/l und Glucose 1 g/l. Diese Kolben wurden bei 28ºC auf einem Drehschüttler, der mit 200 rpm 4 Tage lang in Betrieb war, inkubiert. 5 ml dieses Inokulums wurden dann auf die Oberfläche jeder von 117 Agarplatten (245 x 245 mm, Nunc) gegeben, die 250 ml eines Mediums enthielten, welches Sojamehl 10 g/l, Cerelose 10 g/l, Stärke 10 g/l, Distillers Solubles 5 g/l, Natriumchlorid 5 g/1, Calciumcarbonat 1 g/l, Kobaltchlorid 10 mg/l und Agar 20 g/l, eingestellt auf pH 7,2, umfaßte. Diese Platten wurden vor Extrahieren der gesamten Substanz mit Methanol (30 l) bei 28ºC zwischen 5 und 7 Tagen inkubiert. Die resultierende Suspension wurde filtriert und unter Vakuum konzentriert, um 1 l wässerige Lösung zu ergeben. Diese wurde dreimal mit 1 l Ethylacetat extrahiert, und die organische Lösung wurde zur Trockene konzentriert. Zum Rückstand wurden 10 ml Methanol gegeben, und diese Lösung wurde auf eine Sephadex LH 20-Säule (4 x 85 cm) (Pharmacia) gepackt und mit 2 l Methanol eluiert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgedampft und der Rückstand auf einer Silikasäule (Kieselgel 60, 70-230 Mesh, Merck) (4,5 x 30 cm) unter Eluieren zuerst mit Chloroform (500 ml) und schließlich mit Chloroform-Ethylacetat 20:1 (500 ml) chromatografiert. Fraktionen, die UK-86.956 enthielten, wie durch Dünnschichtchromatografie festgestellt worden war, wurden unter Vakuum zur Trockene konzentriert. Die Endreinigung wurde durch präparative Kieselerdeschichtchromatografie unter Entwicklung mit Chloroform-Ethylacetat 3:1 erzielt, um reines UK-86.956, 64 mg, zu liefern.
Die so erhaltene reine UK-86.956-Probe besitzt die folgenden charakteristischen physikalischen und spektroskopischen Daten:
a) Spezifische optische Drehung [α]²&sup5; + 95,0º (c = 0,16, Aceton)
b) Ultraviolett-Absorptionsspektrum 238 (&epsi; = 24 600)
max 244 (&epsi; = 27 000)
252(sh) (&epsi; = 17 500)
c) Hauptionen im Elektronenstoß-Massenspektrum 612 (M&spplus;), 594 (M-H&sub2;O), 576 (M-2H&sub2;O)&spplus;, 466, 151.
d) FAB-Massenspektrum 635 (M + Na&spplus;) (theoretisch 635)
e) Protonenmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;) zum Teil: gut aufgelöste Signale bei δ=5,79 (dm, J=11,4, 1H), 5,73 =13,8, 11,4, 1H), 5,41 (bs, 1H), 5,12(d, J=8,1, 9(dd, J=14,3, 2,1, 1H), 4,65 (dd, J=14,3, 2,1, 4,29 (m, 1H), 3.95 (d, J=6,2, 1H), 3,36 (d, =10,2, 1H), 3,26 (m, J=2,3, 1H), 2,56 (m, 1H), 1,87 (bs, 3H), 1,57 (bs, 3H), 1,54 (bs, 2H), 1,40 (q, J=12, 1H), 1,03 (d, J=6,6, 3H), 1,00 (d, J=6,6, 3H,), 0,93 (d, J=6,7, 3H) und 0,70 (d, J=6,6, 3H).
Aufgrund einer detaillierten Analyse der kernmagnetischen Resonanzdaten glaubt man, daß die erhaltene Verbindung die folgende relative Stereochemie hat:

Beispiel 2

Es wurde die anthelmintische Aktivität der nach Beispiel 1 erhaltenen Verbindung UK-86.956 gegen Caenorhabditis elegans unter Verwendung des von K.G. Simpkin und G. L. Coles in Parasitology, 1979, 79, 19, beschriebenen Screening-Tests ausgewertet. Die Verbindung tötete 100 % der Würmer bei einer Konzentration von 0,01 ppm pro Vertiefung.

Beispiel 3

Es wurde die insektizide Aktivität von UK-86.956 gegen das Larvenstadium der Schmeißfliege Lucilia cuprina (Q-Stamm) unter Verwendung eines Standard-Verfahrens, bei welchem Ersterscheinungsform-Larven mit mit der Testverbindung behandeltem Filterpapier in Kontakt gebracht werden, ausgewertet. Die Testverbindung wird zuerst als Acetonlösung auf das Papier aufgebracht. Das behandelte Filterpapier wird dann in ein Röhrchen gegeben, welches 1 ml Serum eines neugeborenen Kalbes enthält, und die Ersterscheinungsformen werden zugegeben. UK-86.956 tötete 100 % der Larven bei Aufbringen auf das Filterpapier in einem Gehalt von 10 mg pro Quadratmeter.

Claims

1. Verbindung der Formel

2. Verbindung der Formel (I), worin die relative Stereochemie der Formel (II) entspricht:

3. Verbindung, hergestellt durch Fermentation des Mikroorganismus Streptomyces griseochromogenes ATCC 53928 oder einer mutanten, genetisch transformierten oder rekombinanten Form desselben, gekennzeichnet durch die folgenden physikalischen und spektroskopischen Eigenschaften:

a) Spezifische öptische Drehung [α]²&sup5; + 95,0º (c = 0,16, Aceton)

b) Ultraviolett-Absorptionsspektrum 238 (&epsi; = 24 600)

max 244 (&epsi; = 27 000)

252(sh) (&epsi; = 17 500)

c) Hauptionen im Elektronenstoß-Massenspektrum 612 (M&spplus;), 594 (M-H&sub2;O), 576 (M-2H&sub2;O)&spplus;, 466, 151.

d) FAB-Massenspektrum 635 (M + Na&spplus;) (theoretisch 635)

e) Protonenmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;) zum Teil: gut aufgelöste Signale bei δ=5,79 (dm, J=11,4, 1H), 5,73 (dd, J=13,8, 11,4, 1H), 5,41 (bs, 1H), 5,12(d, j=8,1, 1H), 4,69(dd, J=14,3, 2,1, 1H), 4,65 (dd, J=14,3, 2,1, 1H), 4,29 (m, 1H), 3,95 (d, J=6,2, 1H), 3,36 (d, J=10,2, 1H), 3,26 (m, J=2,3, 1H), 2,56 (m, 1H), 1,87 (bs, 3H), 1,57 (bs, 3H), 1,54 (bs, 2H), 1,40 (q, J=12, 1H), 1,03 (d, J=6,6, 3H), 1,00 (d, J=6,6, 3H,), 0,93 (d, J=6,7, 3H) und 0,70 (d, J=6,6, 3H).

4. Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend die Kultivierung des Mikroorganismus Streptomyces griseochromogenes ATCC 53928 oder einer mutanten, genetisch transformierten oder rekombinanten Form desselben mit der Fähigkeit, besagte Verbindung zu produzieren, in wässeriger Submerskultur oder auf festem Agar-Kulturmedium, enthaltend eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, unter aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Erzielung einer gewinnbaren Menge dieser Verbindung und die Gewinnung, Isolierung und Reinigung dieser Verbindung.

5. Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhütung von Parasiteninfektionen bei Menschen und Tieren, einschließlich anthelmintischen, insektiziden und acaridischen Zusammensetzungen, welche eine Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 3 zusammen mit einem inerten Verdünnungsmittel oder Träger umfaßt.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5 in Form einer oralen, injizierbaren oder aufbringbaren Formulierung oder in Form eines Sprays oder Staubes oder in Form eines konzentrierten Futterzusatzes, -vorgemisches oder -ergänzungsstoffs zur Einarbeitung in das normale Tierfutter.

7. Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur verwendung bei der Behandlung oder Verhütung von Parasiteninfektionen bei Menschen oder Tieren.

8. Verfahren zur Bekämpfung von Insekten- oder Parasiteninfektionen oder -befall (ausschließlich Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers) und von agrikulturellem oder hortikulturellem Schädlingsbefall, welches die Applikation einer wirksamen Menge einer Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 3 auf den für besagte Infektion oder besagten Befall verantwortlichen Mikroorganismus bzw. auf die Stelle seines Vorkommens umfaßt.

9. Biologisch reine Kultur eines Stamms der Art Streptomyces mit den Identifikationsmerkmalen von ATCC 53928 oder einer mutanten, genetisch transformierten oder rekombinanten Form desselben, welcher Mikroorganismus in der Lage ist, die antibiotischen Verbindungen nach Anspruch 1, 2 oder 3 nach Kultivierung in einem wässerigen Nährmedium, das eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, in gewinnbarer Menge zu produzieren.

10. Streptomyces griseochromogenes ATCC 53928.