DD267512A5

DD267512A5 - Verfahren zum herstellen von avermectinen und kulturen hierfuer

Info

Publication number: DD267512A5
Application number: DD88312394A
Authority: DD
Inventors: Edmund W Hafner; Kelvin S Holdom; Shin-Jen E Lee
Original assignee: ��@��Kk��
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1989-05-03
Also published as: CN88100649A; CZ279782B6; FI880280A0; ES2053719T3; HUT47644A; IN167980B; EP0276131A2; PL156764B1; FI90088C; CN1056883C; SK40788A3; AU7111091A; PT86584B; JPS63291576A; IE61066B1; MY103514A; BR8800271A; FI880281A0; PL270239A1; AU631298B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Avermectinen und Kulturen hierfuer. Staemme von Streptomyces avermitilis, denen die Transaminase-Aktivitaet fuer verzweigtkettige Aminosaeuren und/oder die Dehydrogenase-Aktivitaet fuer verzweigtkettige 2-Oxosaeuren fehlt/fehlen; Verfahren zu deren Erzeugung und ihre Verwendung fuer die Herstellung natuerlicher und nicht-natuerlicher Avermectine, die als Mittel gegen Parasiten wertvoll sind.

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Stämme von Streptomyces avermitilis, denen die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren und/oder die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, auf Verfahren zum Herstellen dieser £>_Λ avermitilis und auf die Verwendung von S. avermiti1 is zur Herstellung natürlicher und nicht-natürlicher Avermectine.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die US Patente 4.310.519 und 4.429.042 beschreiben die Avermectine, einen Komplex miteinander verwandter Agentien mit starker antiparasitäter Aktivität, und de.'.en Herstellung

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26 7 άΓ/2

durch aerobe Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces avermitilis, nämlich von S^ avermitilis ATCC Nr. 31267, 31271 und 31272. Die beiden letztgenannten Stämme stellen Kulturen dar, die in einem Gläschen eingefroren bzw. in einem Röhrchen lyophi1isiert wurdenund durch ultraviolette Bestrahlung von S. avermitil is ATCC 312 67 gewonner, v/orden waren.

Die EP 214 . 7 ? 1, veröffentlicht am 18. März 1987, die der US-Anmeldung, Serial No. 886,867, eingereicht am 16. Juli 1986, entspricht, offenbart eine Reihe von Verbindungen (die hier als nicht-nacür1iche Avermectine bezeichnet werden), die mit den natürlichen oder bekannten Averm.Retinen verwandt sind, aber in 25-Stel lung eine neue Subshituentengruppe besitzen, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Fermentation eines Avermectin produzierenden Organismus' in Gegenwart bestimmter, spezifizierter Carbonsäuren oder Derivate oder Vorläufer hiervon. Die S^ avermitilis-Organismen, die zur Herstellung dieser neuen, C-25-substituierten Avermectine eingesetzt v/erden, sind S^ avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 und NCIB 12121. Der letztgenannte Organismus, beschrieben in EP 214.731, wird aus S^ avermitilis ATCC 31271 erhalten. Er liefert höhere Ausbeuten an den neuen C-25-substituierten Avermectinen, v/enn er in einem halbdefinierten Medium kultiviert wird. Jeder der Stämme ATCC 31267, 31271, 31272 und NCIB 12121 kann außerdem zusätzlich zu den neuen C-25-substituierten Derivaten verschiedene Mengen der bekannten oder natürlichen AveriTiPctine produzieren, ii denen der 25-Substituent Isopropyl oder (S)-sec-butyl (1-Methylpropyl) ist.

Das Kohlenstoffskelett der Avermectine (in Formel (I) unten angegeben) leitet sich von Acetaten und Propionaten ab, und der C-25-Substituent natürlicher Avermectine leitet sich von L-Isoleucin (R-(S)-sec-butyl) oder L-Valin (R=Isopropyl) ab (Fisher und Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) Kap. 14) .

Unter "bekannten" oder "natürlichen" Avermectinen sollen solche Avermectine verstanden werden, die von S^ avermiti1 is ATCC 31267, ATCC 31271 und ATCC 31272 produziert werden, v/obei der Substituent in 25-Stel lung entweder Isopropyl oder (S)-sec-Butyl (1-Methylpropyl) ist. Avermectine, in denen der Substitute.t in 25-3tellung ein anderer als Isopropyl oder sec-Butyl (S-Form) ist, werden in dieser Beschreibung als neue oder nicht-natürlj ehe Avermectine bezeichnet.

Die St.ämme von S^ avermitilis, die in den oben erwähnten US-Patenten genannt sind, produzieren eine Klasse von Verbindungen, die dort den Gattungsnamen ("Generic") C-076 tragen. Die Klasse umfaßt acht unterschiedliche, aber eng verwandte Verbindungen, die als C-076-Ala, -Alb, -A2a, -A2b, -BIa, -BIb, -B2a und -B2b bezeichnet werden. Die "a"-Verbindungsreihe bezieht sich auf die natürlichen Avermectine, in denen der 25-Substituent (S)-sec-Butyl ist, und die "b"-Reihe auf diejenigen, in denen der 25-Substituent Isopropyl ist. Die Bezeichnungen-¹¹A" und "B" beziehen sich auf Avermectine, in denen der 5-SuDstituent Methoxy bzw. Hydroxy ist. Schließlich bezieht sich die Ziffer "1" auf Avermectine, in denen in der 22-23-Position eine Doppelbindung vorliegt und die Ziffer "2" auf Avermectine, in denen in der 22-Position ein Wasserstoffatom und in der 23-Position Hydroxy gebunden vorliegt.

In dieser Anmeldung werden bezüglich des 25-Substituenten der nicht-natürlichen Avermectine solche Identif ikationsmerkma.·. e nicht verwendet. Die Identifikationsmerkmale Al, A2, Bl und B2 wurden beibehalten, um auf strukturelle Merkmale der nicht-natürlichen Avermectine zu verweisen, die denjenigen der natürlichen Avermectine entsprechen, wie oben angemerkt.

Die Erzeugung von Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige Alpha-Ketosäuren fehlt, wurde für 3acillus subtilis von Willecke und Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264-72 (1971) und für Pseudomonas putida von Martin et al., J. Bacteriology, IJJi, 198-204 (1973) beschrieben, aber

nicht für Streptomycos.

Über S_^ avermitiiis AgIy-J, eine Mutante, die faktisch nur die Averniectin-Aglycone Ala und A2a produziert, wurde von Schulman et al., J. Ar.tibiot. 38(11), 1494-1498 (1985) berich tet. Ebenfalls beschrieben wurde die Fermentation von S_^ aver mi ti 1 is AgIy-I in Gegenwart von Sinefungin, das eine erhöhte Produktion der Avermectin-Aglycon-B-Bestandteile verursachte. Ähnlich führte die Fermentation von S^ avermitilis 08, einem Stamm mit hoher Avermectin-Produktion, in Gegenwart von Sinefungin als Inhibitor der O-Methyl-Transferasen zur Produktion von Avermectinen ohne O-Methylgruppen am Aglycon in C-5-Position und an der Oleandrose-Disaccharid-Gruppe.

Das US-Patent. 4.378.353 beschreibt mit C-076 verwandte Verbin dungen und deren Herstellung durch Kultivation von MA-5218, einer Mutante von S^ avermiti.¹.is ATCC 31272, die durch ultraviolette Bestrahlung daraus erhalten wurde. Die Mutante wird als ATCC 317&0 identifiziert. Den dem C-076 verwandten Verbin dungen, die diese Mutante produziert, fehlt der C-076-Furariring. Zusätzlich waren in einigen dieser genannten Verbindungen einer der oder beide Oleandrose-Zuckergruppen gespalten, während in anderen die Gruppe in 5-Stellung zu einer Keto-Gruppe oxidiert war.

Über drei Klassen von O-Methyltransferase-Mucanten von S. avermiti1 is, die Avermectine ohne O-Methyl-Gruppen produzieren, ist von Ruby et al., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Hungary, 26.-30. August (1985), und von Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy IA^, 744-7 (1987) berichtet worden. Die erste Klasse produziert vornehmlich B-Avermectine, da sie nicht in der Lage ist, die C-5-Hydroxylgruppe des macrocyclischen Lactonrings zu methylieren. Die zweite Klasse produziert Y -0,-Y ' O-Bis-demethylavermectine (Avermectine, die in 3-Stel lung beider Oleandrose-Monosaccharidreste keinen O-Methyl-Substituenten tragen), die als Demethylavermectine

2 δ V £

bezeichnet werden. Die dritte Klasse kann in gar keiner Position methylieren.

Schulman et al., Fed. Proc. _<H, 931 (1985), offenbart eine erhöhte Produktion von B-Avermectinen durch Fermsntieren von S_._ avermitilis in Gegenwart von Substanzen wie Sinefungin, S-Adenosylethionin und S-Adenosylhomocystein, die die Methylierung der C-5-Hydroxy-Gruppe der Aglycon-Einheit durch das Enzym Avermectin-B-O-Methyltransferase inhibieren. Schulman et al. offenbart und bezieht sich in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2^, 620-624 (1986) auf Streptomyces avermitilis-Mutanten, die keine O-Methyltransferase-Aktivität besitzen und erhöhte Mengen an Avermectin-B-Bestandteilen produzieren.

Die Mutagenese von S^ avermitilis erzeugt Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren oder die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt.. Mutagenese der so hergestellten, einfach blockierten Mutanten führt zu Mutanten, denen sowohl die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren als auch die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt. Die Mutanten besitzen in Abwesenheit einer zugesetzten Verbindung RCOOH, worin R Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, oder einer Verbindung, die sich wänrend des Fermentationsverfahrens in RCOOH umwandeln läßt, nicht länger die Fähigkeit, nennenswerte Mengen an natürlichen Avermectinen zu produzieren. Überraschend und unerwartet konnte jedoch festgestellt werden, daß die Mutanten Avermectine, natürliche und nicht-natürlicne, produzieren, wenn sie in Anwesenheit einer zugesetzten Verbindung RCOOH, worin R Isopropyl oder (£)-sec-Butyl oder eine andere, hier offenbarte Gruppe ist, oder eines Vorläufers für dieses RCOOH fermentiert werden. Noch erstaunlicher ist es, daß die hier beschriebenen Mutanten, denen nur die Dehydrogenase-Aktivität für verzueigtkettige 2-Oxosäuren fehlt und die L-Isoleucin oder L-Valin nicht abbauen können, in der Lage sind, eine große Vielzahl von Verbindungen für den biosynthetischen Aufbau von Avermectin zu assimilieren und

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dabei nicht-natürliche Avermectine zu produzieren, ohne daß natürliche Avermectine vorhanden sind.

Mindestens genauso überraschend ist die Feststellung, daß die hier beschriebenen Mutanten, denen die Transaminase für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt und die L-Isoleucin, L-Leucin oder L-Valin nicht abbauen können und die diese drei Aminosäuren benötigen, um v/achsen zu können, ebenfalls andere Verbindungen assimilieren können und dabei nicht-natürliche Avermectine produzieren, ohne daß dabei natürliche Avermectine vorhanden sind.

Die natürlichen Avermectine werden, wie schon angemerkt, als komplexe Mischung von acht unterschiedlichen, aber nahe verwandten Verbindungen erzeugt; Formel (I), R = Isopropyl und (S) -sec-Butyl. Während sie in im wesentlichen reiner Form isoliert wurden (siehe US Patent 4.429.042), ist das Herstellungsverfahren bestenfalls als mühsam zu bezeichnen. Die Herstellung von nicht-natürlichen Avermectinen nach dem Verfahren, das in der EP 214.731 beschrieben ist, kann unter anderem wegen des Vorhandenseins von Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und der Aminosäuren L-Valin und L-Iscleucin in der Zelle der Mikroorganismen S_^ avermitilis, die für ihre Erzeugung verwendet werden, zu einigen der natürlichen Avermectine - in unterschiedlichen Mengen - führen.

Ziel der Erfindung

Es ist ein wünschenswertes Ziel, in der Lage zu sein, auszuwählen, ob natürliche oder nicht-natürliche Avermectine erzeugt werden, um so die Anzahl und die Komplexizität der Produkte möglichst klein zu halten und dadurch die Reinheit eines ausgewählten Avermectins zu steigern und die Trennschritte zu vereinfachen.

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- 11 Darlegung des Wesens der Erfindung

Stämme von S^ avernitilis, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren oder die Transaminase-Aktivi tät für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt, werden durch Mutieren Avermectin produzierender Stämme von S^ avermitilis erzeugt, und insbesondere durch Mutation von S^ avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 oder NCIB 12121. V/eitere Mutation einer jeden dieser Mangelmutanten erzeugt. Stämme, denen beide Aktivitäten fehlen. Die Mutanten sind unfähig, die natürlichen Avermectine zu synthetisieren, es sei denn, man setzt die Fettsäure oder eine Vorstufe dafür, die die Iso propyl- oder sec-Butyl-Gruppe (S-Form) trägt, dem Medium zu, in dem die Mutanten fermentiert v/erden. Sie sind fähig, natür liche und nicht-natürliche Avermectine zu produzieren, wenn sie unter wäßrigen, aeroben Bedingungen in einem Nährmedium fermentiert werden, das ein geeignete Starter-Säure oder eine Verbindung enthält, die während des Fermentationsprozesses in diese überführt werden kann.

Diejenigen Mutanten, die durch das Fehlen von Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-0xosäuren charakterisiert

14 sind, werden auf der Grundlage einer CO„-Bestimmung aus den mutierten Kolonien isoliert. In diesem Verfahren zeigt das

14 Fehlen einer CO„-Entwicklung aus einem Substrat aus

[ C-l7-2-Oxoisocapronsäure oder [ C-l7-2-Oxo-3-methylvaleriansäure oder [ C-l7-2-Oxo-3-methylbuttersäure durch eine permeabilisierte Kolonie das Fehlen von Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2~0xosäuren auf.

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Diejenigen Mutanten, die durch das Fehlen von Aminosäure-Transaminase-Aktivität gekennzeichnet sind, werden aus den mutierten Kolonien auf der Grundlage ihrer Unfähigkeit selektiert, auf einem Medium ohne L-Isoleucin, L-Leucin und L-Valin zu wachsen. In der Praxis werden einzelne Kolonien, die auf einem Agar-Medium auf der Basis von M9-Salzen und Glucose wachsen, das durch all die einzelnen Aminosäuren ergänzt ist, die man in Casaminosäure findet, auf ein ähnliches Medium übertragen, dem jedoch L-Isoleucin, L-Leucin und L-Valin fehlen. Die hier beschriebenen Mutanten, denen nur die Transferase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt, können 2-Oxosäuren als Vorläufer für die Produktion von Avermectinen verwerten,

Es war überraschend und unerwartet, daß di.e hier beschriebenen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigt kettige 2-0xosäuren und/oder die Transaminase-Aktivität für verzv/eigtkettige Aminosäuren fehlt/fehlen, ihre Fähigkeit zur Produktion von Avermectinen, insbesondere von nicht-natürlichen Avermectinen, behielten. Die Unfähigkeit der Mutanten, die natürlichen Fettsäure-Coenzym A - Derivate zu produzieren, wenn sie auf einem gängigen Medium gezüchtet werden, hätte zu einer letalen Mutation führen können, wenn die Integrität der Membran von diesen Derivaten abhinge oder wenn die Akkumulierung von 2-üxosäuren durch die erstere Mutante Cytotoxizität zur Folge haben könnte. Man hatte darüber hinaus von keiner der Mutanten erwartet, daß sie in der Lage sein würde, Acetyl-CoA und Propionyl-CoA aus dem L-Isoleucin- und L-VaIin-Katabolismus zu synthetisieren, da hierfür die Enzym-Aktivitäten notwendig sind, die den Mutanten fehlen. Der Bedarf an diesen Acy1-CoA-Derivaten für die Avermectin-Biosyn these, der oben erwähnt ist, führte zu der Erwartung, daß die Mutanten bezüglich der Produktion von nicht-natürlichen Avermectinen stark beeinträchtigt c-ein könnten, was überraschenderweise nicht der Fall v/ar.

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Das Fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren in den hier beschriebenen Mutanten führt dazu, daß die Sythese von verzweigtkettigen Acyl-CoA's aus dem Abbau von L-Isoleucin, L-Leucin und L-Valin blockiert wird, und damit auch die Synthese der natürlichen Avermectine. Ähnlich besitzen die bezüglich der Transaminase für verzweigtket tige Aminosäuren negativen Mutanten von S_^ avermicilis ebenfalls das Charakteristikum, daß die Synthese von verzweigtkettigem Fettsäure-CcA nicht stattfindet und, demzufolge, die natürlichen Avermect: ne nicht gebildet werden können. Dieses Fehlen der Fettsäure-CoA hat <iwei Gründe. Zum ersten können solche transaminasenegativen Mutanten aus im Medium angebotenem Isoleucin, Leucin und Valin über den normalen Weg der Transaminierung keine verzweigtkettigen 2-0xosäuren bilden. Zum zweiten ist in diesen Transaminase-Mutanten die Produktion von vevzweigtkettigen 2-0xosäuren durch den zellulären Biosyntheseweg für verzweigtkettige Aminosäuren blockiert, da diese Aminosäuren notwendigerweise im Fermentations-Wachstuir.s medium enthalten sein müssen. Das Vorhandensein dieser Aminosäuren verhindert infolge gut bekannter Mechanismen der Enzym-"epression und der Produkthemmuncj durch diese Aminosäure-Endprodukte des Pathways, daß dieser Biosynthese-Pathway beschritten wird (und damit, daß die zwischenzeitlich entstehen den 2-0xosäuren gebildet werden). Daß diese 2-0xosäuren, die Substrate für das aktive Dehydrogenase-Enzym für verzweigtkettige 2-0xosäuren sind, nicht verfügbar sind, verhindert wirksam die Synthese von verzweigtkettigem Fettsäure-CoA. So umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung solcher 2-0xosäure-Dehydrogenase-Mangel- und Transaminase-Mangelmutanten und derjenigen Mutanten, in denen beide Mutationen, der Mangel an verzweigtkettiger Transaminase und der Mangel an 2-Oxosäure-Dehydrogenase, kombiniert sind.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch jedweden Organismus, ohne Ansehen seiner Erscheinungsform und seines physiologischen Verhaltens, der mittels Transformation, Transduktion, genetischer Rekombination oder eines anderen genetischen Ver-

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fahrens unter Verwendung einer Nukleinsäure oder eines äquivalenten Materials aus den hier beschriebenen Spezies gebildet wurde, wenn er dabei die Charakteristika der hier beschriebenen Mutanten angenommen hat.

Die Ausdrücke "Avermectin" oder "Avermectine" beziehen uich, se wie sie hier gebraucht werden, auf Verbindungen mit der Formel (I) unten, in denen jedoch der 25-Substituent (R) eine beliebige Gruppe sein kann, die von den S_._ avermitilis-Stämmen dieser Erfindung assimilierbar ist.

Die hier beschriebenen Mutanten sind für die Produktion von nicht-natürlichen Avermectinen d irch die hier offenbarten und beispielhaft dargelegtan Verfahren außerordentlich wertvoll. Sie sind insbesondere von Wert für die Herstellung bevorzugter Avermectine, ö.h. von Verbindungen, in denen der C-25-Substituent C .-C,-Cycloalkyl oder -Cycloalkenyl, das fakultativ durch eine C.-C .-Alkylgruppe substituiert ist, 1-Methylthioethyl oder eine 5- oder 6-gliedrige, Sauerstoff oder Schwefel tragende heterocyclische Gruppe ist, insbesondere 3-Thienyl oder 3-Furyl.

Die Mutation eines Avermectine produzierenden Angehörigen der Spezies Streptomyces avermitilis wird nach bekannten Verfahren durchgeführt, wobei man eine Vielzahl von Mutationsauslösern verwenden kann, einschließlich Ultraviolett-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, N-Methyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidin, Methansulfonsaureethyleste*:, salpetriger Säure und Stickstoff-Senfgas, z.B. N-Methylbis(2-chlorethyl)amin, oder ähnliche Behandlungsverfahren. Die Mutagenese kann an Sporen oder einer im Wachstum befindlichen Kultur von S. avermitilis, die natürliche Avermectine produzieren kann, durchgeführt werden, z.B. an S^ avermitilis ATCC 31272.

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Bei dem den Fachleuten gut bekannten Verfahren selektiert man die mutierten Kolonien auf das Fehlen der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren auf der Grundlage eines biochemischen Bestimmungsverfahrens, welches das Durchsuchen einer großen Anzahl zufällig mutierter bakterieller Kolonien auf eine COp-Produktion aus /*14-C-l7-2-Oxosäuren erlaubt (Tabor et al., J. Bact. :L2_8, 48^-436, 1976).

Die Methode umfaßt das Züchten der Mutanten-Kolonien in den Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte auf einem geeigneten Nährmedium, das Permeabilisieren der Zellen mit Toluol und das anschließende Zusetzen von [ C-lJ-2-Oxosäure (z.B. 2-0xo isocapronsäure) zu jeder Vertiefung und das Messen der

14 Atmosphäre über der Kultur auf die Anwesenheit von C0_.

Alternativ kann anstelle von [ C-lJ-2-Oxoisocapronsäure -14 -14 «.

C C-l7-2-Oxo-3-methylvaleriansäure oder [C-IJ-

2-Oxo-3-methy!buttersäure verwendet werden. Die Produktion

14 von CO- wird bequemerweise gemessen, indem mit feuchtem Ba(OH)₀ gesättigtes Filterpapier oberhalb der einzelnen

14 Vertiefungen angebracht wird, um freigesetztes CO₉

14 aufzufangen, und das eventuell gebildete Ba C0_ mittels Autoradiographie gefunden wird. Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-0xosäuren fehlt, liefern Autoradiogramme, die denen der Leerkontrollen annähernd gleichen; d.h. von diesen Mutanten wird kein

14 Ba C0~ produziert.

Die so erhaltenen Mutanten werden mit irgendwelchen der obengenannten Mutagene weiterer Mutagenese unterv/orfen. Die mutierten Kolonien werden auf der Grundlage, daß sie nicht auf M9-Glucose-Minimalplatten wachsen können, sofern nicht L-Isoleucin, L-Leucin und L-Valin (ILV) vorhanden sind, auf das Fehlen der Transferase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren selektiert. Alle drei Aminosäuren müssen anwesend sein, damit Wachstum auftritt. Es ist weiterhin gezeigt worden, daß die Transaminase-Mangelmutanten nicht auf Medien wachsen, die durch alle drei Ketosäuren ergänzt sind, die als

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Substrate für die Transaminase-Reaktionen dienen. Ein einziges Transaminase-Enzym katalysiert also die Transaminierung aller drei Ketosäuren (2-Oxo-3-methylvaleriansaure, 2-0xoisocapronsäure, 2-Oxoisovaleriansäure)·

Die doppelt blockierten Mutanten, denen sowohl die Deh/drogenaseaktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren als auch die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlen, sind von besonderem Interesse, da die Wahrscheinlichkeit extrem niedrig ist, daß sie sich wieder in Kulturen zurückverwandeln, die natürliche Avermectine produzieren. Die nur einfach blockierten Mutanten können sich unter bestimmten Umständen wieder in Kulturen zurückbilden, die natürliche Avermectine produzieren könnten.

Zusätzlich zur Herstellung gewünschter Allele eines gegebenen Stammes von Mikroorganismen durch Mutagenese erlaubt die Protoplastenfusion das Einführen erwünschter Allele, die von einem Stamm produziert / in einem Stamm identifiziert wurden, in das Chromosom eines anderen Stamms. Beispielsweise kann man aus einem Stamm von S_^ avermiti 1 is, dem die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-0xosäuren und die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlen, durch Protoplastenfusion mit einem S_^ avermiti1 is-Stamm, der die vorgenannten Aktivitäten aufweist, einen Stamm von S_. avermitilis erzeugen, dem nur die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt. Wie die Fachleute wissen, ermöglicht die Protoplastenfusions-Technologie die Kombination erwünschter Allele aus divergenten Selektionslinien in einem einzigen Stamm. Der hier beschriebene S^ avermitilis JC-923 (ATCC 53669), ein Stamm, dem die Transaminase für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt, wurde mittels dieser Technologie erzeugt.

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Die morphologischen Eigenschaften und das Verhalten der erfin dungsgemäßen Mutanten in Kultur entspricht im allgemeinen dem jenigen, das im US Patent 4.429.042 beschrieben ist. Das unterscheidende Charakteristikum der erfindungsgemäßen Mutanten ist ihr Fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und/oder der Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren, und diese Charakteristika v/erden wie hier beschrieben bestimmt. Das Fehlen dieser Aktivitäten führt zur Unfähigkeit der Mutanten, beim Wachsen auf einem definierten Medium, das im v/esentlichen frei von Fettsäuren RCOOH mit R gleich Isopropyl oder (S)-sec-Butyl oder von Verbindungen ist, die während der Fermentation in dieses RCOOH umgewandelt werden können, die natürlichen Avermectine zu produzieren. Eine taxonomische Untersuchung, ausgeführt von der American Type Culture Collection, bestätigte, daß die Charakteristika zweier mutanter Stämme 1-3 und HL-026, ausge-

wählt mittels des obenerwähnten C0„-Tests, eine enge Verwandtschaft zu denjenigen des elterlichen Stamms ATCC 31272 aufweisen, der im US Patent 4.429.042 beschrieben ist, jedoch mit bestimmten Ausnahmen. So bildet der mutante Stamm 1-3 (ATCC 53567) signifikant weniger Sporenketten, als dies ATCC 31272 tut, und der mutante Stamm HL-026 (ATCC 53568) ist praktisch frei von Luftmycel und Sporen, aber die ganz wenigen Sporen, die er hervorbringt, besitzen ähnliche Eigenschaften wie diejenigen von ATCC 31272. Auch erweist es sich als unsicher, ob die Mutante HL-026 Raffinose als einzige Kohlenstoffquelle verwerten kann, während der Stamm ATCC 31272 und der mutierte Stamm 1-3 in der Lage sind, Raffinose zu verwerten. (In Experimenten der Anmelderin schien Raffinooe das Wachstum keines dieser Stämme zu unterstützen.) Ein weiteres Charakteristikum des mutierten Stamms HL-C26 war es, daß er weniger Melaninpigment als die anderen beiden Stämme und einzigartigerweise überhaupt keines auf Tyrosin-Agar erzeugte. Schließlich konnten v/ir, im Gegensatz zur Beschreibung, die im US Patent 4.429.042 für ATCC 31272 gegeben ist, kein Wachstum der Mutanten oder von ATCC 31272 bei Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle bemerken. Den Mutanten 1-3 und

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HL-026 fehlt nur die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtket tige 2-Oxosäuren. Die doppelt defizitäre Mutante PGS-119 (ATCC 53670), hergestellt durch weitere Mutagenese der Mutante 1-3 (ATCC 53567), und JC-923 (ATCC 53669), erhalten durch Protoplasten-Fusion, besitzt eine ähnliche taxonomische Verwandtschaft zu ATCC 3127 2 wie der mutierte Stamm 1-3.

Streptomyces avermitilis 1-3, HL-026, PGS-119 und JC-923 wurden nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, einer anerkannten Kulturenbank, die den Verbleib der hinterlegten Kulturen gewährleistet, sowie leichten Zugriff der Öffentlichkeit auf diese, falls ein Patent auf diese Anmeldung erteilt wird. Ihnen wurden die Bezeichnungen Streptomyces avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53670 bzw. ATCC 53669 gegeben. Die hinterlegten Kulturen sind einer Person, die vom Präsidenten des Patentamtes und des Warenzeichenamtes der Vereinigten Staaten bestellt wird, zugänglich, solange diese Anmeldung anhängig ist, und zwar gemäß 37 CFR 1.14 und 35 USC 122, und in Übereinstimmung mit ausländischen Patentgesetzen von Ländern, in denen aine dieser Anmeldung entsprechende Anmeldung oder eine weiterführende Anmeldung eingereicht ist. Alle Beschränkungen der Verfügbarkeit der Mikroorganismen für die Öffentlichkeit v/erden unwiderruflich zurückgenommen, sobald das Patent erteilt ist.

Jede der Kulturen S^ avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 und NCIB 12121 produziert die natürlichen Avermectine, Verbindungen mit der Formel (I)

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CH

(I)

CH.

v/orin die gestrichelte Linie in 22-23-Position eine fakultative Doppelhin Jung darstellt,

R" Hydroxy ist und nur dann vorliegt, wenn die

Doppelbindung fehlt,

2 R 4'-(alpha-L-Oleandrosyl)-alpha-L-oleandrosyloxy

mit der Formel

R Wasserstoff oder Methyl ist, und R Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist. Das US Patent 4.285.963 beschreibt ein Avermectin mit der Formel (I), worin die 25-Stel lung mit einer Methylgruppe und einer Ethylgruppe substituiert ist, R Hydroxy ist und R Methyl ist.

In den nicht-natürlichen Avermectinen, auf die in dieser Schrift Bezug genominen wird, ist R ein Substituent, der nicht die Bedeutung Isopropyl oder (S)-sec-Butyl besitzt und der wie unten angegeben definiert ist.

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Die Verbindungen, die für den Einsatz bei der Biosynthese der Formel (1) essentiell sind, sind in der Zelle von S. avermitilis vorhanden. Man nimmt an, daß diese Verbindungen, L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin, via Umwandlung in 2-Oxosäuren und Decarboxylierung der Säuren durch die Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren in den Biosyntheseweg der Avermectine gelangen, wobei das Produkt gleichzeitig mit Coer.ijym A gekoppelt wird. Ihr Vorliegen ist dafür verantwortlich, daß gleichzeitig sowohl die Isopropyl- als auch die (S)-sec-Butyl-Verbindungen mit der Formel (I) gebildet werden. Dies führt natürlich zu Problemen bei der Trennung der Isopropyl- von den (S)-sec-Butyl-Derivaten.

Wenn sie in einem.Nährmedium, das die geeignete Starter-Verbindung enthält, fermentiert werden, produzieren di.e erfindungsgemäßen Mutanten eine Verbindung mit der Formel (I) oder, wie es häufiger der Fall ist, eine Mischung von zwei oder mehr Verbindungen mit der Formel (I), worin R der eingesetzten Starter-Verbindung entspricht. Es können bis zu vier Produkte gebildet werden, bequemlichkeitshalber mit Trivialnamen R-Avermectin Al, A2, Bl und B2 genannt, entsprechend den im US Patent 4.429.042 verwendeten Bezeichnungen. Die "R-"Gruppe bezieht sich natürlich auf den C-25-Substituenten. Beispielsweise sind, wenn R Cyclopencyl ist, die vier möglichen Avermectine:

Trivial-Name R R

Cyclopenty1-

avermectin Ai Doppelbindung CH.,

Cyclopentyl-

avermectin A2 Hydroxy CH.,

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Cyclopentyl-

avermectin Bl Doppelbindung H

Cyclopenty1-

avermectin B2 Hydroxy H

In den nicht-natürlichen Avermectinen ist der C-25-Substituent "R" in der Formel (I) ein anderer als Isopropyl oder (S)-sec-Butyl.

Verbindungen mit der Formel (I), in denen die Doppelbindung vorliegt und OH fehlt, können alternativ durch eine Dehydrie rungsreaktion aus den entsprechenden Verbindungen mit der Formel (I) hergestellt werden, in denen R OH ist und die Doppelbindung fehlt. Die Reaktion wird durchgeführt, indem zuerst die Hydroxygruppen in 5- und 4"-Stellung selektiv geschützt werden, z.B. in Form des t-Butyldimethylsilyloxyacetyl-Derivats, dann mit einem substituierten Thiocarbonsäurehalogenid, zum Beispiel (4-Methylphenoxy)thiocarbonsäurecMorid, umgesetzt wird und dann in einem Solvens mit hohem Siedepunkt, z.B. Trichlorbenzol, erhitzt wird, um die Dehydrierung zu bev/irken. Das Produkt v/ird schließlich von den Schutzgruppen befreit und liefert dabei die ungesättigt«. Verbindung. Diese Schritte sind, zusammen mit geeigneten Reagentien und Reaktionsbedingungen, im US Patent 4.328.335 beschrieben.

Verbindungen mit der Formel (I), worin R H ist, können auch durch Demethylierung aus den entsprechenden Verbindungen, in denen R CH, ist, hergestellt werden. Diese Reaktion wird durchgeführt, indem man die 5-Methoxy-Verbindung oder ein in geeigneter Weise geschütztes Derivat uavon mit Quecksilberacetat versetzt und den gebildeten 3-Acetoxy-enolether mit verdünnter Säure zur 5-Keto-Verbindung hydrolysiert. Diese v/ird dann unter Verwendung von zum Beispiel Natriumborhydrid zum 5-Hydroxy-Derivat reduziert. Für diese Schritte geeignete Reagentien und Reaktionsbe-

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- 22 -· dingungen sind im US Patent 4.423.209 beschrieben.

Verbindungen mit der Formel (I) , worin R H ist. und die Doppelbindung fehlt, können auG den entsprechenden Verbindungen, in denen die Doppelbindung vorliegt und R' fehlt, durch selektive katalytische Hydrierung mit Hilfe eines geeig neten Katalysators hergestellt werden. Zum Beispiel kann man die Reduktion unter Verwendung von Tris(triphenylphosphan)rho dium (I)chlorid ausführen, wie in der Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung 0001689 und in dem ihr entsprechenden US Patent 4.199.569, veröffentlicht am 22. April 1980, beschrieben.

2 Die Verbindungen mit der Formel (I), worin R H ist, werden aun den entsprechenden Verbindungen hergestellt, in denen R 4'-(alpha-L-Oleandrosyl)-alpha-L-oleandrosyloxy ist, indem man die 4'- lalpha-L-Oleandrosyl)-alpha-L-oleandrose-Gruppe durch milde Hydrolyse mit einer Säure in einem wäßrigen organischen Solvens entfernt und dabei das Aglycon mit einer Hydroxygruppe in der 13-Stel lung erhält; dieses wird dann halogeniert, zum Beispiel durch Umsetzung mit einem Benzolsulfonylhalogenid, wobei das 13-Desoxy-13-Halogen-Derivat entsteht, welches schließlich selektiv reduziert wird, zum Beispiel mit Tributylzinnhydrid. Um unerwünschte Seitenreaktionen zu vermeiden, ist es wünschenswert, andere Hydroxygruppen, die vorliegen können, zu schützen, zum Beispiel unter Verwendung einer tert.-Butyldimethylsilyl-Gruppe. Diese wird dann nach dem Halogenierungs- oder Reduktionsschritt durch Versetzen mit Methanol, das eine Spur Säure enthält, leicht abgespalten. £11 diese Schritte sind, zusammen mit geeigneten Reagentien und Reaktionsbedingungen für ihre Ausführung, in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0002615 beschrieben.

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Die Verbindungen, die von den erfindungsgemäßen Stämmen von S. avermitilis für die Biosynthese von Avermectinen, natürlichen und nicht-natürlichen, verwertet werden können, sind Verbindungen mit der Formel (H-A)

RCOOH (H-A)

einschließlich von Verbindungen, die während des Fermentationsprozesses in (H-A) überführt werden können. Diese Verbindungen werden hier als "Starter-Verbindungen" bezeichnet. In der Formel (H-A) ist R eine alpha-verzweigte Gruppe, deren Kohlenstoffatom, an das die COOH-Gruppe gebunden ist, wiederum mit mindestens zv/ei weiteren Atomen oder Gruppen verknüpft ist, die nicht Wasserstoff sind. Diese Definition umfaßt natürlich gesättigte und ungesättigte, acyclische und cyclische Gruppen einschließlich solcher, die fakultativ ein Schwefel- oder Sauerstoff-Heteroatom als Glied in der acyclischen Kette oder im cyclischen Ring tragen.

Spezifischer kann R, das zum C-25-Substituenten wird, eine alpha-verzweigte C-Cn-Alkyl, -Alkenyl, -Alkinyl, -Alkoxyalkyl oder -Alkylthioalkylgruppe, eine C,--C_fi-Cycloaikylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine verzweigtkettige C„-C._c.-Alkylgruppe ist, eine Cj-Cß-Cycloalkyl- oder

C_c-C_o-Cycloalkenylgruppe, die beide fakultativ mit Methylen b ο

oder einer oder mehreren C,-C.-Alkylgruppen oder Halogenatomen (Fluor, Chlor, Iod oder Brom) substituiert sein können, odur ein 3- bis 6-gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterocyclischer Ring sein, der gesättigt oder ganz oder teilweise ungesättigt sein kann und der fakultativ durch eine oder mehrere C.-C.-Älkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein kann.

Verbindungen, die im Fermentationsprozeß in RCOOH umwandelbar sind, d.h. Vorläufer, sind Verbindungen mit der Formel (H-B) , worin R wie oben definiert ist:

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- 24 R-(CH₂J_n-Z (H-B),

worin η 0, 2, 4 oder 6 ist und Z -CH₃OH, -CHO, -CH₃NH₂, -COOR⁵ oder -CONHR⁶ ist, wobei R⁵ H oder (C )Alkyl ist, R⁶ Wasserstoff, (C, jAlkyl oder der Rest einer Aminosäure ist, insbesondere von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Methionin, z.B. -CH(COOH)CH₂COOh, -CH (COOK) (CH₂)₂COOH bzw. -CK(COOH)

Handelt es sich um S_^ avermitilis-Stämme, denen nur die Transaminase für ver-iv/eigtkettige Aminosäuren fehlt, dienen auch 2-Oxosäuren als Vorläufer. So sind für diese Stämme Säuren mit der Formel (H-C)

R-CO-Z (H-C)

worin R und Z vie oben definiert sind, geeignet, von S. avermitilis für die Biosynthese von Avermectinen verwertet zu werden.

Ebenfalls von dieser Erfindung eingeschlossen sind die isomeren Formen der Verbindungen mit der Formel (H-A) und Verbindungen, die während des Fermentationsverfahrens in diese umgewandelt werden können, und die am C-25 isomeren Avermectine, die infolge ihrer Verv/endung im hier beschriebenen Verfahren entstehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt, indem man einen Stamm S_^ avermitilis, dem die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-0xosäuren und/oder die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt/fehlen, in einem wäßrigen Nährmedium fermentiert, das eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, Kohlenstoff, anorganische Salze und eine Verbindung mit der Formel RCOOH oder eine Verbindung enthält, die während der Fermentation in diese Verbindung umgewandelt v/erden kann (d.h. einen Vorläufer). Die Säure oder die Verbindung, die in diese überführt werden kann, wird

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der zu fermentierenden Kultur entweder zum Zeitpunkt des Animpf ens oder in Intervallen während der Fermentation zugesetzt. Verwendet man eine Transaminase-Mangelmutante, muß das Medium L-Isoleucin, L-Leucin und L-Valin enthalten, damit die Mutante wachsen kann. Die Erzeugung der Avermectin-Produkte kann beobachtet werden, indem Proben aus dem Fermenter entnommen und mit einem organischen Solvens extrahiert v/erden und indem nan das Erscheinen des Produkts mittels Chromatographie verfolgt, zum Beispiel unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute des Produktes maximal ist, im allgemeinen für einen Zeitraum von 4 bis 15 Tagen.

Eine bevorzugte Menge der jeweils zuzusetzenden Starter-Verbindungen (Carbonsäuren oder Verbindungen, die in diese umgewandelt werden können) liegt zwischen 0,05 und 3,0 Gramm pro Liter. Die Starter-Verbindung kann kontinuierlich, intermittierend oder auf einmal der Fermentationsbrühe zugesetzt v/erden. Die Säure (RCOOH) wird als solche oder als Salz zugesetzt, zum Beispiel als Natrium-, Lithium oder Ammoniumsalz, oder in Form einer Verbindung, die sich in die Säure umwandeln läßt, wie oben definiert. Die Säure wird, wenn sie ein Feststoff ist, vorzugsweise in einem geeigneten Solvens wie Wasser oder (C,_.)Alkoholen aufgelöst.

Die für die Fermentation verwendeten Medien können, insbesondere, wenn der C-25-Substituent Isopropyl oder (S)-sec-Butyl sein soll, gängige Medien sein, die assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelemente enthalten. Wenn der C-25-Substituent eine nicht-natürliche Gruppe sein soll, d.h. er nicht Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, dann ist das Fermentationsmedj-um ein solches, in welchem unter den gewählten Bestandteilen diejenigen Starter-Verbindungen fehlen oder nur in minimalen Mengen vorhanden sind, in denen die R-Gruppe Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist.

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Nach mehrtägigem Fermentieren bei einer Temperatur im Bereich von vorzugsweise 24 bis 33 C wird die Fermentationsbrühe zentrifugiert oder filtriert, und der Mycelkuchen v/ird mit vorzugsweise Aceton oder Methanol extrahiert. Der Solvens-Extrakt wird eingeengt, und das gewünschte Produkt wird dann in ein mit Wasser nicht mischbares organisches Solvens extrahiert, zum Beispiel in Methylenchlorid, Ethylacetät, Chloroform, Butanol oder Methylisobutylketon. Der Solvens-Extrakt wird eingeengt, und das Rohprodukt wird, wenn notwendig, durch Chromatographie weiter gereinigt, zum Beispiel unter Verwendung von präparativer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr (reverse phase HPLC).

Das Produkt erhält man im allgemeinen als Mischung der Verbindungen mit der Formel (I), worin R 4'-(alpha-L-01eandrolsyl)-alpha-L-oleandrosyloxy ist, R OH ist und die Doppelbindung fehlt oder R fehlt und die Doppelbindung vorhanden ist, und worin R H oder CH.. ist; die Anteile können jedoch in Abhängigkeit von der einzelnen Mutante und der eingesetzten Starter-Verbindung und den verwendeten Bedingungen schwanken.

Die Quelle für die R-Gruppe, d.h. ob diese direkt aus R-COOH stammt oder aus einem der obengenannten Vorläufer oder aus einem beliebigen Vorläufer gebildet wird, ist für die Produktion der Avermectine ohne Bedeutung. Das entscheidende Erfordernis des erfindungsgemäßen Verfahrens für ihre Herstellung ist, daß die gewünschte Gruppe R für die erfindungsgemäßen S. avermiti1 is-Stämme im Fermentationsprozeß verfügbar gemacht wird.

Geeignete Verbindungen umfassen die folgenden: 2,3-Dimethy!buttersäure 2-Methylhexansäure 2-Methylpent-4-ensäure 2-Cyc1opropyI-propionsäure 4,4-Difluorcycohexancarbonsäure, Lithiumsalz

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4-Methylencyciohexancarbonsäure S-Methylcyclohexancarbonsäure (cis/trans) 1-Cyclopentencarbonsäure l-Cyclohexencarbonsäure Tetrahydropyran-4-carbonsäure Thiophen-2-carbonsäure 3-Furansäure

2-Chlorthiophen-4-carbonsäure Cyclobutancarbonsäure Cyclopentancarbonsäure Cyclohexancarbonsäure Cycloheptancarbonsäure 2-Methy!cyclopropanearbonsaure 3-Cyclohexen-1-carbonsäure 2-Methylthiopropionsäure 2-Methyl-4-methoxybuttersäure Thiophen-3-carbonsäure Hydroxymethy1eye 1opentan 3-Thiophenearboxaldehyd 3-Cyclohexylpropionsäure 3-Cyelopenty!propionsäure Hydroxymethylcyclobutan Tetrahydrothiophen-3-carbonsäure S-Cyclopentyl-l-propanol S-Methylcyclobutancarbonsäure, Lithiumsalz 3-Fluorcyclobutancarbonsäure

3-Methylencyclobutancarbonsäure, I.ithiumsalz

2-Methyl-4-methylthiobuttersäure Tetrahydrothipyran-4-carbonsäure Cyclobutylmethylamin CyclobutanearbonsaureethyIester 4-HydroxymethyIcyelopenten

2-(3-Thiophencarbonyl)propionsäureethylester

(S)-2-Methylpentansäure (R)-2-Methylpentansäure

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O-Methyltr.ansferase-Mutanten kann man aus den hier beschriebenen Dehydrogenase-Mangelmutanten für verzweigtkettige 2-0xosäuren und/oder Transaminase-Mangelmutanten für verzweigtkettige Aminosäuren gewinnen. Mutanten, in denen eine Mutation der aktiven Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und/oder Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren mit einer oder beiden O-Methyltransferase-Mutationen gekoppelt ist, ergibt Stämme von S_^ avermitilis, die, wenn sie mit RCOOH-Verbindungen oder Verbindungen gefüttert werden, welche während des Fermentationsprozesses in RCOOH überführt werden können, vorwiegend B Avermectine, Demethylavermectine oder Demethylavermectin-B-Verbindungen produzieren. Diese Mutanten erhält man durch Mutagenese der hier beschriebenen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-0xosäuren und/oder die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt/fehlen, mit Hilfe von ultraviolettem Licht und/oder chemischen Mutagenen wie N-Methyl-N-Nitroso-urethan, Nitrosoguanidin, Methansulfonsäureethylester oder anderen Agentien wie den oben aufgezählten. Alternativ können bezüglich der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-0xosäuren positive Mutanten und/oder bezüglich der Transaminase für verzweigtkettige Aminosäuren positive Mutanten, denen eine oder beide O-^Methyltransferasen fehlt/fehlen, durch Behandeln mit UV-Licht oder einem Mutagen mutiert werden, wobei man Dehydrogenase-Mangelmutanten für verzweigtkettige 2-Cxosäuren und/oder Transaminase-Mangelmutanten für verzweigtkettige Aminosäuren erhält.

Die nicht-natürlichen Avermectine, die aus solchen Mutanten gebildet werden, sind dadurch gekennzeichnet, daß in C-5-Stellung der Aglycon-Einheit und/oder in C-3'- und/oder C-3"-Stel lungen der Oleandrosegruppen Hydroxygruppen vorliegen.

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Die oben beschriebenen Mutanten werden nach dem Verfahren, das von Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, ^9, 620-624 (1986) beschrieben wurde, identifiziert. Sie eignen sich in gleicher Weise für die selben Zwecke wie die bekannten Avermectine.

Alternativ werden erhöhte Mengen der B-Avermectine einschließ lich derer, denen Methyl-Gruppen an der Oleandrose-Disaccharid-Gruppe fehlen, durch Fermentieren der erfindungsgemäßen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und/oder die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt/fehlen, in Gegenv/art einer Substanz wie Sinefungin, S-Adenosyl-ethionin oder S-Adenosylhomocystein hergestellt, welche die O-Methyl-Transferase-Aktivität inhibiert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind hochaktive Mittel gegen Parasiten und besitzen besonderen Wert als Antihelmintica, Ektoparasitizide, Insektizide und Acarizide.

So sind die Verbindung bei der Behandlung einer Vielzahl von Zuständen wirksam, die durch Endoparasiten verursacht werden, einschließlich insbesondere von Helminthose, die am häufigsten von einer Gruppe parasitärer Würmer verursacht wird, v/elche als Nematoden beschrieben wurden, und die schwere ökonomische Verluste bei Schweinen, Schafen, Pferden und Rindvieh verursachen sowie Haustiere und Geflügel befallen können. Die Verbindungen wirken auch gegen andere Nematoden, die verschiedene Tierspezies befallen können, einschließlich beispielsweise Dirofilaria in Hunden und verschiedene Parasiten, die Menschen infizieren können, worunter auch gastrointestinale Parasiten v/ie Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius und Parasiten fallen, die im Blut oder in anderen Geweben oder Organen gefunden werden, z.B. Fadenwürmer und die extraintestinalen Stadien von Strongyloides und Trichinella.

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Die Verbindungen sind außerdem bei der Behandlung von Ectoparasiten-Infektionen von Wert, wobei insbesondere arthropode Ektoparasiten in Tieren und Vögeln eingeschlossen sind, z.B. Zecken, Milben, Läuse, Fliegen, Schmeißfliegen, saugende Insekten und wandernde Zweiflügler-Larven, die Rindvieh und Pferde befallen können.

Die Verbindungen sind auch Insektizide, die gegen Ungeziefer wirksam sind, z.B. gegen Küchenschaben, Kleidermotten, Teppichkäfer und Hausfliegen, und sie sind auch nützlich bei der Bekämpfung von Insekten-Schädlingen in gelagerter, Getreide und landwirtschaftlichen Pflanzungen, z.B. von Blattspinnmilben, Blattläusen, Raupen und bei der Bekämpfung von wandernden Geradflüglern, z.B. von Wanderheuschrecken.

Die Verbindungen mit der Formel (I) werden in einer Darreichungsform verabreicht, die dem spezifischen, ins Auge gefaßten Zweck und der jeweiligen Spezies des tierischen Wirts, der behandelt werden soll, und dem betreffenden Insekt angepaßt ist. Für die Verwendung als Antihelmintica können die Verbindungen oral in Form einer Kapsel, eines Bolus^v, einer Tablette oder eines flüssigen Arzneitranks verabreicht werden, oder sie können alternativ durch Injektion oder als Implantat gegeben werden. Solche Formulierungen werden der tierärztlichen Standardpraxis gemäß auf übliche Weise hergestellt. So können Kapseln, BoIi oder Tabletten hergestellt werden, indem man den aktiven Bestandteil mit. einem geeigneten, fein verteilten Verdünnungsmittel oder Träger vermischt, wobei zusätzlich eJn den Zerfall förderndes Mittel und/oder ein Bindemittel enthalten sein kann, z.B. Stärke, Lactose, Talcum, Magnesiumstearat etc. Eine Arzneitrank-Formulierung kann man herstellen, indem man den aktiven Bestandteil zusammen mit Dispersions- oder Netzmitteln etc. in einer wäßrigen Lösung diipergiert, und injizierbare Formulierungen können in Form einer sterilen Lösung bereitet werden, die andere Substanzen enthalten kann, beispielsweise ausreichend Salze und Glucose, um die Lösung mit Blut isotonisch zu machen. Diese

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Formulierungen werden bezüglich der Einwaage an aktiver Verbindung in Abhängigkeit vom zu behandelnden Wirtstier, von der Schwere und Art. der Infektion und dem Körpergewicht des Wirts schwanken. Im allgemeinen wird für die orale Verabreichung eine Dosis von etwa 0,001 bis 10 mg pro kg Körpergewicht des Tieres ausreichen, die als einzelne Dosis oder in geteilten Dosen über einan Zeitraum von 1 bis 5 Tagen dargereicht wird, aber es können natürlich Umstände eintreten, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche angezeigt sein werden, und auch diese liegen im Rahmen dieser Erfindung.

Alternativ können die Verbindungen mit dem Tierfutter verabreicht werden, und für diesen Zweck kann man einen konzentrierten Futterzusatz oder eine Vormischung herstellen, die mit dem normalen Tierfutter vermischt werden kann.

Für den Einsatz als Insektizide und für die Behandlung von landwirtschaftlichen Schädlingen werden die Verbindungen in Übereinstimmung mit der landwirschaftiichen Praxis in Form von Sprays, Stäubemitteln, Emulsionen und ähnlichem angewendet.

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Erzeugunq von S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) # Hangelmutante ohne Dehydrogenase für verzweiqtkettiqe

Schritt 1. S. avermitilis ATCC 31272 wurde auf New Patch Agar Medium 12 Tage lang bei 30°C gezüchtet, b: Rasen entstanden war. Das Medium enthielt

Medium 12 Tage lang bei 30 C gezüchtet, bis ein konfluenter

V-8-Saft 200 ml

CaCO 3 Gramm

Agar 15 Gramm

H₂O ad 1000 ml

Nährbrühe 1,0 Gramm/1

Natriumacetat χ 3 H„0 1,4 Gramm/1

Isovaleriansäure 50 mg/1

Isobuttersäure 50 mg/1

2-Methylbuttersäure 50 mg/1

Isoleucin 250 mg/1

Leucin 250 mg/1

Valin 250 mg/1

Spurenelement-Lösung 1 ml/1

Eine Mischung aus 8 Gemüsesäften (Tomate, Karotte,

Sellerie, Rote Beete, Petersilie, Lattich oder Kopfsalat, Brunnenkresse und Spinat) plus Salze, Ascorbin- und Zitronensäure und natürliche Aromastoffe. Zu beziehen von Campbell Soup Company, Camden, NJ.

Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung:

FeCl₃ χ 6 H₂O 2,7 g

MnSO. χ H₂O "., 2

CuSO₄ χ 5 H₉O 0,5

CaCl₂ 11,0

H₃BO₃ 0,62

CoCl₂ x 6 H₂O 0,24

ZnCl₂ 0,68

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0,24

Die obige Mischung ist in 1 Liter 0,1N HCl zu lösen.

Von dreien solcher Platten wurden Sporen geerntet und in 20 ml 0,05M Tris-Maleinsäurepuffer, pH 9,0, suspendiert.

Schritt 2. 10 ml der Sporen-Suspension wurden in ein Gefäß gegeben, das 10 mg N-Methyl-N'-nitro-N-nii rosoguanidin (NTG) enthielt. Das Gefäß wurde bei 28°C 60 Minuten lang inkubiert und geschüttelt, und dann wurden die Sporen ausgiebig mit l%iger NaCl-Lösung gewaschen.

Schritt 3. Die gewaschenen Sporen wurden in l%iger NaCl suspendiert und mit dem gleichen Volumen an 80 %igem Ethylenglycol gemischt. Man konservierte diese Suspension bei -20 C und verwendete sie als Ausgangsmaterial für Zellen, die .iuf Mutarten untersucht werden sollten. Das ergab beim Aussäen etwa 10 Kolonien/ml.

Diese Sporen-Stammlösung wurde auf YPD-Platten aufgebracht und ergab dabei annähernd 100 Kolonien pro Platte (YPD-Medium

* enthält jeweils 10 g/l Hefeextrakt, Bacto-Pepton und

* Dextrose und 15 g/l Bacto-Agar , vor dem Autoklavieren auf pH 6,9 eingestellt). Die mit einem Sternchen versehenen Inhaltsstoffe sind von Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238 zu beziehen.

Schritt 4. Einzelne Kolonien v/urden nach zwei- bis dreiwöchigem Wachstum bei 28 C von den Platten abgenommen und in einzelne Schalen einer Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Schalen überführt. Außerdem wurde ein kleiner Teil der Kolonie auf ein frisches Agar-Medium aufgebracht, der als Quelle für lebensfähige Zellen dienen sollte, wenn die Mutanten identifiziert waren.

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_ 34 -

Schritt 5. In jede Schale gab man annähernd 75 Mikroliter eines flüssigen M9-Salz-Mediums, das 1% Glucose, 0,1% Casaminosäuren und jeweils 0,01% Isovaleriansäure, Isobuttersäure und 2-Methylbuttersäure enthielt. Nach einigen Tagen der Inkubation bei 28°C wurden die Zellen auf das Vorhandensein von Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren überprüft. (Jeweils ein Liter M9-Salz-Medium enthält 6g Na₃HPO₄, 3g KH₉Fu., ö,5g iNaCi und Ig ΝΠ.Cl. Das Medium wird autcklaviert und dann werden aseptisch jeweils 1 ml sterilisiertes IM MgSO. und 0,1M CaCl- zugesetzt).

Schritt 6. Eine Mikrosuapeiision aus 5% Toluol in M9-Salz-Medium wurde durch eine kurze Behandlung mit Ultraschall der nicht mischbaren Mischung hergestellt. Zu 25 ml dieser Sus-

/-14 t pension setzte man 1,2 ml einer Losung zu, die [ C-l/-2-0xo-

isocapronsäure, 2,5 Mikrocurie/ml und 10,0

Mikrocurie/Mikromol enthielt. 50 Mikroliter dieser gesamten Mischung wurde in jede der Schalen der Mikrotiterplatten gegeben, die die zu untersuchenden Kolonien enthielten.

Schritt 7. Das CO₉, das in jeder Schale produziert wurde, wurde aufgefangen und nach dem von Tabor et al., J. Bacteriol. 128 485-486 (1976) unter dem Titel "Convenient

14 Method for Detecting CO₉ in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants" beschriebenen Verfahren sichtbar gemacht. Mangelmutanten, denen die aktive Dehydrogenase für varzv/eigtkettige 2-0xosäuren fehlt,

14 produzieren nicht mehr Ba CO., als das, das man bei den

Kontrollen beobachtet.

Ein verfeinertes Verfahren, das den Unterschied zwischen

14 einem positiven Test auf CO₉, ersichtlich aus einem dunklen

14 Flecken auf dem Autoradiogramm als Folge der Ba CO-.-Bildung, und einem negativen Test, ersichtlich daraus, daß kein Fleck oder nur ein sehr schwacher Fleck erscheint, verbessert, umfaßt das folgende, modifizierte Testverfahren.

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Einzelne Kolonien (siehe Schritt 4 oben) wurden nach 7-14 Tagen des Wachstums vom Agar-Medium abgenommen (eher als nach 2 bis 3 Wochen) und direkt mit Hilfe der Schritte 6 und 7 untersucht. Der obengenannte Schritt 5 entfällt.

Ein noch stärker verfeinertes Untersuchungsverfahren, das die

CO„-Freisetzung quantitativ erfaßt, umfaßt das Zuchten der

Mutanten, die mittels der obengenannten Tests gefunden wurden, auf einem geeigneten Medium, das M9-Salz- Medium mit Glucose, l%ig, und "Syncasa-bcaa" 0,l%ig, enthält (eine synthetische Mischung von L-Aminosäuren mit der angenäherten Zusammensetzung kommerzieller Casaminosäuren, aber ohne daß L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin vorhanden ist, siehe unten).

Nachdem man sie bis zu hoher Zelldichte wachsen ließ, werden die Zellen in M9-Salz-Medium gewaschen und in kaltem, 1% Toluol enthaltendem M9-Salz-Medium resuspendiert, das mit Ultraschall behandelt worden war, um eine milchig weiße Dispersion des Toluols zu erzielen. Die ZeIlen/Puffer/Toluol-Sus pension wurde 40 Minuten lang bei 3ü C inkubiert, um die Zellen zu permeabilisieren. Die permeabilisierten Zellen wurden dann in M9--Salz-Medium gewaschen und schließlich in einem Fünftel des ursprünglichen Volumens an M9-Medium-Puffer resuspendiert. 180 Mikroliter dieser Suspension wurden pro Bestimmung verwendet.

Ein Reaktionsvolumen von 300 Mikroliter enthielt die mit Toluol behandelten Zellen, 0,4 mM Thiamin Pyrcphosphat (TPP), 0,11 mM Coenzym A (CoA), 0,68 mM Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, 2,6 mM Dithiothreitol (DTT), 4,1 mM MgCl₂, 60 mM Tris-HCl mit pH 7,5 und 6,000 cpm /f¹⁴C-l7-alpha-Ketoisocaproat, Mikrocurie pro Mikromol. Die Zählausbeute betrug 73 %. Die Reaktion wurde in 15 ml fassenden Scintillationszählergefäßen durchgeführt, die ein 2 χ 2 cm großes Whatman ^4-Papierquadrat enthielten, das in die Schraubkappe der Gefäße gedrückt war. Das Papier enthielt 30 Mikroliter IM

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Hyaminhydroxid (IM Lösung aus Methylbenzethoniumhydroxid in Methanol, zu beziehen von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO

14 63178), das während der Reaktion freigesetztes CO,,

auffängt. Nach 2-stündigem Inkubieren wurden die Papierchen in 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC (Flüssigkeitsscintillationszähler), das von New England Nuclear Research Products, Bosten, MA 02118 bezogen werden kann), eingetaucht, und die Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeitsscintillationszähler gemessen, nachdem man sie in diesem Solvens mindestens 4 Stunden lang äquilibriert hatte. Eine Reaktion der Leerkontrolle (d.h. keine Zellen) ergibt ca. 50-300 cpm.

Die Mutante 1-3 und andere ergab Impulszahlen, die niedriger als oder gleich groß wie die der Leerkontroll-Reaktion waren, während der elterliche Stamm eine Zahl von Impulsen ergab, die mehrfach höher als der Wert für die Leerkontrolle war.

Isolierung des HL-026-Derivats (ATCC 53568) von S. Avermiti-

lis 1-3 (ATCC 53567)

S_^ avermitilis I--3 (ATCC 53567) wurde auf Nähragar-Platten ausgestrichen. Spontane Varianten traten mit¹ relativ hoher Frequenz auf, denen zum Teil nach 4-tägiger Inkubation bei 30⁰C das Luftmycel fehlte. Einige dieser Varianten wurden isoliert und auf ihre Fähigkeit untersucht, richt-natürliche Avermectine zu erzeugen, wenn man sie in AP-5-Medium fermentierte, dem Cyclopentancarbonsaure zugesetzt v/ar. Unter den isolierten Varianten, unter denen viele nicht-natürliche Avermectine produzierten, die frei von natürlichen Avermectinen waren, wurde ein Stamm mit der Identifikationsnummer HL-026 (ATCC 53568) versehen, der in Reagenzglas-Experimenten höhere Titer an Avermectinen produzierte als sein Elternstamm S^ avermitilis 1-3 (ATCC 53567) .

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Produktion von S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670), Mangelmutate ohne Dehydrogenase für verzweigtkettige

2-Oxosäuren und ohne Transaminase für verzweigtkettige

Aminosäuren

Schritt 1. Mit annähernd 100 mg S^ avermitilis 1-3 (ATCC 53567), die vier Tage lang auf einer Platte mit frischem SAMM-Agar gezüchtet worden waren, wurde ein 300 ml fassender Kolben beimpft, der 50 ml SCM-Medium (pH 7,2) enthielt. Der Kolben wurde dann bei 30 C vierundzwanz 200 Upn geschüttelt (pH zuletzt = 8,2).

Kolben wurde dann bei 30 C vierundzwanzig Stunden lang mit

Schritt 2. Der Kolben wurde vom Schüttler genommen, und 10 ml der cjssamten Brühe wurden in einem sterilen Reagenzglas fünf Minuten lang bei 2000 Upm zentrifugiert. Dann wurden die ZeI lei. in 50 ml SCM-Medium in sterilen 300 ml fassenden Erlenmeyerkolben resuspendiert, und die Kolben wurden auf einem Rotationsschüttler zwei Stunden lang bei 30 C geschüttelt.

Schritt 3. Die 10 ml der Suspension wurden in ein steriles Röhrchen gegeben.

Schritt 4. Methansulfonsäureethylester (250 ul) wurde in das Röhrchen zugegeben (in einem gut belüfteten Abzug), der Inhalt wurde gründlich gemischt und dann in einen sterilen 300 ml fassenden Kolben gegossen, und der Kolben wurde in einem Rotationsschüttler drei Stunden bei 30 C geschüttelt.

Schritt 5. Frisches, steriles SCM-Medium (40 ml) wurde in den Kolben zugegeben, und das Schütteln wurde für insgesamt 70 Stunden bei 30⁰C fortgesetzt.

Schritt 6. Der Kolben wurde abgenommen, der Inhalt mit 8000 Upm zehn Minuten lang bei 20 C abzentrifugiert. Die Zellen wurden durch Resuspendieren in SCM-Medium gewaschen, nochmals abzentrifugiert und in 10 ml SCM-Medium resuspendiert.

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Schritt 7. Die Zellen wurden entfernt und mittels Replika-Plattierung, ca. L50 Kolonien/Platte, auf ihre Fähigkeit untersucht, auf MQ/Glucose-Minimal-Platten in Gegenwart und Abwesenheit von L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin bzw. von Kombinationen der verschiedenen Aminosäuren zu wachsen. Die interessierenden Mutanten wuchsen nur auf Medien, die mit L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin ergänzt waren. Diese Derivate von S^. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) , denen die Aktivität der Transaminase für verzweigtkectige Aminosäuren fehlt, wuch sen auch nicht auf Medien, denen eine oder mehrere der drei 2-Oxosäuren (2-Oxoisocapronsäure, 2-Oxo-3-methylvaleriansäure und 2-Oxoisovaleriansäure) zugesetzt waren, die als Vorläufer für L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin fungieren. Dieses Verhalten ist dem von S^ avermitilis 1-3 (ATCC 53567) vollständig entgegengesetzt, der auf solchen Medien gut wächst. Demzu folge katalysiert ein einziges Transaminase-Enzym die Transaminierung aller genannter 2-0xosäuren.

	SCM-MEDIUM	10	g/i	g/i
Hefeautolysat	5	6,0	g/i
RinJfleischextrakt	in-Hydrolysat 10	3,0	g/i
Enzymatisches Case	3	0,5	g/i
IM MgSO₄	(HCl) 100	1,0	g/i
IM K₃HPO₄, pH 7,0	SAMM Agarplatte	1,0
	1,0
	8,0
Na₃HPO	20,0
KH₂PO₄	20,0
NaCl
NH₁Cl 4
IM MgSO
0,IM CaCl₂
Dextrose
Casaminosäureη
Agar

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Zusammensetzung von "Syncasa-bcaa", lOOfaches Konzentrat

Gramm/liter

L-Alanin 3

L-Arginin 4

L-Asparaginsäure 6

L-Cystin 1

L-Glutaminsäure 20

Glycin 1

L-Histidin 2

L-Lysin 7

L-Methionin 3

L-Phenylalanin 6

L-Prolin 10

L-Serin 6

L-Threonin 4

L-Tyrosin 4

L-Tryptophan 1

Die Mischung wird auf pH 7 eingestellt und filtrationssterilisiert. Ein Volumenteil des Konzentrats wird zu 99 Volumenteilen Medium zugesetzt, um die Konzentration für Standardbedingungen zu erzielen.

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S^ avermitilis JC-923 (ATCC 53669) durch Protoplastenfusion eines gegen Spectinomycin resistenten Stammes von S^ avermitilis ATCC 31272 und S^ avermitilis PGS 119 (ATCC 53670)

Gegen Spectinomycin resistenter S^ avermitilis ATCC 31272 ist eine Spontanmutante von S_^ avermitil is ATCC 31272. Sie wurde aus Populationen vegetativer Mycelien von ATCC 31272 isoliert, die auf 50 mcg/ml Spectomycin enthaltenden AS-1-Agarplatten ausgesät v/aren. Sporen der Mutanten, die sich auf angereichertem Medium entwickelt hatten, sind gegenüber 50 mcg/ml Spectomycin resistent, wie ein Vergleich mit Sporen des isogenen elterlichen Stamms zeigt, der unter diesen Bedingungen nicht keimt. Dieser dominant selektierbare Marker wurde erfolgreich eingesetzt, um Mangelmutanten von ATCC 31272 zu isolieren, denen die Transaminase für verzweigtketti ge Aminosäuren fehlt.

AS-1-Agar

(Angereichertes Plattenmedium für Streptomyces)

Hefeextrakt 1 g

L-Alanin 0,2 g

L-Arginin 0,2 g

L-Asparagin 0,5 g

Lösliche Stärke 5 g

NaCl 25 g

Na₃SO₄ 10 g

Agar 20 g

Destilliertes Wasser i Liter

Einstellen auf pH 7,5. Autoklavieren für 15 Minuten bei 121°C. 30 ml bis 35 ml gießen (100 auf 15 mm).

121°C. 30 ml bis 35 ml in sterile Petrischalen aus Kunststoff

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VERFAHREN ZUM HERSTELLEN LEBENSFÄHIGER PROTOPLASTEN AUS STÄMMEN VON STREPTOMYCES AVERMITILIS

A. Sporen als Inoculum

1. Sporenpräparationen v/urden nach Standardverfahren hergestellt, wobei die Anzahl lebensfähiger Sporen durch Plattenverdünnung auf Keimagar abgeschätzt wurde, und portionsweise in 40 %igem Glycerin auf -70⁰C eingefroren.

2. Vor der Verwendung wurden die Sporenkonzentrace 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und im gleichen Volumen 0,85 %iger physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.

3. 30 ml modifizierten Hefeextrakt und Malzextrakt (YEME) enthaltendes Kulturmedium mit 0,5 % Glycin (siehe unten) in einem 300 ml fassenden, drei- oder vierfach unterteilten Kolben wurde mit ungefähr 10 Sporen beimpft.

B. Gefrorenes, mit Ultraschall behandeltes Mycel als Inoculum

1. Kycelkultüren von PGS-119 wurden in Trypticase-Sojabohnen-Brühe (TSB) gezüchtet, bis der Trübungsgrad bei 600 η.τι 2 bis 9 betrug. Die Kultur wurde 10 mal mit einem gläsernen Gewebshomogenisator homogenisiert.

2. Das homogenisierte Mycel wurde in TSB zweifach verdünnt, und man gab 20 ml in ein steriles PolypropyJ.en-Zentrifugenröhrchen. Eine Ultraschall-Sonde wurde bis auf eine Tiefe von i bis 2 cm in die Flüssigkeit eingetaucht, und die Probe wurde bei 50 % Intensität 10 Sekunden lang mit Ultraschall behandelt. Die Behandlung mit Ultraschall dispergierte die Mycelmenge in einzelne oder doppelte zelluläre Einheiten, die schnell exponentiell zu wachsen begannen, als sie subkultiviert wurden.

3. Die mit Ultraschall behandelten Mycelpräparationen wurden auf eine Endkonzentration von 40 % Glycerin verdünnt, in kleine Glasgefäße pipettiert und auf -70 C eingefroren.

4. Nach Bedarf wurde portionsweise aufgetaut, um YEME-Medium zu inokulieren, wie in Schritt A.3 oben beschrie-

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C. Kolonien auf Agar-Medium als Inoculum

1. Sechs reife Kolonien PGS-119, die auf TSA- oder YPD-2-Agar wuchsen, wurden mit einer Öse in 200 μΐ steriles Wasser in einem Mikrofugenröhrchen eingebracht.

2. Die Mycel-Mischung wurde mit einem Wegwerfpistill homogenisiert.

3. Die homogenisierten Kolonien wurden wie in Schritt A.3. oben angegeben zu YEME-Medium gegeben.

D. Präparation von Protoplasten aus in Glycin gezüchtetem Mycel

1. Kulturen wurden in einem Schüttel-Wasserbad auf Stufe 8 bei 29°C etwa 65 Stunden lang inkubiert.

2. Die Mycelien wurden mikroskopisch mit der 40fachen Vergrößerung, Phase 2, untersucht und in einem Polypropylen-Zentrifugenröhrchen 10 Minuten bei 20 C mit etwa 1475 g gesammelt.

3. Die überstehende Lösung v/urde verworfen, und das Mycelpellet wurde in 10 ml Protoplasten-Puffer (P-Puffer) (siehe unten) resuspendiert. Das Pellet wurde 5-10 mal mit einen Gewebshomogenisator homogenisiert, um Klumpen zu dispergieren.

4. Die Probe wurde 10 Minuten lang mit etwa 1000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung v/urde verworfen, und das Pellet wurde vorsichtig in 10 ml P-Puffer wieder suspendiert .

5. Der Waschvorgang oben wu\.de wiederholt.

6. Das Mycelpellet wurde in 10 ml evier Lösung von 1,0 mg/ml frischem Lysozym in P-Puffer resuspendiert, die durch Passieren durch einen 0,22 Mikrometer-Filter filtrationssterilisiert worden war.

7. Die Mycelmischung wurde in einem Wasserbad unter vorsichtigem Schütteln 60 Minuten lang bei 37°C inkobiert. Die Proben wurden alle 15 Minuten in der Lysozym-Lösung resuspandiert. Die Proben wurden iir. Phasenkontrastniikroskop

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unter 40facher Vergrößerung auf das Vorhandensein von Protoplaoten untersucht.

8. Die Mycelpräparationen wurden dreim?¹ mit einer 5 ml Pipette behandelt, um die Protoplasten von ihren Zellwänden zu befreien.

9. Die Präparationen wurden durch Glaswolle oder nicht absorbierende Baumwolle filtriert.

10. Die Protoplasten wurden durch 7-minütiges Zentrifugieren bei ca. 1000 g sedimentiert, vorsichtig in 5 ml P-Puffer resuspendiert und unter 40 fächer Vergrößerung im Phasenkontrastmikroskop untersucht.

11. Die Protoplasten wurden wie oben angegeben sedimentiert und in 1,0 ml P-Puffer resuspendiert. Verdünnungen dieser Suspension wurden mit P-Puffer und destilliertem Wasser gemacht und auf Regenerationsmedium ausplattiert. Von Kolonien, die sich aus mit destilliertem Wasser verdünnten Protoplastenpräparationen entwickelten, wurde angenommen, daß sie aus Mycel-Einheiten mit unvollständigem oder ohne Protoplasma entstanden waren.

12. Die Protoplasten wurden auf Eis in 200-300 ^1-Portionen auf -70⁰C eingefroren. Sie wurden nach 18-24 Stunden vom Eis entfernt.

FUSION VÜN PROTOPLASTEN MIT POLYETHYLENGLYCOL (PEG) 1000

1. Alle hier beschriebenen Experimente wurden mit einer einzelnen Charge PEG 1000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) ausgeführt, die in unseren Händen wenig toxisch erschien.

2. Portionen von ein (1,0) g "EG wurden in Glasgefäßen autoklaviert, 1,0 ml P-Puffer wurde zugesetzt, und das PEG wurde durch Erwärmen des Gefäßes auf 55°C gelöst, oder das PEG wurde gewogen, in P-Puffer gelöst und direkt vor Gebrauch filtrationssterilisiert. Die PEG-Lösungen v/urden bei Umgebungstemperatur eingesetzt.

3. Protoplaster wurden frisch nergestellt oder

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schnell unter fließendem Wasser aus den bei -70°C gelagerten Stamriilösungen aufgetaut. In etwa gleiche Mengen von Protoplasten eines jeden Genotyps wurden vorsichtig in ein PoIycarbonat-Zentrifugenröhrchen einpipettiert. Bei den frisch bereiteten Protoplasten-Präparationen v/urde der Trübungsgrad gemessen, und mehrere unterschiedliche Konzentrationen v/urden jusioniert. Das Volumen in jedem Röhrchen wurde mit P-Puffer auf 5,0 ml aufgefüllt.

4. Die Fusionsmischung wurde bei etwa 1000 g 7 Minuten lang zentrifugiert.

5. Die überstehende Lösung wurde vorsichtig abgegossen. Das Protoplastenpel let v/urde vorsichtig in P-Puffer auf ein Endvolumen von 200 ^m resuspendiert.

6. Achthundert (800) ^l 50 %iges PEG wurde der Fusionsmischung schnell zugesetzt. Die Präparation wurde gemischt, indem sie in eine Pasteurpipette aufgezogen und wieder ausgestoßen wurde. Die Fusionsmischung wurde 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Neun (9) ml P-Puffer wurden zugegeben, um das PEG zu verdünnen. Weitere Fusionen wurden serienweise so durchgeführt, daß die Inkubations-Intervalle gleichmäßig eingehalten wurden.

7. Die Fusionsmischungen wurden wie in Schritt 4 oben zentrifugiert, die überstehende Lösung wurde'vorsichtig abgegossen, und die verschmolzenen, gewaschenen Protcplasten wurden in 1,0 ml P-Puffer resuspendiert.

8. Die Fusionsmischung wurde nacheinander mit P-Puffer auf ΙΟ"¹ und 10 verdünnt.

9. Fusionen jedes einzelnen Stamms für sich wurden in jedem Experiment durchgeführt und als Kontrollen ausplattiert.

10. \ -!rdünnungen von jeder Protoplastenprdparation (die lebensfähigen waren gezählt) wurden ausplattiert, um die Anzahl der lebensfähigen Nachkommen eines jeden Stammes zu bestimmen, der im Fusionsverfahr<_n eingesetzt war.

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REGENERATION VON PROTOPLASTEN

1. Protoplastens.uspensionen, Fusionsmischungen oder Selbstfusionsmischungen wurden in geeigneter Weise in P-Puffer verdünnt und in 100 μΐ Chargen unter Einsatz der Technik des vorsichtigen Verss£ühens auf Regenerationsagarir.edien ausplattiert. Die fusionierten Protoplasten als Überschicht aus weichem Agar überzusprühen, verbesserte deren Regeneration nicht signifikant.

2. Wo es sinnvoll war, wurde das in D.11 oben beschriebene Verfahren verwendet.

3. Die Regenerationsplatten wurden mit der rechten Seite nach oben in verschlossenen Kunststoffbehältern bei 29-30°C und etwa 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.

4. Für Protoplastenfusionsmischungen, in denen die Resistenz gegen Spectinomycin als dominanter selektierbarer Marker verwendet wurde, wurden die regenerierenden Protoplasten nach 18 Stunden mit 3,5 ml aus 100 mcg/ml Spectinomycin in weichem Agar (siehe unten), autoklaviert und zugesetzt bei 45°C, überschichtet.

5. Die Protoplasten wurden 7-10 Tage lang inkubiert.

WACHSTUMSMEDIEN, REGENBRATIONSMEDIEN WO PROTOPLASTENPUFFER

VoI!ständiges Regenerationsmedium

(Modifiziert nach Hopwocd et al., 1985, genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, S. 235) Stammlösung:

Saccharose 205 g

K₂SO₄ 0,25 g

MgCl₂ χ 6 H₂O 10,12 g

Glucose 10 g

Difco Casaminosäuren 0,1 c

Difco Hefeextrakt 5,0 g

Difco Haferschleimagar 3,0 g

Difco Bactoagar 22,0 g

Destilliertes Wasser ad 955 ml 25 Minuten lang bei 121 C autoklavieren.

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2*6? SS/Z

~ HO ~

Nach dem Autoklavieren werden sterile Stammlösungen zugesetzt aus :

KH₂PO₄ (0,5 %) 10 ml

CaCl₂ χ 2 H₂O 5 ml

L-Prolin (20 %ig) 15 ml

MES Puffer (1,0 M) 10 ml

* Spurenelement-Losung 2,0 ml

NaOH (IN) 3,0 ml

Der pH wird auf 6,5 eingestellt, das Volumen auf 1 Liter gebracht.

* Spurenelement-Lösung (pro Liter):

ZnCl„ 40 mg

FeCl₃ χ 6 H₉O 200 mg

CuCl₂ χ 2 H₂O 10 mg

MnCl₂ χ 4 H₃O 10 mg

Na₃B₄O₇ χ 10 H₂O 10 mg

(NH₄J₅Mo₇O₂₄ χ 4 H₂O 10 mg

Überschichtung aus weichem Spectinomycin-Agar

Vollständiges Regenerationsmedium, siehe oben, außer:

Agar 4,10g

Man autoklaviert wie oben, kühlt auf 55°C. Man setzt 100 mg Spectinomycin hinzu. Man füllt jeweils Volumina von 5 ml in verschließbare KuIturröhrchen und kühlt. Man autoklaviert direkt vor dem Verbrauch.

Modifizierter Protoplasten-Puffer (P-Puffer) Stammlösung:

Saccharose 205 g

K₂SO₄ 0,25 g

MgCl χ 6 HO 2,02 g

Destilliertes Wasser auf 977 ml Bei 121 C 25 min autoklavieren.

Nach dem Autoklavieren der Reihe nach zur sterilen Stammlösung zugeben:

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KH PO. (0,5 %) 1 ml

Spurenelament-Losung 2 ml

CaCl₂ χ 2 K₂O (3,68 %) 10 ml MES Puffer (1,0 M) 10 ml

Den pH auf 6,5 einstellen, Volumen auf 1 Liter bringen. Spurenelement-Lösung: Zusammensetzung siehe oben

Modifiziertes Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium (YEME-Medium)

Stammlösung

Difco Hefeextrakt 3 g

Difco Bacto-Pepton 5 g

Difco Bacto Malzextraktbrühe 3 g

Glucose 10 g

Saccharose 300 g

Destilliertes Wasser ad 973 ml

min lang bei 121 C autoklavieren.

Nach dem Autoklavieren sind zuzusetzen:

MgCl₂ χ 6 H₂O (2,5 M) 2 ml

Glycin (20 %) 25 ml

Volumen auf 1 Liter einstellen.

- 48 ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1: UV-Absorption (240 nm) gegen Zeit (Minuten) einer HPLC-Chromatographie der Solvens-Fraktion aus der SoI-vansextraktion von Zellen des Stamms S^ avermitilis 1-3 (ATCC 53567) nach Züchtung auf fettsäurefreiem Medium (WPM SynA 40:40). Die Absorption bei 13,12 ist Oligomycin A

Fig. 2: UV-Absorption (240 nm) einer HPLC-Chromatographie der Solvens-Fraktion aus der Solvensextraktion von Zellen von S^ avermitilis MA 4848 (ATCC 31272) nach Züchtung auf fettsäurefreiem Medium (WPM SynA 40:40). Die Produkte sind natürliche Avermectine.

Fig. 3: UV-Absorption (240 nm) einer HPLC-Chromatographie der Solvens-Fraktion aus der Solvensextraktion von Zellen von S^ avermitilis 1-3 (ATCC 53567) nach Züchtung auf Medium, das Cyclopentylcarbonsäure enthielt (siehe Beispiel D .

Die beigefügten Darstellungen sind genaue Kopien von HPLC-Kurven der angegebenen Verbindungen.

- 49 -

Die Zusammensetzung der in den folgenden Beispielen verwendeten Medien sind unten angegeben. Alle Molekulargewichtsbestimmungen v/urden durch Massenspektrometrie durch Beschüß mit schnellen Atomen ermittelt, die auv einem Massenspektrometer VG Modell 7070E unter Einsatz einer Probenmatrix aus Triethylenglycol mit festen Natriumchlorid ausgeführt v/urde. Bestimmt wurde (M + Na) . Elektronenstoß-Massenspektrometrie wurde auf einem Massenspektrometer VG Modell 7070F durchgeführt, um m/e-Werte zu erhalten. Es wurden nur Werte für die Hauptbruchstücke aufgezeichnet.

AS-7-Medium

Verflüssigte Stärke ^a . 20

Ardamin pH 5

Pharmamedia ^c 15

CaCO₃ 2

Hergestellt durch Hydrolyse von Stärke durch Alpha Amylase aus Bacillus 1lcheniformis (zu beziehen von Novo Enzymes, Wilten, CT, und verkauft unter dem Warenzeichen

I¹ b

Von Traders Protein., Memphis, TN 38108

"Termamyl") auf ein Dextroseäquivalent von 40% - 5%.

Von Yeasts Products, Inc., Clifton, NJ 07012 c

Einstellen des pH auf 7,2 mit NaOH.

AP-5-Medium	all
	80
Verflüssigte Stärke	5
Ardamin pH	1
K₂HPO₄	1
MgSO₄ χ 7 H₂O	1
NaCl	7
CaCO₃	0,01
FeSO. χ 7 H₉O

- 50 -

MnCl₂ χ 7 H₂O 0,001

ZnSO₄ χ 7 H₂O 0,001

Ρ-2000 (Mittel gegen Schaumbildung) 1 ml/1

Einstellen des pH auf 6,9 mit 25 % NaOH

WPM Syn A 40;40

g/l destilliertes H„O

Verflüssigte Stärke 40

Lösliche Kartoffelstärke 40

Glutaminsäure 1,0

Arginin 0,168

Cystin 0,084

Histidin· 0,069

Leucin 0,798

Lysin 0,297

Methionin 0,108

Phenylalanin 0,168

Threonin 0,174

Tryptophan 0,048

Tyrosin 0,192 K₂HPO₄ · 1,0

MgSO₄ χ 7 H₂O 1,0

NaCl 1,0

CaCO₃ 3,5

FeSO. χ 7 H₀O 0,01

MnCl₂ χ 4 H₂O 0,001

ZnSO₄ χ 7 H₂O 0,001

Den pH auf 6,8-7,0 einstellen, 30 Minuten bei 121°C rühren

WPM Syn B 40:40

g/i	Lösliche Kartoffelstärke	destilliertes H„0	0,297	0,108
Verflüssigte Stärke	40	0,168
Glutaminsäure	40	0,174
Arginin	0,390	0,048
Cystin	0,168	0,192
Histidin	0,084	1
Lysin HCl	0,069	1
Methionin	1
Phenylalanin	3,5
Threonin	0,01
Tryptophan	0,001
Tyrosin	0,001
K₂HPO₄
MgSO₄ χ 7 H₂O
NaCl
CaCO₃
FeSO₄ χ 7 H₂O
MnCl₂ x 4 H₂O
ZnSO. χ 7 H„0

Den pH auf 6,8-7,0 einstellen, 30 Minuten bei 121°C rühren,

Allgemeines Verfahren für die Hochleistungs-Flüssigkeits-

chromatographie (HPLC)

Mobile Phase:

150 ml Wasser 70 ml Acetonitril

ad 1 Liter mit Methanol Säule:

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments,

- 52 -

26?

Fullerton, CA 92634-3100)

Fli'ßrate: 0,75 ml/Minute Detektion: UV bei 240 nm

Dämpfung: etv/a 6 Probenverdünnungsmittel (D):

35 ml Acetonitril plus 390 ml Methanol Standards:

1. Man wiege 0,5 mg Avermectin A2a in einen 10 ml fassenden Kolben ein und fülle mit Methanol auf.

2. Man wiege j,5 mg Testprodukt in einen 10 ml fassenden Kolben ein und fülle mit Methanol auf.

und 2 sind Standard-Stammlösungen: zur Herstellung von Arbeits-Standards gebe man :

100 ^uI (1) und 100 ul (2) in ein Röhrchen und

setze 800 μ\ mobile Phase hinzu. Proben:

1. Man nehme 1 ml gut geschüttelte Kulturbrühe und zentrifugiere herunter

2. M:in entferne soviel überstand wie möglich, ohne das Pellet aufzuwirbeln

3. Man setze dem Pellet 100 ^il HPLC-Wasser zu und vermische auf einem Vortex-Mischer, um zu dispergieren

4. Man setze 2 ml Verdünnungsmittel (D) zu und mische gut

5. Man filtriere dieses und lasse es über die HPLC-Säule laufen.

Die natürlichen Avermectine wurden diesem chromatographischen HPLC-Verfahren unterzogen, und die Retentionszeit des Erscheinens der einzelnen Avermectine wurde durch die Retentionszeit geteilt, die für das vorhandene Oligomycin A beobachtet wurde, welches als interner Standard für eine gegebene HPLC-Bestimmung dient. Oligomycin wi-rd bei Fermentationen von S^ avormitilis mit Hilfe von HPLC fast immer -ils Nebenprodukt beobachtet, und es ist das einzige Produkt, das sich durch HPLC nachweisen läßt, das von den hier beschriebenen Mutanten

- 53 -

produziert wird, wenn diese in einem Medium kultiviert werden, das frei von Säuren RCOOH, wobei R die hier angegebene Definition besitzt, oder von Verbindungen ist, die sich in Säuren mit der Formel RCOOH umwandeln lassen,- wobei R die hier angegebene Bedeutung besitzt. Die typische Retentionszeit für Oligomycin A beträgt 12.5-14 Minuten. Das Verhältnis der Retentionszeiten (RT) liefert eine stärker signifikante Basis für den Vergleich der Identität und der Ausbeuten an Avermectin-Produkten. Das gewöhliche Erscheinungsbild der Avermectine nach HPLC ist B2, A2, Bl, und Al (Fig. 2).

Natürliche

Avermectine RT/RT (Oligomycin A)

B2b 0,70

B2a 0,84

A2b 0,90

A2a 1,09

BIb 1,40

BIa 1,83

Alb 1,83

AIa 2,42

Nicht natürliche

Avermectine RT/RT (Oligomycin A)

Cyclopentyl B2 0,94

Cyclopentyl A2 1,23

Cyclopentyl Bl 1,99

Cyclcpentyl Al 2,62

Die Relationen wurden aus Fig. 2 für die natürlichen Avermectine (es ist anzumerken, daß BIa und Alb nicht aufgelöst sind) und aus Fig. 3 für die nicht natürlichen Avermectine bestimmt. Die Retentionszeiten schv/anken an den verschiedenen Meßtagen um 1-2 Minuten, wobei Oligomycin im allgemeinen nahe 12,5-14 Minuten erscheint.

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In den folgenden Beispielen wurden die Avermectine nach dem oben beschriebenen HPLC-Verfahren bestimmt:.

- 55 -

- 55 Ausführungsbeispiel

BEISPIEL 1 Cyclopentylavermectin A2

S_l avermitilis 1-3 (ATCC 53567) wurde unter Schütteln 24 Stunden lang bei 28-30°C in AS-7-Medium kultiviert. Ein Anteil von 5 ml wurde verwendet, um einen 500 ml fassenden Kolben zu beimpfen, der 100 ml AS-7-Medium enthielt, und die Inkubation wurde 24 Stunden lang unter denselben Bedingungen durchgeführt; 1 ml dieser Kultur wurde verwendet, um AP-5-Medium zu beimpfen (40 ml in 300 ml Kolben), wozu 24 Stunden später 0,4 g/l Cyclopentancarbonsaure (Natriumsalz) gegeben wurden. Die produkthaltigen Kolben wurden unter Schütteln bei 28-30°C gehalten. Nach 240 Stunden waren 35 mg/1 Cyclopentylavermectin A2 produziert worden, während der entsprechende A2a-Titer bei 0 lag. Andere Cyclopentylavermectine wurden ebenfalls produziert.

BEISPIEL 2 Cyclopentylavermectin A2

Ein Gläschen mit gefrorenem S^ avermitilis HL-026 (ATCC 53568) wurde verwendet, um 100 ml AS-7-Medium in einem 500 ml fassenden Kolben zu beimpfen. Wachstum trat auf, während bei 28-30⁰C 24 Stunden lang unter Schütteln inkubiert wurde. Eine Menge von 1 ml wurde verwendet, um zwei weitere, 500 ml fassende Kolben zu beimpfen, die 100 ml AS-7-Medium enthielten, und diese letztgenannten Kolben wurden, nach 18-stündiger Inkubation, verwendet, um 10 Liter AP-5-Medium (weniger NaCl) zu beimpfen. Nach 24-stündiger Inkubation bei 28°C wurden dem Medium 0.4 g/l Cyclopentancarbonsaure zugesetzt. Die Mischung wurde so in Bev/egung gehalten, daß gelöster Sauerstoff bei 20 % Sättigung gehalten wurde. Die Cyclopentyl-A2-Titer nach 120, 168, 23.6, 264 und 312 Stunden betrugen 16, 40, 65, 88 bzw. 110 mg/1. Im Gegensatz dazu war der entsprechende Titer des natürlichen Avermectins A2a 0 (d.h.

- 56 -

- 56 nicht nachweisbar) in diesen Proben.

BEISPIEL 3 Cyclopontylavermectin A2

In diesem Experiment v/urde das Produktionsmedium angereichert, und Cyclopentancarbonsaure wurde mehrfach zugegeben, um die Cyclopentylavermectin-Titer zu steigern. Die Bedingungen während der Inoculum-Entwicklung und der Fermentation waren identisch mit denen, die in Beispiel 2 beschrieben sind, mit folgenden Ausnahmen: v/eitere 5 g/l Ardamin pH (auf insgesamt 10 g/l) wurden in das AP-5-Medium gegeben, und 0,4, 0,2 und 0,2 g/l Cyclopentancarbonsaure wurde nach 30, 172 bzw. 220 Stunden zugesetzt. Die Cyclopentylavermectin-A2-Titer betrugen 1,2. 11, 78, 137 und 214 mg/l nach 120, 168, 216, 264 bzw. 312 Stunden.

BEISPIEL 4 Cyclopentylaverraectine

Ein Gläschen mit gefrorenem S_._ avermiti lis HL-026 (ATCC 53568) wurde verwendet, um luü ml AS·-7-Medium, in einem 500 ml fassenden, unterteilten Kolben zu beimpfen, das bei 28-30 C 24-28 Stunden lang inkubiert wurde. Dann wurde 1 ml verwendet, um einen 300 ml fassendun Kolben zu beimpfen, der 40 ml AP-5-Medium enthielt (weniger NaCl, aber zusätzlich 0,6 g/l Glutaminsäure). Nachdem unter Schütteln 96 Stunden lang bei 28-30°C inkubiert worden war, wurden 0,4 g/] Cyclopentancarbonsaure (Natriumsalz) zugesetzt. Die HPLC-Chromatographie einer 216 Stunden alten Probe zeigte, daß die Cyclopentylavermectine B2, A2, Bl und Al vorlagen, mit Retentionszeiten von 12,32, 15,86, 25,28 bzw. 32,96 Minuten.

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BEISPIEL 5 Cyclopenta'lavermectin A2

In diesem Beispiel wurden S_-1 avermiti 1 is 1-3 (ATCC 53567) und S^ avermitilis HL-026 (ATCC 53568) unter identischen Bedingungen gezüchtet. Drei Medien (AP-5, WPM Syn A 40:40 und WPM Syn B 40:40) wurden verv/endet. Eine eingefrorene Kultur eines jeden Organismus' wurde eingesetzt, um 100 ml AS-7-Medium in 500 ml fassenden, unterteilten Kolben damit zu beimpfen, die daraufhin 24-26 Stunden lang bei 28-30⁰C inkubiert wurden. Dann wurde 1 ml einer jeden Kultur zum Beimpfen von 300 ml fassenden Kolben verwendet, wobei die Kolben jeweils 40 ml eines der drei Medien enthielten. Alle Kolben wurden in doppelter Ausfertigung der Behandlung unterworfen. Nachdem man 24 Stunden lang unter Schütteln bei J8 C inkubiert hatte, fügte man zu jedem Kolben 0,4 g/l Cyclopentylcarbonsäure (Natriumsalz) hinzu; und nach insgesamt 192-stündiger Inkubation wurden die Titer des Hauptprodukts, Cyclopentylavermectin A2, bestimmt (Tabelle I).

TABELLE I

Cyclopentyl-S. avermitilisavermectin A2

Medium Stairn mg/1

AP-5 ATCC 53567 29

ATCC 53568 67

WPM Syn A 40:40 ATCC 53567 35

ATCC 53568 115

WPM Syn B 40:40 ATCC 53567 38

ATCC 53568 36

BEISPIEL 6 Cyclohexylavermectine

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In diesem Beispiel wurden nach 96 Stunden anstelle von Cycloprntancarbonsäure 0,2 g/l Cyclohexancarbonbaure zugesetzt, während alle anderen Bedingungen mit denen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, übereinstimmten. Auf dem HPLC-Chromatogramm einer 240 Stunden alten Probe wurden vier Cyclohexylavermectine identifiziert. Die Retentionszeiten für die Cyclohexylavermectine B2, A2, Bl und Al betrugen 14,84, 19,26, 31,46 bzw. 41,14 Minuten.

BEISPIEL 7 3-Cyclohexenylavermectine

In diesem Beispiel wurden nach 96 Stunden anstelle von Cyclopentancarbonsäure 0,2 g/l 3-Cyclohexencarbonscure zugesetzt, während alle anderen Bedingungen mit denen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, übereinstimmten. Einige Cyclohexenylavermectine wurden auf dem HPLC-Chromatogramm ei.ier 312 Stunden alten Probe identifiziert. Ihre Retentionszeiten sind 12,88 (B2), 16,39 (A2) , 27,37/28,36 (Bl-Isomere) bzw. 35,80/37,13 (Al-Isomere).

BEISPIEL 8 3-Thienylavermectine

In diesam Beispiel wurden nach 96 Stunden anstelle von Cyclopentancarbonsäure 0,05 g/l Thiophen-3-carbonsäure zugesetzt, während alle anderen Bedingungen mit denen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, übereinstimmten. Vier 3-Thianylavermectine v/urden auf dem HPLC-Chromatogramm siner 312 Stunden alten Probe identifiziert. Die Retentionszeiten für die 3-Thienylavarmectine B2, A2, Bl und Al betrugen 6,96, 8,76, 13,8 bzw. 23,5 Minuten.

BEISPIEL 9 1-Methylthioethy lavermectine

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2.6?

Ir. diesem Beispiel wurden nach 24 bzw. 96 Stunden anstelle von Cyc3opentancarbonsaure 0,4 bzw. 0,2 g/l 2-Methylthiopropionsäure zugesetzt, während alle anderen Bedingungen mit denen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, übereinstimmten. Zwei 1-Methylthioethylavermectine wurden auf dem HPLC-Chromatogramm einer 240 Stunden alten Probe identifiziert. Die Retentionszeiten für die 1-Methylthioethylavermectine A2 und Bl betrugen 9,30 bzw. 13,06 Minuten. Eine Absorption mit einer geschätzten Retentionszeit von etwa 7,2 Minuten, die aus der Vorderschulter der Absorption mit einer Retentionszeit von 7,557 Minuten herausragt, wird als die der B2-Verbindung angesehen, und von der Al-Verbindung nimmt man an, daß sie sich unter der Absorption bei 17,22 Minuten befindet.

BEISPIEL 10 2-Pentylavermectine

In diesem Beispiel wurden nach 96 Stunden anstelle von Cyclopentancarbonsäure 0,2 g/l 2-Methylvaleriansäure zugesetzt, während alle anderen Bedingungen mit denen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, übereinstimmten. Vier 2-Pentylavermectine wurden auf dem HPLC-Chrcmatogramm einer 312 Stunden alten Probe identifiziert. Die Retentionszeiten für die 2-Pentylavermectine B2, A2, Bl und Al betrugen 12,88, 16,58, 31,90 bzw. 41,92 Minuten.

BEISPIEL 11 l-Methyl-S-butenylavermectine

In diesem Beispiel wurden nach 96 Stunden anstelle von Cyclopentancarbonsäure 0,2 g/l 2-Methyl-4-pentensäure zugesetzt, während alle anderen Bedingungen mit denen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, übereinstimmten. Vier l-Methyl-3-butenylavermectine wurden auf dem HPLC-Chromatogramm einer 312 Stunden alten Probe identifiziert. Die Retentionszeiten für die l-Methyl-3-butenylavermectine B2, A2, Bl und Al betrugen 11,13, 14,78, 22,10 bzw. 28,92 Minuten.

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26?

BEISt £EL 12 1-Methy1-1-butenylavermectine

In diesem Beispiel wurden nach 96 Stunden anstelle von Cyclopentancarbonsäure 0,2 g/l 2-Methy1-2-pentensäure zugesetzt, während alle anderen Bedingungen mit denen, die in Beispiel 4 beschrieben sind, übereinstimmten. Vier 1-Methyl-l-butenylc.v'ermectine wurden auf dem HPLC-Chromatogramm einer 312 Stunden alten Probe identifiziert. Die Retentionszeiten für die 1-Methyl-l-butenylavermectine B2, A2, Bl und Al betrugen 11,59, 14,93, 25,29 bzw. 33,18 Minuten.

BEISPIEL 13

In diesem Beispiel wird die Verwendung der Mutante demonstriert, um die natürlichen Avermectine, die sich von L-Valin ableiten, in Abwesenheit der Avermectine, die sich von L-Isoleucin ableiten, herzustellen. Der Inhalt eines gefrorenen Gläschens mit S_^ avermitilis 1-3 (ATCC 53567) wurde in einen 500 ml fassenden, unterteilten Kolben überführt, der 100 ml AS-7-Medium enthielt. Nach annähernd eintägigem Schütteln (ca. 200 Upm) bei 28-30°C wird 1 ml der Kultur eingesetzt, um 40 ml WPM Syn A 40:40 Medium in einem 300 mi fassenden Kolben zu beimpfen, der anschließend 24 Stunden lang unter Schütteln bei 28-30 C inkubiert wird. Zu diesem Zeitpunkt setzt man 4 ml einer filtrationssterilisierten Lösung von Isobuttersäure (mit NaOH auf pH 6-7 neutralisiert) in einer Konzentration von 4 mg/ml zu und inkubiert insgesamt 8 Tage lang weiter wie oben. Die HPLC-Analyse zeigte vier Hauptabsorptionen (außer der von Oligomycin). (In ähnlichen Experimenten mit 2-Methylbuttersäure anstelle von Isobuttersäure konnte man die vier komplementären Absorptionen erkennen, die von den von L-Isoleucin stammenden Avermectinen verursacht sind.)

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- 61 BEISPIEL 14

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt; jedoch wurden die Starter-Verbindungen, die unten aufgelistet sind, anstelle von Cyclopentancarbonsaure eingesetzt. Die Avermectine

ο (Verbindungen mit der Formel I, in denen R die Oleandrose-Disaccharidgruppe ist und R, R und R die gezeigten Bedeutungen besitzen), die aus den genannten Fermentationsverfahren identifiziert wurden, sind ebenfalls in der Tabelle angegeben.

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Verb. Starter-Verbindung

Produkt: RT/RT (Oligornycin A) B „ A- B-, A,

10 11 12 13 14 15 16

2-Methylvaleriansäure 2-MethylpenL-4-ensäure

l-Cyclohexencarbor.säure

Thiophen-2-carbonsäure

3-Furansäure

Cyclobutancarbonsäure

Cyclopentancarbonsaure

Cyclohexancarbonsäure

Cycioheptancarbonsäure

3-Cyclohexen-l-carbonsäure

2-iMethy 1 thiopropionsäure

Thiophen-3-carbonsäure

Hydroxymethylcyclopentan

3-Thiophencarboxaldehyd

3-Cyclohexylpjopionsäure

3-Cyclopenty!propionsäure

Pent-2-yl	1	853	1,287	2,478	isch mit	3,255	7
4-Penten-2-yl	0,	904	1, 01 0	1,694	2,217	12
	0,	785	1,133	1,784	2,346	8
Cyclohexen-1-yl	0,		1, 0 21	1,665	2,179	7
Thien-2-yl			0,694	1,143	1,499
3-Furyl		728	0,705	1,095
Cyclobutyl	0,	960	0,933	1, 5 4 6	2,02"
Cyclopentyl	0,	206	1,236	1,970	2,568
Cyclohexyl	1,	465	1,565	2,556	3,343
Cycloheptyl	1,		1,923
Cyclohex-3-enyl	1	565	1,273	2,125	2,780
1-Methylthioethyl	0,	539	0,730	1,025	1,351
Thien-3-yl	o,		^,639	1,069	1,388
Cyclopentyl			identisch mit
Thien-3-yl			identisch mit
Cyclohexyl			identisch mit
Cyclopentyl		ident

Produkt: RT/RT (Oligomycin A)

Verb. Starter-Verbindung

17 Hydroxymethylcyclobutan

18 3-Cyclopanty1-1-propanol

19 Cyclobuty lmethylarnin

20 Cyclobutancarbonsäureethylester

21 2-{Cyclobutylcarbonyl)-propionsäure

22 2- (3-Thiophencarbonyl)-propionsaureethyIester

1-Meth.-1 cyclopropancar-

oonsäure 24 2-Methylpent-2-ensäure

2-Furansäure 5-Methylthiophen-2-carbonsäure

1-MethyIcyclopropancarbonsaure Cyclopropancarbonsaure

Cyclobutyl

Cyclopentyl

Cyclobutyl

Cyclobutyl Cyclob'ityl Thien-3-yl

1-Methy1eye1opropyI 2-Penten-2-yl 0,812

0,882 2-Furyl

5-Methyithien-2-yl 0,533

1-Methylcyclopropyl Cyclpropyl 0,802

A₀ B₁ ί

identisch mit identisch mit identisch mit identisch mit identisch mit identisch mit

1,236 1,091 1,135 0,709

1,923 2,523

1,146

1,236 1,048

1,514

2,236

Andere physikalisch-chemische Daten für einige der oben ge nannten Verbindungen werden im folgenden angegeben:

Verb. Physikalisch-chemische Daten

(A2) Weißes Pulver, Smp. 135-140°C, Molekulargewicht = 925; m/e 596, 454,321.. 303, 275, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 and 87.

(Al) Weißes Pulver, Smp. 120-124°C, Molekulargewicht = 907? m/e 578, 303, 275, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 and

(B2) Weißes Pulver, Smp. 110-112°C, Molekulargewicht =911; m/e 321, 303, 261, 257, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 and 87.

(Bl) Weißes Pulver, Smp. 135-138°C, Molekulargewicht =893; m/e 303, 261, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 and C'7.

(A2) Weißes Pulver, Smp. 112-117°C, Molekulargewicht = 953; m/e 624, 482, 349, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 21", 207, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 and 87.

(A2) Weißes Pulver, Smp. 131-135⁰C, Molekulargewicht =951; m/e 624, 480, 347, 329, 275, 263, 245, 235, 217, 205, 193, 179, 145, 127, 113, 111, 95 and 87.

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12(Λ2) VJeißes Pulver, Smp. 167°C, Molekulargewicht = S53; m/e 34S, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127, 113, 95 and 87.

BEISPIEL 15 Gev/innung von Cyclopentylavermectin-A2

Dieses Beispiel wird gegeben, um ein Verfahren zur Gewinnung der Avermectine vom A2-Typus, die aus dem Cyclopentancarbonsäure-Vorläufer gebildet wurden, vorzustellen. Die gesamte Ku.lturbrühe (aus einer Fermentation wie der des Beispiels 2) wurde filtriert, und die Mycelzellmasse wurde zweimal mit Aceton (3-faches Volumen) extrahiert. Der Acetonextrakt wurde zu eineir wäßrigen Öl eingeengt, das Öl wurde mit Methylenchlorid extrahiert, und die Methylenchlorid-Lösung wurde zu einem dunkelbraunen Öl eingeengt. Das dunkelbraune Öl wurde dann in Methanol/Wasser (4:j) gelöst, und die gebildete Lösung wurde mit Hexan extrahiert, um Fettsäuren/Lipide zu entfernen. Eindampfen des Methanol/Wasser-Gemischs lieferte ein hellbraunes Öl, das etwa 10 Gew.-% (w/w) Cyclopentylavermectin A2 enthielt. Das rohe Avermectin-öl w:rde dann mit Chloroform (3 ml CHCl₃ pro Gramm Öl) verdünnt, Aktivkohle (0,35 g/g Öl) und Silicagel (1 g/g Öl) wurden zugesetzt, und die Mischung wurde eine Stunde lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt, und das gebildete Öl wurde mit Isopropylether (1 ml IPE pro g Öl) verdünnt. Die entstandene Lösung wurde dann nach und nach tropfenv/eise in eine große Menge Hexan (25 ml Hexan/g Öl) eingetragen, worauf ein weißes, roher. Avermectinpulver ausfiel. Dieses erste Präzipitat wurde durch Filtration isoliert, und das Filtrat wurde daraufhin auf annähernd 5 C gekühlt, um weiteren Niederschlag auszufällen. Die Rohprodukte wurden mittels präparativer Hochleistungs-h 'Chdruckchromatographie weiterbehandelt, um gereinigtes Produkt zu erhalten. Das Rohprodukt wurde in

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25/25/25/50/C, 125 IPE/CH-jCN/Fthylacetat/Hexan/Essj.gsäure gelöst (4,1 ml Solvens pro Gramm rohes Pulver). Die Proben .vurden auf eine präparative 41,4 mm χ 25 cm Silica-Säule gegeben und mit dem obengenannten Solvens mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/Minute eluiert, und der produkthaltige Peak wurde gesammelt. Die vereinigten Fraktionen wurden eingeengt und mit MeOH/H,O (86/14) so verdünnt, daß 1 ml etwa 50 mg Produkt enthielt. Dann wurden die Proben in eine präparative C-.1°-Säule (mit denselben Abmessungen wie die Silica-Säule) injiziert und mit einer Geschwindigkeit von 18-20 ml/Minute mit MeOH/H₂O (275 ml H₃O mit Methanol ad 2 Liter) eluiert. Die Fraktionen wurden wieder eingeengt und ein zweites Mal über die präp. C-18-3äu!e gegeben. Eindampfen der produkthaltigen Fraktionen bis zur Trockne lieferte reines Titelprodukt.

Dia entsprechenden Cyclopentylavermectine B2, Al und Bl werden gewonnen, indem die entsprechenden Fraktionen aus den oben beschriebenen HPLC-Stufen gesammelt werden.

BEISPIEL 16

Mycel von S^ avermitilis JC 923 (ATCC 53669) aus einem YPD-2 Agar-Medium wurde verwendet, um 50 ml AS-7-Medium in einem 300 ml fassenden, unterteilten Kolben zu beimpfen, der unter Schütteln (220 üpm) 24 Stunden lang bei 30⁰C belassen wurde. Dann wurden jeweils zwei 300 ml fassende Kolben (nicht untertei.' t) , die 50 ml AP-5-Medium enthielten, mit einem ml der Kultur beimpft. Ein Kolben enthielt 2-Methylbuttersäure (0,1 %), und der andere keine 2-Methylbuttersäure. Bei 30^cC wurde 11 Tage lang unter Schütteln fermentiert. Die Inhalte beider Kolben wurden auf dieselbe Weise aufgearbeitet. Die gesamte Kulturbrühe wurde mit einem vierfachen Volumen-Überschuß an Acetonitril!Methanol (810:75) extrahiert. Nach heft.-.gem Schütteln, das die Antibiotika-Extraktion aus den Zellen beschleunigen sollte, wurde der geklärte Überstand mittels HPLC auf Avermectine analysiert. Im Fall, in dem kein

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Fettsäure-Vorläufer eingesetzt worden war, fand man keine erkennbaren Avarmectine ("a"-Typ) (Sensitivität = 0,20 ic.g/1). In Gegenv/art der 2-Methylbuttersäure wurden Avermectine B2a, A2a, BIa und Als in Mengen von 0,5, 1,3 1.4 bzw. 1,1 mg/1 gemessen.

BEISPIEL 17

In diesem I;·· j.splel wurden Fermentationskulturen von S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) auf AP-5-Grundlage für die Produktion aus wie in Beispiel 16 auf AS-7 gezüchteten Inocu-Ia hergestellt Die Starter-Verbindung 2-Methylbuttersäure lag in einer Konzentration von 0,C5 % vor. In diesem Fall führte die Kontrollfermentierung ohne die Ergänzung (keine Fettsäure-Ausgangsverbindung) zu Werten von 0,3, 0,9, <0,2 bzw. <0,2 mg/l für die Avermectine B2a, A2a, Bia bzw. AIa, während die Ergebnisse für die mit Fettsäure ergänzten Fermentationen 2,8, 5,0, 4,5 bzw. 2,3 mg/1 lauteten.

BEISPIEL 18

In diesem Beispiel wurden Fermentationskulturen von Sj_ avermitilis JC 923 (ATCC 53669) auf AP-5-Grundlage für die Produktion aus wie in Beispiel 17 auf AS-7 gezüchteten Inocula hergestellt. In diesem Beispiel wurde 48 Stunden nach der Beimpfung des AP-5-Mediums 2-Methylbuttersäure in einer Konzentration von 0,05 % zugesetzt, und die Zellen wurden mittels Filtiation geerntet, gewogen {Feuchtgewicht) und mit einem vierfachen Gewichts-Überschuß an Extraktionssolvens extrahiert. Dieser Konzentrationsschritt ermöglicht eine größere Sensitivität bei den Messungen der Avermectin-Titer im Vergleich zu den voranstehinden Fällen, in denen die gesagten Kulturbrühen direkt extrahiert worden waren. Im vorliegenden Beispiel wurden Mengen von 2,5, 8,5, 4,5 und °,5 mg/1 für B2a, A2a, BIa bzw. AIa für die mit 2-Metnylbuttersäure ergänzte Fermentation gemessen, im Vergleich zu Werten von 0,3, 0,3, 0,3 und 0,1 für die Kontrol!fermentation ohne Ergänzung.

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Diese letzteren, niedrigen Werte sind wahrscheinlich dem Vorhandensein kleiner Mengen endogener Fettsäure-Verbindungen im rohen AP-5-Produktionsmedium zuzuschreiben.

BEISPIEL 19

Fermentationen wurden durchgeführt wie in Beispiel 18, ύit der Ausnahme, daß die Ergänzung mit 2-Methylbuttersäure durch eine solche mit Cyclopentancarbonsäure in einer Konzentration von 0,045 % ersetzt wurde. Es wurde festgestellt, daß Cyclopentylavermectin A2 .n einer Konzentration von 4 mg/1 vorlag.

BEISPIEL 20

Fermentationen (16) von S^ avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) wurden in 50 ml AP-5-Medium durchgeführt, das in 300 ml fassende.¹ Kolben (ohne unterteilung) bei 30⁰O inkubiert wurde. Das Medium v/urde mit einem ml einer 24 Stunden alLen Kultur des Stamms in AS-7-Medium · 30 C Inkubation, 50 ml Medium in 300 ml fassendem, unterteiltem Kolben - beimpft. Nach 66-stündigsm Wachstum im AP-5-Mediutn wurde Isobuttersäure in einer Konzentration von 0,1 % zu 8 der Kolben zugesetzt. Mit der Aufarbeitungsmethode des Beispiels 16 lieferten Kolben, die diese Ergänzung enthielten, Konzentrationen an B2b, A2b, Bib und Alb gleich (Durchschnitt aus zwei Experimenten) 5,6, 45, 45 bzw. 68 mg/1. Die Kulturen ohne diese Ergänzung erbrachten Werte von 0,5, 4,0, 4,5 bzw. = 8,5 mg/1. Außerdem fand man in der letztgenannten Fermentationskultur Werte von 1,1, 1,1/ unbestimmt und <0,2 mg/l für die entsprechenden B2a-, A2a-, BIa- und Ala-Avermectine.

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BEISPIEL 21

In diesem Beispiel wurden vier AP-5-Ferm°ntationen von S__L avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) in Kulturen von 2 ml Volumen in Kunststoffröhrchen (15 ml) durchgeführt. Die Inocula wurden wie in Beispiel 20 beschrieben in AS-7-Medium hergestellt, wobei man bei 30 C die Röhrchen in bleibender Schräglage von 30 schüttelte. Die Fettsäure-Vorstufe, CyclOhexancarbonsäure (CHC) v/urde 96 Stunden nach der Beimpfung des AP-5-Mediums in einer Konzentration von 0,045 % zu zweien der Röhrchen zugegeben. Vierhundert Stunden nach der Inokulierung des AP-5-Mediums mit 0,05 ml der AS-7-Kultux wurden jedem Röhrchen 8 ml Extraktions-Solvens (Acetonitril: Methanol 810:75) zugesetzt, und die Avermectin-Titer wurden mittels HPLC-Analyse in den überständen bestimmt, wie im Text beschrieben. Für die Avermectine CHC-B2, CHC-A2, CHC-B], CHC-Al, A2b, BIb, Alb, A2b und AIa betrugen die Konzentrationen !Durchschnitt aus zwei Röhrchen) 3,5, 6,2, 3,0, 1,4, 0,2, 0,2, 0,4, 0,2 bzw. <0,2 mg/1. Die entsprechenden Werte für die Fermentationsröhrchen, die keine Vorstufen-Säure erhalten hatten, waren <0,2, <0,2, <0,2, <0,2, 4,2, 2,9, 9,3, 1,2 bzw. 0,3 mg/1. Alle anderen natürlichen Avermectine waren im wesentlichen nicht aufzufinden.

Claims

PC 7123/A

ERFINDUNGSANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Herstellen eines Avermectins,dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces avermitilis, dem eine der beiden oder beide Aktivitäten, die der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die der Transaminase für verzweigtkettige Aminosäuren, fehlt/fehlen, in einem wäßrigen Nährmedium das eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, Kohlenstoff und anorganische Salze und eine Verbindung enthält, die geeignet ist, in der Biosynthese eines Avermectins verwertet zu werden, aerob fermentiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung, die geeignet ist, in der Biosynthese eines Avermectins verwertet zu werden, eine Säure mit der Formel

R-COOH

oder eine Verbindung ist, die durch S_^ avermitilis in diese Säure umgewandelt werden kann, worin R eine andere Gruppe als Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von S± avermitilis die Identifikations-Charakte ristika von ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 536C9 oder ATCC 53670 besitzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die Formel

R-COOH

besitzt, worin R eine alpha-verzweigtkettige Gruppe ist, deren Kohlenstoffatom, an dem die -COOH-Gruppe gebunden ist, außerdem mindestens mit zwei weiteren Atomen oder Gruppen, die nicht Wasserstoff sind, verknüpft ist, oder daß sie eine Verbindung ist, die sich während des Fermentationsverfahrens in diese Verbindung umwandeln läßt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R eine alpha-verzweigte C-.-Cg-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -Alkoxyalkyl- oder -Alkylthioalkylgruppe, eine C -Cg-Cycloalkylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine alpha-verz'/eigte C_?-C,--Alkylgruppe ist, eine C^-Cg-Cycloalkyl- oder eine Cc-Cg-Cycloalkenylgruppe, die beide fakultativ durch Methylen oder eine oder mehrere C,-C.-Alkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein können, oder ein 3- bis 6-gliedriger, sauerstoff- oder schwefelhaltiger heterocyclischer Ring ist, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und der fakultativ mit einer oder mehreren C,-C.-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann, oder eine Verbindung, die sich in während des Fermentationsverfahrens in diese Verbindung umwandeln läßt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung, die sich in das Substrat RCOOH umwandeln läßt,

R-(CH₂)_n-Z

Z 6'7

ist, worin R wie voranstehend definiert ist, η 0, 2, 4 oder ist und Z -CH₂OH, -CHO, -COOR⁵, -CH₃NH₂ oder -CONHR⁶ ist, wobei R⁵ H oder (C_1-6)AIlCyI ist, R⁶ Wasserstoff,

(C_x_₄)-Alkyl, -Ch(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂C0OH oder -CH(COOD (CH₀)-SCH, ist, oder daß, wenn dem Stamm von S. avermitilis nur die Transaminase-Aktivität für verzweigtkettige Aminosäuren fehlt, die Verbindung, die sich in das Substrat RCOOH umwandeln läßt, R-CO-Z ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R bedeutet: Cyclobutyl
Cyclopentyl
Cyclohexyl
Cycloheptyl
2-Methylcyclopropyl
3-Cyclohexenyl
1-Cyclopentenyl
1-Cyclohexenyl

3-Methylcyclohexyl (cis/trans) 4-Methylencyciohexyl 3-Methylcyclobutyl 3-Methylencyclobutyl 3-Cyclopentenyl 1-Cyclopropylethyl 3-Fluorcyclobutyl 4,4-Difluorcyclohexyl Isopropyl
sec-Butyl
2-Pentyl

2,3-Dimethylpropyl 2-Hexyl
2-Pent-4-enyl 2-Methylthioethyl S-2-Methylpentyl R-2-Methylpentyl

2-Thienyl

3-Thienyl

4-Tetrahydropyranyl 3-Furyl

2-Chlorthienyl 3-Tetrahydrothienyl 4-Methylthio-2-butyl 4-Tetrahydrothiopyranyl 4-Methoxy-2-butyl oder 4-Methylthio-2-butyl.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet; daß R Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Thienyl ist.
9. Verfahren, nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn R eine alpha-verzweigte C^-C^-Alkylgruppe ist, sie nicht Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist.
10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von S^ avermitilis S_^ avermitilis ATCC 53567, ATCC 5J568, ATCC 53669 oder ATCC 53670 ist.