DE3880088T2

DE3880088T2 - Ethylierte avermectine.

Info

Publication number: DE3880088T2
Application number: DE8888310457T
Authority: DE
Inventors: Steven Joseph Hawrylik; Shih-Jen Edward Lee
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1987-11-09
Filing date: 1988-11-07
Publication date: 1993-07-22
Anticipated expiration: 2008-11-08
Also published as: PT88952A; EP0316124B1; US5387509A; EP0316124A2; JPH01157986A; DE3880088D1; JPH0695947B2; ATE87926T1; DK621688D0; ES2045146T3; EP0316124A3; DK621688A; IE883358L; IE62446B1; PT88952B; CA1340771C

Description

Die Erfindung betrifft Antiparasit-Mittel und insbesondere natürliche und nicht-natürliche Avermectine, in welchen eine oder beide der 3'- und 3"-Stellungen des Oleandrosedisaccharid- Restes durch eine Ethoxy-Gruppe anstelle einer Methoxy-Gruppe substituiert sind; und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die US-Patentschriften 4 310 519 und 4 429 042 beschreiben die Avermectine, ein Komplex von verwandten Verbindungen mit starker antiparasitischer Aktivität, und deren Herstellung durch aerobische Fermentation van Streptomyces avermitilis-Stämmen, nämlich S. avermitilis ATCC Nrn. 31267, 31271 und 31272. Die letzten beiden angegebenen Stämme verkörpern eine gefrorene Ampulle bzw. ein lyophilisiertes Röhrchen einer durch Ultraviolett-Bestrahlung von S. avermitilis ATCC 31267 erhaltenen Kultur.
Die EP-Patentschrift 214 731, veröffentlicht am 18. März 1987, das Gegenstück der US-Patentanmeldung Serial No. 886 867, angemeldet am 16. Juli 1986, beschreibt eine Reihe von mit den natürlichen oder bekannten Avermectinen verwandten Verbindungen (hier als nicht-natürliche Avermectine bezeichnet), die eine neue Substituenten-Gruppe in der 25-Stellung aufweisen, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Fermentation eines Avermectin-produzierenden Organismus in Gegenwart von bestimmten spezifizierten Carbonsäuren, oder Derivaten oder Vorstufen derselben. Die zur Herstellung der genannten neuen C-25-substituierten Avermectine verwendeten S. avermitilis-Organismen sind S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 und NCIB 12121. Der zuletzt genannte, in der EP-Patentschrift 214 731 beschriebene Organismus leitet sich van S. avermitilis ATCC 31271 ab. Er gibt verbesserte Ausbeuten an den neuen C-25-substituierten Avermectinen, wenn er in einem semi-definierten Medium gebildet wird. Jeder der nachstehend aufgeführten Organismen, nämlich ATCC 31267, 31271, 31272 und NCIB 12121 kann auch außer dem neuen C-25-substituierten Derivat variierende Mengen der bekannten, oder natürlichen, Avermectine bilden, worin der 25- Substituent Isopropyl oder (S)-sek.-Butyl (1-Methylpropyl) ist.
Die US-Patentanmeldung Serial No. 6512, angemeldet am 23. Januar 1987, beschreibt S-avermitilis-Mutanten ATCC 53567 und 53568, von denen jedem die verzweigtkettige 2-Oxosäure-Dehydrogenase-Aktivität fehlt, und deren Verwendung zur Herstellung von nicht-natürlichen Avermectinen. Ebenso wird die Verwendung von O-Methyltransferase-Inhibitoren, wie Sinefungin, S-Adenosylethionin (SAE) und S-Adenosylhomocystein in Fermentationen der erwähnten Organismen zur Herstellung erhöhter Mengen von B-Avermectinen beschrieben, einschließend diejenigen, denen an dem Disaccharid-Rest Methyl-Gruppen fehlen.
Das Kohlenstoffgerüst der Avermectine (abgebildet in der weiter unten stehenden Formel (I)) ist abgeleitet von Acetaten und Propionaten und dem C-25-Substituenten von natürlichen Avermectinen von L-Isoleucin (R = (S)-sek.-Butyl) oder L-Valin (R = Isopropyl) [Fisher und Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) Ch. 14].
Unter "bekannten" oder "natürlichen" Avermectinen sind diejenigen Avermectine zu verstehen, die durch S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 und ATCC 31272 produziert werden, worin der Substituent in der 25-Stellung entweder Isopropyl oder (S)-sek.-Butyl (1-Methylpropyl) ist. Avermectine, in welchen der Substituent in der 25-Stellung ein anderer als Isopropyl oder sek.Butyl (S-Form) ist, werden hier als neue oder nichtnatürliche Avermectine bezeichnet.
Die in den oben erwähnten US-Patentschriften aufgeführten Stämme von S. avermitilis produzieren eine Klasse von Substanzen, die ganz allgeniein darin als C-076 bezeichnet werden. Die Klasse umfaßt acht verschiedene, jedoch eng verwandte Verbindungen, die als C-076 A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a und B2b beschrieben werden. Die "a"-Reihe der Verbindungen betrifft die natürlichen Avermectine, in welchen der 25-Substituent (S)-sek.- Butyl ist und die "b"-Reihe diejenigen, in welchen der 25-Substituent Isopropyl ist. Die Bezeichnungen "A" und "B" betreffen Avermectine, in welchen der 5-Substituent Methoxy bzw. Hydroxy ist. Schließlich bezieht sich die Ziffer "1" auf Avermectine, in denen eine Doppelbindung an der 22-23-Stellung vorhanden ist; und die Ziffer "2" auf Avermectine, die in der 22-Stellung ein Wasserstoffatom und in der 23-Stellung eine Hydroxy- Gruppe enthalten.
In dieser Anmeldung werden bezüglich des 25-Substituenten der nicht-natürlichen Avermectine keine derartigen Kennzeichen verwendet. Die Kennzeichen A1, A2, B1 und B2 wurden zur Bezugnahme auf die nicht-natürlichen Avermectine mit den Struktureigenschaften, entsprechend denjenigen der natürlichen Avermectine, wie oben erwähnt, beibehalten.
Die US-Patentschrift 4 378 353 beschreibt C-076-verwandte Verbindungen und deren Herstellung durch Züchtung von MA-5218, ein Mutantenstamm von S. avermitilis ATCC 31272, erhalten daraus durch ultraviolette Bestrahlung. Den durch den erwähnten Mutanten erzeugten C-076-verwandten Verbindungen fehlt der C-076- Furanring. Zusätzlich wurde in bestimmten der aufgeführten Verbindungen eine oder beide der Oleandrosezucker-Reste gespalten, während in anderen die Gruppe in der 5-Stellung zu einer Keto- Gruppe oxidiert wurde.
Von Ruby et al., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Ungarn, 26. bis 30. August (1985) und von Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 (1987) wurde über drei Klassen von O-Methyltransferase-Mutanten von S. avermitilis berichtet, die Avermectine erzeugen, denen O-Methyl-Gruppen fehlen. Die erste Klasse produziert vorwiegend B-Avermectine infolge ihrer Unfähigkeit, das C-5-Hydroxyl des makrocyclischen Lactonrings zu methylieren. Die zweite Klasse erzeugt 3'-O, 3"-O-Bis-demethylavermectine (Avermectine, denen der O-Methyl-Substituent an der 3-Stellung von beiden Oleandrosemonosaccharid-Resten fehlt) und die als Demethylavermectine bezeichnet werden. Die dritte Klasse ist unfähig, in irgendeiner Stellung zu methylieren.
Schulman et al., Fed. Proc. 44, 931 (1985) beschreiben eine erhöhte Produktion von B-Avermectinen durch Fermentieren von S. avermitilis in Gegenwart von Substanzen, wie Sinefungin, S-Adenosylethionin und S-Adenosylhomocystein, welche das Enzym Avermectin-B-O-Methyltransferase inhibieren, welches die Überführung des Methyls von S-Adenosylmethionin in die C-5-Hydroxy-Gruppe katalysiert. Streptomyces avermitilis-Mutanten, denen die O-Methyltransferase-Aktivität fehlt und die erhöhte Mengen von Avermectin-B-Komponenten bilden, werden ebenfalls offenbart und beschrieben durch Schulman et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29, 620-624 (1986).
S. avermitilis Agly-1, ein Mutantenstamm, der im wesentlichen nur Avermectin-aglycone A1a und A2a erzeugt, wird von Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), 1494-1498 (1985) beschrieben. Ebenfalls berichtet wird die Fermentation von S. avermitilis Agly-1 in Gegenwart von Sinefungin, welches eine erhöhte Produktion von Avermectin-aglycon-B-Komponenten bewirkt. Desgleichen führt S. avermitilis 08, ein in hohem Maße produzierender Stamm für Avermectine, sofern fermentiert in Gegenwart von Sinefungin als Inhibitor von O-Methyltransferasen, zur Produktion von Avermectinen, denen O-Methyl-Gruppen an dem Aglykon bei C-5 und in dem Oleandrosedisaccharid-Rest fehlen.
Schulman et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31, 744-7 (1987) vermutet, daß es, obwohl noch nicht bewiesen, in hohem Maße wahrscheinlich ist, daß S-Adenosylmethionin in die Methylierung des Disaccharid-Restes einbezogen ist, da die Methylierung der 3'- und 3"-Stellungen des Disaccharid-Restes von Avermectinen durch Sinefungin inhibiert ist.
Die natürlichen Avermectine werden, wie vermerkt, als eine komplexe Mischung von acht getrennten, jedoch eng verwandten Verbindungen produziert; Formel (I), R = Isopropyl und (S)-sek.- Butyl. Obwohl sie im wesentlichen in der Vorform gewonnen wurden (vgl. US-Patentschrift 4 429 042), ist die Methodologie im besten Fall mühselig.
Die durch Fermentation erzeugten Avermectine, natürliche und ebenso nicht-natürliche, haben alle Methoxy-Gruppen in den 3'- und 3"-Stellungen des Disaccharid-Restes. Die Produktion von Avermectinen, insbesondere von neuen Avermectinen, welche Substituenten tragen, die sich stark auf ihre Löslichkeit und/oder Polarität, und daher auf ihre physiologischen und biologischen Eigenschaften auswirken, ist ein erwünschtes Ziel. Ein weiteres erwünschtes Ziel ist die Fähigkeit, die erwähnten Avermectine so herzustellen, daß die Anzahl und die Komplexität der Produkte auf ein Minimum herabgesetzt wird und dadurch die Reinheit eines gewählten Avermectins erhöht wird und dadurch die Abtrennungsverfahren vereinfacht werden.
Trotz der Offenbarungen bezüglich der Verwendung von SAE als ein Inhibitor von Avermectin-B-O-Methyltransferase, existiert keine Offenbarung bezüglich ihres Werts als ein Ethylierungsmittel für den Disaccharid-Rest und keine Erwähnung der Bildung von ethylierten Avermectinen in Gegenwart von SAE. Die Verwendung von SAE als ein Avermectin-Ethylierungsmittel war nicht beabsichtigt und nicht beachtet, und die Produktion von ethylierten Avermectinen wurde durch frühere Forscher nicht erkannt.
Es wurde nun gefunden, daß man antiparasitische ethylierte Avermectine durch Fermentieren von S. avermitilis-Stämmen in Gegenwart von S-Adenosylethionin herstellen kann. Die Verbindungen haben die nachfolgende Formel (I)
in welcher die gestrichelte Linie an der 22-23-Stellung eine wahlfreie Doppelbindung bedeutet;
R¹ Hydroxy bedeutet und nur vorhanden ist, wenn die Doppelbindung fehlt;
R² ein Disaccharid-Rest der nachfolgenden Formel
ist, in welcher jeder der Reste R³ und R&sup4; Methyl oder Ethyl bedeutet, unter der Bedingung, daß zumindest einer der Reste R³ und R&sup4; C&sub2;H&sub5; ist;
R&sup5; H oder CH&sub3; bedeutet;
R eine gegebenenfalls α-verzweigte C&sub3;&submin;&sub8;-Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl-Gruppe, eine C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl- oder C&sub5;&submin;&sub8;-Cycloalkenyl-Gruppe ist, wobei eine davon gegebenenfalls durch Methylen oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppen substituiert sein kann; oder ein 3- bis 6gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterocyclischer Ring ist, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und gegebenenfalls durch eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppe oder ein Halogenatom substituiert sein kann; unter der Bedingung, daß, falls R Alkyl ist, dieses nicht Isopropyl oder sek.-Butyl bedeutet.
Die ethylierten Avermectine werden durch Fermentieren von S. avermitilis-Stämmen, denen verzweigtkettige 2-Oxosäure-Dehydrogenase-Aktivität und/oder verzweigtkettige Aminosäure- Transaminase-Aktivität fehlt, in Gegenwart von S-Adenosylethionin (SAE) hergestellt.
S. avermitilis-Stämme, denen verzweigtkettige 2-Oxosäure- Dehydrogenase-Aktivität fehlt, werden durch Mutation von Avermectin produzierenden Stämmen von S. avermitilis, und insbesondere durch Mutation von S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 oder NCIB 12121, hergestellt. Die Mutanten sind unfähig, die natürlichen Avermectine zu synthetisieren, mit der Ausnahme, wo die Fettsäure, oder eine Vorstufe dafür, welche die Isopropyl- oder sek.-Butyl-(S-Form)-Gruppe trägt, zu dem Medium zugesetzt werden, in welchem die Mutanten fermentiert werden. Sie sind fähig, natürliche und nicht-natürliche Avermectine zu produzieren, wenn sie unter wässerigen aeroben Bedingungen in einem Nährmedium fermentiert werden, welches eine geeignete Primer-Säure oder eine in dem Fermentationsverfahren in diese überführbare Verbindung enthält.
Die durch ihren Mangel an verzweigtkettiger 2-Oxosäure-Dehydrogenase-Aktivität gekennzeichneten Mutanten, werden aus den mutierten Kolonien auf der Basis von einem ¹&sup4;CO&sub2;-Assay ausgewählt. In diesem Verfahren zeigt die Abwesenheit von ¹&sup4;CO&sub2;- Entwicklung durch eine permeabilisierte Kolonie aus einem Substrat von [¹&sup4;C-1]-2-Oxoisocapronsäure oder [¹&sup4;C-1]-2-Oxo-3- methylvaleriansäure oder [¹&sup4;C-1]-2-Oxo-3-methylbuttersäure das Fehlen von verzweigtkettiger 2-Oxosäure-Dehydrogenase-Aktivität an.
Die Termini "ethyliertes Avermectin" oder "ethylierte Avermectine", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf Verbindungen mit der obigen Formel (I), worin der 25-Substituent (R) irgendeine Gruppe sein kann, assimilierbar an der erwähnten Stellung durch die hier beschriebenen S. avermitilis- Mutanten, und, in dem Disaccharid-Rest R², zumindest einer der Reste R³ oder R&sup4; Ethyl ist.
Die hier beschriebenen Mutanten sind in hohem Maße für die Herstellung nicht-natürlicher ethylierter Avermectine durch die hierin beschriebenen und erläuterten Verfahren wertvoll. Sie sind insbesondere für die Herstellung der bevorzugten ethylierten Avermectine wertvoll, d.h. von Verbindungen, in welchen der C-25-Substituent ein C&sub4;&submin;&sub6;-Cycloalkyl oder Cycloalkenyl, gegebenenfalls durch eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alky1gruppe substituiert, ist; 1-Methylthioethyl, oder eine 5- oder 6gliedrige Sauerstoff- oder Schwefel-heterocyclische-Gruppe, insbesondere 3-Thienyl oder 3-Furyl.
Die Verbindungen dieser Erfindung werden durch aerobische Fermentation mit einem Stamm von S. avermitilis, vorzugsweise einem solchen, dem verzweigtkettige 2-Oxosäure-Dehydrogenase- Aktivität fehlt, in einem wässerigen Nährmedium, enthaltend eine assimilierbare Quelle von Stickstoff, Kohlenstoff, anorganischen Salzen und einer Primer-Verbindung der Formel RCOOH, oder einer während der Fermentation in die erwähnte Verbindung umwandelbare Verbindung (d.h. einer Vorstufe), hergestellt. Die Säure oder die in diese umwandelbare Verbindung wird zu der Fermentation entweder zum Zeitpunkt der Inokulation oder zu irgendeinem Zeitpunkt während der Fermentation zugesetzt. Sie kann auf einmal oder portionsweise in Intervallen während der Fermentation zugegeben werden. Das S-Adenosylethionin kann auch zum Zeitpunkt der Inokulierung oder zu irgendeinem Zeitpunkt während der Fermentation, entweder auf einmal oder in Portionen in Intervallen während der Fermentation, oder kontinuierlich zugegeben werden. Die Herstellung der Avermectin- Produkte kann durch Entnahme von Proben aus der Fermentation, Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel und Beobachten des Auftretens des Produkts durch Chromatographie, beispielsweise unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie, überwacht werden. Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute an dem Produkt ein Maximum erreicht hat, im allgemeinen während eines Zeitraums im Bereich von 4 bis 15 Tagen.
Eine bevorzugte Höhe von jedem Zusatz der Primer-Verbindungen (Carbonsäure oder eine in eine solche umwandelbare Verbindung) liegt zwischen 0,05 und 3,0 g pro Liter. Die Primer- Verbindung kann kontinuierlich, intermittierend oder auf einmal zu der Fermentation zugesetzt werden. Die Säure (RCOOH) wird als solche oder als ein Salz, wie beispielsweise als das Natrium-, Lithium- oder Ammoniumsalz zugesetzt, oder als eine in die Säure, wie oben definiert, umwandelbare Verbindung. Die Säure wird, wenn sie fest ist, bevorzugterweise in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Wasser oder in C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoholen, gelöst. Das SAE wird in Mengen im Bereich von 0,01 bis 0,10 g/l, und bevorzugterweise in Mengen von 0,03 bis 0,6 g/l, eingesetzt.
Die für die Fermentation verwendeten Mittel können, insbesondere wenn der C-25-Substituent Isopropyl oder (S)-sek.-Butyl sein soll, herkömmliche Mittel sein, welche assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelementen enthalten. Wenn der C-25-Substituent eine nicht-natürliche Gruppe sein soll, d.h. wenn er nicht Isopropyl oder (S)-sek.-Butyl ist, ist das Fermentationsmedium ein solches, in welchem die ausgewählten Bestandteile fehlen, oder nur minimale Mengen von Primer-Verbindungen enthalten sind, worin der R-Rest Isopropyl oder (S)-sek.-Butyl ist.
Nach der Fermentation für einen Zeitraum von mehreren Tagen bei einer Temperatur, vorzugsweise im Bereich von 24º bis 33ºC, wird die Fermentationsbrühe zentrifugiert oder filtriert und der Mycel-Kuchen mit bevorzugterweise Aceton oder Methanol extrahiert. Der Lösungsmittel-Extrakt wird eingeengt und das Produkt dann in ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Ethylacetat, Chloroform, Butanol oder Methylisobutylketon, extrahiert. Der Lösungsmittel- Extrakt wird eingeengt und das Rohprodukt weiter gereinigt, falls notwendig durch Chromatographie, beispielsweise unter Verwendung von präparativer Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
Die der Nutzbarmachung durch das S. avermitilis dieser Erfindung für die Biosynthese von ethylierten Avermectinen (Formel (I)-Verbindungen) fähigen Verbindungen haben die Formel (II-A)
R-COOH (II-A)
einschließlich Verbindungen, umwandelbar in (II-A) während des Fermentationsverfahrens. Die erwähnten Verbindungen werden hierin als "Primer-Verbindungen" bezeichnet. In der Formel (II-A) ist R eine α-verzweigtkettige Gruppe, wobei das Kohlenstoffatom derselben, an welches die -COOH-Gruppe gebunden ist, ebenfalls an zumindest zwei andere Atome oder Gruppen, die nicht Wasserstoff sind, gebunden ist. Diese Definition umfaßt selbstverständlich gesättigte und ungesättigte acyclische und cyclische Gruppen, einschließend diejenigen, welche gegebenenfalls ein Schwefel- oder Sauerstoff-Heteroatom als ein Glied der acyclischen Kette oder des cyclischen Rings tragen.
Noch spezifischer kann der Rest R, welcher der C-25-Substituent wird, eine α-verzweigte C&sub3;&submin;&sub8;-Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxyalkyl- oder Alkylthiogruppe sein; eine C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl- oder C&sub5;&submin;&sub8;-Cycloalkenylgruppe, wobei jede gegebenenfalls durch Methylen oder eine oder mehrere C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppen oder Halogenatome (Fluor, Chlor, Iod oder Brom) substituiert sein kann; oder ein 3- bis 6gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterocyclischer Ring, der gesättigt oder vollständig oder partiell ungesättigt sein kann und der gegebenenfalls durch ein oder mehrere C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein kann; unter der Bedingung, daß, falls R Alkyl ist, es nicht Isopropyl oder sek.-Butyl bedeutet.
Verbindungen, die in dem Fermentationsverfahren zu RCOOH umwandelbar sind, d.h. Vorstufen, sind Verbindungen der Formeln (II-B), in welcher R die gleiche Bedeutung wie oben besitzt:
R-(CH&sub2;)n-Z (II-B)
worin n den Wert 0, 2, 4 oder 6 besitzt; und Z -CH&sub2;OH, -CHO, -CH&sub2;NH&sub2;, -COOR&sup6; oder -CONHR&sup7; ist, wobei R&sup6; H oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl bedeutet; R&sup7; Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl bedeutet oder der Rest einer Aminosäure ist, insbesondere von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Methionin, z.B. -CH(COOH)CH&sub2;COOH, -CH(COOH) (CH&sub2;)&sub2;COOH beziehungsweise -CH(COOH) (CH&sub2;)&sub2;SCH&sub3;.
Ebenfalls eingeschlossen in diese Erfindung sind die isomeren Formen der Verbindungen der Formel (II-A), und der während des Fermentationsverfahrens in diese Verbindungen umwandelbaren Verbindungen, und die isomeren Avermectine bei C-25, herrührend von ihrer Verwendung in dem hier beschriebenen Verfahren.
Der Ursprung der R-Gruppe, d.h. ob sie direkt von R-COOH oder von einer der obigen Vorstufen, oder von irgendeiner beliebigen Vorstufe abgeleitet ist, ist für die Herstellung der ethylierten Avermectine nebensächlich. Die entscheidende Bedingung des erfindungsgemäßen Verfahrens für ihre Herstellung besteht darin, daß die gewünschte R-Gruppe den S. avermitilis- Stämmen dieser Erfindung in dem Fermentationsverfahren verfügbar gemacht wird.
Geeignete Verbindungen schließen die nachfolgend aufgeführten ein:
2,3-Dimethylbuttersäure,
2-Methylhexansäure,
2-Methylpent-4-ensäure,
2-Cyclopropylpropionsäure,
4,4-Difluorcyclohexancarbonsäure.Lithiumsalz,
4-Methylencyclohexancarbonsäure,
3-Methylcyclohexancarbonsäure (cis/trans),
1-Cyclopentencarbonsäure,
1-Cyclohexencarbonsäure,
Tetrahydropyran-4-carbonsäure,
Thiophen-2-carbonsäure,
3-Furansäure,
2-Chlorthiophen-4-carbonsäure,
Cyclobutancarbonsäure,
Cyclopentancarbonsäure,
Cyclohexancarbonsäure,
Cycloheptancarbonsäure,
2-Methylcyclopropancarbonsäure,
3-Cyclohexen-1-carbonsäure,
2-Methylthiopropionsäure,
2-Methyl-4-methoxybuttersäure,
Thiophen-3-carbonsäure,
Hydroxymethylcyclopentan,
3-Thiophencarboxaldehyd,
3-Cyclohexylpropionsäure,
3-Cyclopentylpropionsäure,
Hydroxymethylcyclobutan,
Tetrahydrothiophen-3-carbonsäure,
3-Cyclopentyl-1-propanol,
3-Methylcyclobutancarbonsäure.Lithiumsalz,
3-Fluorcyclobutancarbonsäure,
3-Methylencyclobutancarbonsäure.Lithiumsalz,
2-Methyl-4-methylthiobuttersäure,
Tetrahydrothiopyran-4-carbonsäure,
Cyclobutylmethylamin,
Ethylcyclobutancarboxylat,
4-Hydroxymethylcyclopenten,
2-(3-Thiophencarbonyl)-propionsäureethylester,
S-2-Methylpentansäure,
R-2-Methylpentansäure.
Die für die Herstellung der Verbindungen der Formel (I) besonders brauchbaren S. avermitilis-Mutanten werden durch Mutation eines Avermectin-produzierenden Mitglieds der Spezies Streptomyces avermitilis gemäß dem bekannten Verfahren unter Verwendung einer Vielzahl von mutierenden Faktoren erhalten, einschließend Ultraviolett-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat, salpetrige Säure und Stickstoffsenfgas, z.B. N-Methyl-bis(2-chlorethyl)amin, oder ähnliche Behandlungen. Die Mutagenese kann an Sporen oder an einer vegetativen Kultur von S. avermitilis, fähig der Erzeugung von natürlichen Avermectinen, z.B. S. avermitilis ATCC 31272, durchgeführt werden.
Gemäß Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiete bekannt sind, werden mutagenisierte Kolonien auf der Basis einer biochemischen Assay-Methode ausgewählt, welche das Screening von großen Zahlen von statistisch mutagenisierten Bakterienkolonien für die ¹&sup4;CO&sub2;-Produktion aus [¹&sup4;C-1]-2-Oxosäuren (Tabor et al., J. Bact. 128, 485-486, 1976), erlaubt.
Die Methodologie umfaßt das Züchten der Mutant-Kolonien in den Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte auf einem geeigneten Nährmedium, Permeabilisieren der Zellen mit Toluol, gefolgt von Zugabe der [¹&sup4;C-1]-2-Oxosäure (z.B. 2-Oxo-isocapronsäure) zu jeder Vertiefung und Prüfung der Atmosphäre oberhalb der Fermentation auf ¹&sup4;CO&sub2;. Wahlweise kann [¹&sup4;C-1]-2-Oxo-3-methylvaleriansäure oder [¹&sup4;C-1]-2-Oxo-3-methylbuttersäure anstelle von [¹&sup4;C-1]-2-Oxo-isocapronsäure verwendet werden. Die Produktion von ¹&sup4;CO&sub2; wird geeigneterweise überprüft, indem man feuchtes Ba(OH)&sub2;-gesättigtes Filterpapier oberhalb der einzelnen Vertiefungen placiert, um irgendwelches freigesetztes ¹&sup4;CO&sub2; aufzufangen und Ba¹&sup4;CO&sub3;, falls vorhanden, durch Autoradiographie zu erfassen. Die Mutanten, welchen verzweigtkettige 2-Oxosäure-Dehydrogenase-Aktivität fehlt, liefern Autoradiogramme, annähernd denjenigen von blanken nichtgeimpften Kontrollen; d.h., durch die Mutanten wird kein zusätzliches Ba¹&sup4;CO&sub3; produziert.
Die morphologischen und Kultureigenschaften der hier beschriebenen Mutanten sind ganz allgemein wie in der US-Patentschrift 4 429 042 beschrieben. Die kennzeichnende Eigenschaft der Mutanten dieser Erfindung ist deren Mangel an verzweigtkettiger 2-Oxosäure-Dehydrogenase-Aktivität, welche Eigenschaft, wie hierin beschrieben, bestimmt wird. Der Mangel der erwähnten Aktivität resultiert in dem Versagen der Mutanten zur Herstellung der natürlichen Avermectine, wenn sie auf einem definierten Medium, im wesentlichen frei von Fettsäuren RCOOH, worin R Isopropyl oder (S)-sek.-Butyl ist, oder Verbindungen, die während der Fermentation zu RCOOH umwandelbar sind, gezüchtet werden. Eine von der American Type Culture Collection durchgeführte taxonomische Untersuchung bestätigte, daß die Eigenschaften der zwei Mutantenstämme I-3 und HL-026, ausgewählt durch das obige ¹&sup4;CO&sub2;-Assay, eine enge Verwandtschaft zu denjenigen des ursprünglichen ATCC 31272-Stamms, beschrieben in der US-Patentschrift 4 429 042, aufweisen, jedoch mit bestimmten Ausnahmen. Daher bildet der Mutantenstamm 1-3 (ATCC 53567) signifikant weniger Sporenketten als ATCC 31272, und der Mutantenstamm HL-026 (ATCC 53568) ist praktisch frei von luftigen Mycelien und Sporen, jedoch sind die sehr wenigen Sporenketten, die er produziert, von ähnlichem Charakter wie diejenigen von ATCC 31272. Auch der Mutant HL-026 weist eine zweifelhafte Kapazität zur Verwertung von Raffinose als einzige Kohlenstoffquelle auf, wohingegen der ursprüngliche Stamm und der Mutant I-3-Stamm fähig sind, Raffinose zu verwenden. (Gemäß Versuchen der Anmelderin scheint Raffinose das Wachstum von irgendeinem dieser Stämme nicht zu unterstützen.) Eine weitere Eigenschaft des Mutantenstamms HL-026 war, daß er weniger Melaninpigment als die anderen zwei Stämme produzierte und besonders auf Tyrosin-Agar überhaupt keines. Schließlich war die Anmelderin der vorliegenden Anmeldung im Gegensatz zu der für ATCC 31272 in der US-Patentschrift 4 429 042 gegebenen Beschreibung nicht in der Lage, Wachstum der Mutanten oder von ATCC 31272 mit Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle zu entdecken.
Streptomyces avermitilis I-3 und HL-026 wurden gemäß den Richtlinien des Vertrags von Budapest in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, eine anerkannte Verwahrungsstelle, welche die Dauer der Hinterlegung und die sofortige Zugänglichkeit durch die Öffentlichkeit gewährleistet, wenn ein Patent für diese Anmeldung erteilt wird, hinterlegt. Sie erhielten die Bezeichnung Streptomyces avermitilis ATCC 53567 beziehungsweise ATCC 53568. Die hinterlegten Stämme sind während der Laufzeit dieser Anmeldung für jemanden, der durch den Commissioner of the United States Patent and Trademark Office gemäß 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 als berechtigt erklärt wird, und in Übereinstimmung mit den ausländischen Patentgesetzen in Ländern, in welchen Kopien dieser Anmeldung, oder ihrer Vorläufer, eingereicht wurden, verfügbar. Alle Beschränkungen der Verfügbarkeit für die Allgemeinheit der hinter legten Mikroorganismen werden unwiderruflich nach Erteilung des Patents beseitigt.
Nachdem die Mutanten dieser Erfindung in einem Nährmedium, enthaltend die geeignete Primer-Verbindung und SAE, fermentiert wurden, produzieren sie eine Verbindung der Formel (I), oder, wie es noch üblicher der Fall ist, eine Mischung von zwei oder mehreren Verbindungen der Formel (I), in welcher R der verwendeten Primer-Verbindung entspricht. Es können bis zu zwölf Produkte, herkömmlich und gewöhnlich als R-Avermectin Al, A2, B1 und B2 gemäß den in der US-Patentschrift 4 429 042 verwendeten Bezeichnungen hergestellt werden. Die "R"-Gruppe bezieht sich selbstverständlich auf den C-25-Substituenten. Wenn beispielsweise R Cyclopentyl ist, sind die möglichen Avermectine zwei monoethylierte Disaccharid-Derivate und ein diethyliertes Disaccharid-Derivat von jedem der nachstehend aufgeführten vier Cyclopentyl-avermectinen: Trivialname Cyclopentyl-avermectin Doppelbindung Hydroxy
In den nicht-natürlichen Avermectinen ist der C-25-Substituent "R" der Formel (I) ein anderer als Isopropyl oder (S)-sek.-Butyl.
Die Verbindungen der Formel (I), worin die Doppelbindung vorhanden ist und OH fehlt, können andererseits aus der entsprechenden Verbindung der Formel (I) hergestellt werden, worin R¹ OH bedeutet und die Doppelbindung durch eine Dehydratisierungsreaktion fehlt. Die Reaktion wird durchgeführt, indem man zuerst die Hydroxy-Gruppen selektiv an den 5- und 4"-Stellungen schützt, z.B. als das tert.-Butyldimethylsilyloxyacetyl-Derivat, anschließend mit einem substituierten Thiocarbonylhalogenid, wie (4-Methylphenoxy)-thiocarbonylchlorid, umsetzt, gefolgt von Erhitzen in einem Lösungsmittel mit hohem Siedepunkt, z.B. Trichlorbenzol, um die Dehydratisierung zu bewirken. Das Produkt liefert schließlich nach Entfernung der Schutzgruppen die ungesättigte Verbindung. Diese Stufen, zusammen mit geeigneten Reagentien und Reaktionsbedingungen, sind in der US-Patentschrift 4 328 335 beschrieben.
Die Verbindungen der Formel (I), worin R&sup5; H ist, können auch aus den entsprechenden Verbindungen, in denen R&sup5; CH&sub3; bedeutet, durch Demethylierung hergestellt werden. Diese Reaktion wird durch Behandeln der 5-Methoxy-Verbindung, oder eines geeignet geschützten Derivats davon, mit Quecksilber(II)-acetat und Hydrolysieren des erhaltenen 3-Acetoxyenolethers mit verdünnter Säure unter Bildung der 5-Keto-Verbindung, bewirkt. Diese wird dann unter Verwendung von beispielsweise Natriumborhydrid reduziert und liefert das 5-Hydroxy-Derivat. Geeignete Reagentien und Reaktionsbedingungen für diese Stufen werden in der US-Patentschrift 4 423 209 beschrieben.
Die Verbindungen der Formel (I), in denen R¹ H bedeutet und die Doppelbindung fehlt, können aus der entsprechenden Verbindung, in welcher die Doppelbindung vorhanden ist und R¹ fehlt, durch selektive katalytische Hydrierung unter Verwendung eines geeigneten Katalysators hergestellt werden. Beispielsweise kann die Reduktion unter Verwendung von Tris(triphenylphosphin)rhodium(I)-chlorid durchgeführt werden, wie dies in der Europäischen Patentanmeldung No. 0001689 beschrieben ist.
Die Verbindungen der Erfindung sind hochaktive antiparasitische Mittel, die eine besondere Brauchbarkeit als Anthelmintika, Ectoparasiticide, Insecticide und Akaricide aufweisen.
So sind die Verbindungen bei der Behandlung einer Vielzahl von durch Endoparasiten verursachten Zuständen wirksam, einschließend, insbesondere Helminthiasis, die am häufigsten durch eine Gruppe von parasitischen Würmern hervorgerufen wird, die als Nematoden beschrieben sind und schwere ökonomische Verluste bei Schweinen, Schafen, Pferden und Rindvieh verursachen können, als auch auf Haustiere und Geflügel schädlich wirken können. Die Verbindungen sind auch gegen andere Nematoden wirksam, welche verschiedene Spezies von Tieren befallen, einschließend zum Beispiel Dirofilaria bei Hunden und verschiedene Parasiten, die Menschen infizieren können, einschließend gastro-intestinale Parasiten, wie Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius und Parasiten, die im Blut oder anderen Geweben und Organen gefunden werden, wie Fadenwürmer und die extra-intestinalen Stufen von Strongyloides und Trichinella.
Die Verbindungen sind auch von Wert zur Behandlung von Ectoparasit-Infektionen, einschließend insbesondere Gliederfüßler- Ectoparasiten von Tieren und Vögeln, wie Zecken, Milben, Läuse, Flöhe, Schmeißfliegen, stechende Insekten und wandernde Zweiflüglerlarven, die Rindvieh und Pferde befallen können.
Die Verbindungen sind auch Insecticide, aktiv gegen Hausschädlinge, wie Kakerlaken, Kleidermotten, Teppichkäfer und die Hausfliege, als auch brauchbar gegen Insektenschädlinge von gelagertem Korn und von landwirtschaftlichen Pflanzen, wie Spinnenmilben, Blattläuse, Raupen und gegen wandernde Geradflügler, wie Heuschrecken.
Die Verbindungen der Formel (I) werden als geeignete Formulierung für die vorgesehene spezifische Verwendung und für die besondere Spezies des zu behandelnden Wirtstiers und des infrage kommenden Parasiten oder Insekts verabreicht. Für die Verwendung als Anthelmintikum können die Verbindungen oral in Form einer Kapsel, eines Bolus, einer Tablette oder eines flüssigen Trunks, oder andererseits durch Injektion oder als ein Implantat, verabreicht werden. Derartige Formulierungen werden in einer herkömmlichen Weise gemäß der Standard-Veterinärpraxis hergestellt. So können Kapseln, Bolusse oder Tabletten durch Mischen des aktiven Bestandteils mit einem geeigneten feinzerteilten Verdünnungsmittel oder Träger, zusätzlich enthaltend ein zerfallförderndes Mittel und/oder Bindemittel, wie Stärke, Lactose, Talkum, Magnesiumstearat, etc., hergestellt werden. Eine Trunk-Formulierung kann durch Dispergieren des aktiven Bestandteils in einer wässerigen Lösung zusammen mit Dispergier- oder Netzmitteln, etc., zubereitet sein und injizierbare Formulierungen können in Form einer sterilen Lösung hergestellt sein, die andere Substanzen enthalten kann, beispielsweise genug Salze oder Glucose, um die Lösung isotonisch mit Blut zu machen. Diese Formulierungen werden mit Rücksicht auf das Gewicht der aktiven Verbindung in Abhängigkeit der Spezies des zu behandelnden Wirtstieres, der Schwere und des Typs der Infektion und des Körpergewichts des Wirts variieren. Gewöhnlich wird für eine orale Verabreichung eine Dosis von etwa 0,001 bis 10 mg pro kg Körpergewicht des Tieres, gegeben, als Einzeldosis oder in getrennten Dosen während eines Zeitraums von 1 bis 5 Tagen, zufriedenstellend sein, jedoch können selbstverständlich Fälle auftreten, wo höhere oder niedrigere Dosisbereiche indiziert sind und so innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegen.
Als eine Alternative können die Verbindungen mit dem Tierfuttermittel verabreicht werden und für diesen Zweck kann ein konzentrierter Futterzusatz oder eine Vormischung zum Mischen mit dem normalen Tierfutter hergestellt werden.
Für die Verwendung als ein Insecticid und zur Behandlung von landwirtschaftlichen Schädlingen werden die Verbindungen als Sprays, Stäube, Emulsionen, und dergleichen, gemäß der herkömmlichen landwirtschaftlichen Praxis, angewandt.

Herstellung von S. avermitilis I-3 (ATCC 53567)

Stufe 1.

S. avermitilis ATCC 31272 wurde als zusammenfließender Rasen auf New Patch Agar Medium für 12 Tage bei 30ºC gezüchtet. Das Medium enthielt:
V-8-Saft* ... 200 ml
CaCO&sub3; ... 3 g
Agar ... 15 g
H&sub2;O ... ad 1000 ml
Nährbouillon ... 1,0 g/l
Natriumacetat.3H&sub2;O ... 1,4 g/l
Isovaleriansäure ... 50 mg/l
Isobuttersäure ... 50 mg/l
Methylbuttersäure ... 50 mg/l
Isoleucin ... 250 mg/l
Leucin ... 250 mg/l
Valin ... 250 mg/l
Spurenelemente-Lösung** ... 1 ml/l
* Eine Mischung von 8 Pflanzensäften (Tomaten, Karotten, Selerie, Rüben, Petersilie, Lattich, Brunnenkresse und Spinat) plus Salz, Ascorbin- und Citronensäure und natürliche Geschmackstoffe. Verfügbar durch Campbell Soup Company, Camden, NJ.
** Zusammensetzung der Spurenelemente-Lösung:
FeCl&sub3;.6H&sub2;O ... 2,7 g
MnSO&sub4;.H&sub2;O ... 4,2 g
CuSO&sub4;.5H&sub2;O ... 0,5 g
CaCl&sub2; ... 11,0 g
H&sub3;BO&sub3; ... 0,62 g
CoCl&sub2;.6H&sub2;O ... 0,24 g
ZnCl&sub2; ... 0,68 g
Na&sub2;MoO&sub4; ... 0,24 g
Man löst die vorstehenden Verbindungen in 1 Liter 0,1n-HCl.
Die Sporen wurden von 3 solchen Platten geerntet und in 20 ml 0,05M-Tris-Maleinsäure-Puffer, pH 9,0, suspendiert.

Stufe 2.

10 ml der Sporensuspension wurde in ein Fläschchen, enthaltend 10 mg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), eingefüllt. Das Fläschchen wurde inkubiert und bei 28ºC 60 Minuten lang geschüttelt und die Sporen dann reichlich mit 1%iger NaCl-Lösung gewaschen.

Stufe 3.

Die gewaschenen Stufen wurden in 1 % NaCl suspendiert und mit einem gleichen Volumen von 80%igem Ethylenglykol gemischt. Diese Suspension wurde bei -20ºC konserviert und als Quelle von Zellen zur Überprüfung auf Mutanten verwendet. Sie gaben angenähert 10&sup4; Kolonien/ml, wenn sie zum Keimen gebracht worden waren.
Dieses Sporenmaterial wurde auf YPD-Platten zur Erzielung von angenähert 100 Kolonien pro Platte verteilt (YPD-Medium enthält 10 g/l von jeweils Hefeextrakt, Bacto peptone* und Dextrose; und 15 g/l Bacto agar*, eingestellt auf pH 6,9, vor der Autoklavbehandlung). Die mit einem Sternchen versehenen Bestandteile sind von Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238 erhältlich.

Stufe 4.

Einzelne Kolonien wurden nach 2-3 Wochen Wachstum bei 28ºC von den Platten gesammelt und in einzelne Vertiefungen einer Standard 96-Vertiefung-Mikrotiterplatte placiert. Ebenso wurde auch eine kleine Menge der Kolonie auf ein frisches Agarmedium eingerieben, um als eine Quelle von lebensfähigen Zellen zu dienen, wenn die Mutanten identifiziert sind.

Stufe 5.

Zu jeder Vertiefung wurden angenähert 75 Mikroliter eines flüssigen M9-Salzmediums, enthaltend 1 % Glucose, 0,1 % Casaminosäuren und 0,01 % von jeweils Isovalerian-, Isobutter- und 2-Methylbuttersäure, zugegeben. Nach mehreren Tagen der Inkubation bei 28ºC wurden die Zellen auf die Anwesenheit von verzweigtkettiger 2-Oxosäure-Dehydrogenase untersucht. (Jeder Liter des M9-Salzmediums enthielt 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl und 1 g NH&sub4;Cl. Das Medium wurde im Autoklaven behandelt und anschließend 1 ml von jeweils sterilisiertem 1M MgSO&sub4; und 0,1M CaCl&sub2; aseptisch zugesetzt.)

Stufe 6.

Eine Mikrosuspension von 5 % Toluol in M9-Salzmedium wurde durch eine kurze Sonikation der nichtmischbaren Mischung hergestellt. Zu 25 ml dieser Suspension wurden 1,2 ml einer Lösung, enthaltend [¹&sup4;C-1]-2-Oxo-isocapronsäure, 2,5 Mikrocurie/ml und 10,0 Mikrocurie/Mikromol, zugegeben. 50 Mikroliter dieser Gesamtmischung wurden zu jeder der Vertiefungen der Mikrotiterplatten, welche die zu untersuchenden Kolonien enthielten, zugesetzt.

Stufe 7.

Das von jeder Vertiefung gebildete ¹&sup4;CO&sub2; wurde aufgefangen und sichtbar gemacht nach dem von Tabor et al., J. Bacteriol. 128, 485-486 (1976) beschriebenen Verfahren, betitelt "Convenient Method for Detecting ¹&sup4;CO&sub2; in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants". Mutanten, denen aktive verzweigtkettige 2-Oxosäure-Dehydrogenase fehlt, produzieren kein Ba¹&sup4;CO&sub3; über das für die Kontrollen Beobachtete hinaus.
Eine verfeinertere Methode, welche den Gegensatz zwischen einem positiven Assay für ¹&sup4;CO&sub2;, angezeigt durch einen dunklen Fleck auf dem Autoradiogramm als Ergebnis der Ba¹&sup4;CO&sub3;-Bildung, und einem negativen Assay, angezeigt durch keinen Fleck oder einen sehr schwachen Fleck, verbessert, umfaßt das folgende modifizierte Screen.
Einzelne Kolonien (vgl. Stufe 4 oben) wurden nach 7 bis 14 Tagen des Wachstums von dem Agarmedium gesammelt (eher als 2 bis 3 Wochen und direkt durch die obigen Stufen 6 und 7 untersucht). Die Stufe 5 des obigen Verfahrens wurde weggelassen.
Eine noch mehr verbesserte Assay-Methode, die bezüglich der ¹&sup4;CO&sub2;-Freigabe ihrer Natur nach quantitativ ist, umfaßt das Wachstum der Mutanten, ermittelt durch die obigen Screens auf einem geeigneten Medium, enthaltend M9-Salzmedium mit Glucose, 1 % und "Syncasa-bcaa", 0,1 % (einer synthetischen Mischung von L-Aminosäuren mit der annähernden Zusammensetzung von kommerziellen Casaminosäuren, jedoch ohne die Anwesenheit von L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin, vgl. unten).
Nach dem Wachstum auf hohe Zelldichte wurden die Zellen in M9-Salzmedium gewaschen und resuspendiert in kaltem M9-Salzmedium, enthaltend 1 % Toluol, das zur Bildung einer milchigen weißen Dispersion des Toluols schallbehandelt worden war. Die Zellen/Puffer/Toluol-Suspension wurde 40 Minuten lang bei 30ºC inkubiert, um die Zellen zu permeabilisieren. Die permeabilisierten Zellen wurden dann in M9-Mediumsalzen gewaschen und schließlich in einem Fünftel des ursprünglichen Volumens von M9-Mediumpuffer resuspendiert. 180 Mikroliter dieser Suspension wurden pro Assay verwendet.
Eine Reaktionsvolumen von 300 Mikroliter enthielt die mit Toluol behandelten Zellen, Thiaminpyrophosphat (TPP), 0,4 mM; Coenzym A (CoA), 0,11 mM; Nicotinamidadenindinucleotid (NAD), 0,68 mM, Dithiothreitol (DTT), 2,6 mM; MgCl&sub2;, 4,1 mM; Tris-HCl, 60 mM; Tris-HCl, 60 mM, pH 7,5; und [¹&sup4;C-1]-2-Oxo-isocaproat, 6000 cpm, Mikrocurie pro Mikromol. Die Zählwirksamkeit betrug 73 %. Die Reaktion wurde in 15 ml Scintillation-Fläschchen durchgeführt, enthaltend ein 2 x 2 cm Whatman #4-Papierviereck, flachgepreßt in der Schraubverschlußkappe des Fläschchens. Das Papier enthält 30 Mikroliter 1M Hyaminhydroxid (1M-Lösung von Methylbenzethoniumhydroxid in Methanol; erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), welches in der Reaktion entwickeltes ¹&sup4;CO&sub2; auffängt. Nach einer Inkubation von 2 Stunden wurden die Papiere in 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC (Flüssig-Scintillationszähler), verfügbar von New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118) eingetaucht und die Radioaktivität in einem Flüssig-Scintillationszähler nach Herstellung des Gleichgewichts in diesem Lösungsmittel für 4 Stunden oder länger gemessen. Eine Blind-Kontrollreaktion (d. h. - keine Zellen) ergab ca. 50 bis 300 cpm.
Der Mutant I-3 und andere ähnlich diesem gaben Zählimpulse, die kleiner waren als oder gleich der Blind-Kontrollreaktion, wohingegen der ursprüngliche Stamm Zählimpulse lieferte, die mehrfach höher waren als der Blind-Kontrollwert.

Isolierung des HL-026-Derivats (ATCC 53568) von S. avermitilis I-3 (ATCC 53567)

S. avermitilis I-3 (ATCC 53567) wurde auf Agarnährplatten ausgestrichen. Es trat eine relativ hohe Häufigkeit von spontanen Varianten auf, von denen einigen das aerile Mycel nach 4 Tagen Inkubation bei 30ºC fehlte. Mehrere derartiger Varianten wurden isoliert und auf ihre Fähigkeit untersucht, nichtnatürliche Avermectine zu produzieren, wenn sie in AP-5-Medium, zu welchem Cyclopentancarbonsäure zugesetzt worden war, fermentiert wurden. Aus den isolierten Verbindungen, von denen viele nicht-natürliche Avermectine, frei von natürlichen Avermectinen, gebildet hatten, wurde ein Stamm, der höhere Titer der Avermectine in Flaschenversuchen als sein ursprünglicher Stamm S. avermitilis I-3 (ATCC 53567) lieferte, mit der Identifikationsnummer HL-026 (ATCC 53568) bezeichnet. Zusammensetzung von "Syncasa - bccaa", 100fach-Konzentrat Gramm/Liter L-Alanin L-Arginin L-Asparaginsäure L-Cystin L-Glutaminsäure Glycin L-Histidin L-Lysin L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tyrosin L-Tryptophan
Die Mischung wurde auf pH 7 eingestellt und filtersterilisiert. Ein Volumen Konzentrat wurde zu 99 Volumina des Mediums zugesetzt, um standardübliche Konzentrationen zu erhalten.
Die Zusammensetzungen der nachfolgend verwendeten Media sind nachstehend wiedergegeben. AS-7-Medium Gramm/Liter Verdünnte Stärkea) Ardamine pHb) Pharmamediac)
a) Hergestellt durch Hydrolyse von Stärke durch α-Amylase von Bacillus licheniformis (verfügbar von Novo Enzymes, Wilton, CT und im Handel unter der Handelsmarke "Termamyl" zu einem Dextrose-Äquivalent von 40 % ± 5 %.
b) Von Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012
c) Von Traders Protein., Memphis, TN 38108
Einstellen des pH-Wertes auf 7,2 mit NaOH. AP-5-Medium
Gramm/Liter Verdünnte Stärke Ardamine pH P-2000 (Antischaum)a)
a) Von The Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640 Einstellen des pH-Wertes auf 6,9 mit 25 % NaOH.

Allgemeine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Probeentnahme-Verfahren

Mobile Phase:

150 ml Wasser
70 ml Acetonitril
Auffüllen auf 1 Liter mit Methanol

Säule:

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100)
Durchfluß: 0,75 ml/Minute
Nachweis : UV bei 240 nm
Dämpfung : Nahe 4

Probenverdünnungsmittel (D):

35 ml Acetonitril plus 390 ml Methanol

Proben:

1. Nimm 4 ml gut geschüttelte Kulturlösung, nach unten schleudern.
2. Entferne so viel überstehende Flüssigkeit wie möglich, ohne die Pellets zu stören.
3. Füge 4 ml Verdünnungsmittel zu den Pellets und verwirble die Mischung zur Dispergierung.
4. Schleudere nach unten und sammle die überstehende Flüssigkeit.
5. Filtriere die überstehende Flüssigkeit und führe die HPLC durch.

Beispiel 1

Ethylierte Cyclopentyl-avermectine

Eine Gefrierflasche von S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) wurde zur Inokulierung von 100 ml AS-7-Medium in einem unterteilten Kolben von 500 ml Inhalt verwendet, der unter Schütteln während 24 bis 28 Stunden bei 28º bis 30ºC inkubiert wurde. Anschließend wurde 1 ml dieser Kultur zur Inokulierung eines 300 ml-Kolbens, enthaltend 40 ml AP-5-Medium (weniger NaCl, jedoch plus 0,6 g/l Glutaminsäure), verwendet. Nach einer Inkubation von angenähert 96 Stunden bei 28º bis 30ºC unter Schütteln wurden 0,4 g/l Cyclopentancarbonsäure (Natriumsalz) und 0,03 g/l SAE zugesetzt. HPLC-Chromatographie einer 312-Stunden-Probe zeigte die Anwesenheit von ethylierten Cyclopentyl-avermectinen B2, A2 und B1, mit den folgenden Retentionszeit-Verhältnissen bezüglich zu deren entsprechenden Cyclopentyl-avermectinen:
Monoethyl ... CP-B2/CP-B2 = 1,10
Diethyl ... CP-B2/CP-B2 = 1,23
Monoethyl ... CP-A2/CP-A2 = 1,10
Diethyl ... CP-A2/CP-A2 = 1,26
Monoethyl ... CP-B1/CP-B1 = 1,10
Diethyl ... CP-B1/CP-B1 = 1,24
CP = Cyclopentyl

Beispiel 2

Ethylierte Cyclohexyl-avermectine

Eine Gefrierflasche von S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) wurde zur Inokulierung von 100 ml AS-7-Medium in einem unterteilten Kolben von 500 ml Inhalt verwendet, der unter Schütteln während 24 bis 28 Stunden bei 28º bis 30ºC inkubiert wurde. Anschließend wurde 1 ml dieser Kultur zur Inokulierung eines 300 ml-Kolbens, enthaltend 40 ml AP-5-Medium (weniger NaCl, jedoch plus 0,6 g/l Glutaminsäure), verwendet. Nach einer Inkubation von angenähert 96 Stunden bei 28º bis 30ºC unter Schütteln wurden 0,2 g/l Cyclohexancarbonsäure (Natriumsalz) und 0,03 g/l SAE zugesetzt. Weitere 0,03 g/l SAE wurden bei etwa 168 Stunden zugesetzt. HPLC-Chromatographie einer 312-Stunden-Probe zeigte die Anwesenheit von ethylierten Cyclohexyl-avermectinen B2, A2 und B1, mit den folgenden Retentionszeit-Verhältnissen bezüglich zu deren entsprechenden Cyclohexyl-avermectinen:
Monoethyl ... CH-B2/CH-B2 = 1,11
Diethyl ... CH-B2/CH-B2 = 1,25
Monoethyl ... CH-A2/CH-A2 = 1,11
Monoethyl ... CH-A2/CH-A2 = 1,13
Diethyl ... CH-B1/CH-B1 = 1,25
CH = Cyclohexyl

Claims

1. Verbindung der nachstehenden Formel

in welcher die gestrichelte Linie an der 22-23-Stellung eine wahlfreie Doppelbindung bedeutet;

R¹ OH bedeutet und die Doppelbindung fehlt, oder die Doppelbindung vorhanden ist und R¹ fehlt;

R² ein Disaccharid-Rest der nachfolgenden Formel

ist, in welcher jeder der Reste R³ und R&sup4; CH³ oder C&sub2;H&sub5; bedeutet, unter der Bedingung, daß zumindest einer der Reste R³ und R&sup4; C&sub2;H&sub5; ist;

R&sup5; H oder CH&sub3; bedeutet; und

R eine gegebenenfalls α-verzweigte C&sub3;&submin;&sub8;-Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxyalkyl- oder Alkylthioalkyl-Gruppe, eine C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl- oder C&sub5;&submin;&sub8;-Cycloalkenyl-Gruppe ist, wobei jede davon gegebenenfalls durch Methylen oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppen substituiert sein kann; oder ein 3- bis 6gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterocyclischer Ring ist, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und gegebenenfalls durch eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-Gruppe oder ein Halogenatom substituiert sein kann; unter der Bedingung, daß, falls R Alkyl ist, dieses nicht Isopropyl oder sek.-Butyl bedeutet.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Alkyl ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Cycloalkyl ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R ein 3- bis 6gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterocyclischer Ring ist.

5. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R Cyclohexyl ist, R¹ fehlt und R&sup5; H bedeutet.

6. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R Cyclopentyl, R¹ OH und R&sup5; H ist.

7. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R 3-Thienyl ist und R¹ fehlt.

8. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R 3-Furyl und R¹ OH ist.

9. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Reste R³ und R&sup4; des Disaccharid-Restes R² Ethyl ist.

10. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Reste R³ und R&sup4; des Disaccharid-Restes R² Ethyl ist.

11. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R 3-Thienyl ist und in dem Disaccharid-Rest R³ Ethyl und R&sup4; Ethyl ist und R&sup5; H bedeutet.

12. Verbindung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß R 3-Furyl ist, R&sup5; H bedeutet und jeder der Reste R und R&sup4; in dem Disaccharid-Rest Ethyl ist.

13. Zusammensetzung für die Behandlung und Verhütung von parasitischen Infektionen bei Menschen und Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung nach Anspruch 1, zusammen mit einem inerten Verdünnungsmittel oder Träger, enthält.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form eines flüssigen Tranks oder einer oralen oder injizierbaren Formulierung hat.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Form eines Tierfuttermittels oder einer Vormischung oder einer Ergänzung für den Zusatz zum Tierfutter hat.