PT88952B - Processo para a preparacao de avermectinas etiladas - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
Resumo presente invento diz respeito «
a um processo para a preparação de avermectinas, em que uma ou ambas as posições 3’ e 3” da fracção dissacarxdica oleandrose está substituida por um grupo etoxi, de preferência a um grupo metoxi. Estes compostos são uteis como agentes antiparasiticos e apresentam a fórmula (l):
PFIZER INC.
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE AVERMECTINAS ETILADAS em que a linha quebrada representa uma dupla ligação facul tativa; R é 03 ou está ausente; R á uma porção dissacarídica da fórmula
exemplo, alquilo 0^-0θ.
processo consiste, por exemplo, em se fazer a fermentação aeróbica, na presebça de
S-adenosiletionina, com uma estirpe Streptomyces avermetili sem actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada, num meio nutriente adequado.
presente invento diz respeito a um processo para a preparação de avermectinas naturais e não naturais, em que uma ou ambas as posições 3’ e 3” da fracção dissacarídica oleandrose está substituída por um grupo etoxi, de preferência a um grupo metoxi. Estes compostos sao uteis como agentes antiparasiticos.
As Patentes dos E.U.A. 4.310.519 e 4.429.042 descrevem as avermectinas, um complexo de agentes afins tendo uma potente actividade antiparasitica e a sua produção por fermentação aeróbica, de estirpes de Streptomyces avermitj lis; nomeadamente S.. avermitj lis ATCC Nos. 31267, 31271 e 31272. As duas últimas estirpes citadas representam um frasco gelado e um tubo liofilizadop. respectivamente de uma cultura obtida por irradiação de ultravioletas de S. avermitjlis ATCC 31267.
A EP 214,731, publicada em 18 de Março de 1987, contraparte do Pedido de Patente dos
E.U.A. No, de Serie 886.867, depositada em 16 de Julho de 1986, revela uma série de compostos (a que se faz referência como avermectinas não naturais) relacionados com as avermectinas naturais ou conhecidas, mas tendo um novo grupo substituinte na posição 25, e um processo para a sua preparação por fermentação de um organismo produtor de avermectina, na presença de determinados ácidos carboxilicos específicos, ou seus derivados ou precursores. Os organismos £>. avermitj lis utilizados para produzir as referida novas avermectinas C-25 substituídas são £. avermitjlis ATCC 31267, 31271, 31272 e NCIB 12121. 0 último organismo descrito em EP 214.731, θ derivado de S.» avermitj lis ATCC 3I27I. Ele dá melhores rendimentos das novas avermectinas C-25 substituídas, quando a sua cultura se faz num meio semi-definido. Todos os ATCC 31267, 31271, 31272 e NCIB 12121 podem também £>roduzir, para além do novo derivado
C-25 substituído, quantidades variadas das avermectinas conhecidas, ou naturais, em que o substituinte 25 © isopropilo ou (s)-sec-butil (1-metilpropilo).
Pedido de Patente dos E.U., Série No.6512, depositado em 23 de Janeiro 1987» revela mutantes S. avermitilis ATCC 53567 © 53568, cada um dos quais sem actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada e a sua utilização para produzir avermectinas não naturais. Também se revela a utilização de inibidores de O-metiltransferase, tais como sinefungina, S-adenosiletionina e S-adenosil-homo-cistina em fermentações dos referidos organismos para produzir maiores quantidades de avermectinas B, incluindo os grupos metilo em falta na fracção dissacaridica.
esqueleto de carbono das avermectinas (representado na fórmula (i) seguinte) é derivado de acetatos e propionatos e o substituinte C-25 de avermectinas naturais de L-isoleucina (R = (S)-sec-butilo) ou L-valina (R = isopropilo) /Pischer e Mrozik, Macrolide Antibiotics, Academic Press (1984) Gap. l4
Por avermectinas conhecidas” ou naturais pretende-se significar aquelas avermectinas produzidas por S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 e ATCC 31272, em que o substituinte da posição 25 é ou isopropilo ou (S)-sec-butil(1-metilpropilo). á feita referencia a aver mectinas em que o substituinte da posição 25 é diferente de isopropilo ou sec-butilo (forma S), como avermectinas novas ou não naturais.
As estirpes de S.avermitilis citadas nas patentes dos E.U. anteriormente referidas produzem uma classe de substâncias aí geralmente descritas como C-076. A classe inclui oito compostos distintos mas intimamente afins, descritos como Ala, Alb, A^a, Bla,
Blb, B2a e B^b C-076. A série a de compostos refere-se às avermectinas naturais em que o substituinte 25 é (s)-sec-butilo e a série ”b” às em que o substituinte 25 é isopropilo. As designações ”A” e ”B” referem-se a avermecti nas em que o substituinte 5 é metoxi ou hidroxi, respectiva mente. Por fim, o numeral ”1” refere-se a avermectinas em que está presente uma ligação dupla na posição 22-23; e o numeral ”2 a avermectinas tendo um hidrogénio na posição 22 e hidroxi na posição 23.
Neste pedido, não se utilizam aqueles identificadores relativamente ao substituinte 25 das avermectinas não naturais. Os identificadores A^, A^, e Bp têm sido retidos para referenciar avermectinas não naturais tendo os aspectos estruturais correspondentes aos das avermectinas naturais, como anteriormente indicado.
A Patente dos E.U. 4.378.353 des creve compostos relacionados com C-076 ® a sua preparação pelo cultivo de MA-5218, uma estirpe mutante de S_, avermitilis ATCC 31272, obtidos por irradiação de ultravioletas.
mutante é identificado como ATCC 31780. Os compostos relacionados com C-076 produzidos pelo referido mutante não apresentam o anel de furano de C-O76. Para além disso, nalguns dos compostos indicados, deu-se a divisão de uma ou ambas as fracções de açúcar oleandrose, enquanto que noutro o grupo da posição 5 se oxidificou num grupo ceto.
Três classes de mutantes 0-metil transferese de S. avermitilis. que produzem avermectinas sem grupos G-metilo foram indicados por Ruby et al.,6s
Simpósio Internacional sobre Biology of Actinomycetes” Debrecen, Hungary, Agosto 26-30 (1985) e por Schulman et al. , Antimicrobial Agents and Chemotherapy’' 31, 744-7 (1987). A primeira classe produz primeiramente avermectinas B devido à sua incapacidade para metilar o hidroxido C-5 do anel lactono-macrocíclico. A segunda classe produz 3’-0, 3-0-bis-demetilavermectinas (avermectinas a que falta o substituinte 0-metilo na posição 3 de ambos os resíduos monossacarideos oleandrose), e a que se faz referência como demetilavermectinas. A terceira classe é incapaz de metilar em qualquer posição.
Schulman et al.♦ Fed. Proc. 44, 931 (1985) revelam uma maior produção de avermectinas B por fermentação de S,. avermjtilis na presença de substâncias como sinefungina, S-adenosiletionina e S-adenosil-homocistina, que inibem a B-O-metiltransferase da avermectina enzimática, que cataliza a transferência do metilo de S-adenosilmetionina para o grupo hidroxi C^. Os mutantes Streptomyces avermjtilis sem actividade 0-metiltransferese o que produzem maiores quantidades de componentes de avermeç tina B, são também revelados e referidos por Schulman et al in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29. 620-624 (1986).
S. avermjtilis Agly-1, uma estirpe mutante que produz virtualmente apenas aglicones de avermectinas Ala e A2a, é indicada por Schulman et al.,
J. Antibiot, 38 (ll) 1494-1498 (1985). Também é indicada a fermentação de S. avermjtilis Agly-1 na presença de sinefungina, que provoca uma maior produção de componentes agli cone E de avermectina. De igual modo, S.. avermjtilis 08, uma estirpe altamente produtora de avermectinas, quando fermentada na presença de sinefungina como inibidor de 0-metil-transferases, resultando na produção de avermectinas a que faltam grupos 0-metilo na aglicone em C.5 e na fracção dissacarídica oleandrose.
Schulman et al., Antimicrob.
Agents Ch.emoth.er. 31. 744-7 (1987) consideram que, embora não esteja ainda demonstrado, é altamente provável que, dado a metilação das posições 3' e 3 da fracção dissacarxdica de avermectinas ser inibida por sinefungina, a S-adenosilmetionina esteja envolvida na metilação da fracção dissacarxdica.
As avermectinas naturais, como verificado, são produzidas como uma mistura complexa de oito compostos distintos, mas intimamente relacionados; fórmula (i), R = isopropilo e (s)-sec-butilo.
Embora tenham sido recolhidos substancialmente em pré-forma (ver Patente dos E.U. 4,429· 042) a metodologia á, no melhor dos casos, laboriosa.
As avermectinas produzidas por fermentação, tanto as naturais como as não naturais, têm todas grupos metoxi nas posições 3’ θ 3” da fracção dissacarxdica. À produção de avermectinas, em especial das novas avermectinas, transportando substituintes que influenciam a sua solubilidade e/ou polaridade e, por consequência, as suas propriedades fisiológicas e biológicas, á um objectivo desejável.
Um outro objectivo desejável e a capacidade para produzir as referidas avermectinas, de modo a reduzir ao minimo o numero e complexidade dos produtos e, desse modo, fazendo aumentar a pureza de uma avermeç tina escolhida, simplificando assim os processos de separação.
Apesar das revelações sobre a utilização de SAE como um inibidor de O-metiltransferase de avermectinas B, não existe qualquer revelação quanto ao seu
-8valor como um agente etilante para a fracção dissacarídica e não é feita qualquer referência à formação de avermectinas etiladas na presença de SAE,
Não se pretendem nem se considerou a utilização de SAE como um agente etilante de avermectinas, e a produção de avermectinas etiladas não foi reconhecida pelos anteriores investigadores.
Verificou-se agora que as avermectinas etiladas antiparasiticas podem ser preparadas por fermentação de estirpes de S,. avermitilis na presença de S. adenosiletionina. Os compostos têm a fórmula
(I) em que a linha quebrada na posição 22-23 representa uma ligação dupla facultativa;
X Λ Z
R é hidroxi e está presente apenas quando a ligação dupla está ausente;
Λ z
R é uma fracção dissacarídica tendo a fórmula
4 em que R e R sao cada um metilo ou etilo, com a condição 3 4 de, pelo menos, um de R e R ser C^H^.
R ó alquilo 0^-0θ, facultativamente substituído por um grupo alquilo θ^θ4» alquenilo, alquinilo, alcoxialquilo, alquiltioalquilo, grupo cicloalquilalquilo C^-Οθ, em que a fracção alquilica é alquilo C^-Cj-, cicloalquilo 0^-0θ ou grupo cicloalquenilo C^-Οθ, podendo qualquer um deles ser facultativamente substituído por metileno ou grupos alquilo um aoel heterocícli co contendo oxigénio ou enxofre de 3 a ó membros, que pode ser saturado ou total ou parcialmente insaturado e que pode facultativamente ser substituído por um grupo alquilo C^-C^ ou um átomo de halogéneo, com a condição de, quando R á alquilo, ele não ser isopropilo ou sec-butilo.
-ΙΟ-
Ν o presente invento também se incluem compostos da fórmula (l), em que um de Ic ou R é etilo e o outro é hidrogénio, Embora os referidos compostos não tenham ainda sido detectados entre os produtos de fermentação dos exemplos a seguir apresentados, ou porque são produzidos em quantidades relativamente pequenas e/ou porque são dissumuladas por outros produtos de fermentação, eles são tidos como estando presentes em fermentações realizadas na presença de SAE.
As avermectinas etiladas são preparadas por fermentação de estirpes £5. avermitilis sem actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada e/ou actividade transaminase de amino-ácido de cadeia ramificada na presença de S-adenosiletionina (SAE),
As estirpes de S. avermitilis sem actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada são produzidas por mutação de estirpes produtoras de avermectinas de S. avermitilis e, em especial, por mutação de S. avermiti ATCC 3126?, ATCC 31271, ATCC 31272 ou NGIB 12121. Os mutantes são incapazes de sintetizar as avermectinas naturais, excepto quando se adiciona ao meio onde são fermentados os mutantes ácido gordo, ou um precursor, transportando o grupo isopropilo ou sec-butilo (forma -S). Eles têm a capacidade de produzir avermectinas naturais e não naturais, quando fermentados em condições aeróbicas aquosas num meio nutriente contendo um ácido primário apropriado ou composto convertivel nele no processo de fermentação.
Os mutantes caracterizados pela sua falta de actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada, são seleccionados a partir das colónias mutagenizadas na base de um ensaio ^00«. Neste processo, a ausência de evolução CO^ por uma colónia permeabilizada de um substracto de ácido / C-1_7“2-oxoisocapróico ou ácido /^C-l 72-oxo-3-metil-valórico ou ácido / ^C-l 72-oxo-3-metilbutirico, indica ausência de actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada.
Os termos avermectina etilada” ou avermectinas etiladas” como aqui utilizados, referem-se a compostos tendo a fórmula (l) anterior, em que o subs tituinte (R) pode ser qualquer grupo assimilável na referida posição pelos mutantes £>. avermitilis aqui descritos e, na ~2 3 4 z fracção dissacaridica R , pelo menos um de R ou R e etilo.
Os mutantes aqui descritos são altamente valiosos para produzir avermectinas etiladas nao naturais pelos processos aqui revelados e exemplificados. Eles são especialmente valiosos para produção de avermectinas etiladas, preferidas isto é, compostos em que o substituinte C-25 é cicloalquilo G^-C^ ou cicloalquenilo, faculfativamente substituído por um grupo alquilo C^-C^; 1-metiltioetilo, ou um grupo heterociclico de oxigénio ou enxofre de 5 ou 6 membros, em especial 3-tienilo ou 3-furilo.
Os compostos deste invento são preparados por fermentação aeróbica com uma estirpe de S. avermitilis, de preferência uma sem actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada, num meio nutriente aquoso, consistindo numa fonte assimilável de azoto, carbono, sais inorgânicos e um composto primário da fórmula RCOOH, ou um composto convertível no referido composto (isto é, um precursor) durante a fermentação. 0 ácido, ou o composto convertível nele, é adicionado à fermentação, quer no momento da inoculação, ou em qualquer altura durante a fermentação. Ele pode ser adicionado todo de uma vez ou em porções, com intervalos, durante a fermentação. A S-adenosiletionina pode também ser adicionada no momento da inoculação ou em qualquer altura durante a fermentação, quer
12toda de uma vez ou em porções, com intervalos, durante a fermentação, ou continuadamente.
Λ produção dos produtos de avermectinas pode ser controlada pela remoção de amostras da fermentação, por extracção com um solvente orgânico e seguindo-se a aparência do produto por cromatografia, por exemplo, utilizando-se cromatografia liquida de alta pressão. A incubação prossegue até à maximização do rendimento do produto, geralmente durante um periodo de 4 a 15 dias.
Um nivel preferido de cada adição dos compostos primários (ácido carboxílico ou composto convertivel nele) situa-se entre 0,05 e 3,0 grama por litro.
composto primário pode ser adicionado continuadamente intermitantemente ou todo de tuna vez, à fermentação, 0 ácido (RCOOIi) é adicionado como tal ou como um sal, tal como sal de sédio, litio ou amónio, ou como um composto converti vel no ácido, como anteriormente definido. 0 ácido, se um sólido é de preferência dissolvido rum sólido solvente adequado, tal como água ou alcéois (C^ ^). 0 SAE é utilizado em niveis variando de 0,01 a 0,10 g/l e, de preferência em niveis de 0,03 a- 0,0ó g/l.
Os meios utilizados para a fermentação podem ser, em especial quando o substituinte C-25 é suposto ser isopropilo ou (s)-sec-butilo, meios convencionais contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e elementos vestigiários.
Quando se pretende que o substituinte C-25 seja um grupo não natural; isto é, não seja isopropilo ou (s )-sec-butilo, o meio de fermentação é um em que os ingredientes escolhidos não têm, ou contem apenas quantidades mínimas de compostos primários, em que a fracção R é isopropilo ou (s)-sec-butilo.
Após fermentação durante um periodo de vários dias a uma temperatura de preferência na ga.ma de 24 a 332C, o caldo de fermentação é centrifugado ou filtrado e o bolo micelial é extraido com acetona ou metanol, de preferência. 0 extracto de solvente é concentrado e o produto é a seguir extraido para dentro de um solvente orgânico imiscivel em água, tal como cloreto de metileno, acetato de etilo, clorofórmio, butanol ou metil-isobutil-cetona. 0 extracto de solvente é concentrado e o produto cru é a seguir purificado, como necessário, por cromatografia, por exemplo, utilizando-se a fase reversa preparatória, cromatografia liquida de elevada pressão.
Os compostos com capacidade de utilização pelas S_. avermitilis deste invento para a biossin tese de avermectinas etiladas (compostos de fórmula (l)) têm a fórmula (ll-Λ)
R-COOH (IX-A) incluindo compostos convertiveis em (ll-Λ) durante o processo de fermentação. Os referidos compostos são aqui designados por compostos primários. Na fórmula (iI-A), R é um gru po de cadeia ramificada na posição alfa, o seu átomo de carbono ao qual está ligado o grupo -COOH, está tambám ligado a pelo menos dois outros átomos ou grupos diferentes de hidrogénio. Esta definição engloba, evidentemente, grupos acíclicos e cíclicos saturados e insaturados, incluindo os que facultativamente transportam um heteroátomo de enxofre ou oxigénio, como um membro da cadeia acíclica ou anel cícli co.
Mais especificamente, R, que se torna no substituinte 0-25, pode ser um grupo 0^-0θ alquilo alquenilo, alquinilo, alcoxialquilo ou alqui ltioalqui lo ramificado na posição alfa; um grupo cicloalquilalquilo C^-Cg em que o grupo alquilo é um grupo alquilo C^-C^ ramificado na posição alfa; um grupo cicloalquilo C^-Cg ou cicloalquenilo C^-Cg, qualquer dos quais pode ser facultativamente substituído por metileno ou um ou mais grupos alquilo C^-C^ ou átomos de halogénio (fluor, cloro, iodo ou bromo); ou um anel heterocíclico contendo oxigénio ou enxofre de 3 a 6 membros, que pode ser saturado ou total ou parcialmente insaturado e que, facultativamente, pode ser substituído por um ou mais grupos alquilo °u átomos de halogénio, com a condição de que, quando R é alquilo, não é isopropilo nem sec-butilo.
Compostos convertiveis em RCOOH; isto é, precursores, no processo de fermentação são compostos das fórmulas (il-Β) em que R é como definido anteriorment e:
R-(CH2)n-Z (IIB) néO, 2, 4 ou 6; e Z é -CHgOH, -CHO, -CHgNHg, -COOR6 ou -COKHR^, em que R6 é H ou (C^-Cg)alquilo; R? é hidrogénio, (C^_^)alquilo ou o residuo de um aminoácido em especial de ácido aspártico, ácido glutamico e metionina, por ex: -ch(cooh)ch2cooh, -ci-i(cooh) (ch2)2cooh e -ch(cooh) (ch2)2sch re spe c tiva&ent e,
Também se incluem neste invento formas isoméricas de compostos da fórmula (il-Α.) e de compostos convertiveis neles durante o processo de fermentação e as avermectinas isoméricas em C-25, resultantes da sua utilização no processo aqui descrito.
A fonte do grupo R, isto é, quer um dos provenha directamente de R-COOH ou seja produzido de anteriores precursores, ou de qualquer precursor não é importante para a produção das avermectinas etiladas. 0 requisito critico do processo deste invento para a sua produção é o facto do grupo R desejado ser resultante das estirpes S,. avermitilis deste invento no processo de fermentação.
Os compostos adequados incluem os seguintes:
ácido 2,3-dimetilbutirico, ácido 2-metil-hexanáico, ácido 2-metil-4-pentanáico, ácido 2-ciclopropil-propiónico, sal de lítio de ácido 4,4-difluoro-ciclo-hexano-carboxilico, ácido 4-metilenociclo-hexano-carboxilico, ácido 3-nietilcicloh.exano-carboxilico (cis/trans), ácido 1-ciclopentenocarboxilico, ácido l-ciclo-hexano-carboxilico, ácido tetra-hidropirano-4-carboxilico, ácido tiofeno-2-carboxilico, ácido 3-furóico, ácido 2-clorotiofeno-4-carboxilico, ácido ciclobutano-carboxilico, ácido ciclopentano-carboxilico, ácido ciclo-hexano-carboxilico, ácido ciclo-heptano-carboxilico, ácido 2-metilciclopropano-carboxilico, ácido 3-ciclo-hexano-l-carboxilico, ácido 2-metiltiopropionico, ácido 2-metil-4-metoxibutírico ácido tiofeno-3-carboxilico liidroximetilcic lopent ano
3-tiofeno-carboxaldeido ácido 3-ciclo-hexil-propiónico :6
ácido 3-ciclopentil-propiénico, hidroxime bilcic lohutano, ácido tetra-hidrotiofeno-3-carboxilico ,
3-c iclopenti1-1-propano1, sal de litio de ácido p-E^til-ciclobutano-carboxilico, ácido 3--£,luo3?ociclobutano-carboxilico, sal de litio de ácido 3-nietileno-ciclobutano-carboxilico, ácido 2-metil-4-metiltiobutirico, ácido tetra-hidrotiopirano-4-carboxilico, c i c1obut ilmetilamina, ciclobutanocarboxilato de etilo,
- lii droxime t ilc ic lopent ano, éster etilico do ácido 2-(3-tiofenocarbonil)propiénico, ácido S-2-metilpentanéico, ácido ΣΙ-2-metilpentanóico.
Os mutantes S., avermitilis especialmente uteis para a preparação de compostos da fórmula (i) são obtidos por mutação de um membro produtor de avermectinas da espécie Streptomyces ave imiti lis de acordo com os processos conhecidos, utilizando-se um qualquer de uma série de agentes mutantes, incluindo irradiação de ultravioletas, irradiação de raios X, N-metil-Ií ’ -nitro-N-nitrosoguanidina, etil-metano-sulfonato, ácido nitroso e mostardas de azoto, por ex, , N-metil-bis(2-cloroetil)amina, ou proces s ament o s afins.
A mriagénese pode ser conduzida em espórios ou numa cultura vegetativa de S_. ave imiti lis capaz de produzir avermectinas naturais, por ex», j3. avermitilis ATCC 31272.
Seguindo-se os processos bem conhecidos para os peritos na técnica da especialidade, as colónias mutagenizadas são seleccionadas na base de um método de ensaio bioquímico que permite o peneiramento de grandes quantidades de colónias bacterianas aleatoriamente l4 /-l4 -7 mutagenizadas para produção de CO^ de / C-l_/-2-oxo-ácidos (Tabor et al.. J. Bact. 128. 485-486t 1976).
A metodologia consiste em se fazer a cultura de colónias mutantes nas cavidades de uma placa de microtitulação num meio nutriente adequado, permeabilizando-se as células com tolueno, seguindo-se a adição de /^^C-l 7-2-oxo-ácido (por ex. , ácido 2-oxo-isocapróico) a cada cavidade e verificando-se a atmosfera sobre a fermenl4 tação para CO^.
Eia alternativa, pode-se utilizar z z—14 *7 z z /—14 acido / C-l /-2-oxo-3-metilvalerico, ou acido / C-l /, /-14
-2-oxo-3-metilbutirico no lugar de acido / C-l /-2-oxo-isocapróico. À produção de CO^ θ verifiçada de forma conveniente, colocando-se papel de filtro saturado humedecido com Ba(OH)p sobre as cavidades individuais para re14 l4 tenção de qualquer CG? libertado e detecção de Ba CO^, se houver, por autoradiografia. Os mutantes sem actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada originam autoradiografias próximas dos controlos em vazio não z l4 inoculados, isto e, sem se produzir Ba CO^ adicional pelos mutant e s.
As características morfológicas e culturais dos mutantes aqui descritos são geralmente como descritos na Patente dos E.U. 4.429.042, A característiea que distingue os mutantes deste invento é a sua falta de actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada, cuja caranteristica é determinada como aqui se descreve. A falta da referida actividade resulta na incapacidades de os mutantes produzirem as avermectinas naturais, quando cultivadas num meio definido substancialmente isento de áci-18dos gordos RCOOH, em que R ó isopropilo ou (s)-sec-butilo, ou compostos convertiveis nos referidos RCOOH durante a fermentação. Uma investigação taxinómica realizada por American Type Culture Collection confirmou que as caracteristicas de duas estirpes de mutantes 1-3 ® HL-02Ó seleccionadas atra z l4 A/ ” vós do teste CO^ anterior apresentam uma estreita relação com as da estirpe parenteral ATCC 31272 descritas na Patente dos E.U. 4.429.042, embora com algumas excepções. Assim, a estirpe mutante 1-3 (ATCC 5336?) forma significativamente menos cadeias de espórios do que a ATCC 31272, e a estirpe mutante HL-02Ó (ATCC 53568) ó praticamente livre de micólios aéreos e espórios, mas as pouquíssimas cadeias de espórios que produz têm caracteristicas semelhantes às de ATCC 31272 De igual modo a IIL-02Ó mutante apresenta uma capacidade duvidosa para utilizar rafinose como única fonte de carbono, ao passo que a estirpe parenteral, e estirpe 1-3 mutante são capazes de utilizar rafinose. (Em experiências efectuadas pelos requerentes, a rafinose não pareceu suportar o crescimento de qualquer destas estirpes). Uma outra caracteristica da estirpe mutante HL-02Ó foi o facto de ela produzir menos pigmento de melanina que as outras duas estirpes e absolutamente nenhum em agar de tirosina.
Por fim, em contraste com a descrição dada para ATCC 31272 na. Patente dos E.U. No.
4.429.042, somos incapazes de detectar crescimento de mutantes ou de ATCC 31272 com sacarose como única fonte de carbono.
As gtreptomyces avermitjlis
1-3 θ UL-02Ó foram depositadas nos termos do tratado de Budapeste na American Type Culture Collection, Rockville Maryland, um reconhecido depositário que assegura a permanência dos depósitos e pronta acessibilidade a eles pelo publico se for concedida uma patente a este pedido. Foi-lhes dada a designação de Streptomyces avermitjlis ATCC
-1953507 e ATCC 53568, respectivamente. Os depósitos estão disponíveis durante o periodo de pendência deste pedido para quem determinado pelo Delegado do Departamento de Patentes e Marcas Registadas dos Estados Unidos a ser autorizado para tal, sob a designação de 37 CER 1.14 e 35 USC 122, e h de acordo com as leis de patentes estrangeiras em paises I si onde estejam depositadas contrapartes deste pedido, ou sua :! progénie. Todas as restrições à disponibilidade, para o público, dos microorganismos depositados serão irrevogavel' mente retiradas após concessão da patente.
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Quando fermentados num meio nutriente contendo o composto primário adequado e SAE, os mutantes deste invento produzem um composto de fórmula (i) ou, como é mais frequentemente o caso, uma mistura de dois ou mais compostos da fórmula (l) em que R corresponde ao composto primário, utilizado. Pode-se produzir até dose produtos, conveniente e vulgarmente designados por R-avermectina Al, A2, BI e B2, de acordo com as designações uti!i lizadas na patente dos E.U. No. 4.4-29,04-2. 0 grupo ”R” refe; re-se evidentemente ao substituinte C-25. Por exemplo, quando
R ó ciclopentilo, as avermectinas possíveis são dois derivados dissacarideos monoetilados e um derivado dissacarideó , dietilado de cada uma. das quatro avermectina.s ciclopentiliH i’ cas a seguir referidas.
-20Nome vulgar .1
ciclopentil-avermectina Al ligação CH„ dupla ciclopentil!
ρ -avermectina A2
Ί
Í!
í! ciclopentil-avermectina Bl ciclopentil-avermectina B2 hidroxi CHO ligação dupla H hidroxi
Ii
Nas avermectinas não naturais, o substituinte C-25 R da fórmula (l) é diferente de isopropilo ou (S )-sec-butilo.
Os compostos da fórmula (l), em que a ligação dupla está presente e OH está ausente, podem alternativamente ser preparados a partir do composto correspondente da fórmula (l), em que R ó OH e a ligação dupla está ausente por uma reacção de desidratação. A reacção ó executada primeiramente procedendo-se à protecçâo selectiva dos grupos hidroxi nas posições 5 e 4, por exemplo, como derivado t-butil-dimetilsililoxi-acetilo, a seguir fazendo-se a reacção com um halsto tiocarbonilo substituido, nomeadamente cloreto (4-metilfenoxi) tioca.rbonilo, seguindo-se o aquecimento num solvente com um elevado ponto de ebulição, por exl', triclorobenzeno, para que se efectue a desidratação. G produto é finalmente desprotegido para dar o composto insaturado. Estes passos, juntamente com os reagentes apropriados e condições de reacção são descritos na Patente dos E.U. No. 4.328.335
Os compostos da fórmula (l) em ff que é H, podem ser também preparados a partir dos compostos corresijondcxites, em que Ic é CH^, por demetilação. Esta reacção é alcançada por processamento do composto 5-metoxi, ou de um seu derivado adequadamente protegido, com acetato mercúrico, e hidrolizando-se o éter enólico de 3“ -acetoxl resultante com ácido diluido, para se obter o composto 5-aceto. Isto é seguidamente reduzido utilizando-se por exemplo, boro-hidreto de sódio, para produzir o derivado 5-hidroxi. Os reagentes apropriados e as condições de reacção para estes passos são descritos na Patente dos E.U. No.4.423.209.
Os compostos da fórmula (l), em que ρΛ é II e a ligação dupla está ausente, podem ser preparados a partir do composto correspondente, em que a ligaçao dupla está presente e κ está ausente, por hidrogenação catalítica selectiva, utilizando-se um catalisador apropria do. Por exemplo, a redução pode ser alcançada utilizando-se cloreto de tris(trifenilfosfina)ródio, como descrito na Publicação do Pedido de Patente Europeia No.OOOlé89.
Os compostos deste invento são agentes antiparasiticos muitíssimo activos, tendo uma parti cular utilidade como antelmintícos, ectoparasiticidas, insecticidas e acai-icidas,
Deste modo, os compostos são efi cazes no tratamento de uma série de estados causados por endoparasitas incluindo, em particular, helmintiasis, que é, na ma.ior parte das vezes provocado por um grupo de vermes parasiticos, descritos como nematódios e que podem causar sérios prejuízos nos porcos, ovelhas, cavalos e gado bovino, bem como afectar os animais domésticos e criação.
Os compostos são também eficazes contra outros nematóides que afectam várias espécies de animais, incluindo, por ejcemplo, Dirofilaria em cães e vários parasitas que podem infectar humanos, incluindo parasitas gastro-intestinais, nomeadamente Ancylostoma, Necat or, Ase ar is , Strongyloides , Trinchine11a, Capillaria, Trichuris, Enterobius e parasitas que se encontram no sangue ou outros tecidos e orgãos, tais como vermes filiariais e as fases extra-intestinais de Strongyloides e Tyiohinella.
Os compostos são também valiosos para o tratamento de infecções ectoparasiticas, incluindo em particular ectoparasitas atropodes de animais e aves, nomeadamente carrapatos, acarinos, piolhos, pulgas, varejeiras, insectos picantes e larvas ditéi-icas migrantes que podem afectar o gado bovino e equino.
Os compostos são também insecticidas activos contra pragas domésticas, nomeadamente baratas traças e outros insectos rastejantes, bem como moscas, e são também úteis contra pragas de insectos de grãos armazenados plantas agrícolas, tal como aranhas, afídios, larvas de insectos e contra ortopteranos migratórios, tais como gafanhotos.
Os compostos da fórmula (i) são administrados como uma formulação apropriada à utilização especifica prevista e à espécie particular de animal hospedeiro a ser tratado e ao parasita ou insecto envolvido. Para utilização como um antelmintico, os compostos podem ser administrados oralmente na forma de uma cápsula, pilula, comprimido ou um remédio liquido ou, em alternativa, eles podem ser administrados por injecção ou como um implante. Tais formulações são preparadas da forma convencional de acordo com a prática veterinária, normal. Assim, as cápsulas pilulas ou comprimidos podem ser preparadas por misturação do ingrediente activo com um diluente ou veiculo adequado finamente dividido, contendo adieionalmente um agente desintegrante e/ou ligante, tal como amido, lactose, talco, estearato de magnésio, etc. TJma formulação de remáio liquido pode ser preparada fazendo-se a dispersão de um ingrediente activo numa solução aquosa, juntamente com agentes de dispersão ou humectantes, etc. e as formulações injectáveis podem ser preparadas na forma de uma solução estéril, que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou glucose suficientes para formar a solução isotónica com o sangue.
Estas formulações variarão relativamente ao peso do composto activo, dependendo da espécie de animal hospedeiro a ser tratado, da gravidade e tipo de infecção e do peso do hospedeiro. Em geral, para administração oral, será satisfatória uma dose de cerca de 0,001 a 10 mg por kg do peso do animal, dada como uma dose única ou em doses divididas por um pex'iodo de 1 a 5 dias, embora evidentemente, possa haver casos em que são indicadas gamas superiores ou inferiores de dosagem, que estão dentro do âmbito do invento.
Em alternativa, os compostos podem ser administrados juntamente com os alimentos do animal e, para este fim, pode-se preparar um aditivo alimentar concentrado, ou pre-mistura, para misturação com os alimentos normais do animal.
Para utilização como um insecticida, e para tratamento de pragas agrícolas, os compostos são aplicados como sprays”,pós, emulsões e afins, de acordo com a prática agrícola normal.
Produção de S.» avermitilis (ATCC 53567)
Passo 1. Procedeu-se à cultura de j3. avermitilis ATCC 2?2 em ”Nevr Patcb. Agar Médium” durante 12 dias a 3O2C. 0 meio era constituido por:
| V-8 Juice * | 200 ml |
| CaCO^ | 3 grama |
| Agar | 15 grama |
| H2° a | 1000 ml |
| Caldo nutriente | 1,0 grama/L |
| Ac e t at o de sódio. 311^0 | 1,4 grama/L |
| Ácido isovalórico | 50 mg/L |
| Ácido isobutirico | 50 mg/L |
| Ácido metilbutirico | 50 mg/L |
| Isoleucina | 250 mg/L |
| Leucina | 250 mg/L |
| Valina | 250 mg/L |
| Solução de elementos vestigiarios ‘ | 1 ml/L |
*
Uma mistura de 8 sumos de vegetais (tomate, cenoura, aipo, betarraba, salsa, alface, agrião e espinafre) mais sal, ácidos ascórbico e cítrico e aromas naturais. Vendido por Campbell Soup Company, Camden, NJ.
Composição da solução de elementos vestigiários:
| FeCl3.ÓH20 | 2,7 g |
| MnSOjpH^O | 4,2 |
| CuSOZr5H2O | 0,5 |
| CaCl2 | 11,0 |
| H_B0„ 3 3 | 0,62 |
| CoCl2.ól-I20 | 0,24 |
| ZnCl2 | 0,68 |
| θθ | 0,24 |
São dissolvidos em 1 litro de
0,1 N HC1.
Faz-se a colheita dos espários de 3 daquelas placas e a sua suspensão em 20 ml de solução tampão de ácido tris-maleico 0,05 Μ. pH 9,0.
Passo 2: Adiciona-se 10 ml da suspensão de espários a um frasco contendo 10 mg de N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NIC·). 0 frasco é incubado e agitado a 28^C durante 6o minutos e os espários são a seguir lavados profusamente com uma solução de NaCl a 1$.
Passo 3ϊ Os espórios lavados são suspensos em NaCl a 1$ e misturados com um volume igual de etilenoglico1 a 80$. Esta suspensão ó conservada a -2020 e utilizada como uma fonte de células a ser peneiradas para mutantes. 0 resultado foi de aproximadamente 10 colénias/ml quando germinadas.
Esta colecção de espórios e espalhada em placas PPD produzindo aproximadamente 100 colónias por placa (o meio EPD consiste em 10 g/l de cada um de extracto de fermento, peptona de Bacto ' ajustado para um pll de 6,9 antes da passagem em autoclave.
Os ingredientes assinalados com um asterisco são comei-cialiaados por Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238.
Passo 4; Retiram-se as colónias individuais das placas após crescimento de 2-3 semanas a 2820 e colocaram-se em cavidades individuais de uma placa normal de microtitulação de 96 cavidades. De igual modo colocou-se uma pequena quantidade da colónia num meio de agar fresco, para servir como uma fonte de células viáveis, quando os mutantes são identificados .
Passo 5; Adicionou-se a cada cavidade aproximadamente 75 microlitros de um meio liquido de sais de M9 contendo 1$ de glucose, 0,1$ de ácidos de casamino e 0,01$ de cada um dos ácidos isovalérico, isobutirico e 2-metiIbutirico.
Após alguns dias de incubação a 28 9C, as cólulas foram testadas quanto à presença de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada. Cada litro do meio de sais M9 contem 6 g de 3 g de IU^PO^, ° de NaC1 e 1 S d® NH^Cl.
O meio é autoclavado e a seguir adiciona-se 1 ml tanto de 1 M MgSO^ esterilizado como 0,1 M CaCl^, assepticamente.
Passo 6; Prepara-se uma microssuspensão de tolueno a 5% em meio de sais H9 por Breve sonicação da mistura imiscivel A 25 ml desta suspensão adicionou-se 1,2 ml de uma solução contendo ácido /~ C-l /-2-oxo-isocapróico, 2,5 microcurie/ /ml e 10,0 microcurie/micromol, Adicionou-se 50 microlitros desta mistura global a cada uma das cavidades das placas de microtitulação contendo as colónias a ser ensaiadas.
Passo 7: 0 00^ produzido a partir de cada cavidade e retido e visualizado pelo processo descrito por Tabor et al.,
J. Bacteriol. 128 485-486 (1976), intitulado Convenient l4 l-íetiiod for Detecting 00^ in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants. Os mutantes sem aetividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada não l4 z produzem Ba 00^ para alem do observado para os controlos.
Um método mais refinado que mel4 lhora o contraste entre um teste positivo quanto a CO^, indicado por uma mancha escura no autoradiograma como resul l4 tado de formação de Ba CO^, e um teste negativo indicado por inexistência de mancha ou por uma maneira muito leve, consiste no seguinte cenário modificado.
Retira-se do meio de agar .
colónias individuais (ver Passo 4 anterior) após 7-l4 dias de crescimento (de preferência a 2-3 semanas e submetidas a teste directamente pelos Passos 6 e 7 anteriores). Omi-28te-se o passo 5 do processo anterior.
Um método de ensaio ainda mais refinado , que é de natureza quantitativa relativa recente s l4 a libertação de 00^, consiste em se cultivar os mutantes detectados pelos crivos anteriores num meio de cultura contendo meio de sais 119 com glucose, 1$ e Syncasa-bcaa,
0,l£ ( una mistura sintética de L-amino ácidos com a composição aproximada dos casamino-ácidos comerciais, mas sem a presença de l-valina, L-isoleucina. e L-leucina, ver a seguir).
Após cultivo a elevada densidade de células, estas são lavadas em meio de sais M9 e suspenas de novo em meio de sais M9 frio contendo tolueno a 1$ que tinha sido sonicado para produzir uma dispersão branca leitosa do tolueno. A suspensão células/solução tampão/tolueno é incubada durante 4o minutos a 30SC cora vâsSa à permeabilização das células. Às células permeabilisadas são a seguir lava.das em meio de sais M9 e finalmente suspensas de novo em um quinto do volume original da solução tampão de meio M9· Utilizou-se, por ensaio, 180 micro litros desta suspensão.
Um volume de reacção de 300 micro litros continha as células toluenisadas, pirofosfato de tiamina (PFT), 0,4 mM; coenzima A (CoA), 0,11 mM; nicotinami do-adenino-dinucleótido (EàD), 0,68 mM, ditiotreitol (DTT),
2,6 mM; MgCl9, 4,1 mM; Tris-HOl, 6o mM; Tris-íICl, 6o mM, .-l4 pH 7,5; e / ~’C-l_/~2-axoisocaproato, 6000 cpm, microcurie por Kiicromol. A eficácia de contagem foi de 73$. A reacção foi realizada em frascos de cintilação de 15 ml contendo um quadi-ado de papel de 2x2 com Uhatman $ k- comprimido para dentro da tampa com rosca do frasco. 0 papel contem 30 mi crolitros de 1 M Hyamine Hidroxide (solução 1M de hidróxido de metilbensotonima em metanol, comercializada por l4
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), que retem 00^ segregado na reacção. Após incubação durante 2 horas, os papeis sao mergulhados em 10 ml de Beckman. Aquasol II (Universal LSC (contado!* de cintilação liquido) comercializado por ITew England Nuclear Research Products, Boston, líÀ 02118) e a radioactividade medida num contador de cintilação liquido após equilíbrio neste solvente durante 4 horas ou mais.
Uma reacção de controlo em vazio (isto ó, sem ceíulas) dá cerca de 50, 300 cpm, mutante 1-3 ® outros semelhante a ele deram resultados inferiores ou iguais aos da reacção de controle em vazio, ao passo que a. estirpe afim deu resultados várias vezes superiores ao valor do controlo em vazio.
Isolamento de Derivado HL-02Ó (ATCC 53568) de £3. Avermitili 1-3 (ATCC 5356?)
Dispôs-se £3. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), em filas, em placas de agar nutrientes. Apareceu uma frequência relativamente elevada de variantes espontâneas, algumas das quais não tinham micélio aérso após 4 dias de incubação a 3θ9θ. Várias destas variantes foram isoladas e testadas quanto à sua capacidade para produzir avermectinas não naturais, quando fermentadas em meio AP-5 ao qual se adicionou ácido ciclopentano-carboxilico. Das isoladas, muitas das quais produziram avermectinas não naturais Isentas de avermectinas naturais a uma estirpe, que produziu titulos mais elevados de avermectinas a sua afim em experiências em frascos do que S. avermjtilis 1-3 (ATCC 53567), foi atribuido o número de identificação HL -026 (ATCC 53568).
Composição de Syncasa-bccaa, Concentrado a 100 vezes grama/li t r o
L-alanina
L-arginina ácido L-aspártico
L-cistina ácido-L-glutâmico glicina
L-histidina
L-li sina
L-metionina
L-fenilalanina
L-prolina
L-serina
L-treonina
L-tirosina
L-triptofan
6
“3 ΙΑ mistura é ajustada para um pH de 7 e estexdlizada por filtragem, Adiciona-se um volume de concentrado a 99 volumes de meio para se alcançarem concentrações padrão de utilização.
São apresentadas a seguir as composições de meios utilizadas.
Meio AS-7
CaC0o
Milton, CT e vendido com a marca registada de Fennamyl) para um equivalente dextrose de Ac^o - 5$>.
De Yeast Products, Inc. Clifton, NJ 07012
De Traders Protein. , Memplxis, TN 38108
-32Ο pH e ajustado para 7,2 com
NaOH.
Meio AP-5
S&
-/
| Amido não espesso | 80 |
| Ardamine pll | 5 |
| K I-IPO^ | 1 |
| MgSOj,, 7H20 | 1 |
| NaCl | 1 |
| CaC0o | 7 |
| FeSOZr7H2O | 0,01 |
| MnCl2.7H20 | 0,001 |
| ZnS0,,.7Ho0 | 0,001 |
| . \ Q. P-2000 (anti-espuma) | 1 ml/1 |
a)
De Tlio Dow Chemical Co. , Midland, Michigan 4864o Ajustar o pH para 6,9 com NaOH a 25%.
I
s-ass»
-33Cromatografia Liquida de Elevado Rendimento Geral (HPLC) e Processos de Amostragem
Fase Movei:
IpO ml de água 70 ml de acetonitrilo perfazendo 1 litro com metanol
C oluna:
Ultra-esfera ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100) fluxo: 0,75 ml/minuto detecção: UV a 24-0 nm atenuação: aproximadamente 4
Diluente de amostras (d):
ml de acetonitrilo mais 390 ml de metanol.
Amostras:
1. Tirar A ml de caldo bem agitado; rodar para baixo.
2. Remover tanto sobrenadante quanto possivel sem perturbação do pellet
3. Adicionar 4 ml de diluente ao pellet e misturar em vór tice para dispersar
4. Rodar para baixo e recolher o sobrenadante
5. Filtrar o sobrenadante e passar em HPLC.
EXEMPLO 1
Ciclopentil Avermectinas etiladas
Utilizou-se um frasco gelado de S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) para inocular 100 ml de meio AS-7 num balão de 500 ml, que foi incubado, sob agitação, durante 24-28 horas a 28-302C. A seguir utilizou-se 1 ml desta cultura para inocular um balão de 3oo ml contendo 4θ ml de meio ÂP-5 (menos NaCl mas mais 0,6 g/l de ácido glutâmico). Após aproximadamente 96 horas de incubação a 28-3O2C, sob agitação, adicionou-se 0,4 g/l de ácido ciclopentano carboxilico (sal de sódio) e 0,03 g/l de SAE. A cromatografia IIPLC de uma amostra de 312 horas revelou aver mectinas ciclopentilicas etiladas B2, A2 e BI presentes com as seguintes relações em tempo de retenção relativas as suas ciclopentil-avemiectinas correspondentes:
monoetilo CP-B2/CP-B2 = 1,10 dietilo monoetilo dietilo monoetilo dietilo
CP-B2/CP-B2 = 1,23 CP-A2/CP-A2 = 1,10 CP-A2/CP-A2 =1,26 CP-B1/CP-B1 = 1,10 CP-B1/CP-B1 = 1,24
CP = ciclopentilo
EHEMPLO 2
Ciclo-bexi1-avermectinas etiladas
Utilisou-se um frasco gelado de S., avermitilis HL-02Ó (àTCC 53568) para inocular 100 ml de meio AS-7 num balão de 500 ml que foi incubado sob agitação durante 24-28 horas em 28-3O2C. A seguir utilizou-se 1 ml desta cultura para inocular um balão de 300 ml contendo 4o ml de meio AP-5 (menos NaCl mas mais de 0,6 g/l de ácido glutâmico). Após aproximadamente 96 boras de incubação a 28-309% sob agitação, adicionou-se 0,2 g/l de ácido ciclo-bexano-carboxilico (sal de sódio) e 0,03 g/l de SAE, Adicionou-se mais 0,03 g/l de SAE a cerca de 168 horas. A cromatografia HPLC de uma amostra de 312 boras revelou ciclo-bexil-avermectina,s etiladas B2, A2 e BI presentes com as seguintes relações de tempo de retaição rela.tivas às suas ciclo-hexil-avermectinas correspondentes:
monoetilo CH-B2/CH-B2 = 1,11 dietilo monoetilo monoetilo dietilo
CH-B2/CH-B2 = 1,25 CH-A2/CH-A2 =1,11 CH-A2/CH-A2 = 1,13 CH-Bl/CH-Bl = 1,25
CH = ciclo-bexilo.
a prepara·
Claims (8)
- REIVINDICA gÕES:ção de um composto tendo19. - Processo para a fórmulaOR'CHem que a linha quebrada na posição 22-23 representa uma ligação dupla facultativa;l/ ó OH e a ligação dupla está ausente, ou, a ligação du pia está presente e κΛ está ausente;R ó uma fracção dissacaríddica tendo a fórmulaI »-377,3 4 em que R e R sao cada um CH- ou C-H3 4 ~ 5?pelo menos um de R e R são C^H^j R ν' ii ; com a condição de & H ou CH^; eR é alquilo C^-Cg, facultativamente substituido por um grupo alquilo C^-C^, alquenilo, alquinilo, alcoxialquilo, alquiltio-alquilo, grupo cioloalquilalquilo C^-Cg em que a fracçao alquilo é alquilo C^-C^, cicloalquilo C^-Cg ou grupo cicloalquenilo C^-Οθ, qualquer dos quais podendo ser facultativamente substituido por metileno ou grupos alquilo gj“c2j,5 ou um anel heterocíclico contendo oxigénio ou enxofre de 3 a 6 membros, que pode ser saturado ou completa ou parcialmente insaturado e que pode facultativamente ser substituido por um grupo alquilo C^-C^ ou um halo-átomo ; com a condição de que, quando R é alquilo não é isopropilo ou sec-butilo, caracterizado por compreender a fer mentação aerobica, na presença de S-adenosiletionina, com uma estirpe de Streptomyces avermitilis sem actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácido de cadeia ramificada, num meie nutriente aquoso contendo uma fonte assimilável de azoto, carbono b sais inorgânicos e um composto com capacidade de utilização na biossíntese de uma avermectína.
- 2&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto com capacidade de utilização na biossíntese de uma avermectína ser um ácido da fórmulaR-COOH ou um composto convertível no referido ácido por g.avermitilis, em que R é diferente de isopropilo ou (g)-sec-butilo.
- 3-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a S.avermitilis ter as-38características identificadoras de ATCC 53568.
- 4&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto ter a fórmulaR-COOE em que R é um grupo de cadeia ramificada na posição alfa, o seu átomo de carbono, ao qual está ligado o grupo -COOH, está também ligado a pelo menos dois outros átomos ou grupo diferentes de hidrogénio; ou um composto convertível no referido composto durante o processo de fermentação.
- 5-. - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por R ser um grupo °3-°8 -alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxialquilo ou alquiltioalquilo, ramificado na posição alfa; um grupo cicloalquilalquilo C^-Cg em que, o grupo alquilo é um grupo alquilo C^-C^ ramificado na posição alfa, um grupo cicloalquilo C^-Cg ou cicloalquenilo C^-Cg, podendo qualquer deles ser facultativamente substituido por metileno ou um ou mais grupos alquilo Cj-Cjj, ou átomos de halogênio; ou um anel heterociclico contendo oxigénio ou enxofre de 3 a 6 membros, que po de ser saturado, ou total ou parcialmente insaturado e que pode facultativamente ser substituido por um ou mais grupos alquilo C^-Cj^ ou ãtomos de halogênio, ou um composto conver tivel no referido composto durante o processo de fermentação,
- 6&. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por R ser ciclopentilo, ciclo -hexi lo, 3-tienilo, 3-furilo ou 1-metiltioetilo.
- 7-· - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por, quando R é um grupo al-39-89. - Processo para a preparação de uma composição para o tratamento e prevenção de infecções parasiticas em seres humanos e animais, caracterizado por se incluir na referida composição um composto preparado de acordo com a reivindicação 1, juntamente com um veiculo ou diluente Inerte.
- 9&. - Método para o combate de infecções ou infestações por parasitas, que consiste em se pôr em contacto o organismo responsável pela referida infecção ou infestação ou o local do referido organismo com uma quantidade antiparasitica de um composto preparado de acordo com a reivindicação 1, sendo a gama de dosagem de 0,001 a 10 mg por quilograma de peso por dia.
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