KR900004419B1 - B 아베르멕틴의 제조방법 및 이를 위한 배양물 - Google Patents
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Abstract
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Description
본 발명은 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성 및 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍된 스트랩토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 에스. 아베르미 틸리스의 제조방법, 및 천연 및 비 -천연 B 아베르멕틴을 제조하기 위한 에스. 아베르미틸리수의 용도에 관한 것이다.
미합중국 특허 제 4, 310, 519호 및 제 4, 429, 042호에는 아베르멕틴, 강력한 구충활성을 갖는 관련제제의 복합체 및, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스, 즉, 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31267, 31271 및 31272 균주의 호기성 발효에 의한 이들의 제조방법이 기술되어 있다. 인용된 나중의 두균주는 각각 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31267을 자외선 조사시켜 수득한 배양물을 냉각된 바이알 및 동결 건조 튜브에 담은 것을 나타낸다.
미합중국 특허원 제 886, 867호(1986. 7. 16 출원)와 유사한 유럽 공개특허 제 214, 731호(1987. 3. 18 공개)에는, 천연 또는 공지의 아베르멕틴에 관련되어 있으나, 25-위치에 신규한 치환체 그룹을 갖는 많은 화합물(본 명세서에서 비-천연 아베르멕틴이라 칭한다), 및 특정한 카복실산, 또는 이의 유도체 또는 전구체 존재하에 아베르멕틴 생성 미생물을 발효시켜 이들은 제조하는 방법이 기술되어 있다. 신규한 C-25 치환된 아베르멕틴 제조에 사용되는 에스. 아베르미틸리스 미생물은 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31267, 31271, 31272 및 NCIB 12121이다. 유럽 특허 제 214, 731호에 기술된 후자의 미생물은 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31271로부터 유도된다. 이는, 신규한 C-25 치환된 아베르멕틴을 반-정제된 배지에서 배양할경우, 그 수율을 개선시킨다. ATCC 3l267, 31271, 31272 및 NCIB 12121 각각은 또한 신규한 C-25 치환된 유도체외에 여러가지 양의 공지되어 있거나 또는 천연인, 25-치환체가 이소프로필 또는 (S)-그룹-부틸(1-메틸프로필)인 아베르멕틴을 제조할 수 있다.
(하기 일반식(I)에 묘사된)아베르멕틴의 탄소골격은 아세테이트 및 프로피오네이트와, L-이소로이신 (R=(S)-2급-부틸) 또는 L-발린(R=이소프로필)으로부터의 천연 아베르멕틴의 C-25 치환체로부터 유도된다. [참조 : Pisher and Mrozik, "Macrolide Antibiotics；Academic Press (1984) Ch. 14 ].
"공지의"또는 "천연의"아베르멕틴은 25-위치의 치환체가 이소프로필이거나 (S) -2급-부틸(1-메틸프로필)인 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31267, ATCC 31271 및 ATCC 31272에 의해 제조된 아베르멕틴을 의미한다. 25-위치의 치환체가 이소프로필 또는 2급-부틸(S-형)이 아닌 아베르멕틴을 본 명세서에서 신규하거나 비-천연의 아베르멕틴으로 명명한다.
상기 미합중국 특허에 인용한 에스. 아베르미 틸리스 균주는 본 명세서에서 C-076로 총괄적으로 기술된 부류의 물질을 생성한다. 이 부류는 C-076A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a 및 B2b로 기술된 8개의 명확하게 구분되나 밀접하게 관련된 화합물을 포함한다. "a"계열의 화합물은 25-치환체가 (S)-2급-부틸인 천연 아베르멕틴을 나타내고, "b"계열은 25-치환체가 이소프로필인 천연 아베르멕틴을 나타낸다. 명칭 "A" 및 "B"는 5-치환체가 각각 메톡시 또는 히드록시인 아베르멕틴을 나타낸다. 최종적으로, 번호"1"은 이중결함이 22-23위치에 존재하는 아베르멕틴을 나타내고 ; 번호 "2"는 22-위치에 수소 및 23위치에 히드록시를 갖는 아베르멕틴을 나타낸다.
본 출원에서, 이러한 확인수단은 비-천연 아베르멕틴의 25-치환체의 관점에서 사용되지 않는다. 확인수단 A1, A2, B1 및 B2는 상기 천연 아베르멕틴에 상응하는 구조식을 갖는 비-천연 아베르멕틴을 나타내도록 보유된다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)[참조 : Willecke and Pardee, J. Bio1. Chem,246,5264-72(197l)] 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)[참조 : Martin et al., J. Bacterio1ogy,l15 198-204(1973)]가 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍된 돌연변이체를 생성하는 것은 보고되었으나, 스트렙토 마이세스는 그렇게 보고되지 않았다.
사실상, 아베르멕틴 아글리콘 A1a 및 A2a만을 생성하는 돌연변이체 균주인 에스. 아베르미틸리스Agly-1이보고되어 있다[참조 : Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), l494-1498(1985)].또한, 아베르멕틴 아글리콘 B성분의 생성을 증가시키는 사이펀진( sinefungin)존재하의 S. 아베르미틸리스 Agly-1의발효도 보고되어 있다. 마찬가지로, 아베르멕틴을 많이 생성하는 균주인 에스. 아베르미틸리스 O8은, O-메틸 전이효소로서 사이펀진 존재하에 발효시킬 경우, C-5 위치에서 아글리콘 및 올레안드로스 디사카라이드 잔기에 O-메틸그룹이 결핍된 아베르멕틴을 생성시킨다.
미합중국 특허 제 4, 378, 353호에는 C-076 관련화합물 및, 자외선 조사에 의해 수득된 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272의 돌연변이체 균주인 MA-5218을 배양시켜 이들을 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 돌연 변이체는 ATCC 3l780로서 확인되었다. 상기 돌연변이체에 의해 생성된 C-076 관련 화합물은 C-076 푸란환이 결핍되어 있다. 이외에, 다른 화합물에서 5-위치 그룹이 케토그룹으로 산화되는 반면, 보고된 특정한 화합물에서, 올레안드로스 당 잔기중 하나 또는 둘다가 분열된다.
O-메틸그룹이 결핍된 아베르멕틴을 생성하는 에스. 아베르미틸리스의 0-메틸 전이효소 돌연변이체 세종류가 보고되어 있다[참조 : Ruby et al., 6th Intemational Symposium on the "BiologyofActinomycetes", Debrecen, Hyngany, Aygust 26-30(1985) 및 by Schulman et al., AntimicrobialAgents and Chemotherapy 31, 744-7(l987)]. 첫번재 종류는 마크로사이클릭 락톤환의 C-5 히드록실을 메틸화할 수 없기 때문에 주로 B 아베르멕틴을 생성한다. 두번째 종류는 3'-O, 3"-O-비스-디메틸아베르멕틴을 생성하며, 이는 디메틸아베르멕틴이라 칭한다. 세번째 종류는 어떤 위치에서도 메틸화시킬 수 있다.
문헌[Schulman et a1., Fed. Proc. 44, 931(1985)]에 효소 아베르멕틴 B-O-메틸 전이효소에 의한 아글리콘 잔기의 C-5 히드록시그룹의 메틸화를 억제하는 사인펀진, S-아데노신에티오닌 및 S-아데노실호모시스테인과 같은 물질 존재하에 에스. 아베르미틸리스를 발효시킴으로써 B 아베르멕틴이 증가하여 생성되는 것이 기술되어 있다. O-메틸 전이효소 활성이 부족하고 증가된 양의 아베르멕틴 B성분을 생성하는스트렙토마이세스 아베르미틸리스 돌연변이체도 또한 기술되어 있다[참조 : Schulnmn et al., inAutimicrobial Agents and Chemotherapy 29, 620-624(1986) ] .
에스. 아베르미틸리스의 돌연변이 유발(mutagenesis)에 의해 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍된 돌연변이체가 생성된다. 돌연변이체는 발효공정중에 R이 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸인 부가화합물 RCOOH 또는 RCOOH로 전환될 수 있는 화합물 존재하에 상당량의 천연 아베르멕틴을 생성시킬 능력이 없어진다. 그러나 놀랍게도, 예상외로 돌연변이체는, R이 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸 또는 본 명세서에 기술된 다른 그룹인 부가화합물 R-COOH, 또는 상기 RCOOH의 전구체 존재하에 발효될 경우, 천연및 비-천연 아베르멕틴을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 놀라운 것은 측쇄-2-옥소 산 탈수소효소 활성만이 결핍되고 L-이소로이신, L-로인 또는 L-발린을 분해할 수 없는, 본 명세서에 기술된 돌연변이체가 천연 아베르멕틴의 존재와 상관없이 비-천연 아베르멕틴을 생성하여 광범위한 종류의 화합물을 아베르멕틴 생합성 경로로 동화시킬 수 있다는 것이다.
이와 같이 생성된 단일차단된 돌연변이체의 돌연변이 유발로 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성 및 아베르멕틴 B-O-메틸 전이효소 활성이 모두 결핍된 돌연변이체가 생성된다. 상기 이중 차단된 들연변이체는 놀랍게도 예상외로 R이 상기 정의한 바와같은 부가 화합물 R-COOH 존재하에 배양될 경우, 실질적으로 천연 및 비천연 B 아베르멕틴만을 생성한다.
상기한 바와같이, 천연 아베르멕틴은 8개의 명확하게 구분되나 밀접하게 관련된 일반식(I)(여기서, R은이소프로필 및 (S)-2급-부틸이다)화합물의 복합혼합물로서 생성된다. 이들은 실질적으로 순수한 형태로 회복되지만[참조 : 미합중국 특허 제 4, 429, 042호], 방법론은 어렵다. B 아베르멕틴은 일반적으로 상응하는 A 아베르멕틴보다 더 큰 구충활성을 나타낸다. 유럽 특허 제 214, 731호에 기술된 방법에 따른 비-천연 아베르멕틴(A 및 B 성분)의 생성으로 에스. 아베르미틸리스 미생물의 세포 및 이들의 생성에 사용되는 배지중 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 및 아미노산 L-발린 및 L-이소로이신의 존재에 기인하여 천연 아베르멕틴도 다양한 양으로 생성할 수 있다.
생물학적으로 더 효과적인 천연 또는 비-천연 아베르멕틴의 B 성분을 생성하고, 생성물의 수 및 복합성을 최소화하고 이렇게 하여 선택된 아베르멕틴의 순도를 증가시키고 그것에 의해 분리절차를 단순화하는 능력을 갖게 하는 것이 바람직한 목표이다.
측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍된 에스. 아베르미틸리스 균주는 에스. 아베르미틸리스의 아베르멕틴 생성 균주를 돌연변이시키거나, 특히 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC31272 또는 NOIB 12121을 돌연변이시킴으로써 생성된다. 돌연변이체는 이소프로필 또는 2급-부틸(S-형)그룹을 포함하는 지방산 또는 이의 전구체를 돌연변이체가 발효되는 배지에 가할 경우를 제외하고 천연 아베르멕틴을 합성할 수 없다. 이들은 적절한 프라이머(Primer)산 또는 발효공정중 이로 전환가능한 화합물을 함유하는 영양배지중에서 수성 호기성 조건하에 발효될 경우 천연 및 비-천연 아베르멕틴을 생성할 수있다.
측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성의 결핍을 특징으로 하는 돌연변이체는l4CO2검정을 기초로하여 변이유발화 집락으로부터 분리된다. 이 절차에서 [14C-1]-2-옥소이소카프로산 또는 [14C-1]-2-옥소-3-메틸-발레르산 또는 [14C-1]-2-옥소-3-메틸부티르산의 기질로부터의 투과성 세포에 의한14CO2만출의 부재는 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성의 부재를 나타낸다.
놀랍게도 예상밖으로 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍된 본 명세서에 기술된 돌연변이체는 아베르멕틴, 특히 비-천연 아베르멕틴을 생성하는 능력을 보유한다. 돌연변이체가 통상적인 배지상에서 배양될경우 천연 지방 아실 조효소 A 유도체를 생성할 수 없는 것은 세포막 통합성이 상기 유도체에 의존하거나, 전자의 돌연변이체에 의한 2-옥소 산 축적으로 세포독성이 유발될 경우 치명적인 돌연변이일 수 있다. 또한, 돌연변이체가 회피되는 효소활성을 필요로 하는 바와같이 L-이소로이신 및 L-발린 분해대사로 아세틸 CoA 및 프로피오닐 CoA를 합성할 수 없는 것으로 예측된다. 상기한 바와같이, 아베르멕틴 생합성에의 이들 아실 CoA 유도체의 필요성으로 인해 돌연변이체가 놀랍게도 그 경우가 아닌 비-천연 아베르멕틴생성에서 심하게 손상될 것으로 기대된다.
본 명세서에 기술된 돌연빈이체중 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성 결핍으로 인하여 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린이 분해되어 측쇄 지방 아실 CoA가 합성되는 것이 방지되고, 따라서 이에 의해 산R-COOH(여기서 R은 (S)2급-부틸 또는 이소프로필이다) 또는 이의 전구체를 발효배지에 가할 경우를제외하고 천연 아베르멕틴이 합성된다.
측쇄 2-옥소 산 탈수소활성이 결핍된 돌연변이체가 더 돌연변이되면 이외에 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성이 결핍된 돌연변이체가 생성된다. 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성이 결핍된 돌연변이체는 아베르멕틴의 아글리콘 잔기의 C-5 산소를 메틸화시킬 수 없다. 이러한 활성이 결핍된 돌연변이체는 A 아베르멕틴의 생성을 방지하여 주로 B 아베르멕틴만을 생성한다.
본 발명에는 또한 그의 외형 또는 생리학적 유형에 관계없이, 본 명세서에 기술된 종으로부터 헥산 또는 동등한 물질을 사용하여 변형, 변환, 유전적 재결합 또는 다른 유전적 방법으로 개선되어 본 명세서에 기술된 돌연변이체의 특성을 획득할 수 있는 유기체도 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "아베르멕틴" 또는 "아베르멕틴들"은 25-치환체(R)이 본 발명의 에스. 아베르미틸리스로 상기 위치에 축적가능한 그룹일 수 있는 하기 일반식(I)의 화합물을 나타낸다.
본 명세서에 기술된 돌연변이체는 본 명세서에 기술되고 예시화된 방법으로 비-천연 B 아베르멕틴을 생성하는데 매우 유용하다. 이들은 특히 바람직한 아베르멕틴, 즉 C-25 치환체가 C1-C4알킬그룹, 1-메틸티오에틸, 또는 5- 또는 6-원 산소 또는 황 헤테로사이클릭그룹, 특히 3-티에닐 또는 3-푸릴로 임의 치환된 C4-C6사이클로알킬 또는 사이클로알케닐인 화합물의 제조에 유용하다.
종 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 일종을 생성하는 아베르멕틴의 돌연변이는 자외선 조사, X-선조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 에틸메탄설포네이트, 아질산 및 질소[예 : N-메틸비스(2-클로로에틸)아민]등의 처리를 포함하는, 여러가지 돌연변이체를 사용한 공지의 방법으로 수행된다. 돌연변이유발은 천연 아베르멕틴, 즉 에스. 아베르미틸러스 ATCC 31272를 생성할 수 있는 에스. 아베르미틸리스의 포자 또는 영양배지에서 수행될 수 있다.
본 분야의 전문자에서 널리 공지된 방법에 따라, 돌연변이 유발화 집락이 선택된 [14C-1]-2-옥소 측쇄산으로부터14CO2를 생성하기 위해 임의로 번이유발화된 많은 박테리아 집락을 가려낼 수 있는 생물화학적 검정방법을 기초로하여 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소의 결핍에 사용하기 위해 선택된다[참조 : Tabor et al., J. Bact.128,485-486,1976].
이 방법은 적절한 영양배지상 마이크로티터플 레이트의 웰(weI1)에 돌연변이체 집락을 성장시키고, 톨루엔을 세포에 침투시킨 후 각 웰에[14C-1]-2-옥소 산(예 : 2-옥소이소카프로산)을 가하고14CO2의 발효상 대기를 확인하는 것을 포함한다. 이와는 달리, [14C-1]-2-옥소-3-메틸발레르산 또는 [14C-1]-2-옥소-3-메틸부티르산을 [l4C-1]-2-옥소-이소카프로산 대신 사용할 수 있다.14CO2의 생성은 통상적으로각 웰상에 습윤 Ba(CH)2포화 여과지를 두어 방출된l4CO2를 포획하고 경우에 따라 방사선 자동사진법으로 Bal4CO3를 검측하여 확인한다. 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍된 돌연변이체는 오오토다이아그램이 브랭크(비접종된) 대조용과 유사하다 : 즉 추가의 Ba14CO3가 돌연변이체에 의해 생성되지 않는다.
이와 달리 수득된 돌연변이체를 상기한 돌연변이체를 사용하여 추가로 돌연변이 유발시킨다. 돌연변이유발화집락을 첨가된 전구체(예 : 2-메틸부티르산) 존재하에 발효시킨후 크로마토그래피(박층 또는 고성능 액체 크로마토그래피)시켜 아베르멕틴 B O-메틸전이효소 활성 결핍을 검정한다. 아베르멕틴 A 화합물은 본래 이러한 돌연변이체의 발효브로스에 없다.
돌연변이유발에 의한 주어진 미생물 균주의 원하는 대립형질 생성외에, 원형질체 융합으로 한균주의 생성되고 확인된 원하는 대립형질이 다른 균주의 염색체로 도입된다. 예를들면, 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 및 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소가 결핍된 에스. 아베르미틸리스 균주는 전술한 활성이 있는 에스. 아베르미틸러스균주와 원형질체 융합되어 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성만 결핍된 에스. 아베르미틸리스균주를 생성할 수 있다. 본 분야의 전문가에게 인지된 바와같이, 원형질체 융합기술로 선택한 개산라인으로부터의 원하는 대립형질을 단일균주로 배합시킬 수 있다.
본 발명의 돌연변이체의 형태 및 배양 특성을 일반적으로 미합중국 특허 제 4, 429, 042호에 기술된 바와같다. 본 발명의 돌연변이체의 뚜렷한 특성은 본 명세서에 기술된 바와같이 결정되는 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성 및 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성의 결핍이다. 상기 활성이 결핍되면 돌연변이체를 R이 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸인 지방산 RCOOH 또는 발효중 상기 RCOOH로 전환가능한 화합물이 거의 없는 한정된 배지에서 성장시킬 경우 천연 B 아베르멕틴을 생성할 수 없다. 계통학적 연구가 AmericanType Culture Collection에 의해 수행되어, 상기14CO2검정으로 선택된 돌연변이 균주 I-3의 특성이 미합중국 특허 제 4, 429, 042호에 기술된 모체 ATCC 31272 균주와 특정한 예외를 제외하고 밀접한 관계가 있음을 확인했다. 따라서, 돌연변이 균주 I-3(ATCC 53567[한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988. 1. 9])은 ATCC 31272 보다 훨씬 적은 포자쇄를 형성한다. 출원인에 의한 실험에서 라피노스는 I-3의 성장을 뒷받침하지 않는 것으로 나타난다. 우리는 미합중국 특허 제 4, 429, 042호에 기술된 ATCC 31272의 설명과는 대조적으로, 단독 탄소원인 슈크로즈로 돌연변이체 또는 ATCC 31272의 성장을 탐지할 수 없다. 돌연변이체 I-3은 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍되어 있다. 측쇄 2-옥소산 탈수소효소 활성 및 아베르멕틴 B O-메틸 전이 효소 활성이 결핍된, 돌연변이체 I-3(ATCC 53567[한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988. 1. 9])의 추가 돌연변이유발로 생성되는 본 발명의 이중으로 결핍된 돌연변이체, 에스. 아베르미틸리스 7881은 돌연변이 균주 I-3과 같은ATCC 31272와 계통학적으로 유사한 관련이 있다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 I-3 및 7881은 부다페스트 조약하에 기탁을 수행하기 위해 인정된 기탁 기관인, 메릴랜드 로크빌레 소재의 American Type Culture Co1lection에 기탁되어 있으며 이 출원에 특허가 허가될 경우 공공기관이 이로부터 수득할 수 있다. 이들의 명칭은 각각 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 53567[한국기탁번호 : KFCC-l0493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988. 1. 9] 및 ATCC 53692[한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988. 1. 9]이다. 이 기탁명은 이 출원이 미결인 동안 37 CFR l.14 및 35 USC 122하에 여기에 명명된 미합중국 특허와 상표청장에의해, 그리고 이 출원의 상대물 또는 이의 결과물이 출원되는 나라의 외국 특허법에 따라 결정되는 것에 이용가능하다. 기탁된 미생물의 공공기관에의 이용가능성에 대한 모든 제한은 특허를 허가할 경우 변경이 없도록 없어질 것이다.
에스. 아베르미틸리스 ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 및 NCIB 12121 각각은 일반식(I)의 화합물, 천연 아베르멕틴을 생성한다.
상기식에서, 22-23 위치의 점선은 임의 이중결합을 나타내고 ; R1은 히드록시이고 이중결합이 존재할경우에만 존재하며 ;
4'-(알파-L-올레안드로실)-알파-L-올레안드로실 옥시이고 ; R3는 수소 또는 메틸이며 ; R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이다.
미합중국 특허 제 4, 285, 963호에 25-위치가 메틸 및 에틸그룹으로 치환되고, R1이 히드록시이며, R3가 메틸인 일반식(I)의 아베르멕틴이 기술되어 있다.
본 명세서에 언급된 비-천연 아베르멕틴에서, R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸 이외의 치환체이며 하기에 정의하는 바와 같다.
일반식(I)의 생합성에 이용하기 위해 필수적인 화합물은 에스. 아베르미틸리스 세포 및 배지중에 생성 된다. 이들 화합물은 L-발린 및 L-이소로이신을 분해시키거나, 생성물과 조효소 A와의 커플링을 수반하면서 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소에 의한 2-옥소 산의 탈카르복시화를 거쳐 이들의 상응하는 2-옥소 산으로부터 생성된다. 이들의 존재로 이소프로필 및 일반식(I)의 (S)-2급-부틸 화합물이 동시에 생성된다. 이것은 물론 (S)-2급-부틸 유도체로부터 이소프로필을 분리하는데 문제를 야기시킨다.
본 발명의 돌연변이체를 적절한 프라이머 화합물을 함유하는 영양배지에서 발효시킬 경우, 이는 일반식(I)의 화합물 또는 이 경우에 더 통상적인 바와같이, R이 사용된 프라이머 화합물에 상응하는 일반식(I)의 두 화합물의 혼합물을 생성한다. 편의상 통상적으로 미합중국 특허 제 4, 429, 042호에 사용된 명칭에 따라, B-아베트엑틴 Bl 및 B2로 칭해지는 2개 이하의 생성물이 생성될 수 있다. "R-그룹은 물론 C-25 치환체를 말한다. 예를들면, R이 사이클로팬틸일 경우, 가능한 2개의 아베르멕틴은 다음과 같다 :
비 천연 아베르멕틴에서, 일반식(I)의 C-25 치환체 "R"은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이외의 것이다.
이중 결합이 존재하고 OH가 없는 일반식(I)의 화합물은 또한 R1이 OH이고 이중결합이 없는 일반식(I)의 상응하는 화합물을 탈수화반응시켜 제조할 수 있다. 반응은 먼저 예를들어 t-부틸디메틸실릴옥시 아세틸 유도체와 같은 5 및 4"-위치에서 히드록시그룹을 선택적으로 보호한 후, 치환된 티오카보닐할라이드[예 : (4-메틸페녹시)티오-카보닐 클로라이드와 반응시키고 고비점 용매(예 : 트리클로로벤젠)중에 가열시켜 탄수화반응에 영향을 미침으로써 수행된다. 생성물은 최종적으로 탈보호되어 불포화 화합물이 수득된다. 이들 단계는 적절한 시약 및 반응조건과 함께 미합중국 특허 제 4, 328, 335호에 기술되어 있다.
R1이 H이고 이중결합이 없는 일반식(I)의 화합물은 이중결합이 존재하고, R1이 없는 상응하는 화합물을 적절한 촉매를 사용하여 선택적으로 촉매 수소화시켜 제조할 수 있다. 예를 들면, 환원반응은 1980년 4월 22일의 유럽 공개특허원 제 001689호 및 이의 상대출원 미합중국 특허 제 4, 199, 569호에 기술된 트리스(트리페닐포스틴)로듐(I) 클로라이드를 사용하여 수행할 수 있다.
R2가 H인 일반식(I)의 화합물은 R2가 4'-(알파-L-올레안드로실)-알파-L-올레안드로실옥시인 상응하는 화합물을 수성 유기 용매중에서 산으로 온화하게 가수분해시켜 4'-(알파-L-올레안드로실)-알파-L-올레안드로스그룹을 제거하여 13-위치에 히드록시그룹을 갖는 아글리콘을 수득하고 : 그후 이것을 예를 들면 벤젠 설포닐 할라이드와 반응시켜 할로겐화시켜 13-데옥시-13-할로유도체를 수득하고 최종적으로 이 유도체를 예를 들면 트리부틸틴 하이드라이드를 사용하여 선택적으로 환원시켜 제조한다. 원치않는 부반응을 피하기 위하여, 예를 들면 3급-부틸 디메틸실릴 그룹을 사용하여 존재할 수 있는 어떤 다른 히드록시그룹을 보호하는 것이 바람직하다. 그후 이것을 미량의 산을 함유하는 메탄올로 처리하여 할로겐화 또는 환원단계후 즉시 제거한다. 이들을 수행하기 위한 이들 모든 단계와 적절한 시약 및 반응조건이 유럽 공개특허원 제0002615호에 기술되어 있다.
천연 및 비-천연 아베르멕틴을 생합성하기 위해 본 발명의 에스.아베르미틸리스로 이용할 수 있는 화합물은 일반식(II-A)의 화합물 및 발효공정동안 일반식(II-A)의 화합물로 전환될 수 있는 화합물이다.
R - COOH (II -A)
상기 화합물을 본 명세서에서 "프라이머 화합물"로 칭한다. 일반식(II-A)에서, R은 알파-측쇄그룹이며, 그룹에 부착된 이의 탄소원자는 수소이외의 2개이상의 원자 또는 그룹에도 부착된다. 이 정의는 비사이클릭쇄 또는 사이클릭환의 원으로 황 또는 산소 헤테로원자를 임의로 함유하는 것을 포함하는 포화 및 불포화 어사이클릭 및 사이클릭그룹을 포함한다.
더욱 특히 C-25 치환체가 되는 R은 알파-측쇄 C3-C8알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 또는 알킬티오 알킬그룹 ; 알킬그룹이 알파-측쇄 C2-C5알킬그룹인 C5-C8사이클로알킬알킬그룹 : 메틸렌 또는 하나 이상의 C1-C4알킬그룹 또는 할로원자(플루오로, 클로로, 요오드 또는 브로모)로 임의 치환될 수 있는C3-C8사이클로알킬 또는 C5-C8사이클로알케닐그룹 ; 또는 포화되거나 전체 또는 부분 불포화될 수 있고 하나이상의 C1-C4알킬그룹 또는 할로원자로 임의 치환될 수 있는 헤테로사이클릭 환을 포함하는 3 내지 6원 산소 또는 황일 수 있다.
발효공정에서 RCOOH로 전환가능한 화합물, 즉 전구체는 일반식(II-B)의 화합물이다.
R-(CH2)n-Z (II-B)
상기식에서, R은 상기 정의한 바와 같고 ; n은 0, 2, 4 또는 6이며 ; Z은 -CH2OH,-CHO,-CH2NH2,-COOR4또는 -CONHR5(여기서, R4는 H 또는 (C1-6)알킬이고, R5는 수소,(C1-4)알킬 또는 아미노산, 특히 아스파르트산, 글루탐산 및 메티오닌의 잔기, 예를 들면 각각 -CH(COOH)CH2COOH,-CH (COOH) (CH2)2COOH 및 -CH (COOH) (CH2)2SCH3이다.
본 발명에는 또한 일반식(II-A)의 화합물의 이성체 형태, 발효공정중 이로 전환가능한 화합물 및 본 명세서에 기술된 방법으로 이들을 사용하여 생성된 C-25위치의 이성체 아베르멕틴도 포함된다.
본 발명의 방법은 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성 및 아베르멕틴 B-C-메틸 전이효소 활성이 결핍된 에스.아베르미틸리스 균주를 중화가능한 질소, 탄소, 무기염의 미공급된 및 일반식 RCOOH의 화합물 또는 발효중에 상기 화합물로 전환가능한 화합물(즉, 전구체)을 함유하는 수성 영양배치에서 호기성 발효시킴으로써 수행된다. 산 또는 이로 전환가능한 화합물을 접종시 또는 발효중의 간격에 발효물에 가한다. 아베르멕틴 생성물의 생성은 발효물에서 샘플을 제거하고 유기용매로 추출하고 크로마토그래피, 예를 들면 고압액체크로마토그래피시켜 생성물의 외형을 관찰하여 점검될 수 있다. 생성물의 산출이 최소화 될때까지, 일반적으로 4 내지 15일간 계속해서 배양시킨다.
프라이머 화합물(카복실산 또는 이로 전환가능한 화합물)의 바람직한 각 첨가량은 ℓ당 0.05 내지 3.0g이다. 프라이머 화합물은 발효물에 연속적으로, 간헐적으로 또는 한번에 가해질 수 있다. 산(RCOOH)은그 자체 또는 염(예 : 나트륨, 리튬 또는 암모늄염 또는 상기 정의한 바와 같은 산으로 전환가능한 화합물로서 가한다. 산은 고체일 경우 바람직하게는 물 또는 (C1-4) 알코올과 같은 적절한 용매중에 용해한다.
발효에 사용되는 매질은 특히 C-25 치환체가 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸인 경우, 동화가능한 탄소, 질소 및 미량원소 공급원을 함유하는 통상적인 매질일 수 있다. C-25 치환체가 비-천연그룹일 경우, 즉 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이 아닐 경우, 발효매질은 선택성분이 결핍되거나, R잔기가 이소프로필또는 (S)-2급-부틸인 프라이머 화합물을 최소량만으로 함유하는 매질이다.
바람직하게는 24 내지 33℃에서 수일간 발효시킨 후, 발효육즙을 원심분리시키거나 여과시키고 균사체 덩어리를 바람직하게는 아세톤 또는 메탄올로 추출한다. 용매 추출물을 농축시키고 그후 원하는 생성물을 수-불혼화성 유기용매(예 : 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부탄올 또는 메틸 이소부틸케톤)로 추출한다. 용매 추출물울 농축시키고 조생성물을 필요할 경우 크로마토그래피, 예를 들면 제조가역상, 고압 액체크로마토그래피시켜 추가로 정제한다.
생성물은 일반적으로 R2가 4'-(알파-L-올레안드로실) -알파-L-올레안드로실옥시이고, R1이 OH이고 이중결합이 없거나 R1이 없고 이중결합이 있으며 R3가 H인 일반식(I)의 화합물의 혼합물로 수득된다. R3가 CH3인 화합물은 본래 없다. 그러나, 각 화합물의 비율은 특정한 돌연변이체 및 사용된 프라이머 화합물 및 사용조건에 따라 다르다.
R그룹의 원은 즉, 그것이 R-COOH로부터 직접 수득되거나 상기 전구체중 하나 또는 어떤 전구체로부터 생성되건 간에 아베르멕틴의 생성에 중요하지 않다. 본 발명의 이들은 생성하기 위한 방법의 임계 필요 조건은 바람직한 R그룹이 발효공정중 본 발명의 에스.아베르미틸리스 균주에 유용하게 되는 것이다.
적합한 화합물은 다음과 같다 : 2, 3-디메틸부티르산, 2-메틸헥사노산, 2-메 틸펜트-4-에노산, 2-사이클로프로필 프로피온산, 4, 4-디플루오사이클로헥산 카복실산 리튬염, 4-메틸렌사이클로헥산 카복실산, 3-메틸사이클로헥산 카복실산(시스/트랜스), 1-사이클로펜텐 카복실산,1-사이클로헥센 카복실산, 테트라히드로피란-4-카복실산, 티오펜-2-카복실산, 3-푸로산 2-클로로티오펜-카복실산, 사이클로부탄 카복실산, 사이클로펜탄 카복실산, 사이클로헥산 카복실산, 사이클로헵탄 카복실산, 2-메틸사이클로프로판 카복실산, 3 -사이클로헥산-1-카복실산, 2 -메틸티오프로피온산, 2-메틸-4-메톡시부티르산, 티오펜-3-카복실산, 히드록시메틸사이클로로펜탄, 3-티오펜카복스알데하이드, 3-사이클로헥실프로피온산, 3-사이클로펜틸프로피온산, 히드록시메틸사이클로부탄, 테 트라히드로티오펜-3-카복실산, 3-사이클로펜틸-1-프로파놀, 3-메틸사이 클로부탄 카복실산 리튬염, 3-플루오로사이클로부탄카복실산, 3-메틸렌사이 클로부탄 카복실산 리튬염, 2-메틸-4-베틸티오부티르산, 테트라히드로티오피란-4-카복실산사, 이클로부틸메틸아민, 에틸사이클로부탄 카복실레이트, 4-히드록시메틸사이클로펜텐, 2-(3-티오펜카보닐)프로피온산 에틸 에스테르 S-2-메틸펜다노산, R-2-메틸펜타노산.
세종류의 O-메틸 전이효소 돌연변이체는 본 명세서에 기술된 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 음성 돌연변이체로부터 수득할 수 있다. 활성 측쇄 2-옥소 산탈수소효소 활성에 있어서의 돌연변이체와 하나이상의 O-메틸전이효소 돌연변이체가 결합된 돌연변이체는 에스.아베르미틸리스 균주를 생성시켜 RCOOH 화합물 또는 발효공정중에 RCOOH로 전환가능한 화합물을 공급할 경우주로 모두 메틸화되지 않은 B아베르멕틴, 디메틸아베르멕틴 또는 아베르멕틴을 생성할 것이다. 상기 돌연변이체는 본 명세서에 기술된, 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성이 결핍된 돌연변이체를 자외선 및/또는 화학적 돌연변이 유발소(예 : N-메틸-N-니트로소우레탄, 니트로소구아니딘 또는 상기 열거한 것과 같은 다른 제제)를 사용하여 돌연변이유발시킴으로써 수득된다. 이와는 달리, 하나이상의 O-메틸 전이효소가 결핍된 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 양성 돌연변이체는 자외선 또는 돌연변이유발제로 처리하여 돌연변이되어 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 음성돌연변이체를 생성할 수 있다.
이러한 돌연변이체로 생성된 비-천연 아베르멕틴은 아그리콘 잔기의 C-5위치 및/또는 올레안드로스 잔기의 C-3' 및/또는 C-3' 위치에 히드록시그룹이 존재함을 특징으로 한다.
상기 기술된 돌연변이 체는 문헌[Schulman etal., Antinicrobial Agents and Chemotherapy, 29 620-624(1986)]에 기술된 방법으로 확인된다. 이들은 공지된 아베르멕틴과 같이 동일한 목적 및 동일한 방법에 유용하다.
이와는 달리, 올레안드로스 디사카라이드 잔기에 메틸그룹이 부족한 것을 포함하는 증가된 량의 아베르멕틴은 활성 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소가 부족한 본 발명의 돌연변이체를 , O-메틸 전이효소 활성을 억제하는 사인펀진, S-아데노실에티오닌 또는 S-아네노실호모시스테인과 같은 물질의 존재하에 발효시킴으로써 생성된다.
본 발명의 화합물은 특히 구충제, 외부기생충 살충제, 살충제 및 살비제로 유용한 고 활성 구충제이다.
그러므로, 화합물은 특히 선충류로 기술되어 기생충의 그룹으로 가장 흔히 발생하고 가축 및 가금류에 영향을 미침은 물론 돼지, 양, 말 및 소의 심한 경제적 손실을 야기시킬 수 있는 기생층증을 포함하는 내부기생충에 의해 야기되는 여러가지 질병을 치료하는데 효과적이다. 이 화합물은 또한 예를 들면, 개중의 디로필라리아 (Diroti1aria), 안실로스토마(Ancylostoma), 네카토르(Nacatis), 아스카리스(Ascaris), 스트롱일로네스(Strongyloides), 트린키넬라(Trinchihella), 카필라리아(CapiIlaria), 트리커리스(Trichuris), 엔테로비우스(Enterobius)와 같은 위장내 기생충을 포함하는 인간에게 감염될 수 있는 여러가지 기생충 및 애벌레 해충 및 장관외 단계의 스트롱일로이드(Strongyloides) 및 트리키넬라(Trichinella)와 같은 혈액 또는 다른 조직 및 기관에서 발견되는 개생충을 포함하는 여러가지 종류의 동물에 영향을 주는 다른 선충류에 대해서도 효과적이다.
이 화합물은 또한 소 및 말에 영향을 줄 수 있는 참진드기, 진드기, 이 벼룩, 검정파리, 흡혈곤충 및 유주성 쌍지 유충과 같은 동물 및 새의 특정한 절지동물 외부기생충을 포함한 외부기생충 감염을 치료하는데에도 가치가 있다.
이 화합물은 또한 거미, 진디, 쐐기벌레와 같은 저장 곡류 및 농작물의 해충 모충에 대해 유용함은 물론 바퀴, 의복의 좀, 카팻트, 딱정벌레 및 집파리와 같은 가정의 모충 및 메뚜기와 같은 유주성 절지동물에 대해 활성이 있는 살충제이다.
일반식(Ⅰ)의 화합물은 직면한 특정 용도 및 처리되는 숙주동물의 특정한 종 및 포함되는 기생체 또는 해충에 적합한 제제로 투여된다. 구충제로 사용하기 위해, 이 화합물을 캅셀제, 거환제, 정체 또는 액체 음약제 형태로 경구투여하거나, 이와는 달리 이들을 주사하거나 베렛으로 투여할 수 있다. 이러한 제제는 표준수의학적 실시에 따라 통상적인 방법으로 제조된다. 그러므로 캅셀제, 거환제 또는 정제는 활성성분을 적절한 미분 희석제 또는 추가로 붕해제를 함유하는 담체 및/또는 전분, 락토즈, 탈크, 스테아르산 마그네슘등과 같은 결합제와 혼합하여 제조할 수 있다. 음약제제는 활성성분을 분산제 또는 습윤제 등과 함께 수성용액중에 분산시켜 제조할 수 있으며, 주사용 제제는 다른 물질, 예를 들면 용액이 혈액과 등자성이 되기에 충분한 염 또는 글루코즈를 함유할 수 있는 멸균용액형태로 제조될 수 있다. 이들 제제는 처리되는 숙주동물의 종류, 감염 정도 및 타입 및 숙주의 체중에 따라 함유하는 활성 화합물의 중량이 다르다. 경구로 투여하기 위해서는 일반적으로 1 내지 5일간 단일 용량 또는 분배용량으로 체중kg당 약 0.01 내지 10mg의 용량이 충분하나, 물론 더 많거나 적은 용량범위를 나타낼 경우도 있으며 이것도 본 발명의 영역에 포함된다.
또한, 화합물을 동물사료에 넣어 투여할 수 있고, 이를 위하여 농축된 급속 첨가물 또는 예비혼합물을 정규동물사료와 혼합하기 위해 제조할 수 있다.
살충제로 사용하는 농경 해충을 처리하기 위해, 화합물을 표준농경실시에 따라 분무제, 산제, 유화제등으로 적용한다.
아베르미틸리스 Ⅰ -3 (ATCC 53567[한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988. 1. 9])의 제조
[단계 1]
에스. 아베르미틸리스 ATCC3127를 뉴패치(New Patch)아가 배지에서 30℃의 온도로 12일간 합류잔듸로 성장시킨다. 다음 성분을 함유한다.
V-8 즙 200ml
CaCO33g
아가 15g
H2O 1000ml
영양 브로스 1.0g/l
나트륨 아세테이트 1.4g/l
이소발레르산 50mg/L
이소발레르산 50mg/L
메틸부티르산 50mg/L
이소로이신 250mg/L
로이신 250mg/L
발린 250mg/L
미량성분 용액 1ml/L
* 8가지 야채즙(토마토, 당근, 셀러리, 사탕수수, 파슬리, 상치, 워터크레스 및 시금치)의 혼합물+염, 아스코르브산 및 시트르산 및 천연향료. 뉴저지 캄덴 소재의 CampbeI1 Soup Company 제품.
** 미량성분용액의 조성
FeCl3·6H2O 2.7g
MnSO4·H2O 4.2
CuSO4·5H4O 0.5
CaC1211.0
H3BO30·62
CoC12·6H2O 0.24
ZnC120.68
Na2MoO40.24
상기 용액을 0.1N HCl 1l에 용해한다. 포자를 이러한 3개의 플레이트로부터 수득하여 pH 9.0의 0.05M트리스-말레산 완충제 20ml/에 현탁시킨다.
[단계 2]
포자 현탁액 10ml를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소-구아니 딘(NTG)10mg을 함유하는 바이알에 가한다. 바이알을 배양하고 28℃에서 60분간 진탕하고 그후 포자를 1% Nacl 용액으로 넉넉히 세척한다.
[단계 3]
세척된 포자를 1% NaCl에 현탁시키고 동리한 용적의 80% 에틸렌 글리콜과 혼합한다. 이 현탁액을 -2O℃에 보관하고 돌연변이체를위해 선별되는 세포원으로사용한다. 이는 발아될경우 약 104집락을 형성한다.
이 포자주를 YPD 플레이트에 퍼뜨려서 플레이트당 약 l00 집락을 형성시킨다(YPD 배지는 각 10g/1의효모 추출물, 박토 펩톤*및 덱스트로즈 : 및 15g/1의 박토아가*를 함유하며, 압열멸균시키기 전에 pH 6.9로 조정된다). 아스테리스크로 시파되는 성분은 미시간 48238, 디트로이트 소재의 Difo Laboratories 제품이다.
[단계 4]
28℃에서 2 내지 3분간 성장시킨 후 플레이트에서 한 집락을 채집하여 96개의 표준 웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 둔다. 또한, 소량의 집락을 막 제조한 아가 배지에 두어 돌연변이체가 동일할 경우 생육성 세포원으로 제공한다.
[단계 5]
각 웰에 1% 글루코즈, 0.1% 카사미노산 및 각 0.01%의 이소발레르산, 이소부티르산 및 2-에틸부티르산을 함유하는 액체 M9염 배,지 약 75μ1를 가한다. 28℃에서 수일간 배양한후, 셀을 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소의 존재에 대해 검정한다(Mg염 배지 각 1는 Na2HPO46g, kH2PO43g, NaC1 0.5g 및 NH4Cl 1g을 함유한다. 배지로 압열멸균시킨후, 각 1ℓ의 멸균된 1M MgSO4및 0.1M Cacl2를 무균적으로 가한다).
[단계 6]
M9염 배지중 5% 톨루엔의 미세현탁액을 불혼화성 혼합물을 간단히 초음파처리하여 제조한다. 이 현탁액 25m1에 [14C-1]-2-옥소-이소카프로산 2.5마이크로큐리/ml 및 10.0 마이크로큐러/μmole을 함유하는 용액 1.2ml를 가한다. 이 전체 혼합물 50μ1를 검정되는 집락을 함유하는 마이그로티터 플레이트의 각 웰에 가한다.
[단계 7]
각 웰로부터 생성된14CO2를 문헌[Tabr etal., J, Bacterio1.128 485-486(1976), "Conve1lient Method for Detecting14CO2in Multiple Samples : AppIication to Rapid Screening for Mutants"에 기술된 방법으로 포획하고 눈에 보이도록 조절한다. 활성 촉매 2-옥소 산 탈수소효소가 결핍된 돌연변이체는 Ba14CO3를 대조용의 관찰치 이상으로 생성하지 않는다.
Ba14CO3형성 결과로 오트라디오그람상에 검은 점으로 나타낸,14CO2의 양성 검정 및 점이 없거나 매우 연한 점으로 나타낸 음성 검정간의 대조를 증개선시키는 더욱 정확한 방법은 다음의 변형된 스크린을 포함한다.
(2-3주간보다) 7-14일간 성장시킨 후 아가 배지에서 하나의 집락(상기 단계 4참조)을 채취한다(단계 6 및 7로 직접 검정한다). 상기 절차의 5단계를 생략한다.
본래14CO2방출에 정략적인 더욱 더 정확한 검정방법은 글루코즈, 1% 및 "신카사-브카(Syncasa-bcaa)", 0.1%(L-바린, L-이소로이신 및 L-로이신의 존재를 제외하고 통상의 사카미노산과 유사한 조성으로된 L-아미노산의 합성혼합물, 하기 참조)로 된 M9 염 배지를 함유하는 적절한 배지상에서 상기 스크린으로 탐지된 돌연변이체를 성장시킴을 특징으로 한다.
고 세포 밀도로 성장한 후, 세포를 M9염 배지에서 세척하고 1% 톨루엔을 함유하는 냉 M9염 배지에 재현탁시키고 초음파 처리하여 톨루엔의 유백색 현탁액을 생성한다. 세포/완충제/톨루엔 현탁액을 세포를 투과성화시키기 위해 30℃에서 40분간 배양한다. 그후 투과성 세포를 M9 배지 염에서 세척하고 최종적으로 M9 배지 완충액의 원래 용적의
에 재현탁시킨다. 각 검정당이 현탁액 180μl를 사용한다.
반응용액 300μl에는 톨루엔과 세포, 티아민 괴로포스페이트(TPP), 0.4mM : 조효소 A(CoA), 0.1lmM : 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD), 0.68mM, 디티오스레이톨(DTT), 2.6mM : MgC12, 4.1mM ; 트리스-HC1, 60mM : 트리스-HC1, 60mM ; pH 7.5 ; 및 [14C-1]-2-옥소이소카프로에이트, 6, 000cpm, 마이크로큐러/μmole이 포함된다. 계산 효율은 73%이다. 반응은 바이알의 나사마개로 압축된 정사각형의 2×2cm 와트만 #4지를 함유하는 15m1 섬휘 바이알에서 수행된다. 이 종이는 30μl의 M 히야민 하도록사이드(메탄올중 메틸 벤제토님 히드록사이드 ; Sigma Chemical Co., 제품, St.Louis, MO 63178)를 함유하며, 이는 반응중 방출되는14CO2를 포획한다. 2시간동안 배양시킨후, 종이를 10ml의 Beckman Aquaso1 II [보편적인 LSC(액체 섬휘 계수관), MA 02118, 보스톤 소재의 New England Nuclear Research Products 제품]에 침지시키고, 4시간 이상 이 용매에 평형시킨후 액체 섬휘 계수관에서 방사능을 측정한다. 브랭크 대조용 반응(즉-세포없음)에서 약 50 내지 300cpm이 측정된다.
돌연변이체 I -3 및 이와 비슷한 것은 브랭크 대조용 반응의 측정치 이하로 측정되는 반면, 선조 균주는브랭크 대조용 측정치의 수배이상으로 측정된다.
"신카사-브카(syncasa→bccaa)"의 조성, 1OO배 농도 g/ℓ
L-알라닌 3
L-아르기닌 4
L-아스과르트산 6
L-시스틴 1
L-글루탐산 20
글리신 1
L-히스티딘 2
L-리신 7
L-메티오닌 3
L-페닐알라닌 6
L-프롤라인 10
L-세린 6
L-트레오닌 4
L-트로신 4
L-트립트판 1
혼합물을 pH 7로 조절하고 여과멸균시킨다. 농축물 1용적을 배지 99용적에 가하여 표준 사용농도로 되게한다.
측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 및 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소가 결핍된 에스.아베르미틸리스7881(ATCC 53692) [한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕의 이중 차단된 돌연변이체의 생성
[단계1]
에스.아베르미틸리스 ATCC 53567 [한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕을 30℃에서 12일간 New Patch Agar 배지상에 속류잔디로서 성장시킨다. 포자를 이러한 3개의 판에서 수득하고 pH 9.0 의 0.05M 트리스-말례산 완충액 20ml에 현탁시킨다.
[단계2]
포자현탁액 10ml를 10mg의 N-메딜-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)을 함유하는 바이알에 가한다. 바이알을 배양시키고 28℃에서 60분간 진탕하고 그후 포자를 1% NaCl 용액으로 충분히 세척한다.
[단계3]
세척된 포자를 1% NaCI에 현탁하고 동일한 용적의 80% 에틸렌글리콜과 혼합한다. 이 현탁액을 -20℃에 보관하고 돌연변이체를 위해 채취되는 세포원으로 사용한다.
이 포자주를 YPD 플레이트에 퍼뜨려서 각 플레이당 약 100개의 집락이 생기게 한다. 스트렙토마이세스아베르미틸리스 균주 I -3(ATTCC 53567 [한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9)의 돌연변이화 집단(니트로소구아니딘 처리된) 집락을 채취하여 다음과 같이 제조한 한천 배지상에 반점으로 퍼뜨린다(g/ℓ : 묽은 전분,80 : K2HPO41; MgSO4·7H2O,1; 아르다민 pH 5;CaCO3,5 : P-2000,lmI : FeSO4·7H2O,0.01;MnC12·4H2O,0.001 : ZnSO4·7H2O,0.001 : 박토아가,17 : 증류수 980mI, 압열멸균시킨후, pH가 7.0인 (±)-2-메틸부티르산의 멸균된 5% 균주용액 20ml를 가한다.
한천 배양물을 28℃에서 8 내지 12일간 배양한다. 세포(균사체)를 한천 표면에서 제거하고 아세톤 250μl에 넣는다. 그후 아세톤 추출물 25μl를 Analtech Silica Gel GF로 예비피복된 박층크로마토그래피 플레이트에 점적한다. 크로마토그래피를 용매로 에틸 아세테이트를 사용하여 30 내지 40분간 시행한 후, 건조시키고 에탄올중 3% 바닐린으로 분무한다. 플레이트를 100℃의 오븐에 1 내지 3분간 둔후, 에탄올중 3% 황산으로 분무하고 100℃의 오븐에 다시 10 내지 15분간 둔다. 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소가 결핍된 돌연변이체를 크로마토그래피 패턴의 변화로 확인한다 : 즉, 아베르에틴 B 성분에 상응하는 점(B1 및 B2에 대해 각각 Rf 약 0.54,0.42)은 여전히 존재하나, 아베르멕틴 A 성분에 상응하는 점(Al 및 A2에 대해 각각Rf 약 0.69,0.58)은 없다.
일반적인 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)방법
유동상 : 물 150ml, 아세토니트릴 70ml 및 에탄올로 1ℓ 를 만듬
컬 립 : 초입자 ODS 25cm(Becknan Instnments, Fullerton, CA 92634-3100)유량 : 0.75ml/분
검출 : UV 240nm
감쇠 : 약 6
샘플 희석제(D) : 아세토니트릴 35ml+메탄올 390mI
표준 :
1. 아베르멕틴 A2A 0.5mg을 10ml 용적의 플라스크에 넣고 메탄올로 용적을 채운다.
2. 시행 생성물 0.5mg을 10m1 용적의 플라스크에 넣고 메탄올로 용적을 채운다.
1 및 2가 표준 균주용액이고; 시행할 표준용액을 위해 바이알에 100μI(1) 및 100μI(2)를 넣고 80μl의유동상을 가한다.
샘플 :
1. 잘 진탕한 육즙을 취하고 : 아래로 회전시킨다.
2. 압착결정을 휘젖지 않고 가능한 한 상청액을 많이 제거한다.
3. 팰렛에 HPLC수 100μ1를 가하고 휘저어서 혼합하여 분산시킨다.
4. 희석제(D) 2μ1를 가하고 잘 혼합한다.
5. 동일물을 여과하고 HPLC시킨다.
본 명세서에 기술된 천연 및 비천연 아베르멕틴을 이와같이 HPLC 크로마토그래피시키고 각 아베르멕틴의 피크 보유시간을 올리고머 A존재에 대해 관찰된 보유시간으로 나누며 이는 주어진 HPLC 측정치의 내부표준으로 주어진다. 을리고머 A는 에스.아베르미틸리스 발효의 부생성물로 HPLC에 의해 관찰되고 이들을 산 RCOOH(여기서, R은 본 명세서에 정의한 바와같다)가 없는 배지 또는 일반식 RCOOH(여기서, R은 본 명세서에 정의한 바와같다)의 산으로 전환가능한 화합물이 없는 배지에서 배양할 경우 본 명세서에기술된 물연변이체에 의해 생성되는 HPLC상에 나타나는 유일한 생성물이다. 대표적으로, 올리고마이신 A보유시간은 12.5 내지 14분이다. 보유시간(RT) 비율은 동일한 것과 비교하는 더 중요한 기초를 제공하며 아베르멕틴 생성물을 생성시킨다. HPLC상 아베르멕틴 생성물의 외형의 일반적인 순서는 B2, A2, B1 및A1이다.
주 : Bla 및 Alb는 분해되지 않는다.
보유시간은 다른 일수에 따라 1 내지 2분으로 변하며, 올리고머 A는 일반적으로 약 12.5 내지 14분이다. 다음 실시예에서 주목되는 것을 제외하고 상기에 기술한 HPLC 방법으로 아베르멕틴을 측정한다. 다음실시예에 사용되는 조성물은 하기에 나타낸다.
AS-7 배지
a 전분을 바실러스 리케니포스미스(Bacillus licheniformis)(CT, 윌톤 소재의 Novo Enzymes 제품, 상표 "Termamyl"로 시판됨)로부터의 알파아밀라제를 사용하여 40%±5%에 상당하는 덱스트로즈로 가수분해시켜 제조함.
b NJ 070l2, 클링프턴 소재의 Yeast Products,Inc. 제품
c TN 38108, 멤피스 소재의 Traders Protein 제품. NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정한다.
AP-5 배지
a 미시간 48640, 미들랜드 소재의 The Dow Chemical Co. 제품.25% NaOH를 사용하여 pH 6.g로 조절한다.
[실시예 1-4 ]
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 I -3
(ATCC 53567) [한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕으로부터의 아베르멕틴
3개의 차폐장치가 있는 용적 500m1의 플라스크중 AS-7 배지 80m1에 접종된 포자형성 V-8 플레이트로부터의 에스.아베르미틸리스 I -3(ATCC 53567) [한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회,기탁일 : 1988.1.9〕플라스크를 28 내지 30℃의 온도하에 200rpm으로 교반하면서 회전 진탕기상에서 항온시킨다. 24시간동안 항온시킨 후, 전체 육즙 1m1로 AP-5 배지 40m1를 포함하는 용적 300m1의 플라스크에 접종한다. 하기에 기술된 400ppm의 각 플라이며 화합물 존재하에 28 내지 30℃에서 2배로 발효시키고 24시간후에 가한다.
312시간 후, 전체 육즙의 2m1 샘플을 메탄올 : 아세토니트릴(390 : 35) 8m1와 혼합한다. 여과한 후,5μ1의샘플을 베크만 초입자(Beckman Vltrasphere) ODS 컬럼(3.9×250nm)에 주입한다. 컬럼은 0.8m1/분에서메탄올 : 아세토니트릴 : 물(89 : 14 : 7)로 용출시키고, 용출물을 240nm에서 UV 탐지로 검측한다. 신규한아베르멕틴의 보유시간은 다음과 같다.
+메틸부틸르산 및 -메틸부틸르산을 둘다 아베르멕틴에 혼입한다. 채택된 크로마토그래피 조건하에, +및 - 아베르멕틴의 분해가 B2 및 A2에서만 이루어진다.·
[실시예 5]
스트렙토마이세스로부터의 사이클로헥실 아베르멕 틴
배양물 에스.아베르미틸리스 7881(ATCC 53692) [한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕의 동결된 바이알을 3개의 차폐장치가 있는 용적 500ml의 플라스크중 AS-7 배지 100ml에 접종한다. 플라스크를 28 내지 30℃의 온도하에 200rpm으로 교반하면서 회전진탕기에서 항온시킨다. 28시간동안 항온시킨후, 전체 육즙 5ml를 다른 100ml의 AS-7 배지 또는 3개의 차폐장치가 있는 용적500ml의 플라스크에 접종한다. 플라스크를 28 내지 30℃의 온도하에 200rpm으로 교반하면서 회전진탕기에서 다시 항온시킨다. 24시간동안 항온시킨후, 1ml의 전체 육즙을 40ml의 AP-5 배지를 함유하는 용적 300ml의 플라스크에 접종시킨다.
플라스크를 28 내지 30℃에서 200rpm으로 배양한다. 24시간후, 400rpm의 사이클로헥산 카복실산을 가하고 312시간후에 샘플 2ml를 채취하여 실시예 1에 기술된 바와같이 고성능 액체크로마토그래피시킨다. 이들조건하에 발효중에 탐지된 아베르멕틴 성분만이 각각 사이클로헥실 B2 및 B1에 상응하는 14.84(54.9mg/ℓ) 및 31.46(32.lmg/ℓ)분에 용출된다.
[실시예 6]
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 7881(ATCC 53692) [한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 = 1988.1.9〕로부터의 2급-부틸 아베르멕틴
실시예 5의 방법을 되풀이하되, 단, 사이클로헥산카복실산 대신 ±2-메틸부티르산 400ppm을 사용하고,모든 다른 조건을 실시예 2에 기술된 것과 동일하게 한다.
2급-부틸 아베르멕틴 B2(11.60,12.40분,63.5 42.4mg/) 및 2급-부틸 아베르멕틴, Bl(23.1분,105.5mg/ℓ)만이 발효중에 탐지된다.
Claims (16)
- 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성 및 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성이 결핍된 스트렙토마이세스 아베르미 틸리스(Streptomyces avermitilis) .
- 이의 투과성 세포가, 첨가된 [14C-1〕-2-옥소이소카프로산으로부터14CO2를 생성할 수 없음을 특징으로 하는, 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성 및 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성이 결핍된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스.
- ATCC 53692 [한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕와 동일한 특성을 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스
- 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 53692 [한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕.
- 측쇄 2-옥소 산 탈수소효소 활성 및 아베르멕틴 B O-메틸 전이효소 활성이 결핍된 스트렙토마이세스 아베르미딜리스 균주를 질소, 탄소 및 무기염의 동화가능한 공급원과 아베르멕틴 생합성에 이용가능한 화합물을 함유하는 수성 영양배지에서 호기성 발효시킴을 특징으로 하여, B 아베르멕틴을 제조하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 에스.아베르미틸리스가 ATCC 53692 [한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕와 동일한 특성을 갖는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 화합물이 일반식(II-A)의 화합물 또는 발효공정중에 일반식(II-A)의 화합물로전환가능한 화합물인 방법.R - COOH ( I I - A)상기식에서, R은 알파-측쇄 그룹이고,-COOH 그룹에 부착된 이의 탄소원자가또한 수소이외의 2개이상의 다른 원자 또는 그룹에도 부착된다.
- 제 7 항에 있어서, R이 알파-측쇄 C3-C8알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 또는 알킬티오알킬그룹 : 알킬그룹이 알파-측쇄 C2－C5알킬그룹인 C5-C8사이클로알킬알킬그룹; 메틸렌 또는 하나 이상의C1－C4알킬그룹 또는 할로원자에 의해 임의 치환될 수 있는 C3-C8사이클로알킬 또는 C5-C8사이클로알케닐그룹 : 또는 포화 또는, 완전 또는 부분적 불포화되고 하나 이상의 C1-C4알킬그룹 또는 할로원자에 의해 임의 치환될 수 있는 3 내지 6원 산소 또는 황-함유 헤테로사이클릭 환이 화합물 또는 발효공정중에 일반식(II-A)의 화합물로 전환가능한 화합물을 사용하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 기질 RCOOH로 전환가능한 화합물이 일반식(II-B)의 화합물인 방법.R-(CH2)n－Z (II-B)상기식에서, R은 상기 정의한 바와 같고 : n은 0,2,4 또는 6이며 : Z은 -CH2OH,-CHO,-COOR4,-CH2NH2또는 -CONHR5[여기서, R4는 H 또는 (C1-6)알킬이고; R5는 수소,(C1-4)알킬,-CH(COOH) CH2COOH, -CH(COOH) (CH2)2COOH 또는 -CH(COOH) (CH2)2SCH3이다.〕이다.
- 제 8 항에 있어서, R이 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 2-메틸사이클로.프로필, 3 - 사이클로헥세닐, 1- 사이클로펜테닐, 1- 사이클로헥세닐, 3 - 메틸사이클로헥 실 (시스/트랜스), 4 - 메틸렌사이클로헥 실, 3 - 에틸사이클로부틸, 3 - 메틸렌사이클로부틸, 3 - 사이클로펜테닐, 1 - 사이클로프로필에틸, 3-플루오로사이 클로부틸, 4,4-디클루오로사이클로헥 실, 이소프로필, 2급-부틸, 2-펜 틸, 2,3-디메틸포로필, 2-헥실, 2-펜트-4-에닐, 2-메틸티오에틸, S-2-펜틸, R-2-펜틸, 2-티에닐, 3-티에닐, 4 - 테트라히드로피라닐, 3 - 푸릴, 2 - 클로로티에닐, 3 - 테트라히드로 티에닐, 4 - 메틸티오 - 2 - 부틸, 4-테트라히드로티오피라닐, 4-메톡시 -2-부틸 또는 4-메틸티오-2-부틸인 방법.
- 제 10 항에 있어서, R이 일반식(II-A)의 카복실산으로부터 유도되는 방법.R-COOH (II -A)
- 제 11 항에 있어서, R이 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 티에닐인 방법.
- 제 10 항에 있어서, R이 발효중에 R-COOH로 전환가능한 일반식(II-B)의 화합물로부터 유도되는방법.R-(CH2)n-Z (II-B)상기식에서, R은 상기 정의한 바와같고; n은 0,2,4 또는 6이며 : Z은 -CH2OH,-CHO,-COOR4,-CH2NH2또는 -CONHR5[여기서, R4는 (C1-6)알킬이고, R5는 수소,(C1-4)알킬,-CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH) (CH2)2COOH 또는 -CH(COOH) (CH2)2SCH3이다.〕이다.
- 제 8 항에 있어서, R이 알파-측쇄 C3-C8알킬 그룹일 경우, 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이 아닌 방법.
- 제 8 항에 있어서, 에스·아베르미틸리스 균주가 에스.아베르미틸러스 ATCC 53692 [한국기탁번호 : KFCC-10497, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕인 방법.
- 탄소, 질소 및 무기염의 동화가능한 공급원을 함유하고, 일반식(II-A)의 산, 또는 에스.아베르미틸리스에 의해 상기 산으로 전환될 수 있는 화합물이 거의 없는 수성 영양배지중에서 호기성 조건하에 발효시킬 경우에는, 거의 C-076 아베르멕틴을 생성하지 않지만, 일반식(II-A)의 산 또는, 에스.아베르미틸리스에 의해 상기 산으로 전환될 수 있는 화합물을 함유하는 배지중에서 발효시킬 경우에는, 실질적으로 B 아베르멕틴만을 생성할 수 있으며, 스트렙토마이스 아베르미틸리스 ATCC 53567 [한국기탁번호 : KFCC-10493, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1988.1.9〕을 돌연변이시킴을 특징으로 하는 방법으로 수득되는 스트렙토마이세스 속의 신규한 균주.R -COOH (II -A)상기식에서, R은 이소프로필 또는 (S)-2급-부틸이다.
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