JPS63291576A - アベルメクチンｂ化合物の産生方法およびそのための培養物 - Google Patents

アベルメクチンｂ化合物の産生方法およびそのための培養物

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JPS63291576A JP63011881A JP1188188A JPS63291576A JP S63291576 A JPS63291576 A JP S63291576A JP 63011881 A JP63011881 A JP 63011881A JP 1188188 A JP1188188 A JP 1188188A JP S63291576 A JPS63291576 A JP S63291576A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアベルメクチンＢＯ−メチルトランスフヱラー
ゼ活性および分枝鎖２−オキソ酸デヒト０スを使用して
天然および非天然アベルメクチンを産生すること属関す
る。
（従来の技術） 米国特許第４，３１０，３１９号および第４，４２９，
０４２号はアベルメクチン、強力な抗寄生虫活性を有す
る関連作用剤の複合体、およびストレートマイセス　ア
ベルミチリスＡＴＣＣ第３１２６７号、第３１２７１号
および第３１２７２号の好気性発酵によるそれらの産生
について述べている。上記の最後の２菌株はそれぞれ、
ストレプトマイセス　アベルミチリスＡＴＣＣ第３１２
６７号の紫外線照射によりて得られた培養物を含む凍結
バイアルと凍結乾燥管を表す。
１９８６年７月１６日出願の米国特許出願第８８６．８
６７号に対応する、１９８７年３月１８日発行のヨーロ
ッパ特許第２１４，７３１号は天然または公知のアベル
メクチンに関連するが、２５位置に新規な置換基を有す
る多くの化合物（ここでは非天然アベルメクチンと呼ぶ
）、およびある特定のカルボン酸またはその誘導体もし
くはその前駆体の存在下でのアベルメクチン産生微生物
の発酵によるその製造方法に関する。前記の新規なＣ−
２５置換アベルメクチンの製造に用いられるｌ］レプト
マイセス　アベルミチリス菌は己１どｌ）マイセス　τ
ミＬＬｉｌΔＡＴＣＣ３１２６７゜３１２７１．３１２
７２およびＮＣＩＢ　１２１２１である。ヨーロッノ特
許第２１４，７３１号に記載されている後者の菌はスト
レプトマイセス　アイルミチ１ＪｘＡＴｃｃ３１２７１
から誘導されたものである。
これを半規定培地中で培養すると、新規なＣ−２５置換
アベルメクチンの収率が改善される。ＡＴＣＣ３１２６
７，３１２７１，３１２７２およびＮＣｌＢ１２１２１
のそれぞれは、新規なＣ−２５置換訪導体の他に、Ｃ−
２５置換基がイソプロピルまたは（Ｓ）−武一プチル（
ｌ−メチルプロピル）である公知または天然のアベルメ
クチンをも種々な量で産生ずる。
アベルメクチンの炭素骨格（下記の式（１）に示す）は
酢酸塩とプロピオン酸塩から誘導され、天然アベルメク
チンのＣ−２５置換基はＬ−イソロイシン（Ｒ＝（Ｓ）
　−５ｅｃ−ブチル）またはＬ−パリｙ（Ｒ＝イソプロ
ピル）から誘導される〔フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）
とモロジク（Ｍｒｏｚｉｋ）の「マクロライド０抗生物
質（Ｍａｃｒｏｌ：ｉｄｅ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　
）　Ｊアカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ）　（１９８４）第１４章〕。
「公知」または「天然」とは、２５位置の置換基がイソ
プロピルまたは（Ｓ）　−５ｅｃ−ブチル（１−メチル
プロピル）のいずれかである、ストレプトマ４土ｘ　　
７−＜ｋｉｆユ２　ＡＴＣＣ３１２６７，ＡＴＣＣ３１
２７１およびＡＴＣＣ３１２７２によって産生されるア
ベルメクチンを意味する。２５位置置換基がイソプロピ
ルまたは５ｅｅ−ブチル（Ｓ形）以外の基であるアベル
メクチンをここでは新規または非天然アベルメクチンと
呼ぶことにする。
上記米国特許に記載されたストレプトマイセスアベルミ
チリス菌株は、この特許に一般にＣ−０７６として記載
されている種類の物質を産生ずる。この種類はＧ−０７
６Ａ１ａ、Ａｌｂ、Ａ２ａ、Ａ２’ｂ、Ｂｌａ。
Ｂｉｂ、Ｂ２ａおよびＢ２として表される、密接に関連
した８種類の化合物を含む。「ｓＬ」シリーズの化合物
は２５位置置換基が（Ｓ）　−５ｅｃ−ブチルである天
然アベルメクチンを意味し、「ｂ」シリーズは２５位置
置換基がイソプロピルである天然アベルメクチンである
。ｒＡＪとｒＢＪの名称は５−置換基がそれぞれメトキ
シまたはヒドロキシであるアベルメクチンを意味する。
最後に数字「１」は２２−２３位置に二重結合が存在す
ることを意味し、数字「２」は２２位置に水素を有し、
２３位置にヒドロキシを有するアベルメクチンを意味す
る。
本出願では、非天然アベルメクチンの２５置換基に関す
るこのような同類体を用いない。同類体ＡＩ、Ａ２．Ｂ
ｌおよびＢ２は上記天然アベルメクチンの構造特徴に相
当する構造特徴を有する非天然アベルメクチンを意味す
るように意図する。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない突
然変異体の発生が枯草菌（Ｂａｏｉｌｌｕｓ　５ｕ−１
ｂｔｎｅｓ　）　（ヴイレッチ（Ｗｉｌｌｅａｋｅ）と
パルディー（Ｐａｒｌｅｅ）による、ジエイ、パイオル
、ケム。
（Ｊ、　Ｂｉｏｘ、　Ｃｈｅｍ、　）　２４６巻、５２
６４−７２頁（１９７１））とシェードモナス　Ｙヱ！
′（旨１１５巻、１９８−２０４頁（１９７３））につ
いては報告されているが、ストレプトマイセスについて
は報告されていない。
突然にアベルメクチン　アグリコーンズＡｌａとＡ２ａ
　　のみを産生ずる突然変異株である、ろ」レプトマイ
セス　アはルミチリスＡｇ１ｙ　−１カシ為ルマン（Ｓ
ａｈｕｌｍａｎ）等のソ王Δ、アンチバイオ上（Ｊ、　
Ａｎｔｉｂｉｏｔ　）　３８（１１）ｔ　１４９４−１
４９８頁（１９８５）によって報告されている。アばル
メクチン　アグリコーンＢ成分の産生な増加させるシネ
フンギン存在下でのス　レプ　マ　セス　Ｌ５ルミチリ
ス　Ａｇ１ｙ　−１の発酵も報告されている。
同様に、０−メチルトランスフェラーゼの阻害剤として
のシネフンギン存在下で発酵させた場合に、アベルメク
チン高産生菌であるストレプトマイセス　アベルミチリ
ス０８はアグリコーンのＣ−５位置とオシアント０ロー
スニ糖成分とに０−メチル基を有さないアベルメクチン
を産生ずる。
米国特許第４，３７８，３５３号はＣ−０７６関連化合
物とＭＡ−５２１８の培養によるその産生について述べ
ている、ＭＡ−５２１８はス＋レプ）マイセスアイルき
チリスＡＴＣＣ３１２７２の紫外線照射によって得られ
た突然変異株である。この突然変異株はＡＴＯＣ３１７
８０として確認される。前記突然変異株が産生ずるＣ−
０７６関連化合物はＣ−０７６フラン環を有さない。さ
らに、報告された化合物のあるものでは、オレアンドロ
ース糖成分の一方または両方が開裂するが、他の化合物
では５位置基がケト基に酸化される。
Ｏ−メチル基を有さないアベルメクチンを産生ずるスト
レプトマイセス　アベルミチリスの３種類の０−メチル
トランスフェラーゼ突然変異株が、ルビー（Ｒｕｂｙ）
等による「アンチマイ３１巻のバイオロジー（Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ｏｆ　Ａａｔｉｎｏｍｙａｅｔｅｓ）　Ｊに関
する第６回国際シンポジウム（ハンガリーのデプレセン
において１９８５年８月２６〜３０日開催）によりて、
およびシェルマン等によるアンチマイ３１巻、７４４−
７頁（１９８７）によって報告されている。最初の種類
はマクロ環式ラクトン環のＣ−５ヒドロキシルをメチル
化することができないために主としてＢアベルメクチン
を産生ずる。第２ノ種類は３’−０，３“−０−ビスー
デメチルアはルメクテン（両オレアント９０−ス単糖残
基の３位置に０−メチル置換基を有さないアベルメクチ
ン）を産生ずる、このアベルメクチンはデメチルアベル
メクチンと呼ばれる。第３の種類は如何なる位置をもメ
チル化することができない。
Ｖ　！　、ＡＩ　マン等のフェト９．ブロク、　（Ｆ＠
ｄ、　Ｐｒｏｃ、　）４４巻、９３１頁（１９８！５）
は、アベルメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ酵
素によるアグリコーン成分のＣ−５ヒドロキシ基のメチ
ル化を阻害する例えばシネフンギン、Ｓ−アデノシルエ
チオエンおよびＳ−アデノシルホモシスティンのような
物質の存在下でストレプトマイセス　τゴΔミチリスを
発酵させることによる、Ｂアベルメクチン産生の増強を
開示している。０−メチルトランスフェラーゼ活性を有
さす、アベルメクチンＢ成分の産生量を増強するストレ
プトマイセス　アベルミチリス変異株はシェルマン等に
よってヱ２−二重Ｊ］しく１り　エイジエントス　エフ
Ｙ　　ｌ−モセラピ−２９巻、６２０−６２４頁（１９
８６）にも言及されている。
（課題を解決するための手段） ストレプトマイセス　アベルミチリスの突然変異生成に
よって、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有
さない突然変異株が生ずる。この突然変異株は、化合物
ＲＣＯＯＨ（Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）　−５ｅｅ
−ブチル）の不在下で、または発酵過程中にＲＣＯＯＨ
に転化しうる化合物の不在下で、天然アはルメクチンの
有意な量を産生ずる能力をもはや有さない。しかし、こ
の変異株が、添加化合物ＲＣＯＯＨ（Ｒはイソプロピル
または（Ｓ）　−３ｅＣ−ブチルまたはここに開示した
他の基である）の存在下または前記ＲＣＯＯＨの前駆体
の存在下で発酵させると、天然および非天然のアベルメ
クチンを産生ずることが全く意外にも発見された。ここ
に開示した、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
を有さすかつＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンまたはＬ
−バリンを分解することのできない変異株が広範囲な化
合物をアベルメクチン生合成経路に同化させて、天然ア
ベルメクチンの存在しない非天然アベルメクチンを産生
ずることは、さらに意外である。
このようにして産生じた単独阻害変異株の突然変異生成
によって、分枝鎖２−オキソ酸デヒト９０ゲナーゼ活性
とアベルメクチンＢ−０−メチルトランスフェラーゼ活
性の両方が欠損した変異株が生ずる。前記二重阻害変異
株は添加化合物ＲＣＯＯＨ（Ｒは上記で定義した通りで
ある）の存在下で培養した場合に、実質的に天然および
非天然Ｂアはルメクチンのみを全く意外にも産生ずる。
上記の天然アベルメクチンは密接に関連した８種類の化
合物〔式（１）において、Ｒ＝イソプロピルまたは（Ｓ
）　−５ｅｃ−ブチル〕の複合混合物として産生される
。これらは実質的に純粋な形で回収されるが（米国特許
第４，４２９，０４２号参照）、この方法は結局は困難
である。Ｂアベルメクチンは対応するＡアベルメクチン
よりも大きい駆虫活性を一般に示す。ヨーロッノで特許
第２１４，７３１号に述べられた方法による非天然アベ
ルメクチン（Ａ成分とＢ成分）の産生によりても、スト
レプトマイセス　アベルミチリス菌の細胞中およびその
産生に用いた培地中に分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼおよびアミノ酸し−バリンおよびＬ−イソロイシン
が存在するためｋ、天然アベルメクチンの幾つかが種々
な量で産生される。
天然または非天然アベルメクチンの生物学的により有効
なり成分のみを産生じうろことは、生成物の数と複雑さ
を最小にし、これＫよって特定アベルメクチンの純度を
高め、分離方法を簡単化するために望ましい目的である
。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有メクチン
産生菌株の突然変異、特にΔ上ｖ−／’上ヱイセス　ア
ベルよチリスＡＴＣＧ３１２６７．　ＡＴＣＣ３１２７
１、ＡＴＣＣ３１２７２またはＮＣｌＢ１２１２１の突
然変異によって生ずる。この突然変異株は、インプロピ
ル基または５ｅｃ−ブチル基（Ｓ形）含有脂肪酸または
その前駆体を前記突然変異体の発酵培地に加える場合以
外は、天然アベルメクチンを合成することができない。
この突然変異株は、適当なプライマー酸または発酵過程
中にこれに転化しうる化合物を含む栄養培地中での水性
好気性条件下で発酵させると、天然および非天然アはル
メクチンを産生ずることができる。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないこ
とを特徴とする突然変異株は、１４００２分析に基づい
て突然変異生成コロニーから単離される。この方法では
、（１４Ｇ−１）−２−オキソイツカ、プ７・ロτン／
酸゛または（”Ｃ−１）−２−オキソ−３−メチル吉草
酸または（１４０−１）−２−オキソ−３−メチル酪酸
の基質から透過性化細胞による１４（３０２発生のない
ことが、分校−２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性の存
在しないことを示唆する。
ここに述べた分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
を有さない突然変異株がアベルメクチン、特に非天然ア
ベルメクチンおよびシネフンギン存布下ではデメチルア
ベルメクチンを産生ずる能力を保有することは、意外で
予想しえないことであった。これらの突然変異株が、慣
習的な培地上で増殖させた場合に、天然の脂肪アシル補
酵素Ａ誘導体を産生できないことは、膜の完全性が前記
誘導体に依存するならばまたは前記突然変異体による２
−オキソ酸蓄積が細胞毒性をもたらすならば、致命的な
突然変異になったであろうと考えられる。
さらに、この突然変異体がＬ−イソロイシンおよびＬ−
バリンの分解代謝からアセチルＣｏＡおよびプロピオニ
ルＣ３ｏＡを合成しうろことは予想されなかりた、これ
らの合成にはこの突然変異株に欠けている酵素活性が必
要であるからである。上記のアベルメクチン生合成には
これらのアシルＣｏＡ誘導体が必要であるので、この突
然変異株が非天然アベルメクチン産生でひどく損傷する
ことが予想されたが、これは生じなかりた。
ここに述べる突然変異株に分枝鎖２−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼ活性の存在しないことは、分枝鎖脂肪アシルＣ
ｏＡ合成をＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−
バリンの分解から保護することになり、そのために、酸
Ｒ−ＣＯＯＨ（Ｒは（Ｓ）ｓｅｃ−ブチルまたはイソプ
ロピルである）またはこれの前駆体を発酵培地に加える
場合以外は、天然アベルメクチンの合成を特に保護する
ことになる。さらに、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性欠損変異株が突然変異を起こすと、付加的に７
ベルメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性が欠
損した変異株が形成される。アベルメクチンＢＯ−メチ
ルトランスフェラーゼ活性を有さない変異株はアベルメ
クチンのアグリコーン成分のＣ−５酸素をメチル化する
ことができない。このような活性が欠損した変異株はＡ
アベルメクチン産生を阻害して、本質的にＢアベルメク
チンのみを産生ずる。
本発明は、形質転換、形質導入、遺伝的組換えまたは他
の何らかの遺伝的方法によって、ここに述ぺた細菌種か
らの核酸もしくは同等な物質を用いて発生させ、それに
よりてここに述べた変異株の特徴を獲得させた微生物を
も包含する。
ここで用いる「アベルメクチン」または「アベルメクチ
ン類」なる用語は、２５置換基０が本発明のストレプ　
マイセス　乙ミと７によりて前記位置に同化しうる基で
ある、下記の式（１）で示される化合物を意味する。
ここに述べる突然変異株はここに開示し、ここに例示す
る方法によって非天然デメチルアベルメクチンを製造す
るために非常に貴重である。これらの突然変異株は好ま
しいデメチルアベルメクチン、すなわちＣ−２５置換基
がＣ１−Ｃ４アルキル基によって任意に置換されたＣ、
−ａ６シクロアルキルもしくはシクロアルケニル基、１
−メチルチオエチルまたは５員もしくは６員の酸素もし
くは硫黄含有複素環基、特に３−チェニルまたは３−フ
リルである化合物の製造にとりて特に貴重である。
ストレプトマイセス　１ｄとｊヱユ上種のアベルメクチ
ン産生菌の突然変異は、紫外線照射、Ｘ線照射、Ｎ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニジン、エチル
メタンスルホネート、亜硝酸およびナイトロジェンマス
タード、例えばＮ−メチルビス（２−クロロエチル）ア
ミン、または同様な処置を含む、種々な突然変異誘発剤
を用いる公知の方法によって実施される。突然変異誘発
は、例えばストレプトマイセス　アベルミチリスＡＴＣ
Ｃ３１２７２のよ５な、天然アはルメクチンを産生し５
るストレプトマイセス　アベルミチリスの胞子または増
殖性培養物に対して行われる。
当業者に周知の方法に従りて、特定の（”Ｃ−１）−２
−オキソ分枝鎖酸から１４ＣＯ□を放出する、無作為に
突然変異を誘発した多数の細菌コロニーを検出しうる生
化学的分析方法に基づいて、分枝鎖２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼの欠損に関して突然変異誘発コロニーを選択
する〔タボール（Ｔａｂｏｒ　）等、ジエイ、バクト、
　　（Ｊ、　Ｂａａｔ、　）１２８巻、４８５−４８６
頁（１９７６））。
この方法は、マイクロタイタープレートの孔中の適当な
栄養培地上で突然変異株コロニーを増殖させる；細胞に
トルエンを透過させる；次に各孔に（”Ｃ−１）−２−
オキソ酸（例えば２−オキソイソカプロン酸）を加え、
発酵上の雰囲気を１４　Ｇ　（）２　に関して検査する
ことから成る。また、（”Ｃ−１）−２−オキソ−イン
カプロン酸の代りに、（１４Ｇ−１）−２−オキソ−メ
チル吉草酸または（１４Ｇ−１）−２−オキソ−３−メ
チル酪酸を用いることができる。湿ったＢ　ａ　（ＯＨ
）　２飽和Ｆ紙を各孔の上において放出１４ＣＯ２を捕
捉して、Ｂａ　１４ＣＯａ（存在する場合には）をオー
トラジオグラフィによって検出することによりて、　　
ＣＯ２の発生が簡単に調べられる。分枝鎖２−オキソ酸
デヒドロゲナーゼ活性を有さない突然変異株はブランク
対照に大体等しいオートラジオダラムを示す；すなわち
、Ｂ　ａ　１４ＣＯ３はこの突然変異株によって産生さ
れない。
このよ５Ｋして得られた突然変異株に上記の突然変異誘
発剤を用いて、さらに突然変異を誘発する。突然変異誘
発コロニーを添加前駆体（例えば、２−メチル酪酸）の
存在下での発酵後に、クロマトグラフィ（薄層クロマト
グラフィまたは高速液体クロマトグラフィ）によフて、
アベルメクチンＢＯ−メチルトランスフエ２−ゼ活性の
欠損に関ヨンには、アイルメクチンＡ化合物が本質的に
存在しない。
特定菌株の好ましい対立遺伝子の突然変異誘発による生
成の他に、１つの菌株中に生成し同定された対立遺伝子
の他の菌株の染色体中への導入が、原形質体融合によっ
て可能になる。例えば、分校＠２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼとアはルメクチンＢＯ−メチルトランスフェラー
ゼとが欠損したス菌株との原形質体融合によって、アベ
ルメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性のみが
欠損シタストレプトマイセス　アベルミチリス菌株を生
成することができる。当業者に自明であるように、原形
質体融合法によりて、特定の分岐ラインからの好ましい
対立遺伝子を単菌株に結合させることができる。
ここに述べる突然変異株の方法論的および培養上の特徴
は、一般に米国特許第４，４２９，０４２号に述べられ
ている通りである。この突然変異株の明確な特徴は分枝
鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないことで
あり、この特徴は上述のようにして検出される。この活
性が存在しないと、突然変異体は脂肪酸ＲＣＯＯＨ（Ｒ
はイソプロピルまたは（Ｓ）　−＆−ブチルである）ま
たは発酵中に前記ＲＣＯＯＨに転化しうる化合物を実質
的に含まない規定（ｄｅｆｉｎｅｄ　）培地上で増殖さ
せたときに、天然アイルメクチンを産生ずること−がで
きない。アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクシ１
ン（Ａｍｅｒｉｏａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）によって実施した分類学的研究（
ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）は
、上記１４　Ｃ０２分析によって選択した、２種類の突
然変異株Ｉ−３とＨＬ−０２６の特徴が米国特許第４，
４２９，０４２号に述べられているＡＴＣＣ３１２７２
親菌株の特徴に密接に関係する（若干の例外にあるが）
ことを実証した。従り【、突然変異株ｌ−３（ＡＴＣＣ
５３５６７）はＡＴＣＣ３１２７２よりも有意に少ない
胞子を形成する。出願人による実験では、ラフィノース
は１−３の増殖を支持するように見えなかった。米国特
許第４，４２９，０４２号では、単独炭素源としてスク
ロースを用いてＡＴＣ（３１２７２の突然変異株の増殖
を検出することができなかった。突然変異株Ｉ−３は分
枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない。本
発明の二重欠損変異株すなわち突然変異株ｌ−３（ＡＴ
ＣＣ５３５６７）のさらに突然変異生成によって生じた
、分枝鎖２−オキソ酸デヒトラゲナーゼ活性とアベルメ
クチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性とを有さな
いス　レプ　マイセス　１べｙｊヱｐ　７８８１は、突
然変異株Ｉ−３と同様な、ＡＴＣｉＣ３１２７２に対す
る分類学的関係を有する。
ストレプトマイセス−アベルミチリスＩ−３と７８８１
はブタベスト条約の条件下で、アメリカンタイプ　カル
チャー　コレクシ璽ン−（メリーラント９州、ロックビ
ル）ＶＣ寄託された、この機関は永久的な寄託を可能に
する公認の受託所であり、この出願に特許権が付与され
た場合には公衆に容易に入手可能になる。これらの菌株
はそれぞれろ上レフトマイセス　アベルミチリスＡＴＣ
Ｃ５３５６７と５３５６８なる名称を与えられている。
この寄託は、この出願の審査中はアメリカ合衆国特許庁
の特許局長がａ７ｃＦＲｔ、１４および３５ＵＳＣ１２
２の下に、およびこの出願の対応物またはその後継物を
出願した国の特許法に従って、資格があると判定した人
に利用可能である。寄託した微生物の公衆への利用可能
性に対する全ての制限は、特許の付与時に変更不能に除
去される。
ストレプトマイセス　アベルミチリスＡＴＩＯＣ３１２
６７、ＡＴＣＣ３１２７１，ＡＴＣＣ３１２７２および
ＮＣＩＢＩ　２１２１はそれぞれ、式（１）：〔式中、
２２−２３位置の破線は任意の二重結合を表す； Ｒ１はヒドロキシであるが、二重結合が存在しない場合
のみに存在する； Ｒは式： で示される４′−（α−Ｌ−オレアンドロシル）−α−
Ｌ−オレアンドロシロキシでアリ、Ｒ３は水素またはメ
チルであり、 Ｒはインプロピルまたは（Ｓ）　−５ｅｃ−ブチルであ
る〕 によりて示される化合物を産生ずる。米国特許第４．２
８５，９６３号は２５位置がメチル基またはエチル基に
よりて置換され、Ｒ１がヒドロキシであり　Ｒ３がメチ
ルである式（１）のアベルメクチンを述べている。
上記の非天然アベルメクチンでは、Ｒはイソプロピルま
たは（Ｓ）　−５ｅｅ−ブチル以外の置換基であり、下
記のように定義される。
式（１）化合物の生合成に用いる重要な化合物はストレ
プトマイセス　アベルミチリスの細施中および培地中に
生成する。これらの化合物はＬ−バリンとＬ−インロイ
シンの分解から、または分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼによる２−オキソ酸の脱炭酸により対応２−オキ
ソ酸から、同時に生成物を補酵素Ａと結合させることに
よって得られる。これらの存在は式（１）のイソプロピ
ル化合物と（Ｓ）　−５ｅｃ−ブチル化合物の両方が同
時に生成する原因となる。これは当然、（Ｓ）　−５ｅ
ｃ−ブチル誘導体からイソプロピル誘導体を分離すると
いう問題を招く。
本発明の変異株は、適当なプライマー化合物を含む栄養
培地中で発酵させると、式（１）の化合物または、より
通常の場合には、式（１）の２種類の化合物（Ｒは使用
プライマー化合物に相当する）の混合物を産生ずる。米
国特許第４，４２９，０４２号に用いられている名称に
よるとＲ−アベルメクチンＢｌと８２と便宜的かつ慣用
的に呼ばれる、２種類までの化合物が産生される。Ｒ基
は当然、Ｃ−２５置換基を意味する。例えば、Ｒがシク
ロペンチルである場合には、２種類の可能なアベルメク
チンが存在する： アベルメクチンＢ１　　　二重結合　　　Ｈシクロペン
チル アベルメクチンＢ２　　　ヒドロキシ　　Ｈ非天然アベ
ルメクチンでは、式（１）のＣ−２５置換基ｒＲＪはイ
ンプロピルまたは（均−友一プチル以外の基である。
二重結合が存在し、ＯＨが存在しない式（１）の化合物
は、この代りに、Ｒ１がＯＨであり、二重結合が存在し
ない式（１）の対応化合物から脱水反応によって製造さ
れる。この反応は例えばｔ−プチルジメチルシリルオキ
ンアセチル誘導体として、５および４“位置のヒドロキ
シ基を最初に選択的に保護し、次Ｋ例えば（４−メチル
フェノキシ）チオカルボニルクロリドのような、置換テ
オカルボニルハライビと反応させ、次Ｋ例えばトリクロ
ロインゼンのような高沸点溶媒中で加熱することによっ
て脱水させることによって行われる。最後に、生成物を
脱保護して、不飽和化合物を得る。これらの工程は適当
な試薬と反応条件とともＫ、米国特許第４，３２８，３
３５号に述べられている。
Ｒ１がＨであり、二重結合が存在しない式（１）化合物
は二重結合が存在し、Ｒ１が存在しない対応化合物から
適当な触媒を用いる選択的接触水素化によっ【製造する
ことができる。例えば、ヨーロッノ特許出願公報第００
０１６８９号およびそれに対応する米国特許第４．１９
９，５６９号（１９８０年４月２２日発行）に述べられ
ているように、トリス（トリフェニルホスフィン）ロジ
ウム（１）クロリドを用いて還元が行われる。
Ｒ２がＨである式（１）の化合物は、Ｒ２が４′−（α
−Ｌ−オレアンドロシル）−α−Ｌ−オレアンドロシロ
キシである対応化合物から、水性有機溶媒中での酸によ
る緩和な加水分解によって４′−（α−Ｌ−オレアント
１０シル）−α−Ｌ−オレアント０ロース基を除去して
１３位置にヒドロキシ基を有するアグリコーンを得るこ
とによって製造される。次にこのアグリコーンを例えば
はンゼンスルホニルハライト９との反応によりてハロゲ
ン化して、１３−デオキシ−１３−ハロ誘導体を形成し
、最後にこれを例えば水素化トリブチルスズを用いて選
択的に還元する。好ましくない副反応を避けるために、
存在する他のヒドロキシ基を例えばｔａｒｔ−ブチルジ
メチルシリル基によって保護することが望ましい。この
保護基は次に微量の酸を含むメタノールによる処理によ
って、ハロゲン化または還元後に容易に除去される。こ
れらの工程は全て、その実施のために適当な試薬および
反応条件とともに、ヨーロッノセ特許出願公報第０００
２６１５号に述べられている。
本発明のストレプトマイセス　アベルミチリスによって
式（１）のデメチルアベルメクチンの生合成に用いるこ
とのできる化合物は式（ｎ−Ａ）：ＲＣＯＯＨ（ＩＩ−
Ａ） で示される化合物および発酵過程中に（Ｉｔ−Ａ）に転
化できる化合物である。前記化合物をここでは「プライ
マー化合物」と呼ぶ。式（Ｉｆ−Ａ）では、Ｒはα−分
枝鎖基であり、−ＣＯＯＨが付着した、この基の炭素原
子は水素以外の少なくとも２個の他の原子または基にも
結合する。この定義は当然、非環式鎖または環の要素と
しての硫黄もしくは酸素のへテロ原子を任意に含む飽和
および不飽和の非環式基および環式基を含む。
さらに詳しくは、Ｃ−２５置換基になるＲはα−分枝鎖
Ｃ３−０８アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコ
キシアルキルまたはアルギルチオアルキル基；アルキル
基がα−分枝鎖Ｃ２−Ｃ，アルキル基であるＣ３−Ｃ８
シクロアルキルアルキル基；メチレンまたは１個以上の
Ｃ１−Ｃ，アルキルもしくはハロゲンｉ子（フルオロ、
クロロ、ヨード９もしくはブロム）Ｋよって任意に置換
することのできるＣ３−Ｃ８シクロアルキルまたはＣ，
−Ｃ８シクロアルケニル基；１個以上のＣ１−Ｃ４アル
キル基もしくはハロゲン原子によりて任意に置換するこ
とのできる、飽和なまたは完全にもしくは部分的に不飽
和な、３員〜６員の酸素もしくは硫黄含有複素環式基で
ある。
発酵過程中ＫＲＣＯＯＨＩ／ｃ転化可能な化合物；すな
わち前駆体は式（Ｉｔ−Ｂ）： Ｒ−（ＯＨ２）ｎ−ｚ　　　　　　　（ＩＩ−Ｂ）〔式
中、Ｒは上記で定義した通りであり；ｎは０．　２．　
４または６であり； Ｚバー０Ｈ２０Ｈ，−ＣＨｏ、　−０Ｈ２Ｎ２．−ＣＯ
ＯＨ４または一〇ＯｉＲ’であり； Ｒ４はＨまたは（ｃｌ−ｃ６）アルキルであり；Ｒ５は
水素ｙ　　（０１−Ｃ’４）アルキル、またはアミノ酸
残基、特にアスパラギン酸、グルタミン酸およびメチオ
ニンの残基、例えば−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＯＨ２ＣＯＯＨ
，−ＣｉＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）２Ｇ。
ＯＨ，オヨヒーＣＨ（ＣＯｏＨ）（ＣＨ２）２ＳＣＨ３
テする〕 で示される化合物である。
本発明には、式（ＩＩ−Ａ　”）化合物の異性体形、発
酵過程中にそれに転化可能な化合物およびここに述べる
方法への使用から生ずるＣ−２５における異性体アはル
メクチンをも含む。
本発明の方法は、窒素、炭素、無機塩および式ＲＣＯＯ
Ｈで示される化合物または発酵過程中に前記化合物に転
化可能な化合物（すなわち前駆体）の同化可能なソース
を含む水性栄養培地中で、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼ活性とアベルメクチンＢ−０−メチルトランス
フェラーゼ活性とを有さないストレプトマイセス　アベ
ルミチリス菌株による好気性発酵によって実施する。接
種時にまたは発酵中に時々、酸または酸に転化可能な化
合物を発酵に加える。これは一度に全部、または発酵中
に間隔をおいて加える。発酵からサンプルを採取し、有
機溶媒で抽出し、例えば高速液体クロマトグラフィを用
いたクロマドグ２フイによる生成物の表示に従って、ア
イルメクチン生成物の産生な監視することができる。生
成物の収量が最大になるまで、一般には４〜１５日間イ
ンキエベーシ曹ンを続ける。
プライマー化合物（カルボン酸またはカルボン酸に転化
可能な化合物）の各添加の好ましいしはルは０，０５〜
３．０ｇ／ｌの範囲である。プライマー化合物は連続的
、間欠的にまたは一度に全部を発酵に加えることができ
る。酸はそのものとして、または例えばナトリウム、リ
チウムもしくはアンモニウム塩のような塩として、また
は上記で定義したような酸に転化可能な化合物として加
える。
酸が固体である場合には、酸を水または（Ｃ１−Ｃ４）
アルコールのような適当な溶媒に溶解するのが好ましい
。
発酵に用いる培地は、特にＣ−２５置換基がイソプロピ
ルまたは（Ｓ）　−５ｅｃ−ブチルである場合には、同
化可能な炭素、窒素および微量元素源を含む慣習的培地
である。Ｃ−２５置換基が非天然基である場合、すなわ
ちイソプロピルまたは（Ｓ）　−５ｅｃ−メチル以外の
基である場合には、発酵培地は特定成分が欠損している
またはＲ基がイソプロピルまたは（Ｓ）　−５ｅｃ−メ
チルであるプライマー化合物の少量のみを含む培地であ
る。
好ましくは２４℃〜３３℃の範囲内の温度において数日
間発酵させた後に、発酵ブイヨンを遠心分離または濾過
し、菌糸体ケーキを好ましくはアセトンまたはメタノー
ルによって抽出する。溶媒抽出物を濃縮し、次に目的生
成物を例えば塩化メｆｖンｓ　酢酸エチル、クロロホル
ム、フタノールまたはメチルイソブチルケトンのような
、水に混和しない有機溶媒中に抽出する。溶媒抽出物を
濃縮し、粗生成物を必要に応じて、例えば調製用逆相高
速液体クロマトグラフィな用いて、クロマトグラフィに
よりてさらに精製する。
生成物は一般に、Ｒ２が４′−（α−Ｌ−オレアンドロ
シル）−α−Ｌ−オレアンドロシルオキシであり、Ｒ１
がＯＨで二重結合が存在しない、またはＲ１が存在せず
二重結合が存在し、Ｒ３がＨである式（１）化合物の混
合物である。Ｒ３がＣＨ３である化合物は本質的に存在
しない。しかし、各化合物の割合は特定の変異株、使用
するプライマー化合物および使用条件に依存して変動し
うる。
Ｒ基の源は、すなわちＲ基が直接Ｒ−ＣＯＯＨから生じ
たかまたは上記の前駆体からもしくは何らかの前駆体か
ら生成したかはデメチルアにルメクチンの産生にとって
重要ではない。本発明の方法のデメチルアベルメクチン
の産生にとって重要な必要な条件は、Ｒ基が発酵過程で
本発明のストレプトマイセス　Ｌ≦上土ニュヱ菌株にと
って同化可能であるということである。
適当な化合物を次に挙げる： ２．３−ジメチル酪酸 ２−メチルヘキサン酸 ２−メチルインド−４−エン酸 ２−シクロプロピルプロピオン酸 ４．４−ジフルオロシクロヘキサンカルボン酸リチウム
塩 ４−メチレンシクロヘキサンカルボン酸３−メチルシク
ロヘキサンカルボン酸（シス／トランス） １−シフローンテンカルボン酸 １−シクロヘキセンカルボン酸 テトラヒドロピラン−４−カルボン酸 チオフェン−２−カルボン酸 ３−クロン酸 ２−クロロチオフェン−４−カルボン酸シクロブタンカ
ルボン酸 シクロインタンカルボン酸 シクロヘキサンカルボン酸 シクロヘプタンカルボン酸 ２−メチルシクロプロパンカルボン酸 ３−シクロヘキセン−１−カルボン酸 ２−メチルチオプロピオン酸 ２−メチル−４−メトキシ酪酸 チオフェン−３−カルボン酸 ヒト９０キシメチルシクローンタン ３−チオフェンカルボキシアルデヒド ３−シクロヘキシルプロピオン酸 ３−シクロインチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒド四チオフェンー３−カルボン酸３−シクロベ
ンチルー１−プロノセノール３−メチルシクロブタンカ
ルボン酸リチウム塩３−フルオロシクロブタンカルボン
酸 ３−メチレンシクロブタンカルボン酸リチウム塩２−メ
チル−４−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオプラン−４−カルボン酸シクロプチル
メチルアミン エチルシクロプタンシク四ペンテン ４−ヒト０ロキシメチルシクロはンテン２−（３−ｆオ
フエンカルボニル）７’ｔ−ピオン酸エチルエステル （Ｓ）−２−メチルペンタン酸 （Ｒ）−２−メチルインタン酸 ３種類の０−メチルトランスフェラーゼ変異株がここに
述べた分枝鎖２−オキソ酸デヒト０ロゲナーゼ陰性変異
株から得られる。有効な分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性の突然変異が１個以上の０−メチルトランス
フェラーゼ突然変異と結合した変異株は、ＲＣＯＯＨ化
合物または発酵過程中ＫＲＣＯＯＨに転化可能な化合物
を供給すると、主としてＢアベルメクチン、デメチルア
イルメクチンまたは全（メチル化されていないアベルメ
クチンを産生ずるストレプトライセス　アベルミチＩＪ
　、Ｘ菌株を生産する。前記突然変異株は分枝鎖２−オ
キン酸デヒト９０ゲナーゼ活性を有さない、ここに述べ
た突然変異株の紫外線および／または例えばＮ−メチル
−Ｎ−ニトロソウレタン、ニド四ソグアニジン、エチル
メタンスルホネートもしくは上記に挙げたような他の作
用剤のよ５な化学的突然変異誘発物質による突然変異誘
発によりて得られる。この代りに、Ｏ−メチルトランス
フェラーゼ活性の一方または両方を有さない分枝鎖２−
オキソ酸デヒト０ロゲナーゼ陽性突然変異株は紫外線ま
たは突然変異誘発剤による処理によりて突然変異を起し
て、分枝鎖２−オキソ酸デヒト０ロゲナーゼ陰性突然変
異株および／または分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ
陰性変異株を生ずる。
このような突然変異株によって生ずる非天然アベルメク
チンはアグリコーン成分のＣ５位置および／またはオレ
アンドロース成分の０３’および／またはＣ３“位置に
おけるヒドロキシ基の存在を特徴とする。
上記突然変異株はシェルマン等が述べている方法によっ
て同定する〔アンチマイクロビアル　エイジェント　１
乙ｙ　ケモセラ♂−＊　　２９Ｌ６２０−６２４頁（１
９８６））。これらの突然変異株は公知のアベルメクチ
ンと同じ目的に、同じように有用である。
この代りに、オレアンドロースニ糖成分にメチル基を有
さないアベルメクチンを含めたＢアベルメクチンが、０
−メチルトランスフェラーゼ活性を阻害するシネフンギ
ン、Ｓ−アデノシルエチオニンまたはＳ−アデノシルホ
モシスティンのような物質の存在下で、活性な分枝鎖２
−オキソ酸デヒト０ロゲナーゼを有さない本発明の変異
株を発酵させることによりて多量に産生される。
本発明の化合物は駆虫薬、外部寄生虫撲滅剤。
殺虫剤およびダニ駆除剤として特定の用途を有する非常
に活性な駆虫薬である。
このようＫ、これらの化合物は特に、線虫と呼ばれる寄
生虫群によって非常に頻繁に誘発され、ブタ、ヒツジ、
ウマおよびウシの重度な経済的損失を招き、家畜および
家きんに影響を与える嬬虫病を含めた、内部寄生虫によ
って生ずる種々な症状の治療に有効である。この化合物
は例えばイヌのイヌ糸状虫および例えば鉤虫属（Ａｎｃ
ｙｌｏｓｔｏｍａ）。
鉤虫（Ｎａｃａｔｏｒ　）　、回虫（Ａｓａａｒｉｓ　
）、　　円虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ　）を旋毛
虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　）、毛頭虫（Ｃａｐｉｌ
ｉａｒｉａ　）ｔ　　鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　）、
　　！！！虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕａ　）のような胃腸
寄生虫、ならびに例えばフィラリア虫および円虫と旋毛
虫の腸外期のような、血液またはその他の組織および器
官に検出される寄生虫を含めた、ヒ）Ｋ感染し５る種々
な寄生虫を含めて、種々な動物種に影響を与える線虫に
対して有効である。
この化合物はまた、例えばウシおよびウマに影響を与え
るマダニ、ダニ、シラミオノミ、クロノζ工、刺虫（ｂ
ｉｔｉｎｇｉｎｓｅｃｔ　）および移住性双翅目幼虫の
ような、特に動物および鳥の昆虫綱外部寄生虫を含めた
外部寄生虫感染症の治療にも有効である。
この化合物はまた、ゴキブリ、イガ、ヒメマルカツオプ
シムシおよびイエバエのような家庭害虫に対して有効か
つ貯蔵穀粒の害虫およびハダニ。
アブ２ムシ、イモ虫のよ５な農作物の害虫ならびにダイ
ミ璽つバッタのような移住性直翅目に対して有効である
殺虫剤である。
式（１）の化合物は予定の特定の用途ならびに治療すべ
き特定の宿主動物種および関係する寄生虫または害虫に
適した製剤として投与する。駆虫薬として用いるために
は、化合物をカプセル剤、巨丸剤１錠剤または水薬とし
て経口投与する、またはこの代りに、注射によりてまた
はインブラントとして投与する。このような調剤は標準
的な獣医学的方□法に従って、慣習的な方法で製造され
る。従りて、有効成分を例え１イ殿粉、ラクトース、タ
ルク、ステアリン酸マグネシウム等のような、崩壊剤お
よび／または結合剤を補助的に含む、適当な微粉状希釈
剤またはキャリヤーと混合するととｋよって、カプセル
剤、巨丸剤または錠剤を製造することができる。水薬製
剤は有効成分を分散剤または湿潤剤等とともに水溶液中
に分散させることによって製造し、注射可能な製剤は例
えば、溶液を血液と等強性にするために充分な塩または
グルコースのような、他の物質を含む無菌溶液として製
造することができる。これらの製剤では被治療宿主動物
種、感染症の重症度と種類および宿主の体重に依存して
、有効成分量が変化する。一般に経口投与用には、１回
量または分割量として動物体重１ｋｌ？ｌにつき約０．
００１〜１０■量１日〜５日間投与が充分であるが、こ
れより高いまたは低い用量範囲が指示される場合も当然
あり、このような用量範囲も本発明の範囲内に含まれる
。
代替手段として、化合物を動物の飼料とともに投与する
こともでき、この目的には濃厚な飼料添加剤またはプレ
ミックスを通常の動物飼料との混合用に製造することが
できる。
殺虫剤としておよび農業の害虫駆除のために使用するに
は、化合物をスプレー、ダスト、エマルジッン等として
標準の農業的方法に従って用いる。
ストレプトマイセスｌ−３（ＡＴＣＣ５３５６７）の産
生工程１．ストレプトマイセス　アベルミチリスＡＴＧ
Ｃ３１２７２を二：ｈ　　Ａｙチ寒天培地（ＮｅｗＰａ
ｔｃｈ　Ａｇａｒ　Ｍｅｄｉｕｍ　）上に集密的ローン
として、３０℃において１２日間増殖させた。
Ｖ−８ジエース※　　　　　２００ｄ Ｏａ　ＣＯａ　　　　　　　　　　３　Ｅｌ寒天　　　
　　１５９ Ｈ２Ｏ１０００−になるまで 栄養ブイヨン　　　　　　　　　１．０ｉ／１酢酸ナト
リウム三水和物　　　　１．４１１７１イソ吉草酸　　
　　　　　　　５０１１９／１イソ酪酸　　　　　　　
　　　５０岬／ｌメチル酪酸　　　　　　　　　５０塾
４イソロイシン　　　　　　　２５０１ｎｆ／１０イシ
ン　　　　　　　　　　２５　ｏｖｑ／１／リン　　　
　　　　　２５０壓ｑ 微量元素溶液※※　　　　　　　１４／ｌ※　８種類の
野菜ジー−ス（トマト、ニンジン。
セロリ、ビート、ノセセリ、レタス、オランダガラシ、
ホウレン草）ｋ塩、アスコルビン酸、クエン酸および天
然フレーバーを加えた混合物。
キャンベル　スープ　カンパニー（ＣａｍｐｂｅｌｌＳ
ｏｕｐ　Ｃａｍｐａｎｙ）　（＝　ｘ−シャーシー州、
キャムデン）から入手可能。
※※微量元素溶液の組成： Ｆ　ｅ　Ｃｌ　ａ　・６　Ｈ２０２，７１Ｍ　ｎ　Ｓ　
Ｏ４・Ｈｚ　Ｏ４，Ｚ Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４・５　Ｈ２００−５ Ｇ　ａ　ＣＡ！　ｚ　　　　　　　　　１１．０Ｈ３Ｂ
Ｏ３０，６２ Ｇ　ｏ　Ｃ１２・６　Ｈ２００，２４ Ｚ　ｎ　Ｃｌ　ｚ　　　　　　　　　０．６８Ｎａ２Ｍ
ｏｂ４　　　　　　０．２４ 上記成分を０．ＩＮ　ＨＣｌ１１に溶解。
このような３プレートから胞子を回収してＯ，ＯＳＭト
リスマレイン酸緩衝液（ｐＨ９，０）　２０ｄ中に懸濁
させる。
工程２．胞子懸濁液１０−をＮ−メチル−Ｎ′−二トロ
ーＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）１０＋ｗＪ含有バ
イアルに加えた。このノＺイアルを２８℃において６０
分間振とうインキｚｌ−トし、次に１％ＮａＣ１溶液で
充分に洗浄した。
工程３．洗浄した胞子を１％Ｎａ　Ｃ１中に懸濁し、等
量の５ｏｔｓエチレングリコールと混合した。この懸濁
液を一２０℃で保存し、突然変異株を検出するための細
胞源として用いた。これは発芽時に約１０コローー／ゴ
を生じた。
この胞子ストックをＹＰＤプレート上に展げて、約１０
０コロニー／プレートを形成した（ＹＰＤ培地は酵母抽
出物、バクトハプトン※（Ｂａｃｔ。
ｐｅｐｔｏｎｅ　）およびデキストロース各１０１１／
ｌと、バクト寒天”　（Ｂａｃｔｏ　ａｇａｒ）　１５
１／ｌ　　を含み、加圧滅菌前にｐＨ６，９Ｋ調節する
〕。星印を付けた成分はディフコ　ラホラトリーズ（Ｄ
ｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ−１ａｔｏｒｉｅｓ）　（ミシガン
４８２３８．　　デトロイト）から入手可能。
工程４．２８℃において２〜３週間増殖させた後に、独
立コロニーをプレートから採取して、標準９６孔マイク
ロタイタープレートの孔に入れた。
コロニーの少量は新しい寒天培地に・ぞツチして、変異
株を確認する場合の生育可能細胞としても用いた。
工程５．各孔に１グルコ一ス１％、　カザξノ酸０．１
％、およびイソ吉草酸、イソ酪酸および２−メチル酪酸
各ｏ、ｏｉ％を含む液体Ｍ９塩培地約７５μノ　を加え
た。２８℃において数日間インキエイートシた後、分枝
鎖２−オキソ酸デヒド冒ゲナーゼの存在に関して細胞を
検査した。（Ｍ９塩培地１１はＮａ２ＨＰＯ４６９，Ｋ
Ｈ２ＰＯ４３１１゜Ｎ＆Ｃ１Ｏ，５！ｉおよびＮＨ４Ｃ
ＪＩＪｉ’　　を含有する。
この培地を加圧滅菌し、殺菌したＩＭ　ＭｇＳＯ４と０
．１　Ｍ　Ｇ　ａ　Ｇ　ｌ　２　各１ｄを無菌添加する
）工程６．混和不能な混合物を短時間超音波処理するこ
とによりて、Ｍ９塩培地中５％トルエンのζクロ懸濁液
を調製した。この懸濁液２５ｄに、（１４Ｃ−ｘ）−２
−オキソ−イソカプロン酸２．５マイクロキエーリー／
ｄ、１０．０マイクロキ工−リー／μｍｏｌｅを含む溶
液１．２　ｄを加えた。この総理合物５０μｌを被検コ
ロニー含有マイク四タイタープレートの各孔（ウェル）
に加えた。
リオル（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　１２８巻、
４８５−４８６頁（１９７６） 「多重サンプル中の１４ＣＯ２検出の簡便方法：突然変
異体の迅速検出への適用（ＣｏｎｖｅｎｉｅｎｔＭｅｔ
ｈｏａ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　１４００２　ｉ
ｎ　ＭｕｌｔｉｐｌｅＳａｍｐｘｅ　：　Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｐｔａ　Ｓｃｒｅｅｎｔｎｇｆ
ｏｒ　Ｍｕｔａｎｔａ　）　Ｊ に述ぺている方法に従って、各孔から発生する１４ＣＯ
２を捕捉し、可視化した。活性な分枝鎖２−オキソ酸デ
ヒドロゲナーゼを有さない変異株は対照で観察された以
上のＢ　ａ　”　’　Ｃｊ　Ｏ、を産生じない。
Ｂ　ａ　”　ＣＯ３形成の結果とし【のオートラジオグ
ラム上の暗色スポットとして示される１４Ｃ０２陽性分
析と、スポットなしまたは非常に淡色のスポットとして
示される陰性分析との対比を改良した、より正確な方法
は次の改良検査方法から成る。
独立コロニー（上記工程４参照）を７〜１４日間増殖後
に寒天培地から採取する（２〜３週間ではなく、工程６
と７Ｖｃよって直接検査）。上記方法の工程５は省略す
る。
１４Ｃ０２放出に関して定量的な性質であるさらに正確
な分析方法は、Ｍ９塩培地とグルコース１チおよび「ジ
ンカサ（５ｙｎｃａｓａ　）　−ｂｃａａＪ　（Ｌ　−
アミノ酸と適当な組成の市販のカザミノ酸との合成混合
物、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−ロイシン
は存在せず、下記参照）０．１％とから成る適当な培地
上での上記検査方法によって検出された変異株を増殖さ
せることから成る。
高細胞密度に増殖した後に、Ｍ９塩培地内で細胞を洗浄
し、超音波処理によってトルエンの乳白色分散系を生じ
た１チトル工ン含有冷Ｍ９塩培地中に再懸濁させた。細
胞を透過性化するために、細胞／緩衝液／トルエン懸濁
液を３０℃において４０分間インキ為ベートした。透過
性化細胞をＭ９塩培地中で洗浄し、Ｍ９培地緩衝液の最
初の量の１１５中に最終的に懸濁させた。この懸濁液１
８０μノを分析に用いた。
反応量３００μｌはトルエン化細胞、チアミンピロホス
フェート（ＴＰＰ　）　０．４　ｍＭ　、補酵素Ａ（Ｏ
ｏＡ）　０．１１　ｍ　Ｍｅ　ニコチンアミドアデニン
ジヌクレチオ）’（ＮＡＤ）０．６８ｍＭ、ジチオスレ
イ）−ｙ（ＤＴＴ）　２．６　ｍＭ　、　ＭｇＣｌ２４
．１　ｍＭ　、　）リスＨＣｌ　６０ｍＭ、トリスＨＣ
１６０ｍＭ　　（ｐＨ７，５）、および（”Ｃ−１）−
２−オキソイソカプロニー）　６．ＯＯＯａｐｍ　（マ
イクロキエーリニ／μｍＯりを含有した。計数率は７３
％であった。反応はバイアルのねじ込みキャップに２Ｘ
２ｃｎホワツトマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ　）φ４方形戸
紙を押込んだ、１５ｄシンチレーシ雪ンバイアル内で実
施した。ｐ紙はＩＭヒアミンヒドロキシト”　（Ｈｙａ
ｍｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ　）〔メタノール中メチ
ルベンズエト二ムヒドロキシト９の１Ｍ溶液、シグマケ
ミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ−１ｃａｘ　Ｃｏ、　
）　（ミズーリ６３１７８．セントルイス）から入手可
能〕３０μ！を含み、反応から発生する１４ＣＯ□を捕
捉する。２時間インキエベートした後に、Ｆ紙をベック
マンアクアゾル■〔ユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｘ
　）　ＬＳＣ（液体シンチレータ１フ計数’ｆｌ　”）
　、二島−イングランドニエークレアーリサーチプロダ
クツ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅ
−ｅａａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　）　、　マサチ為
セッツ０２１１８゜ボストンから入手可能〕１０ｄ中に
浸せきし、この溶液中で４時間以上平衡させた後に液体
シンチレーシｌン計数管で放射能を測定した。ブランク
の対照反応（細胞を含まず）は約５０−３００ａｐｍを
示した。変異株Ｉ−３およびこれと同様な他の変異株は
ブランク対照反応以下のカウントを示したが、親囚株は
ブランク対照値よりも数倍高いカウントを示した。
「ジンカサ−ｂｃａａＪの組成、１００倍濃縮物　１／
ＩＬ−アラニン　　　　　　　　　３ Ｌ−アルギニン　　　　　　　　　４ Ｌ−アスパラギン酸　　　　　　　６ Ｌ−システィン　　　　　　　　　Ｉ Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　２０ グリシン　　　　　　　　　　Ｉ Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　　　２ Ｌ−リシン　　　　　　　　　　　７ Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　３ Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　６ Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　１０Ｌ−セリン　　
　　　　　　　６ Ｌ−スレオニン　　　　　　　　４ Ｌ−チロシン　　　　　　　　　４ Ｌ−トリプトファン　　　　　　　１ 混合物をｐ！（７に調節し、フィルター殺菌する。
濃縮部１容量部を培地９９容量部に加えて、標準的な使
用濃度にする。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼとアベルメクチン
ＢＯ−メチルトランスフェラーゼとが欠損したストレプ
トマイセス　アベルミチリス７８８１（ＡＴＣＯ５３５
６２）の二重阻害変異株の調製工程１．ストレプトマイ
セス　アベルミチリスＡＴ００５３５６７をニエーパッ
チ寒天培地上の集密的ローンとして、３０℃において１
２日間増殖させた。
このような３プレートから胞子を回収して、０．０５Ｍ
トリスマレイン酸緩衝液（聞９．０）２０ｍＭ中に懸濁
させた。
工程２．胞子懸濁液１０−をＮ−メチル−Ｎ′−二トロ
ーＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）１０ｍ含有バイア
ルに加えた。このバイアルを２８℃において６０分間振
とうインキ、−＜　−トシ、次に胞子を１％ＮａＣ１溶
液で充分に洗浄した。
工程３．洗浄した胞子を１ＳＮａＣ１中に懸濁させ、等
量の８０％エチレングリコールを加えた。この懸濁液を
一２０℃において保存し、変異株を検出するための細胞
ソースとして用いた。
この胞子ストックをＹＰＤプレート上に展げて約１００
コロニー／フレートヲ得り。ストレフトマ士土２　アベ
ルミチリス菌株Ｉ　−３（ＡＴＣＣ５３５６７）の突然
変異生成集団にトロソグアニジン処理）コロニーを採取
し、次のようＶＣ調製した寒天培地上に、ｅツチとして
展げた。寒天培地の調製（９４）：希薄化殿粉８０　；
　Ｋ２ＨＰＯ４１；　Ｍｇ５Ｏ，，７Ｈ２０１；アルダ
ミｙｐＨ５ｚ　ｌＣａＣＯ３５ｐ　Ｐ−２０００１ｗｌ
　ｓ　Ｆｅ５０　　・７ＨＯＯ，０１ｓ　ＭｎＣ／　２
　”４Ｈ２００，００１ｘ　Ｚｎ５Ｏ４・７Ｈ２００，
００１ｚパクト寒天１７；蒸留水９８０ｄになるまで加
える。ＮａＯＨによって…を７．０に調節してから、１
２１℃において２０分間加圧滅菌する。加圧滅菌後、出
−２−メチル酪酸の無菌５％ストック溶液２０ｓｔｊ（
ｐＨ７，０）を加える。
寒天培養物を２８℃において８−１２日間インキ為ベー
トする。細胞（菌糸体）を寒天表面から採取し、アセト
ン２５０μ！中に入れる。次にア七トン抽出物２５μｌ
をアナルテクシリカゲル（Ａｎａ’１ｔｅｃｈ　５ｉｌ
ｉｃａ　Ｇｅｍ　）　Ｇ　Ｆプレコート薄層クロマトグ
ラフィープレートにスポットする。溶媒として酢酸エチ
ルを用いて、クロマトグラムを３０〜４０分間展開させ
、乾燥し、エタノール中３％バニリンをスプレーした。
このプレートを１００℃の乾燥器ＶＣ１〜３分間入れ、
次にエタノール中３チ硫酸をスプレーし、再び１００℃
の乾燥器ＫＩＯ−１５分間入れた。アベルメクチンＢＯ
−メチルトランスフェラーゼ欠損突然変異株はクロマト
グラフィーパターンの変化によって確認する；すなわち
アベルメクチンＢ成分に相当するスポット（ＢｌとＢ２
のＲｆはそれぞれ、約０．５４と０．４２）がまだ存在
するが、アベルメクチンＡ成分に相当するスポット（Ａ
ＩとＡ２のＲではそれぞれ約０．６９と０．５８）は存
在しない。
−的高速液体り四マドグラフィ（ＨＰＬＣ）処置移動相
： 水　　　１５〇− アセトニトリル　　７０ｄ メタノールを加えて、１１にする。
カラム： ウルトラスフｚア（Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）　ＯＤＳ
　　２５ｃＰｎ〔ベックマンインストルーメンッ（Ｂｅ
ａｋｍａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）　（カリフォル
ニア　９２６３４−３１００、プレート／）〕 流量：０．７５ｄ／ｅ 検出：紫外線２４０　ｎｍ 減衰：約６ サンプル希釈剤ニ アセトニトリル３５ｄ＋メタノール３９０−標準： １、アベルメクチンＡ２Ａ　Ｏ，５■を１０−フラスコ
に秤り入れ、メタノールを１０ゴまで加える。
２、試験生成物０．５■を１０−フラスコに秤り入れ、
メタノールを１０−まで加える。
１と２は標準ストック溶液である；標準溶液の操作： （１）１００μｌと（２）１００μノをバイアルに入れ
、移動相ＳＯＯμｌを加える サンプル： １、充分に振とうしたブイヨン１１１Ｌｌを採取し、遠
心分離する ２、イレットを損傷しないように、できるだけ多（の上
清を除去する ３、ＨＰＬＣ水１０水戸００μｌツトに加え、混合物を
攪拌して分散させる ４゜希釈剤の）２−を加え、充分に混合する５、混合物
を濾過し、ＨＰＬＣ分析する前記天然アベルメクチンと
非天然アベルメクチンに対して、このＨＰＬＯクロマト
グラフィ処置を行い、各アベルメクチンのピークの保持
時間を存在するオリゴマイシンＡに観察された保持時間
で除した、オリゴマイシンＡは特定ＨＰＬＣ測定の内部
標準として役立つ。オリゴマイシンＡはストレプトマイ
セス　アベルミチリス発酵の副生成物として、ＨＰＬ（
Ｋよって殆んど常に観察され、酸ＲＣＯＯＨ（Ｒは前記
で定義した通りである）を含まない培地または酸ＦＩＣ
ＯＯＨ（Ｒは前記で定義した通りである）Ｋ転化可能な
化合物を含まない培地中で培養した場合に前記変異株が
産生ずる、ＨＰＬＣで観察される唯一の生成物である。
オリゴマイシンＡの保持時間は典型的に１２．５−１４
分間である。保持時間（ＲＴ）の比はアベルメクチン生
成物の同一性および収率を比較するための重要な根拠を
与える。ＨＰＬＣ上のアベルメクチン生成物の一般的な
出現順序はＢ２．Ａ２．ＢｌおよびＡ１である。
８２　ｔ＋　　　　　　　　０．７０ Ｂ　２　ａ　　　　　　　　　０．８４Ａ　２　ｋ＋　
　　　　　　　０．９０Ａ２ａ　　　　　　　　　１．
０９ Ｂｉｂ　　　　　　　　　１．４０ Ｂｌａ　　　　　　　　　１．８３ Ａ　１　ｂ　　　　　　　　　１．８３Ａ　１　ａ　　
　　　　　　　２．４２ＢｌａとＡｌａが不溶であるこ
とに注意する。
非天然アベルメクチン　　ＲＴ　ＴオリゴマイシンＡ）
シクロインチルＢ２　　　　　　　０．９４シクロペン
チルＡ２　　　　　　　１．２３シクロペンチルＢｌ　
　　　　　　　１．９９シクロペンチ／Ｌ／ＡＩ　　　
　　　　　２．６２保持時間は日によって１〜２分間変
動し、オリゴマイシンＡは一般に約１２．５−１４分間
に変動する。
次の例では、アベルメクチンを特に指示した場合以外は
上記ＨＰＬＧ方法によって測定する。
次の例に用いる培地の組成は下記の通りである：アルダ
ミ７　（Ａｒｄａｍｉｎｅ）ｐＨｂ５アアルマメディア
（Ｐｈａｒｍａ　ｍｅｃｌｉａ）０　　　１５Ｇ　ａ　
ＯＯａ　　　　　　　　　　　　　　　２”　　、ｐＺ
ｆ　１７２　　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌ
ｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）からのα−アミラーゼ〔
ノボｚｙザイム（Ｎｏｖａ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）　（＝２
ネテイカット州、ウィルトン）から商品名「ターマル（
Ｔｅｒｍａｍｙｌ）　ｊとして入手可能〕によって殿粉
から４０％±５％に等しいデキストロースへの加水分解
によりて調製。
１　イーストプロダクツ社（Ｙｅａｓｔ　Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ、　Ｉｎｃ、　）にニーシャーシー０７０１２　ク
リ７トン）から０　トレーダー　プロプ４　ｙ　（Ｔｒ
ａａｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　）（テネシー３８１０８．
　　エムフィス）からＮａＯＨＩＣよって、…を７．２
に調節する。
ＡＰ−５培地 希薄化殿粉　　　　　　　８０ アルゾミンｐＨ５ に２ＨＰＯ４１ Ｍｇ５Ｏ４−７Ｈ２０１ ＮａＣｌ　　　　　　　　　　Ｉ Ｇ　ａ　ＣＯａ　　　　　　　　　　７ＦｅＳＯ４−７
Ｈ２０ｏ、ｏＩ ＭｎＧｌ　２　・７Ｈ２００，００１ ＺｎＳ０４・７Ｈ２００，００１ Ｐ−２０００（消泡剤）＆１ｘｌ／１ ａ　ダウケミカル社（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｌｃａｌ　Ｇｏ
、　）（ミノガン４８６４０ミツト９ラント９）から２
５％ＮａＯＨによりて−を６．９に調節する。
（実施例） 例１−４ 胞子形成Ｖ−８プレートからのストレプトマイゼ　τ３
２そしＬユヱ、Ｉ　−３（ＡＴＣＣ５３５６７）を５０
０ｄ−）リプルバッフルフラスコ（Ｔｒｉｐｌｅｂａｆ
ｆｌｅｄ　ｆｌａｓｋ　）中のＡｓ−７培地８０ｄに接
種した。このフラスコを回転シェーカー上で２０〜３０
℃において２００　ｒｐｍで攪拌しながら、インキユベ
ートした。２４時間インキエベートした後Ｋ。
全ブイヨンの１ｄをＡＰ−５培地４０ｍ１含有３０〇−
−フラスコに接種した。下記の各プライマー化合物（２
４時間後に添加）　４００ｐｐｍの存在下、２８−３０
℃において２通りの発酵を実施した。
３１２時間後に、全ブイヨンのサンプル２−にメタノー
ル：アセトニトリル（３９０：３５）８ｍｌを混合した
。濾過後Ｋ、サンプル５０ｐｌをベックマンウルトラス
フェア−０ＤＳカラム（３０Ｘ２５０閣）に注入した。
カラムをメタノール：アセトニトリル：水（８９：１４
ニア）によって０．８ｙｄ１分、において溶出し、溶出
物を２４０　ｎｍにおける紫外線検出法によって監視し
た。新規なアベルメクチンの保持時間を下記に示す： ※　＋メチル酪酸と一メチル酪酸の両方をアばルメクチ
ン中に混入する。用いたクロマトグラフィ条件下で、（
イ）アベルメクチンと（→アベルメクチンの分解はＢ２
とＡ２によりてのみ行われる。
例５ ルメクシン 培養物ストレプトマイセス　アイルミチリスフ８８１（
ＡＴＣＣ５３６９２：１Ｈ７）凍結バイアルを５００ｄ
−）リプルバッフルフラスコ中のＡｓ−７培地１００ａ
ｌに接種した。このフラスコを回転シェーカー上で２８
〜３０℃において２００　ｒｐｍで攪拌しながらインキ
ユベートした。２８時間インキエベートした後に、全ブ
イヨン５ゴを５００ａＪ−）リプルバッフルフラスコの
新たなＡｓ−７培地１００ｄに接種した。このフラスコ
を回転シェーカー上で２８−３０℃において２０　Ｏｒ
ｐｍで攪拌しながラインキ、−＜−トシた。２４時間イ
ンキ為ヘートした後に、全ブイヨン１１！１１をＡＰ−
ｓ培地４０ｄ含有３００　ｍｌ−フラスコに接種した。
このフラスコを２８−３０℃において２０　Ｏｒｐｍで
攪拌しながらインキユベートした。２４時間後にシクロ
ヘキサンカルボン酸４０四を加えた、３１２時間後にサ
ンプル２−を採取し、例１に述べたように、このサンプ
ルに対して高速度液体クロマトグラフィを行った。この
ような条件下で、発酵中に検出されたアベルメクチン成
分のみがシクロヘキシルＢ２と８１にそれぞれ相当する
１４．８４　（５４，９Ｗ／ｌ　）および３１．４　ｅ
　（ａｚ、ＩＷＶ′ｌ）分間に溶出した。
例６ Ｂ２ 例５の方法を（り返したが、この場合にはシクロヘキサ
ンカルボン酸の代りに±２−メチル酪酸４００Ｐを用い
、他の条件は全て例２に述べた条件と同じであった。５
ｅｃ−ブチルアベルメクチンＢ　２　（１１，６０，１
２，４０分間、　　６３．５．４２．４ｗｇ／〕）およ
び５６Ｃ−ブチルアベルメクチンＢｌ（２３，１分間。
１０５．５〜／ｌ）のみが発酵中に検出された。
（外４名）

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性および
    アベルメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性を
    有さない￥ストレプトマイセス￥　￥アベルミチリス￥
    （￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥　￥ａｖｅｒｍｉｔｉ
    ｌｉｓ￥）。
  2. （２）その透過性化細胞が添加〔＾１＾４Ｃ−１〕−２
    −オキソイソカプロン酸から＾１＾４ＣＯ＿２を発生さ
    せることができないことを特徴とする、分枝鎖２−オキ
    ソ酸デヒドロゲナーゼ活性およびアベルメクチンＢＯ−
    メチルトランスフェラーゼ活性を有さない￥ストレプト
    マイセス￥　￥アベルミチリス￥。
  3. （３）ＡＴＣＣ５３６９２の同定特徴を有する￥ストレ
    プトマイセス￥　￥アベルミチリス￥。
  4. （４）￥ストレプトマイセス￥　￥アベルミチリスＡＴ
    ￥ＣＣ５３６９２。
  5. （５）分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性とアベ
    ルメクチン５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性とを
    有さないストレプトマイセスアベルミチリス菌株、同化
    可能な、窒素、炭素および無機塩源を含む水性栄養培地
    、およびアベルメクチンの生合成に利用可能な化合物に
    よる好気性発酵からなるＢアベルメクチンの産生方法。
  6. （６）￥ストレプトマイセス￥・￥アベルミチリス￥が
    ＡＴＣＣ５３６９２の同定特徴を有する特許請求の範囲
    第５項記載の方法。
  7. （７）化合物が式： Ｒ−ＣＯＯＨ 〔式中、Ｒは−ＣＯＯＨ基が付着した炭素原子に水素以
    外の少なくとも２個の他の原子または基が付着している
    α−分枝鎖基である〕 で示される化合物、または発酵過程中に前記化合物に転
    化可能な化合物である特許請求の範囲第５項記載の方法
    。
  8. （８）Ｒがα−分枝鎖Ｃ＿３−Ｃ＿８アルキル、アルケ
    ニル、アルキニル、アルコキシアルキルまたはアルキル
    チオアルキル基；アルキル基がα−分枝鎖Ｃ＿２−Ｃ＿
    ３アルキル基であるＣ＿５−Ｃ＿８シクロアルキル基；
    任意にメチレンまたは１個以上のＣ＿１−Ｃ＿４アルキ
    ル基またはハロゲン原子によって任意に置換されるＣ＿
    ３−Ｃ＿８シクロアルキルまたはＣ＿５−Ｃ＿８シクロ
    アルケニル基；または飽和または完全にもしくは部分的
    に不飽和で、１個以上のＣ＿１−Ｃ＿４アルキル基また
    はハロゲン原子によって任意に置換される、３員〜６員
    の酸素もしくは硫黄含有複素環である化合物、または発
    酵過程中に前記化合物に転化可能な化合物である特許請
    求の範囲第７項記載の方法。
  9. （９）基質ＲＣＯＯＨに転化可能な化合物が式： Ｒ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｚ 〔式中、Ｒは前記に定義した通りであり； ｎは０、２、４または６であり； Ｚは−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ＾４、−Ｃ
    Ｈ＿２ＮＨ＿２または−ＣＯＮＨＲ＾５であり； Ｒ＾４はＨまたは（Ｃ＿１−Ｃ＿６）アルキルであり； Ｒ＾５はＨ、（Ｃ＿１−Ｃ＿４）アルキル、−ＣＨ（Ｃ
    ＯＯＨ）ＣＨ＿２ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ
    ＿２）＿２ＣＯＯＨまたは−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ＿
    ２）＿２ＳＣＨ＿３である〕 で示される化合物である特許請求の範囲第７項記載の方
    法。
  10. （１０）Ｒがシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘ
    キシル、シクロヘプチル、２−メチルシクロプロピル、
    ３−シクロヘキセニル、１−シクロペンテニル、１−シ
    クロヘキセニル、３−メチルシクロヘキシル（シス／ト
    ランス）、４−メチレンシクロヘキシル、３−メチルシ
    クロブチル、３−メチレンシクロブチル、３−シクロペ
    ンテニル、１−シクロプロピルエチル、３−フルオロシ
    クロブチル、４，４−ジフルオロシクロヘキシル、イソ
    プロピル、ｓｅｃ−ブチル、２−ペンチル、２，３−ジ
    メチルプロピル、２−ヘキシル、２−ペント−４−エニ
    ル、２−メチルチオエチル、Ｓ−２−ペンチル、Ｒ−２
    −ペンチル１２−チエニル３　３−チエニル、４−テト
    ラヒドロピラニル、３−フリル、２−クロロチエニル、
    ３−テトラヒドロチエニル、４−メチルチオ−２−ブチ
    ル、４−テトラヒドロチオピラニル、４−メトキシ−２
    −ブチルまたは４−メチルチオ−２−ブチルである特許
    請求の範囲第８項記載の方法。
  11. （１１）Ｒが式： Ｒ−ＣＯＯＨ で示されるカルボン酸から誘導される特許請求の範囲第
    １０項記載の方法。
  12. （１２）Ｒがシクロペンチル、シクロヘキシルまたはチ
    エニルである特許請求の範囲第１１項記載の方法。
  13. （１３）Ｒが発酵過程中にＲＣＯＯＨに転化し得る化合
    物から誘導される基であり、前記化合物が式： Ｒ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｚ 〔式中、Ｒは前記で定義した通りであり； ｎは０、２、４または６であり； Ｚは−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ＾４、−Ｃ
    Ｈ＿２ＮＨ＿２または−ＣＯＮＨＲ＾５であり； Ｒ＾４は（Ｃ＿１−Ｃ＿６）アルキルであり； Ｒ＾５は水素、（Ｃ＿１−Ｃ＿４）アルキル、−ＣＨ（
    ＣＯＯＨ）ＣＨ＿２ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（Ｃ
    Ｈ＿２）＿２ＣＯＯＨまたは−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ
    ＿２）＿２ＳＣＨ＿３である〕 で示される化合物である特許請求の範囲第１０項記載の
    方法。
  14. （１４）Ｒがα−分枝鎖Ｃ＿３−Ｃ＿８アルキル基であ
    るときに、イソプロピルおよび（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル
    以外の基である特許請求の範囲第８項記載の方法。
  15. （１５）￥ストレプトマイセス￥　￥アベルミチリス￥
    の菌株が￥ストレプトマイセス￥　￥アベルミチリス￥
    ＡＴＣＣ５３６９２である特許請求の範囲第８項記載の
    方法。
  16. （１６）同化可能な、炭素、窒素および無機塩源を含み
    、式； ＲＣＯＯＨ 〔式中、Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチ
    ルである〕 で示される酸または￥ストレプトマイセス￥　￥アベル
    ミチリス￥によって前後酸に転化可能な化合物を実質的
    に含まない水性栄養培地中好気性条件下で発酵させた場
    合に、Ｃ−０７６アベルメクチンを実質的に産生しない
    が、前記培地が式ＲＣＯＯＨ（Ｒはイソプロピルまたは
    （Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルである）で示される酸または￥
    ストレプトマイセス￥　￥アベルミチリス￥によって前
    記酸に転化可能な化合物を含む場合に、前記培地中での
    発酵時に実質的にＢアベルメクチンのみを産生すること
    ができるストレプトマイセス属に属する新規な菌株であ
    って、￥ストレプトマイセス￥　￥アベルミチリス￥Ａ
    ＴＣＣ５３５６７を突然変異させることからなる方法に
    よって得られる菌株。
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