PL156763B1

PL156763B1 - Sposób wytwarzania awermektyny B P ierw szen stw o:23.01.1987,U S ,006512 PL PL PL PL

Info

Publication number: PL156763B1
Application number: PL1988270238A
Authority: PL
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-21
Publication date: 1992-04-30
Also published as: PT86584B; EP0276131A3; DK175720B1; ZA88448B; CN88100649A; KR910002225B1; HUT47644A; IL85118A0; ZA88447B; FI880280A0; YU47878B; BG51051A3; EP0276103A3; EP0276131A2; AU1069688A; FI90088C; EP0276103B1; NZ223271A; DE3879975D1; JPS63291576A

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania awermektyny 3 polegający na zastosowaniu mutantów Streptomyces ayermitilis nie wykazujących aktywności O-metylotransferazy awermektyny B i aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu do wytwarzania naturalnych i nie naturalnych awermektyn B.

W opisach patentowych St.Zjedn.Am. nr 4 310 519 i 4 429 042 przedstawiono awermektyny, kompleks spokrewnionych czynników o silnym działaniu przeciwpasożytniczym, oraz sposób ich wytwarzania na drodze fermentacji z napowietrzaniem szczepów Streptomyces ayermitilis, takich mianowicie jak S.ayermitilis ATCC nr nr 31267, 31271 i 31272. Dwa ostatnie szczepy są odpowiednio postacią zamrożoną w fiolce oraz zliofilizowaną w probówce hodowli otrzymanej drogą naświetlania promieniami nadfioletowymi szczepu S.ayermitilis ATCC 31267.

156 763

W europejskim opisie patentowym nr 214751, opublikowanym 18 marca 1987, stanowiącym odpowiednik zgłoszenia patentowego St.Zjedn.Am. nr 886867, zgłoszonego 16 lipca 1986, przedstawiono szereg związków (określanych tu jako nienaturalne awermektyny), spokrewnionych z naturalnymi czyli znanymi awermektynami, ale zawierających nowy podstawnik w pozycji 25, oraz sposób ich wytwarzania drogą fermentacji produkującego awermektynę drobnoustroju różnych wyspecyfikowanych kwasów karboksylowych lub ich pochodnych albo prekursorów. Drobnoustrojami S.avermitilis stosowanymi do wytwarzania wspomnianych nowych, podstawionych przy atomie węgla w pozycji 25, awermektyn są S.avermitilis ATCC 51267, 51271 , 31272 i NCIB 12121. Ten ostatni drobnoustrój opisany w Europejskim opisie patentowym nr 214751, wywodzi się z S.avermitilis ATCC 51271. Wytwarza on z wyższą wydajnością nowe, podstawione w pozycji 25, awermektyny podczas hodowli w określonej w połowie pożywce. Każdy ze szczepów ATCC 51267,·

51271 i NCIB 12121 może poza nowymi, podstawionymi w pozycji 25, pochodnymi wytwarzać również różne ilości znanych czyli naturalnych awermektyn, w których podstawnikiem przy atomie węgla w pozycji 25 jest grupa izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa (1-metylopropylowa).

Szkielet węglowy awermektyn (opisany wzorem 1) pochodzi z octanów i propionianów a podstawnik C-25 w naturalnych awermektynach z L-izoleucyny (R=(5)-Il-rz.-butyl) lub L-waliny (R=izopropyl) (Fischer i Mrozik, Macrolide Antibiotics, Akademie Press (1984), rozdział 14).

Jako znane lub naturalne awermektyny określa się awermektyny, wytwarzane przez

S.avermitilis ATCC 51267, ATCC 51271 i ATCC 51272, w których podstawnik przy C-25 jest grupą izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową (1-rnetylopropylową). Awermektyny, w których podstawnik przy C-25 jest inny niż grupa izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa, są określone w opisie jako nowe lub nienaturalne awermektyny.

Szczepy S.Avermitilis cytowane we wspomnianych wyżej opisach patentowych St.Zjedn.Am. wytwarzają klasę substancji o nazwie rodzajowej C-076. Klasa ta składa się z ośmiu różnych, ale blisko spokrewnionych związków określanych jako C-076 Ala, Alb, A2a, A2a, Bib, B2a i 32b.

Serie a odnoszą się do naturalnych awermektyn, w których w pozycji 25 znajduje się grupa (S)-II-rz.-butylowa, zaś serie b do awermektyn, w których podstawnikiem w pozycji 25 jest grupa izopropylowa. Litery A i B odnoszą się odpowiednio do awermektyn, w których podstawnikiem w pozycji 5 jest grupa metoksylowa lub hydroksylowa. Liczba 1 odnosi się do awermektyn, w których obecne jest podwójne wiązanie w pozycji 22 - 23 zaś liczba 2 do awermektyn, zawierających atom wodoru w pozycji 22 i grupę hydroksylową w pozycji 23.

W niniejszym opisie nie są stosowane powyższe identyfikatory dla określenia podstawników w pozycji 25 nienaturalnych awermektyn. Identyfikatory Al, A2. 81 i B2 zostały utrzymane dla nienaturalnych awermektyn o cechach strukturalnych odpowiadających opisanym powyżej naturalnym awermektynom.

Wytwarzanie mutantów nie wykazujących aktywności dehydrogenazy oć -ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu zostało opisane dla Bacillus subtilis przez Willecke’go i Pardee w J.Biol.Chem., 246, 5264 - 5272 (1971) oraz dla Pseudomonas putida przez Martina i wsp. w J.3acteriology,

115, 198-204 (1973), natomiast nigdzie dla Streptomyces.

S.avermililis Agly-1, mutant który produkuje praktycznie tylko aglikony awermektyny Ala i A2a został opisany przez Schumlana ;i wsp. w J.Antibiot., 38/11/, 1494 - 1498 (1985). Opisana jest także fermentacja S.avermitilis Agly-1 w obecności sinefunginy, która wywołuje zwiększenie wytwarzania komponentów aglikonu awermetyny B. Podobnie, S.avermitilis 08, wysokowydajny szczep produkujący awermektyny, podczas fermentacji w obecności sinefunginy jako inhibitora transferaz 0-metylowych, wytwarza awermektyny nie zawierające grup 0-metylowych w aglikonie w pozycji 5 w reszcie dwuchlorku oleandrozy.

W opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr 4378353 opisano związki spokrewnione z C-076 oraz ich wytwarzanie na drodze hodowania szczepu MA-5218, mutanta szczepu 5.avermitilis ATCC 31272, otrzymanego drogą naświetlania promieniowaniem nadfioletowym i zidentyfikowanego jako ATCC 31780. Wytwarzane przez tego mutanta związki spokrewnione z C-076 nie zawierają pierścienia furanowego. Ponadto, w niektórych z opisanych związków jedna lub obie reszty cukru oleandrozy są oderwane, a w innych grupa w pozycji 5 jest utleniona do grupy keto.

Trzy klasy mutantów O-metylotransferazowych S.avermitilis wytwarzających awermektyny nie zawierające grup 0-metylowych zostały opisane przez Ruby’ego i wsp. w materiałach z 6th

156 763

International Symposium on the Biology of Actinomycetes, Debrecon, Węgry, 26-30 sierpień 1985, oraz przez Schumlana i wsp. w Antimicrobiol Agents and Chemotherapy, 31, 744 - 747 (1987). Pierwsza klasa wytwarza przede wszystkim awermektyny B ze względu na brak zdolności metylowania grupy hydroksylowej w pozycji 5 makrocyklicznego laktonu. Druga klasa wytwarza 3’-0,3’’-bis-demetyloawermektyny (awermektyny nie zawierające grup 0-metylowych w pozycji 3 obu reszt monocukrowych) określane jako dwumetyloawermektyny. Trzecia klasa nie jest zdolna do metylowania w żadnej pozycji.

Schumlan i wsp. opisali w Fed.Proc.44, 931 (1985) sposób zwiększenia wytwarzania awermektyn B drogą fermentacji S.awermitilis w obecności substancji takich jak sinefungina, S-adenozyloetionina i S-a d e π o z z 1 o ii orno cy st e i na, które hamują metylowanie grupy hydroksylowej w pozycji C-5 reszty aglikonu przez O-metylotransferazę awermektyny B. Mutanty Streptomyces avermitilis nie wykazujące aktywności O-metylotransferazy i wytwarzające zwiększone ilości komponentów awermektyny B zostały także opisane przez Schulmana i wsp. w Antimicrobiol Agents and Chemotherapy, 29, 620 - 624 (1986).

Drogą mutagenezy 5.avermitilis wytwarzane są mutanty wykazujące brak aktywności dehydrogenezy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Mutanty nie wykazują już zdolności do wytwarzania znaczących ilości naturalnych awermektyn przy nieobecności dodanego związku o wzorze RCOOH, w którym R oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową, lub związku ulegającego przekształceniu w RCOOH podczas procesu fermentacji. Zaskakująco i nieoczekiwanie stwierdzono jednak, że mutanty wytwarzają awermektyny, naturalne i nienaturalne, gdy fermentację prowadzi się w obecności dodanego związku o wzorze RCOOH, w którym R oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową albo inną grupę ujawnioną w tym opisie, albo w obecności prekursora związku o wzorze RCOOH. Jeszcze bardziej zaskakujący jest fakt, że opisywane tutaj mutanty nie wykazujące tylko aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, które są niezdolne do rozkładania L-izoleucyny, L-leucyny lub L-waliny, są zdolne do przyswajania wielu różnych związków w szlak biosyntetyczny awermektyny i wytwarzania nienaturalnych awermektyn wolnych od naturalnych awermektyn.

Drogą mutagenezy tak otrzymanych, pojedyriczych mutantów otrzymuje się mutanty wykazujące brak zarówno aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności O-metylotransferazy awermektyny 8. Te podwójne blokowane mutanty nieoczekiwanie i niespodziewanie wytwarzają zasadniczo wyłącznie naturalne i nienaturalne awermektyny B, jeżeli są hodowane w obecności dodanego związku o wzorze R-COOH, w którym R ma wyżej podane znaczenie.

Naturalne awermektyny, jak uprzednio wspomniano, są wytwarzane w postaci kompleksowej mieszaniny ośmiu różnych, ale blisko spokrewnionych związków (wzór 1, R - izopropyl i (S)-II-rz.-buty1). Chociaż zostały one wyodrębnione w praktycznie czystej postaci (opis patentowy St.Zjedn.Am. nr 4429042), to stosowana metoda jest w najlepszym przypadku pracochłonna Awermektyny B mają zwykle silniejszą aktywność przeciwrobaczą od odpowiednich awermektyn A.

W procesie wytwarzania nienaturalnych awermektyn składniki A i B według sposobu przedstawionego w Europejskim opisie patentowym nr 214731 można również otrzymywać niektóre z naturalnych awermektyn w różnych ilościach, ze względu na obecność dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i aminokwasów L-waliny i L-izoleucyny w komórkach S.avermitilis stosowanego w tym procesie.

Pożądane jest więc wytwarzanie tylko bardziej skutecznych biologicznie składników B albo naturalnych albo nienaturalnych awermektyn, a tym samym minimalizacja ilości i kompleksowości produktów i w ten sposób poprawa czystości wybranej awermektyny oraz uproszczenie procesu rozdzielania.

Szczepy S.avermitilis nie wykazujące aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałędzionym łańcuchu otrzymywane są drogą mutacji wytwarzających awermektynę szczepów S.avermitilis, zwłaszcza S.avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 lub NCIB 12121. Mutanty te nie są zdolne do syntezy naturalnych awermektyn z wyjątkiem przypadku, gdy doda się kwas tłuszczowy lub jego prekursor, zawierający grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową, do pożywki, w której mutanty są fermentowane. Są one zdolne do wytwarzania naturalnych i nienaturalnych awermektyn podczas fermentacji z napowietrzaniem w środowisku wodnym, w pożywce zawierającej

156 763 odpowiedni kwas prymerowy lub związek ulegający przekształceniu w ten kwas podczas fermentacji.

Mutanty charakteryzujące się brakiem aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzio14 nym łańcuchu są izolowane ze zmutowanych kolonii na podstawie oznaczeń COy. W oznaczeniu ^bra^k w^ydzⁱelanⁱa przez kolonię z su^bstratu, taki.e^go ja^k kwas (^gOCi^l)-2-ketoizoka^pronowy, ^kwas (i⁰-¹ )-2-keto^-3-me^ty^lomas^łow^{y l}u^{b (g4}C-l)-2-ketowalerianowy, ws^kazuje na ^brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.

Jest zaskakujące i niespodziewane, ze powyższe mutanty nie wykazujące aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionych łańcuchach utrzymują dalej zdolność wytwarzania awermektyn, w szczególności nienaturalnych. Niezdolność mutantów do wytwarzania acyiowych pochodnych koenzymu A z naturalnymi kwasami tłuszczowymi podczas hodowli na typowym podłożu może dawać letalną mutację, jeśli integralność membrany zależy od powyższych pochodnych, lub jeśli akumulacja 2-ketokwasu przez poprzedni mutant prowadzi do cytotoksyczności.

Ponadto, nie oczekiwano, by któryś z mutantów był zdolny do syntetyzowania acetylo-OoA i propionylo-OoA z metabolitów L-izoleucyny i L-waliny, gdyż wymaga to aktywności enzymatycznej, której brak mutantom. Wymaganie obecności powyższych pochodnych acyiowych OoA w procesie biosyntezy awermektyny, o czym wspomniano uprzednio, prowadziło do wniosku, że mutanty mogą być poważnie osłabione pod względem zdolności wytwarzania nienaturalnych awermektyn,co nieoczekiwanie nie nastąpiło.

Brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu u opisanych uprzednio mutantów prowadzi do zahamowania syntezy pochodnych acyiowych OoA z kwasami tłuszczowymi o rozgałęzionym łańcuchu pochodzącym z degradacji L-izoleucyny, L-ieucyny i L-waliny, i tym samym syntezy naturalnych awermektyn, z wyłączeniem przypadku, gdy do środowiska fermentacyjnego doda się kwas o wzorze R-OOOH, w którym R ma wyżej podane znaczenie, czyli oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butyiową.

Dalsza mutacja mutantów nie wykazujących aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionych łańcuchach daje mutanty, które dodatkowo nie wykazują aktywności O-metylotransferazy awermektyny B. Mutanty pozbawione aktywności O-metylotransferazy awermektyny B są niezdolne do metylowania tlenu O-5 ugrupowania aglikonowego awermektyn. Mutanty pozbawione tej aktywności wytwarzają praktycznie jedynie awermektyny B przez zapobieganie wytwarzaniu awermektyn A.

Sposób według wynalazku obejmuje stosowanie dowolnych drobnoustrojów, niezależnie od ich wyglądu i cech fizjologicznych, które można otrzymywać drogą transformacji, transdukcji, rekombinacji genetycznej lub innych manipulacji genetycznych wykorzystujących kwas nukleinowy lub równorzędny materiał z opisanego tutaj gatunku, o ile odpowiadają one charakterystyce przedstawionych w tym opisie mutantów.

Określenie awermektyna lub awermektyny dotyczą związków o wzorze 1, w którym podstawnik R w pozycji 25 może być dowolną grupą przyswajalną przez mutanta S.avermitilis w sposobie według wynalazku.

Opisane mutanty mają wysoką wartość dla wytwarzania nienaturalnych awermektyn sposobami ujawnionymi i przedstawionymi w tym opisie. Są one specjalnie cenne dla wytwarzania korzystnych awermektyn, to znaczy związków o wzorze 1, w którym podstawnikiem przy atomie węgla w pozycji 25 jest grupa Og-Og-cykloalkilowa lub cykioalkenylowa, ewentualnie podstawiona grupa Og-Og-alkilowa, grupa 1-metylotioetylowa, albo 5 lub 6-członowa grupa heterocykliczna zawierająca w pierścieniu atom tlenu lub siarki, zwłaszcza 3-tionylowa lub 3-furylowa.

Mutację wytwarzającego awermektynę szczepu z gatunku Streptomyces avermitilis prowadzi się stosując znane sposoby i różne czynniki mutujące, takie jak promieniowanie nadfioletowe, promienie rentgenowskie, N-metylo-N’-nitro-N-nitrozuguanidyna, metanosulfonian etylu, kwas azotowy i iperyty azotowe, np. N-metylo-bis(2-chloroetylo)aminę, lub inne czynniki.

Mutagenezę można prowadzić na zarodnikach lub hodowli wegetatywnej S-avermitilis wytwarzającego naturalne awermektyny, np. S.avermitilis ATOO 31272.

Stosując postępowanie dobrze znane specjalistom, zmutowane kolonie selekcjonowano wybierając wykazujące brak dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu. Posługiwano się w tym celu badaniem biochemicznym pozwalającym na ocenę wielkiej ilości losowo mutowanych ko6

156 763 lonii bakteryjnych na wytwarzanie ¹⁴C0₂ z (¹⁴C-¹)-2-ketokwasow (Tabor i wsp. J.Bact., 128,

485 - 486 (1976).

Metoda polega na hodowaniu kolonii mutanta w studzienkach na płytce do mikromiareczkowania, na odpowiednim odżywczym podłożu.nasączeniu do komórek toluenu, dodaniu do każdej stu^dzienki ⁽¹*C-l⁾-²-^ketokwasu ⁽np. kwasu ²-^ke'toi.zoka^pronowe^go⁾ i badani^u atmosfer^y nad fer^menta^cją na otaecnosć l*CO^j. Al.terna^tywnie, zamias^t kwasu (^*C-l)-²-ketoizoka^pronowe^go można s^tosować ^kwas ⁽^⁴C-1 ⁾-2-keto-3-me^tylowa^lerianow^y bjb ^kwas (^C-1)-2-keto-³-rne^tylomasłowy. Sp^rawdzanⁱe wytwarzani ^C^ prowadzi się umiszczając zwiżoną bibuł^ę nas^ycon^ą Ba(OH)^{2 nad} ka^żdą poje^dyncz^ą studzin^ w ceU zwijani ewentuaie w^ydzie^lone^go ^⁴C⁰2 ⁱ oznaczeni ^powstałego Ba ^*C⁰^ za pomocą au^toradiogra^fii. ^Mutan^ty ni w^ykazuj^ące a^ktywności deh^ydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu dają autoradiogramy takie jak i próba kontrolna (nieinokolowana), to znaczy nie wykrywa się Ba ©Oj.

Tak otrzymane mutanty poddaje się dalszej mutagenezię stosując jeden z opisanych powyżej czynników mutagennych. Zmutowane kolonie selekcjonuje się wybierając wykazujące brak aktywności O-metylotransferazy awermektyny 8 na podstawie chromatografii (wysokosprawna chromatografia cieczowa, cienkowarstwowa) po fermentacji prowadzonej w obecności dodanego prekursora (np. kwasu 2-metylomasłowego). Związków awermektyny A praktycznie nie ma w pożywkach fermentacyjnych takich mutantów.

Poza wytwarzaniem pożądanych alleli danego szczepu drobnoustroju drogą mutagenezy, fuzja protoplastów pozwala na wprowadzanie pożądanych alleli wytwarzanych i zidentyfikowanych w jednym szczepie do chromozomu innego szczepu. Np. szczep Ξ .avermitilis nie wykazujący aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności O-metylotransferazy awermektyny 8 może przez fuzję protoplastów ze szczepu S.avermitilis wykazującego powyższe aktywności wytwarzać szczep S.avermitilis nie wykazujący tylko aktywności O-metylotransferazy awermektyny 8. Jak wiadomo specjalistom, technologia fuzji protoplastów pozwala na kombinowanie pożądanych alleli z różnych wyselekcjonowanych linii w jeden szczep.

Charakterystyka morfologiczna i hodowlana mutantów stosowanych w sposobie według wynalazku jest generalnie taka sama jak opisano w opisie patentowym St.Zdjedn.Am. nr 4429042. Wyróżniającą cechą tych mutantów jest brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu i/lub aktywności O-metylotransferazy awermektyny B, które to cechy są oznaczane w opisany uprzednio sposób. W wyniku braku powyższych aktywności mutanty nie wytwarzają naturalnych awermektyn B podczas hodowania w określonej pożywce praktycznie nie zawierającej kwasów tłuszczowych o wzorze RCOOH, w którym R oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.butylową, lub związków ulegających przekształceniu w te kwasy podczas fermentacji. Badania taksonomiczne prowadzone w American Type Culture Collection potwierdziły, że charakterystyki mutanta szczepu 1-3, wyselekcjonowanego na podstawie opisanego uprzednio oznaczania 14

CO2, są ściśle zbliżone do charakterystyki macierzystego szczeou ATCC 31272 opisanego w opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr 4429042, z niektórymi tylko różnicami. Mianowicie, mutant 1-3 (szczep ATCC 53567) tworzy znacznie mniej łańcuchów zarodników niż szczep ATCC 31272. W przeprowadzonych doświadczeniach stwierdzono, że rafinoza nie wydaje się podtrzymywać wzrostu 1-3. W przeciwieństwie do opisu przedstawionego dla ATCC 31272 w opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr 4429042 nie udało się wykryć wzrostu mutantów lub szczepu ATCC 31272 przy zastosowaniu sacharozy jako jedynego źródła węgla.Mutant 1-3 wykazuje tylko brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu. Podwójnie blokowany mutant, który nie wykazuje aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności O-metylotransferazy awermektyny 8 wytwarzany drogą dalszej mutagenezy mutanta 1-3 (ATCC 53567) jest w podobnym stosunku taksonomicznym do ATCC 31272 jak mutant 1-3.

Streptomyces avermitilis 1-3 i 7881 zostały zdeponowane na warunkach Traktatu Budapeszteńskiego w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, znanej kolekcji zapewniającej ciągłość przechowywania i łatwy dostęp publiczny do szczepów po uzyskaniu patentu na to zgłoszenie. Szczepy otrzymały odpowiednio oznaczenia Streptomyces avermitilis ATCC 53567 i ATCC 53692. Depozyty są dostępne w okresie oczekiwania na udzielenie patentu dla uznanych przez Komisarza Urzędu Stanów Zjednoczonych d/s Patentów i Znaków Towarowych za upoważnionych zgodnie z przepisami 37 CFR 1.14 i 35 USC 122, oraz zgodnie z zagraniczny156 765 mi przepisami patentowymi w krajach, w których odoowiedniki tego zgłoszenia lub jego pochodne zostały zgłoszone. Wszelkie ograniczenia dostępności publicznej zdeponowanych drobnoustrojów zostanę nieodwołalnie zniesione po uzyskaniu patentu.

Każdy ze szczepów S.avermiti1is ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 i NCI3 12121 wytwarza naturalne awermektyny o wzorze 1, w którym przerywana linia w pozycji 22 - 23 oznacza podw^ójne wiązanie, ^R oznacza grupę ^hydro^ksylową, ^która jest obecna jed^ynie wted^y, ^gd^y nie występuje podwójne wiązanie, R oznacza grupę 4-( oć -L-oleandrozylo)- aC -L-oleandrozyloo^ksylową o wzorze ², R oznacza atom wodoru ł.ub ^gru^pę me^tylow^ą, a ^R oznacza ^gru^pę izopro^pylową lub (S(-II-rz.-butylową.

W opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr 4285963 przedstawiono awermektynę o wzorze 1, w któ^ryrn pozycja ²⁵ jest pods^wiona grup^ą metylow^ą i ^gru^pą e^tylow^ą, ^r1 oznacza ^gru^{pę hy}dro^ks^ylową, a R^ oznacza grupę metylową.

U nienaturalnych awermektynach, opisywanych tutaj, R jest podstawnikiem innym niż grupa izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa, zidentyfikowanym poniżej.

Związki podstawowe dla wykorzystania w biosyntezie związków o wzorze 1, występują w komórce S.avermitilis i w pożywce. Związki te powstają z degradacji L-waliny i L-izoleucyny lub z odpowiadających ich 2-ketokwasów przez dekarboksylację kwasu przez dehydrogenazę 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, z jednoczesnym sprzęgnięciem produktu z koenzymem A.

Ich obecność wywołuje jednoczesną produkcję zarówno izopropylowych jak i (S)-II-rz.-butylowych związków o wzorze 1. Powstaje przy tym oczywiście problem rozdziału pochodnej izopro. pyłowej i (S)-lI-rz.-butylowej.

Podczas fermentacji w odżywczej pożywce zawierającej odpowiedni związek prymerowy, mutanty stosowane w sposobie według wynalazku wytwarzają związek o wzorze 1 albo, jak to się częściej zdarza, mieszaninę dwóch związków o wzorze 1, w którym R odpowiada zastosowanemu związkowi pry merowemu. W ten sposób może być wytwarzane do dwóch związków, określanych zwykle dla wygody jako R-awermektyna BI i 82, zgodnie z nazewnictwem przyjętym w opisie patentowym St.Zjedn.

Am. nr 4429042. Grupa R oznacza oczywiście podstawnik przy atomie węgla w pozycji 25. Przykładowo, gdy R oznacza grupę cyklopentylową, możliwe są dwie następujące awermektyny.

Nazwa zw^yczajna ^r1 R¹ cyklopentyloawermektyna B1 podwójne wiązanie H cyklopentyloawermektyna B grupa hydroksylowa H

W nienaturalnych awermektynach podstawnik R w pozycji C-25 związku o wzorze 1 jest inny niż grupa izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa.

Związki o wzorze 1, w którym obecne jest podwójne wiązanie, a brak jest grupy hydroksylowej mo^{gą być} a^lternat^ywnⁱe otrz^ym^ywane z odpowiednie^go zwi^ązku o wzorze ^1, w którym ^r1 oznacza grupę hydroksylową i nie występuje podwójne wiązanie, na drodze reakcji odwadniania. Reakcję tę prowadzi się ochraniając najpierw selektywnie grupy hydroksylowe w pozycjach 5 i 4, tworząc np. pochodną Ill-rz.-butylodwumetylosililooksyacetylową. Ochronioną pochodną poddaje się reakcji z podstawionym halogenkiem tiokarbonylu, takim jak chlorek (4-metylofenoksy)-tiokarbonylu, a następnie ogrzewa w wysokowrzącym rozpuszczalniku, np. trójchlorobenzenie, w celu odwodnienia. Po usunięciu grup ochronnych otrzymuje się nienasycony związek. Proces ten oraz odpowiednie reagenty i warunki reakcji zostały opisane w opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr 4328335.

Związki o wzorze ł., w któr^ym R¹ oznacza a-tom wo^doru i. ^bra^k je^{pt p}o^dwójne^go wiązania, molna wytwarzać z odpowiednich związków, w których występuje podwójne wiązanie i brak jest podstawnika ^r1. ^Stosuje się do te^go cel.u sel.e^ktywne ka^ta^lityczne uwodornienie w o^becno^ścⁱ odpowiedniego katalizatora. Przykładowo, redukcję można prowadzić stosując chlorek tris(trójfenylofosfino)rodu(I), jak to opisano w Europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0001689 i w jego odpowiedniku, opisie patentowym St.Zjedn.Am. nr 4199569, wydanym 22 kwietnia 1980 r.

Związek o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, wytwarza się z odpowiednich związków, w któr^ych R? oznacza ^gru^pę 4’-⁽ oC -l--o^lean^droz^ylo⁾- o£ -^L-o^leandroz^yloo^ks^ylową^{, d}ro^gą usuwania tej ostatniej za pomocą łagodnej hydrolizy kwasem w rozpuszczalniku wodno-organicznym.

156 763

Otrzymuje się aglikon zawierający grupę hydroksylową w pozycji 13, który następnie chlorowcuje się, np. w reakcji z halogenkiem benzenosulfonylowym. Otrzymuje się 13-dezoksy-13chlorowco-pochodną, którą poddaje się selektywnej redukcji, np. za pomocą wodorku trójbutylocyny. Dla uniknięcia niepożądanych reakcji ubocznych należy chronić inne grupy hydroksylowe, które mogą występować w cząsteczce, np. za pomocą grupy III-rz.-butylodwumetylosililowej. Grupę tę z łatwością się usuwa po zakończeniu reakcji chlorowcowania lub redukcji, traktując produkt metanolem zawierającym śladową ilość kwasu. Wszystkie etapy powyższego procesu oraz odpowiednie do tego reagenty i warunki reakcji zostały opisane w Europejskim zgłoszeniu patentowym nr 002615.

Związkami przyswajalnymi przez mutanta Ξ.avermitilis zgodnie ze sposobem według wynalazku w procesie biosyntezy awermektyn. naturalnych i nienaturalnych, są związki o wzorze R-COOH, w tym także związki ulegające przekształceniu w związek o wzorze R-COOH podczas procesu biosyntezy. Powyższe związki są w opisie określane jako związki prymerowe.

Zgodnie z tym sposób według wynalazku wytwarzania awermektyny B polega na tym, że mutant Streptomyces ayermitilis ATCC 53567 nie wykazujący aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności O-metylotramsferazy awermektyny B poddaje się fermentacji z napowietrzaniem w wodnej, odżywczej pożywce zawierającej przyswajalne żródo azotu, węgla i soli nieorganicznych oraz związku nadającego się do wykorzystania w biosyntezie awermektyny o wzorze R-COOH lub związku ulegającego przekształceniu w związek o wzorze R-COOH mającego wzór R-(CH2)_n-Z, w których to wzorach R oznacza łańcuchową grupę <c£ -rozgałęzioną, której atom węgla połączony z grupą -C00H lub z grupą o wzorze -ΟΗ?)_R-Z jest również przyłączo ny do co najmniej dwóch innych atomów lub grup innych niż atomy wodoru, π jest 0, 2, 4 lub 6, ^a Z oz^nacza grupę -^CH0^, -^CH2^NH2 bub ^gruo^ę o wzorze -C^OOR lu^b o wzorze -C°N^HR , w ^któryc^{h to} wzorac^h odpow^dnw R⁷ oznacza atom wodoru bjb ^gru^{pę (C}?-^C^⁾a^lkⁱlow^ą a ^R° oznacza atom wodoru, grupę C1-C_Ą)alkilową lub grupę -CH(C00H)CH2C00H, -CH(COOH)(CH2) 2-C00H lub -CH(COOH)(CH2)2SCH3.

U procesie według wynalazku wykorzystuje się także izomeryczne odmiany związków o wzorze R-COOH i określonych wyżej związków ulegających podczas fermentacji przekształceniu w związek o wzorze R-COOH, przy czym otrzymuje się izomeryczne w pozycji C-25 awermektyny.

W procesie prowadzonym sposobem według wynalazku związek o wzorze R-COOH lub określony wyżej związek przekształcający się w związek o wzorze R-COOH dodaje się do fermentacji albo podczas zaszczepiania, albo porcjami poczas fermentacji. Proces wytwarzania awermektyny może być kontrolowany drogą pobierania próbek z fermentacji, ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym i oznaczania ilości produktu za pomocą chromatografii, np. wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej. Fermentację kontynuuje się aż do uzyskania maksymalnej wydajności produktu zwykle w ciągu 4-15 dni.

Korzystna ilość każdego dodatku związków prymerowych (kwasu karboksylowego lub związku przekształcającego się w kwas) wynosi od 0,05 do 3,0 g/litr. Związek prymerowy można dodawać w sposób ciągły, porcjami lub jednorazowo. Kwas (RCOOH) dodaje się w stanie wolnym albo jako sól, taką jak sodowa, litowa lub amoniowa, albo w postaci wspomnianego uprzednio związku ulegającego przekształceniu w kwas. Jeśli stosuje się stały kwas, wówczas korzystnie rozpuszcza się go w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak woda lub alkohol o 1 - 4 atomach węgla.

Pożywki stosowane do fermentacji, zwłaszcza gdy podstawnikiem w pozycji 25 może być grupa izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa, mogą być zwykłymi pożywkami zawierającymi przyswajalne źródła węgla, azotu i pierwiastków śladowych. Gdy podstawnikiem przy C-25 ma być nienaturalna grupa, to znaczy nie izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa, wówczas stosuje się pożywkę nie zawierającą lub zawierającą tylko minimalne ilości związków prymerowych, w których ugrupowanie R jest resztą izopropylową lub (S)-Il-rz.-butylową.

Po fermentacji prowadzonej w ciągu kilku dni w temperaturze zawartej korzystnie w zakresie 24 - 33°C, brzeczkę odwirowuje się lub sączy a grzybnię ekstrahuje się, korzystnie acetonem lub metanolem. Ekstrakt zatęża się i pożądany produkt ekstrahuje się niemieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem, takim jak chlorek metylenu, octan etylu, chloroform, butanol lub keton metylowo-izobutylowy. Ekstrakt zatęża się i surowy produkt w razie potrzeby dalej się oczyszcza chromatograficznie, np. stosując preparatywną wysokorozdzielczą chromatografię cieczową z odwróconą fazą.

156 763 ο

Produkt otrzymuje się na ogół w postaci mieszaniny związków o wzorze 1, w którym R' oznacza g^rupę 4-( -oleandr^ozylo)- cC -L-oleandroz^yloo^ks^ylową, ^r1 oznacza ^gru^pę h^ydro^ksyl^ową, bra^k jest: po^dw^ójnego wi.ązani.a i.ub bra^k jest: ^r1 a w^ys^tępuje ^po^dw^ójne wiązanie^{, natom}i^{ast R} oznacza a^m wo^doru. Zw^iąz^ków^, w k^tórych ^R? oznacza ^gru^pę met^ylow^{ą p}rakt^ycznie nie ma. Proporcje poszczególnych komponentów mieszaniny mogą być różne w zależności od stosowanego mutanta, związku prymerowego i warunków prowadzenia procesu.

Źródło grupy R, to znaczy czy pochodzi ono bezpośrednio z kwasu R-COOH czy też z wymienionych uprzednio prekursorów, nie ma znaczenia dla wytwarzania awermektyn. Podstawowe znaczenie dla procesu ich wytwarzania sposobem według wynalazku ma dostępność pożądanej grupy R dla szczepów S.avermitilis w procesie fermentacji.

Do odpowiednich związków należą między innymi następujące: kwas 2,3-dwumetylomasłowy, kwas 2-metylokapronowy, kwas 2-metylopent-4-enowy, kwas 2-cyklopropylopropionowy, sól litowa kwasu 4,4-dwufluoroheksanokarboksylowego, kwas 4-metylenocykloheksanowy, kwas 3-metylocykloheksanokarboksylowy (cis) (trans), kwas 1-cyklopentenokarboksylowy, kwas 1-cykloheksenokarboksylowy, kwas czterowodoropirano-4-karboksylowy, kwas tiofeno-2-karboksylowy, kwas furano-3-karboksylowy, kwas 2-chlorotiofeno-4-karboksylowy, kwas cyklobutanokarboksylowy, kwas cyklopentanokarboksylowy, kwas cykloheksanokarboksylowy, kwas cykloheptanokarboksylowy, kwas 2-metylocyklopropanokarboksylowy, kwas 3-cykloheksen-l-okarboksylowy, kwas 2-metylotiopropionowy, kwas 2-metylo-4-metoksymasłowy, kwas tiofeno-3-karboksylowy, hydroksymetylocyklopentan, 3-tiofenokarboksyaldehyd, kwas 3-cykloheksylopropionowy, kwas 3-cyklopentylopropionowy, hydroksymetylocyklobutaN, kwas czterowodorotiofeno-3-karboksylowy, 3-cyklopentylopropanol-1, sól litowa kwasu 3-metylocyklobutanokarboksylowego, kwas 3-fluorocyklobutanikarboksylowy, sól litowa kwasu 3-metylenocyklobutanokarboksylowego, kwas 2-metylo-4-metylotiomasłowy, kwas czterowodoropirano-4-karboksylowy, cyklobutylometyloarnina, cyklobutanokarboksylan etylu, 4-hydroksyrnetylocyklopentan, ester etylowy kwasu 2-(3-tiofenokarbonylo/ propionowego, kwas (S)-2-rnetylowa1erianowy, kwas (R)-2-metylowalerianowy.

Trzy klasy mutantów O-metylotransferazowych można otrzymać z opisanych powyżej negatywnych mutantów dehydrogenazowych 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Mutanty, w których mutacja w kierunku uzyskania aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu są skomplikowane z mutacjami w kierunku uzyskania aktywności jednej lub obu O-metylotransferaz dają szczepy S.avermitilis, które mogą, w obecności kwasu RCOOH lub związków ulegających przekształceniu w ten kwas podczas fermentacji, wytwarzać przede wszystkim awermektyny B, demetyloawermektyny lub awermektyny, które zupełnie nie zostały zmetylowane. Powyższe mutanty są otrzymywane drogą mutagenezy opisanych tutaj mutantów nie wykazujących aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, prowadzonej za pomocą promieniowania nadfioletowego i/lub chemicznych mutagenów, takich jak N-metylo-N-nitrozouretan, nitrozoguanidyna lub inny czynnik wymieniony uprzednio. Alternatywnie, mutanty dehydrogenazododatnie, które nie wykazują aktywności jednej lub obu O-metylotramsferaz można zmutować działając promieniami nadfioletowymi lub czynnikiem mutagennym i otrzymywać mutanty dehydrogenazo-negatywne.

Nienaturalne awermektyny wytwarzane przez takie mutanty charakteryzują się obecnością grup hydroksylowych w pozycji C-5 reszty aglikonu i/lub w pozycjach C-3’ i/lub C-3’’ reszt oleandrozy.

Do identyfikacji opisanych powyżej mutantów zastosowana została metodologia opisana przez Schulmana i wsp. w Antimicrobiol.Agents and Chemotherapy, 29, 620 - 624 (1986).

Są one użyteczne dla tych samych celów i wykorzystywane w taki sam sposób jak szczepy wytwarzające znane awermektyny.

Alternatywnie, zwiększone ilości awermektyn B, w tym takich, które nie zawierają grupy metylowej w reszcie dwucukru oleandrozy, można wytwarzać drogą fermentacji mutantów według wynalazku, nie wykazujących aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, w obecności substancji takich jak sinefungina, S-adenozyloetionina lub S-adenozylohomocysteina, które hamują aktywność O-metylotransferazy.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są wysokoaktywnymi czynnikami' przeciwpasożytniczymi, szczególnie przydatnymi jako środki przeciwrobacze, środki przeciw pasożytom zewnętrznym, środki owadobójcze i środki roztoczobojcze.

156 763

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są więc skuteczne w zwalczaniu różnych schorzeń wywoływanych przez pasożyty wewnętrzne, takich w szczególności jak robaczyca, która najczęściej jest wywoływana przez grupę pasożytniczych robaków opisanych jako oblerice, które mogą powodować poważne straty gospodarcze w hodowlach świń, owiec, koni i bydła, a także mogą atakować zwierzęta domowe i drób. Związki te są także skuteczne przeciw innym oblericom, które porażają inne gatunki zwierząt, np. Dirofilaria u psów oraz przeciw różnym pasożytom, które mogą zarażać ludzi, w tym pasożytom przewodu żołądkowa-jelitowego, takim jak Ancylostoma, Necator, Asearia, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Inchuris, Enterobius, a także pasożytom znajdowanym we krwi lub w innych tkankach i organach, takim jak nitkowce i stadia pozajelitowe Strongyloides i Trichinella.

Związki te są również użyteczne do zwalczania zakazrri pasożytami zewnętrznymi, w szczególności pasożytami z grupy stawonogów u zwierząt i ptaków, takimi jak kleszcze, roztocza, wszy, pchły, mucny stajenne, owady gryzące oraz wędrujące larwy dwuskrzydłowych, które to oasozyty mogą atakować bydło i konie.

Związki także są środkami owadobójczymi, aktywnymi przeciw szkodnikom domowym, takim jak karaluch, mól ubraniowy, mrzyk i mucha domowa. Są one tez użyteczne do zwalczania szkodników owadzich w magazynach zbożowych i roślinach hodowlanych, takich jak oajęczaki, mszyce, gąsienice oraz wędrujących owadów prostoskrzydłych, takich jak szarańcza.

Związki o wzorze X podaje się w postaci preparatów odoowiednich dla rodzaju stosowania, gatunku traktowanego zwierzęcia i zwalczanego pasożyta. Do stosowania przeciwrobaczego związki można podawać doustnie w postaci kaosułek, pigułek, tabletek lub ołynów albo alternatywnie można je podawać iniekcyjnie lub w postaci wszczepu. Preparaty takie sporządza się w rutynowy sposób, zgodnie ze standardową praktyką weterynaryjną. Kapsułki, piguły lub tabletki można sporządzać mieszając aktywny składnik z odpowiednim doborze rozdrobnionym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem zawierającym dodatkowo środek rozpraszający i/lub wiążący, taki jak skrobia, laktoza, talk, stearynian magnezu, itp. Preparaty ciekłe można wytwarzać sporządzając zawiesinę składnika aktywnego w wodzie razem z czynnikami rozpraszającymi lub zwilżającymi. Preparaty do iniekcji mogą mieć postać jałowych roztworów, które mogą zawierać także inne substancje, np. sole lub glukozę w ilości odpowiedniej dla uzyskania roztworu izotonicznego względem krwi. Preparaty mogą zawierać różne ilości składnika aktywnego w zależności od gatunku leczonego zwierzęcia, stopnia i typu iniekcji oraz ciężaru ciała pacjenta. Generalnie, do podawania doustnego stosuje się zwykle dawki wynoszące od 0,001 do 10 mg/kg ciężaru ciała zwierzęcia, w postaci dawki jednorazowej lub podzielonej i podawanej w ciągu 1-5 dni, powinna być wystarczająca. Może jednak wystąpić potrzeba stosowania dawek wyższych lub niższych od podanych powyżej.

Alternatywnie, związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być podawane z pokarmem zwierzęcym i dla tych celów można sporządzać koncentraty lub premiksy do następnego zmieszania z normalną karmą zwierzęcą.

Do stosowania w charakterze środków owadobójczych i do zwalczania szkodników roślin, związki wytwarzane sposobem według wynalazku podaje się w postaci pyłów, preparatów do opryskiwania i podobnych, zgodnie ze standardową praktyką agrochemiczną.

Wytwarzanie S.avermitilis 1-3 (Szczep ATCC 53567)

Etap 1. S.avermitilis ATCC 31272 hodowano na podłożu New Patch Agar Medium w ciągu 12 dni, w temperaturze 30°C.

Skład podłoża:

Sok V-8*		200 ml
CaCOj		3 9
agar		13g
h₂o	do	1000 ml
pożywka odżywcza		10 g/litr
octan sodowy trójwodny		1,4g/litr
kwas izowalerianowy		50rng/litr
kwas izomasłowy		30mg/litr
kwas 2-metylomasłowy		30mg/litr

156 763

izoleucyna	250	mg/litr
leucyna	250	mg/litr
walina	250	mg/litr
roztwór pierwiastków
siadowych	1	ml/litr

Mieszanina 8 soków roślinnych (pomidory, marchew, seler, buraki, pietruszka, sałata, rzepicha i szpinak) z dodatkiem soli, kwasu askorbinowego, kwasu cytrynowego i naturalnych aromatów. Producentem jest Campbell Soup Company, Camden, NJ.

XX

Skład roztworu pierwiastków ślasowych

FeClj.6H20	2,7 g
MnS04-H₂0	4,2
CuSO₄.5H₂0	0.5
CaCl2	11,0
H.jBO₃	0,62
CoC1₂.6K₂0	0,24
ZnCl2	0,68
Na2Mo0*	0,24

Rozpuszczone w 0,ln kwasie solnym do objętości 1 litra Oln HC1.

Zarodniki zebrano z trzech takich płytek i zawieszono w 20 ml 0,05 molarnego buforu triskwas maleinowy o pH 9,0.

Etap 2. 10 ml zawiesiny zarodników wlano do fiolki zawierającej 10 ml N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyny (NTG). Fiolkę inkubowano i wstrząsano w temperaturze 28°C w ciągu 60 minut, a następnie zarodniki przemyto obficie 1 \ roztworu chlorku sodowego.

Etap 3. Przemyto zarodniki zawieszono w 1 % roztworze NaCl i zmieszano z taką samą objętością 80 \ glikolu etylenowego. Otrzymaną zawiesinę przetrzymywano w temperaturze -20°C i używano jako źródła komórek badanych na obecność mutantów. Otrzymywano około 10* kolonii/ml podczas zarodnikowania.

Zawiesinę zarodników zasiewano na płytkach z podłożem YPD w ilości około 100 kolonii na jednej płytce. Podłoże YPO zawiera po 10 g/litr wyciągu drożdżowego, peptonu Bacto^x i dekstrozy oraz 15 g/litr agaru Bacto*. Przed autoklawowaniem pH doprowadzono do 6,9. Składniki oznaczone gwiazdką są wytwarzane przez Oifco Laboratories, Detroit, Michigan 48238.

Etap 4. Pojedyncze kolonie pobierano z płytek po 2 - 3 tygodniach hodowli w temperaturze 28°C i umieszczano w poszczególnych studzienkach standardowej płytki do mikromiareczkowania posiadającej 96 takich studzienek. Ponadto, małą ilość kolonii naniesiono na świeże podłoże agarowe dla uzyskania źródła żywych komórek podczas identyfikacji mutanta.

Etap 5. Do każdej studzienki dodano około 75 mikrolitrów ciekłej pożywki M9 z solami zawierającej 1 % glukozy, 0,1 \ preparatu o nazwie casamino acids oraz po 0,01 % kwasu izowalerianowego, kwasu izomasłowego i kwasu 2-metylomasłowego. Po kilkudniowym inkubowaniu w temperaturze 28°C komórki badano na obecność dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, jeden litr pożywki z solami M9 zawiera 6 g Νθ,,ΗΡΟ^, 3 g KF₂PO^, 0,5 g NaCl i 1 g NH^Cl. Pożywkę autoklawowano i dodawano w warunkach jałowych po 1 ml wyjałowionego 1 molarnego roztworu MgSO^ i 0,1 molarnego roztworu CaC^.

Etap 6. Sporządzono mikrozawiesinę 5 \ toluenu w pożywce z solami M9 drogą krótkiego traktowania ultradźwiękami niemieszających się ze sobą składników. Do 25 ml tej zawiesiny dodano ^1,2 ml roztworu zawierającego 0^25.1.0^{2 P}Bq^/m^l (^3,7.¹°^{2 PB}q^/m^ikromo^l/kwasu^/22C-^l)-²ketoizokapronowego. 50 mikrolitrów tej mieszaniny dodano do każdej studzienki na płytce do mikromiareczkowania zawierającej poddawane badaniu kolonie.

156 763

Etap 7. Wytwarzany w każdej studzience CO^ wyłapywano i oznaczano stosując postępowanie opisane przez Tabora i wsp. w 3.Bacteriol., 128, 485 - 486 (1976), zatytułowanej

Convenient Method for Oetecting CO£ in Multiple Samplest Application to Rapid Screening for Mutants. Mutanty nie wykazujące aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym 14 łańcuchu nie wytwarzały Ba CO^ w ilości większej niż obserwowano dla prób kontrolnych. Bardziej czuła metody, w której lepiej uwidoczniony jest kontrast pomiędzy dodatnim wynikiem na obecno^śc ^*^C0₉ (ciemna plama na autoradwęjraiMe jako wynik tworzenia się z

Ba COj) a ujemnym wynikiem) brak plamy lub b.jasna plama), polega na poniższym zmodyfikowanym skriningu.

Pojedyncze kolonie (patrz etap 4 powyżej) pobierano z podłoża agarowego po 7 - 14 dniach wzrostu (zamiast po 2 - 3 tygodniach) i badano bezpośrednio tak jak opisano w etapie 6 i 7 omijając etap 5.

Jeszcze bardzⁱej czuła me-tocla pol.e^gająca na Hościowym oznaczaniu w^ydzie^lane^go ^CC^po^ga na hodowaniu mutantów wybranych na podstawie powyższego skriningu na odpowiednim podłożu zawierającym 1 % pożywki z solami M9 oraz 0,1 \ pożywki Syncasabcan (syntetyczna mieszanina L-aminokwasów o składzie zbliżonym do składu handlowego preparatu o nazwie casamino acids ale nie zawierająca L-aliny, L-izoleucyny i L-leucyny, opisana w dalszej części).

Po uzyskaniu dużej gęstości komórek orzemyto je pożywką M9 i oowtórnie zawieszono w tejże pożywce M9 zawierającej 1 % toluenu. Mieszaninę traktowano ultradźwiękami i otrzymano mleczno -białą dyspersję toluenu. Zawiesinę zawierającą komórki, bufor i toluen inkubowano w ciągu 40 minut w temperaturze 30°C w celu uzyskania przepuszczalności komórek, które nastęonie przemyto pożywką M9 i znów zawieszono 1/5 pierwotnej ilości buforu M9. Porcję 180 mikrolitrów tej zawiesiny stosowano do każdego badania.

Porcja 300 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej zawierała nasycone toluenem komórki. 0,4 milimola pirofosforanu tiaminy (TPP), 0,11 milimola koenzymu A (CoA), 0,68 milimola dwunukletydu nikotynamido-adeninowego, 2,6 milimola dwutiotroitolu, 4,1 milimola MgC^, 60 milimoli Tris^-H^Cl o ^pH ⁷,5 oraz ⁶⁰⁰⁰ c^pm ⁽^⁴ C-l)-°ć -ketoizoikapronianu ⁰,³⁷.¹⁰^ ^P8q (Mikromol). Wydajność zliczania wynosiła 73 %. Reakcję prowadzono w 15 ml fiolkach scyntylacyjnych zawierających kwadratowe płatki o wymiarach 2 x 2 cm bibuły Whatmana nr 4 wprasowane w zakrętkę fiolki. Bibuła zawierała 30 mikrolitrów 1 m roztworu wodorotlenku hyaminy (1 molarny roztwór wodorotlenku metylobenzetoniowego w metanolu produkowanego przez firmę Sigma Chemical Co., St.Louis, MO 63178), który absorbuje uO? wydzielany w reakcji. Po inkubowaniu w ciągu 2 godzin bibułę zanurzano w 10 ml preparatu Aquasol II Beckman (uniwersalny LSC produkcji firmy New England Nuclear Research Products, 8oston, Ma 02118) i mierzono radioaktywność za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego po równoważeniu w tym rozpuszczalniku w ciągu 4 godzin lub dłużej. W próbie kontrolnej (nie zawierającej komórek) uzyskano wynik około 50 - 300 cpm.

Mutant 1-3 i inne do niego podobne dawały ilość impulsów mniejszą lub równą uzyskanej w ślepej próbie, natomiast macierzysty szczep dawał wielokrotnie wyższą ilość impulców niż próba kontrolna.

Skład podłoża Syncasa-bcaa (100 krotny koncentrat) g/litr

L-alanina 3 L-arginina 4 kwas L-asparginowy 6 L-cystyna 1 kwas L-glutaminowy 20 glicyna 1 L-histydyna 2 L-lizyna 7 L-metionina 3 L-fenyloalanina 6 L-prolina 10 L-seryna 6 L-treonina 4 L-tyrozyna 4 L-tryptofan 1

156 763

Wartość pH mieszaniny doprowadza się do 7 i wyjaławia przez sączenie. Jedną objętość koncentratu dodaje się do 99 objętości pożywki, uzyskując standardowe stężenia użytkowe.

Wytwarzanie podwójnie blokowanych mutantów S.avermitilis 7881 (ATCC 53692) nie wykazującego aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności O-metylotransferazy awermektyny B.

Etap 1. S.avermitilis ATCC 53567 hodowano na podłożu New Patch Agar Medium w ciągu 12 dni, w temperaturze 30°C.

Zarodniki zebrano z trzech takich płytek i zawieszono w 20 ml 0,05 molarnego buforu tris-kwas maleinowy o pH 9,0.

Etap 2. 10 ml zawiesiny zarodników wlano do fiolki zawierającej 10 mg N-metylo-N’nitro-N-nitrozoguanidyny (NTG) i inkubowano przy wstrząsaniu w temperaturze 28°C w ciągu 60 minut, a następnie zarodniki przemyto obficie 1 % roztworem chlorku sodowego.

Etap 3. Przemyte zarodniki zawieszono w 1 % roztworze NaCl i zmieszano z równą objętością 80 % glikolu etylenowego. Otrzymaną zawiesinę przechowywano w temperaturze -20°C i używano jako źródła komórek badanych na obecność mutantów.

Zawiesinę zarodników zasiewano na płytkach z podłożem YPO w ilości około 100 kolonii na jednej płytce.

Kolonie zmutowanych populaoji (traktowane nitrozoguanidyną) sczepu Streptomyces ayermitilis 1-3 (ATCC 53567) pobierano i nanoszono na podłoże agarowe otrzymane z następujących składników (gramy na litr): skrobia hydrolizowana 80, ^ΗΡ0^ 1, MgSO^.ł^O 1, ardamina PH 5, CaCOj 5, P-2000 1 ml, F FeS0₄.7H₂0 0,01, MnCl^n 0,001, ZnS0₄_7H20 0,001, Bacto agar 17, woda destylowana do objętości 980 ml. Wartość pH doprowadzono do 7,0 przy użyciu NaOH przed autoklawowaniem w temperaturze 121°C w ciągu 20 minut. Po autoklawowaniu dodano 20 ml jałowego, 5 % roztworu podstawowego kwasu (-)-2-metylomasłowego, pH 7,0.

Hodowle agarowe inkubowano 8 do 12 dni w temperaturze 28°C. Komórki (grzybnie) usuwano z powierzchni agaru i umieszczano w 250 (ul acetonu, 25) ul wyciągów acetonowych nakraplano następnie na płytki chromatograficzne pokryte wstępnie cienką warstwą żelu krzemionkowego GF Analtech.Chromatogram rozwijano przez 30 do 40 minut octanem etylu jako fazę rozwijającą, następnie suszono i spryskiwano 3 \ waniliną w etanolu. Płytki umieszczano w suszarce w temperaturze 100°C na 1 - 3 minut, a następnie spryskiwano 3 % kwasem siarkowym w etanolu i ponownie umieszczano w suszarce o temperaturze 100°C na okres 10 - 15 minut. Mutanty pozbawione 0-metylotransferazy awermektyny B identyfikowano zmianą układu chromatogramu, który polegał na tym, że plamki odpowiadające składnikom awermektyny 8 (Rf około 0,54, 0,42 odpowiednio dla BI i B2) są nadal obecne, ale brak plamek odpowiadających składnikom awermektyny A (Rf około 0,69, 0,58 odpowiednio dla Al i A2). Ogólne zasady postępowania podczas wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej (HPLC). Faza ruchoma: miesza się 150 ml i 70 ml acetonitrylu i dopełnia do 1 litra metanolem.

Kolumna: Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton. CA 92634-3100). przepływ: 0,75 ml/minutę detekcja: UV przy 240 nm tłumienie: około 6.

Rozpuszczalnik dla próbek (0): mieszanina 35 ml acetonitrylu i 390 ml metanolu.

Standardy: (1) odważa się 0,5 mg awermektyny A2a do 10 ml kolby i dopełnia do kreski metanolem, (2) odważa się 0,5 mg testowanego produktu do 10 ml kolby i dopełnia do kreski metanolem, (1) i (2) są roztworami podstawowymi, z których sporządza się roztwór standardowy ' do chromatografii pobierając 100 mikrolitrów (1) i 100 mikrolitrów (2) i dodając w fiolce 800 mikrolitrów fazy ruchomej.

Próbki: (1) pobiera się 1 ml dobrze wytrząśniętej brzeczki i wiruje ją.

(2) usuwa się tak dużo supernatantu jak jest to możliwe, bez naruszenia pastylki, (3) dodaje się 100 mikrolitrów wody do HPLC do pastylki i miesza do otrzymania zawiesiny,

156 763 (4) dodaje się 2 ml rozcieńczalnika (D) i dobrze miesza, (5) sączy się próbkę i poddaje chromatografii.

Naturalne awermektyny poddawane powyższej wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej i czasy retencji indywidualnych awermektyn dzielono przez czas retencji dla oligomycyny A, służącej w tych oznaczeniach jako standard wewnętrzny. Oligomycyna A jest prawie zawsze wykrywana za pomocą HPLC jako orodukt uboczny fermentacji S.avermitilis i jest jedynym produktem wykrywanym przez HPLC, wytwarzanym przez opisane mutanty, gdy hoduje się je w pożywce nie zawierającej kwasów o wzorze RCGOH, w którym R ma znaczenie podane uprzednio, lub związków ulegających przekształceniu w te kwasy. Czas retencji dla oligomycyny A wynosi typowo 12,5 - 14 minut. Stosunek czasów retencji (RT) stanowi lepszą podstawę dla porównywania identyczności i wydajności wytwarzanych awermektyn. Generalna kolejność pojawiania się awermekty- na chromatogramie (HPLC) jest następująca: B2, A2, 31 i Al (patrz fig. 2).

Naturalna awermektyna RT/RT oligomycyna A

B2b 0,70 B2a 0,84 A2o 0,50 A2a 1,09 31b 1,40 Bla 1,B3 Alb 1,83 Ala 2,42

Bla i Alo są nierozpuszczone.

Nienaturalne awermektyny RT/RT oligomycyna A cyklooentylo-82 0,94 cyklopentylo-A2 1,23 cyklopentylo-Bl 1,99 cyklopentylo-Al 2,62

Czasy przebywania wahają się w zakresie 1-2 minut w różnych dniach, a oligomycyna A na ogół pojawia się w okolicy 12,5 - 14 minut.

W następujących przykładach oznaczano awermektyny zgodnie z opisaną wyżej procedurą HPLC. o ile nie zaznaczono inaczej.

Składy podłoży używanych w następujących przykładach podano niżej.

Podłoże AS-7

Hydrolizowana skrobia3 20 ardamina pH^u 5 oharmamediac 15 CaCOj 2

Otrzymana przez hydrolizę skrobi oC -amylaza z Bacillus 1icehniformia (dostępny z Novo Enzymes, 'Cilton, CT. 1 sprzedawany pod nazwą hadlową Termamyl (do równoważnika dekstrozy 40 \ - 5 ¹ Z Teast: ^Pro^ducts, Inc. Cł^ifton, ^NY ⁰⁷00¹²· ^C Z Traders Protein, Memphis, TN38103.

Podłoże AP-5 g/1

Hydrolizowana skrobia 80 ardemina pH 5 k₂hpo₄ 1

MgS0₄.7H20 1

NaCl 1

CaCOj 7

FeS0₄.7H₂0 0,01

156 763

MnCl₂.7H₂0 0,001

ZnSO..7H„0 0,001

Z

P-2000 (środek przeciw oienny)³ 1 m/1 ^a Z the Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640.

Ooorowadzono pH do.6.9 25 % roztworem NaOH.

Przykład I - IV

Awernektyny ze Streotomyces ayermitilis 1-3 (ATCC 53567)

S.ayermitilis 1-3 (ATCC 53567) z zarodnikowanej płytki V-8, którą inkubowano w 80 ml podłoża AS-7 w 500 ml kolbie z trzema przegrodami. Kolbę inkubowano na trząsarce obrotowej, podczas mieszania w temperaturze 2Q-30°C, przy 200 obrotach na minutę. Po 24 godzinach inkubacji 1 ml całej pożywki inokulowano 300 ml kolbą zawierającą 40 ml podłoża AP-5. Podwójne fermentacje orowadzono w temperaturze 2S-30°C w obecności 400 ppm każdego z podanych wyżej związków prymerowych, dodanych po 24 godzinach.

Po 312 godzinach 2 ml próbki całej pożywki mieszano z 8 ml mieszaniny metanol: acetonitryl (390 : 35). Po przesączeniu 53 pl próbki nanoszono na kolumnę 3eckman Ultrasphere OQS (3,9 x 250 mm). Kolumnę eluowano metanolem: acetonitrylem: wodą (39 : 14 : 7) w tempie 0,3 ml/min i eluat badano w świetle nadfioletowym przy 240 nm. Czasy przebywania nowych awermektyn podano niżej.

Czas przebywania awermektyny (minuty)

Związek prymerowy	32	A2	81	Al
1/ kwas - 2-metylomasłowy	^x11,60	Χ14.75	23,1	29,82
	12,40	16,10
11/ kwas cyklopentanokarboksylowy	12,32	15,86	25,28	32,96
III/ kwas cykloheksanokarboksyIowy	14,84	19,26	31,46	41,14
IV/ kwas + metylomasłowy	11,60	14,75	23,1	29,82

^x Zarówno kwas + metylomasłowy jak i kwas -metylomasłowy są włączone w awermektyny. W trakcie stosowanej chromatografii rozdzielanie awermektyn + i - uzyskiwane jest tylko dla B2 i A2.

Przykład V. Awermektyny cykloheksylowe ze Streptomyces ayermitilis 7881 (ATCC 53692).

Zamrożoną fiolkę hodowli S.ayermitilis 7881 (ATCC 53692) inokulowano w 100 ml podłoża AS-7 w 500 ml kolbie z trzema przegrodami. Kolbę inokulowano na trząsawce obrotowej, podczas mieszania w temperaturze 23 - 30°C, przy 200 obrotach na minutę. Po 28 godzinach inkubacji 5 ml całej pożywki inokulowano dalsze 100 ml podłoża AS-7 lub 500 ml kolbę z trzema przegrodami. Kolbę inkubowano nadal na trzęsswce obrotowej, oodczas mieszania w temperaturze 28 - 30°C, przy 200 obrotach na minutę. Po 24 godzinach inkubowania 1 ml całej pożywki inokulowano 300 ml kolbę zawierającą 40 ml podłoża AP-5. Kolby inkubowano w temperaturze 28 - 30°C przy 200 obrotach na minutę. Po 24 godzinach dodano 400 ppm kwasu cykloheksanokarboksylowego, po 312 godzinach 2 ml próbki pobrano i poddano wysakosprawnej chromatografii cieczowej opisanej w przykładzie I. U tych warunkach jedyne składniki awermektynowe były wykrywane w tej brzeczce fermentacyjnej eluowano w 14,84 (54,9 mg/1) i 31,46 (32,1 mg/1) minutach, odpowiadające cykloheksylo B2 i 31.

Przykład VI. Awermektyny Il-rz.-butylowe ze Streptomyces ayermitilis 7881 ATCC 53692).

Powtórzono postępowanie z przykładu V, ale stosując 400 ppm kwasu - 2-metylomasłowego zamiast kwasu cykloheksanokarboksylowego, natomiast wszystkie inne warunki były takie same jak opisane w przykładzie II. W brzeczce fermentacyjnej wykryto tylko awermektynę Il-rz.-butylową 82 (11,60, 12,40 minut, 63,5, 42,4 mg/1) i awermektynę Il-rz.-butylową 81 (23,1 minut,

105,3 mg/1).

Przykład VII - XXIX. Powtórzono postępowanie z przykładu V, ale stosując 400 ppm każdego z zestawionych niżej związków prymerowych. Wszystkie inne warunki były takie same jak opisane w przykładzie II. Czasy przebywania otrzymanych awermektyn podano w tabeli.

156 763

Tabela

Numer orzykładu	Związek prymerowy	Czas przebywania
awermektyn	i (minuty)
B2	BI
VII	kwas i-tmnokacOoksylwwy	6,95	13,79
VII	kwas 3-f'jranokarbaksylawy	7,81	14,13
IX	kwas 2-tinnokarbokyylowy	7,32	14,7
X	kwas l-metylonutenn-3-kartioksyl:>'wy-l	11,0	22,2
XI	kwas metylntiarneknwwy	7,7	13,53
XII	kwas 4-tetaayddippiΓanϋ'arrnkkyyiwwy	7,55	14,72
XIII	kwas 4-iietnksy-2-metynnmasnowy	8,72	17,39
XIV	kwas 3-cykloheksenokaΓt>oksyiwwy	12,9	27,9
XV	kwas 4 - te taBbydrotó ppi^i^anokrrnkksynwy	11,3	22,76
XVI	kwas 3-tetaahydrotiofenkarrnksyInwwy	8,97	17,96
XVII	kwas 4,4-αiflnoΓoykkiaekkknnkkarnoksyiwwy	14,35	32,26
WII	kwas 2-cy'ołopenteπokarboksyiwwy	12,43	26,23
XIX	kwas 1-cyklopenienokarboksyiwwy	12,43	26,23
XX	kwas 1-cykloheksenokaΓίioksyiwwy	15,24	33,23
XXI	kwas 4-ggzometylenocy0ln.aeksaπikaΓt)oksyiowy	15,3	34,1
XXII	kwas 2-fu i? a n o kar boks yn ww y	7,32	15,31
O^III	kwas 2-tetaahydΓoUraanokarnoksyiwwy	6,16	11,62
XXIV	kwas 4-tetannyGioUukanoarrnkksyiwwy	6,17	11,64
XXV	kwas l-metylnDutyn-3-kkrnnosylowy-I	10,59	21,78
XXVI	kwas 3,4-bihydΓopiaanokarboksyiσwy-2	7,72	15,10
XXVH	kwas 2-teraayddippiΓnnkarrbokyyiwwy	7,55	14,72
XXVHI	kwas 3-tetaahydioprrnnkkrrnkksyiwwy	7,56	14,74
XXIX 1	kwas 2-tetaahydrotippiΓankkrrnokΞyiwwy	11,00	22,76

R¹

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 5000 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania awermektyny B, znamienny tym, że mutant Streptomyces avermitilis ATCC 53567 nie wykazujący aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności O-metylotransferazy awermektyny B poddaje się fermentacji z napowietrzaniem w wodnej, odżywczej pożywce zawierającej przyswajalne źródło azotu, węgla i soli nieorganicznych oraz związku nadającego się do wykorzystania w biosyntezie awermektyny o wzorze R-COOH lub związku ulegającego przekształceniu w związek o wzorze R-COOH mającego wzór R--p H?j -Z, w których to wzorach R oznacza łańcuchową grupę oć -rozgałęzioną, której atom węgla połączony z grupą -COOH lub z grupą o wzorze -(CH?),,-Z jest również przyłączony do co najmniej dwóch innych atomów lub grup innych niż atomy wodoru, n jest 0, 2, 4 lub 6 a ^{Z oznacz}a grupę -C^H°, -C^N^ lub ^grup^ę o wzorze -0°°^ l.u^b o wzorze -C°^nhr6, w ^któryc^{h t}o wzorac^h odpowietoio ^rJ oznacza atom wodoru ^lub grupę ^(C^-^Cg)a^lki^low^ą a R° oznacza atom wodoru, grupę (Cj-Cjalkilową lub grupę -CH(COOH)CH2CODH, -CH(COOH)(CH2)2COOH lub -CH(C00H)(CH₂)₂SCH₃.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poddaje się fermentacji S.avermitilis o numerze identyfikacyjnym ATCC 53692.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze R-COOH, w którym R oznacza rozgałęzioną w pozycji oC grupę Cj-Cg-alki Iową, alkenylową, alkinylową, alkoksyalkilową lub alKilotioalkilową, grupę C^-Cg-cykloalkiloalkilową, w której grupa alkilowa jest oó -rozgałęzioną grupą C^-t^i^^alkilową, grupę Cj-Cg-cykloalkilową lub Cj-Cg-cykloalkenyIową, z których każda może być ewentualnie podstawiona grupą metylenową albo jedną lub kilkoma grupami Cj-Cj-alkilowymi lub atomami chlorowca, albo R oznacza 3- do 6-członowy, zawierający tlen lub siarkę, pierścień heterocykliczny, nasycony lub całkowicie albo częściowo nienasycony, który może być ewentualnie podstawiony jedną lub kilkoma grupami Cl-Cj-alkilowymi lub atomami chlorowca.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze R-COOH, w którym R oznacza grupę cyklobutylową, cyklopentylową, cykloheksylową, cykloheptylową, 2-metylocyklopropylową, 3-cykloheksenylową, 1-cyklopentenylową, 1-cykloheksenylową, 3-metylocykloheksylową cis lub trans, 4-metylenocykloheksylową, 3-metylocyklobutyIową, 3-metylenocyklobutylową, 3-cyklopentenylową, 1-cyklopropyloetylową, 3-fluorocyklobutylową,

4,4 ,-dwufluorocykloheksylową, izopropylową, Il-rz.-butylową, 2-oentylową, 2,3-dwumetylopropylową, 2-heksylową, 2-pent-4-enyIową, 2-metylotioetylową, S-2-pentylową, R-2-pentylową, tienylową, zwłaszcza 2-tienylową lub 3-tienylową, 4-czterowodoropiranylową, 3-furylową, 2-chlorotienylową, 3-czterowodorotienylową, 4-metylotio-2-butylową, 4-czterowodorotiopiranylową, 4-metoksy-2-butylową lub 4-metylotio-2-butylową.

* * *