JPH0681757B2 - 非天然デメチルアベルメクチン - Google Patents

非天然デメチルアベルメクチン

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JPH0681757B2
JPH0681757B2 JP63012462A JP1246288A JPH0681757B2 JP H0681757 B2 JPH0681757 B2 JP H0681757B2 JP 63012462 A JP63012462 A JP 63012462A JP 1246288 A JP1246288 A JP 1246288A JP H0681757 B2 JPH0681757 B2 JP H0681757B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は殺寄生虫剤、すなわち非天然デメチルアベルメ
クチンに関する。
米国特許第4,310,519号と第4,429,042号はアベルメクチ
ン、強力な抗寄生虫作用を有する関連作用剤の複合体、
およびストレプトマイセス アベルミチリス（Streptom
yces avermitilis）の菌株、すなわちストレプトマイセ
ス アベルミチリス ATCC 第31267号、第31271号およ
び第31272号の好気性発酵によるその産生に関する。上
記の最後の２菌株はそれぞれ、ストレプトマイセス ア
ベルミチリス ATCC 第31267号の紫外線照射によって
得られた培養物を含む、凍結バイアルと凍結乾燥管を表
す。
1986年７月16日出願の米国特許出願第886,867号に対応
する、1987年３月18日発行のヨーロッパ特許第214,731
号は天然または公知のアベルメクチンに関連するが25位
置に新規な置換基を有する、多くの化合物（ここでは非
天然アベルメクチンと呼ぶ）、およびある特定のカルボ
ン酸またはその誘導体もしくは前駆体の存在下でのアベ
ルメクチン産生微生物の発酵によるその製造方法に関す
る。前記の新規なＣ−25置換アベルメクチンの産生に用
いられるストレプトマイセス アベルミチリス菌はスト
レプトマイセス アベルミチリス ATCC 31267,31271,3
1272およびNCIB12121である。ヨーロッパ特許第214,731
号に記載されている、後者の菌はストレプトマイセス
アベルミチリス ATCC 31271から誘導されたものであ
る。これを半規定（semi-defined）培地中で培養する
と、新規なＣ−25置換アベルメクチンの収率が改善され
る。ATCC 31267,31271,31272およびNCIB 12121のそれぞ
れは、新規なＣ−25置換誘導体の他に、Ｃ−25置換基が
イソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル（１−メチル
プロピル）である、公知のまたは天然のアベルメクチン
をも種々な量で産生する。
アベルメクチンの炭素骨格（下記の式（１）に示す）は
酢酸塩とプロピオン酸塩から誘導され、天然のアベルメ
クチンのＣ−25置換基はＬ−イソロイシン（Ｒ＝（Ｓ）
−sec−ブチル）またはＬ−バリン（Ｒ＝イソプロピ
ル）から誘導される〔フィッシャー（Fisher）とモロジ
ク（Mrozik）の「マクロライド抗生物質（Macrolide An
tibcotics）」アカデミック プレス（Academic Pres
s）（1984）第14章〕。
「公知」または「天然」とは、25−位置の置換値がイソ
プロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル（１−メチルプロ
ピル）のいずれかである、ストレプトマイセス アベル
ミチリス ATCC 31267,ATCC 31271およびATCC 31272に
よって産生されるアベルメクチンを意味する。25−位置
置換基がイソプロピルまたはsec−ブチル（Ｓ−形）以
外の基であるアベルメクチンをここでは新規なまたは非
天然アベルメクチンと呼ぶことにする。
上記米国特許に記載されたストレプトマイセス アベル
ミチリスの菌株は、この特許に一般にＣ−076として記
載されている種類の物質を産生する。この種類はＣ−07
6A1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2aとB2として表される、密
接に関連した８種類の化合物を含む。「ａ」シリーズの
化合物は25−置換基が（Ｓ）−sec−ブチルである天然
アベルメクチンを意味し、「ｂ」シリーズは25置換基が
イソプロピルである天然アベルメクチンである。「Ａ」
と「Ｂ」の名称は５−置換基がそれぞれメトキシまたは
ヒドロキシであるアベルメクチンを意味する。最後に、
数字「Ｉ」は22-23位置に二重結合が存在することを意
味し、数字「２」は22−位置に水素を有し、23−位置に
ヒドロキシを有するアベルメクチンを意味する。
本出願では、非天然アベルメクチンの25−置換基に関す
るこのような同類体を用いない。同類体AI,A2,BIおよび
B2は上記天然アベルメクチンの構造特徴に相当する構造
特徴を有する非天然アルバメクチンを意味するように意
図する。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない突
然変異体の発生が、枯草菌（Bacillus subtilis）〔ヴ
ィレッチ（Willecke）とパルディー（Pardee）による、
ジェイ・バイオル・ケム・（J.Biol.Chem.）246巻,5264
-72頁（1971）〕とシュードモナス プチダ（Pseudomon
as putida）〔マーチン（Martin）等による、ジェイ・
バクテリオロジー（J.Bacteriology）115巻,198-204頁
（1973）〕については報告されているが、ストレプトマ
イセスについては報告されていない。
米国特許第4,285,963号は25−位置がメチル基およびエ
チル基で置換され、23−位置がヒドロキシで置換されて
いるアベルメクチンＡ誘導体を述べている。米国特許第
4,378,353号はＣ−076関連化合物と紫外線照射によって
得られたストレプトマイセス・アベルミチリス ATCC 3
1272の突然変異株、MA-5218の培養によるその製造につ
いて述べている。この突然変異株はATCC 31780とされて
いる。前記突然変異株によって産生されたＣ−076関連
化合物は、Ｃ−076フラン環を有さない。さらに、報告
された或る化合物では、オレアンドロース糖成分の一方
または両方が開裂されるが、他の化合物では５−位置基
が酸化されてケト基になっている。
Ｏ−メチル基を有さないアベルメクチンを産生する、ス
トレプトマイセス アベルミチリスの３種類のＯ−メチ
ルトランスフェラーゼ突然変異株がルビ（Ruby）等によ
る「アクチノマイセテスのバイオロジー（Biology of A
ctinomycetes）」に関する第６回国際シンポジウム（ハ
ンガリーのデブレセンにおいて1985年８月26〜30日開
催）によって、およびシュルマン（Schulman）等による
アンチマイクロビアル エイジェント アンド ケモセ
ラピー（Antimicrobial and Chemotherapy）31巻,744−
７頁（1987）によって報告されている。最初の種類はマ
クロ環式ラクトン環のＣ−５ヒドロキシルをメチル化す
ることができないために、主としてＢアベルメクチンを
産生する。第２の種類は３′−O,3″−Ｏ−ビス−デメ
チルアベルメクチン（両オレアンドロース単糖残基の３
位置にＯ−メチル置換基を有さないアベルメクチン）を
産生する、このアベルメクチンはデメチルアベルメクチ
ンと呼ばれている。第３の種類は如何なる位置をもメチ
ル化することができない。
シュルマン等のフェド・プロク・（Fed.Proc.）44巻,93
1頁（1985）は、アベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ酵素によるアグリコン成分のＣ−５ヒドロ
キシ基のメチル化を阻害する、例えばシネフンギン、Ｓ
−アデノシルエチオニンおよびＳ−アデノシルホモシス
ティンのような物質の存在下でストレプトマイセス ア
ベルミチリスを発酵させることによるＢアベルメクチン
産生の増強を開示している。Ｏ−メチルトランスフェラ
ーゼ活性を有さず、アベルメクチンＢ成分の産生量を増
強するストレプトマイセス アベルミチリス変異株はシ
ュルマン等によってアンチマイクロビアル エイジェン
ト アンド ケモセラピー 29巻,620〜624頁（1986）
にも開示され、言及されている。
シュルマン等のジエィ・アンチバイオト・（J.Antibio
t.）38巻（11）,1494-1498頁（1985）はシネフンギンの
存在下で発酵させた場合に実際にアベルメクチン アグ
リコーンズAIaとA2aのみを産生する変異株である、スト
レプトマイセス アベルミチリス Agly−１がアベルメ
クチン アグリコーンＢ成分の産生量を増強することを
報告している。同様に、アベルメクチン産生量の高い菌
株であるストレプトマイセス アベルミチリス08は、Ｏ
−メチルトランスフェラーゼの阻害剤としてのシネフン
ギンの存在下で発酵させた場合に、Ｃ−５のアグリコー
ンおよびオレアンドロース二糖成分にＯ−メチル基の存
在しないアベルメクチンを産生した。
ストレプトマイセス アベルミチリスの突然変異は、分
枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない突然
変異株を形成する。この突然変異株は、化合物RCOOH
（Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル）の不
在下で、または発酵過程中にRCOOHに転化しうる化合物
の不在下で、天然アベルメクチンの有意な量を産生する
能力をもはや有さない。しかし、この変異株が、添加化
合物RCOOH（Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチ
ルまたはここに開示した他の基である）の存在下または
前記RCOOHの前駆体の存在下で発酵させると、天然およ
び非天然のアベルメクチンを産生することが全く意外に
も発見された。ここに開示した、分枝鎖２−オキソ酸デ
ヒドロゲナーゼ活性を有さずかつＬ−イソロイシン、Ｌ
−ロイシンまたはＬ−バリンを分解することのできない
変異株が広範囲な化合物をアベルメクチン生合成経路に
同化させて、天然アベルメクチンの存在しない非天然ア
ベルメクチンを産生することは、さらに意外である。
上記天然アベルメクチンは密接に関連した８種類の化合
物〔式（１）において、Ｒ＝イソプロピルまたは（Ｓ）
−sec−ブチル〕の複合混合物として産生される。これ
らは実質的に純粋な形で回収されるが〔米国特許第4,42
9,042号参照〕、この方法論は結局は困難である。ヨー
ロッパ特許第214,731号に述べられている方法による非
天然アベルメクチンの産生では、この産生に用いたスト
レプトマイセス アベルミチリス菌の細胞内に分枝鎖２
−オキソ酸およびアミノ酸のＬ−バリンとＬ−イソロイ
シンが存在するために、天然アベルメクチンの幾つかも
種々な量で形成される。本発明前の公知のストレプトマ
イセス アベルミチリス菌株をＳ−アデノシルメチオニ
ン同族体の存在下で培養すると、ＡおよびＢ系列のデメ
チルアベルメクチンが産生される。
生成物の数と複雑さを最小にするために、天然または非
天然のアベルメクチンまたはデメチルアベルメクチンの
産生を選択して、特定アベルメクチンの純度を高め、分
離方法を簡単にしうることが望ましい。
式（Ｉ）： 〔式中、22-23位置の破線は任意の二重結合を表す； R1は二重結合が存在しない場合にのみ存在し、ヒドロキ
シである； R2は式： （式中、R4とR5のそれぞれは水素またはメチルである
が、但しR4とR5の少なくとも一方は水素である） で示される二糖成分であり； R3は水素またはメチルであり； Ｒはα−分枝鎖C3-C8アルキル、アルケニルもしくはア
ルキルチオアルキル基、任意にメチレンまたは１個以上
のC1-C4アルキル基もしくはハロゲン原子によって置換
されるC3-C8シクロアルキルもしくはC5-C8シクロアルケ
ニル基、または飽和もしくは完全にもしくは部分的に不
飽和であり、１個以上のC1-C4アルキル基もしくはハロ
ゲン原子によって任意に置換される、３員〜６員の酸素
もしくは硫黄含有複素環である；但しＲがアルキル基で
ある場合には、イソプロピルおよびsec−ブチル以外の
アルキル基である〕によって示される化合物は、シネフ
ンギンの存在下で、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナー
ゼ活性および／または分枝鎖アミノ酸トランスアミナー
ゼ活性を有さないストレプトマイセス アベルミチリス
菌株を培養することによって製造される。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないス
トレプトマイセス アベルミチリス菌株、はストレプト
マイセス アベルミチリスのアベルメクチン産生菌株の
突然変異、特にストレプトマイセス アベルミチリス
ATCC 31267,ATCC31271,ATCC31272またはNCIB 12121の突
然変異によって生ずる。この突然変異株は、イソプロピ
ル基またはsec−ブチル基（Ｓ形）含有脂肪酸またはそ
の前駆体を前記突然変異体の培養培地に加える場合以外
は、天然アベルメクチンを合成することができない。こ
の突然変異株は、適当なプライマー酸または発酵過程中
にこれに転化しうる化合物を含む栄養培地中での水性好
気性条件下で発酵させると、天然および非天然アベルメ
クチンを産生することができる。シネフンギンの存在下
で発酵させると、二糖成分の３′−位置および／または
３″−位置のメトキシ基の１個または両方を有さず、前
記位置にヒドロキシ基（複数の場合もあり）を有する脱
メチル化Ａアベルメクチンと脱メチル化Ｂアベルメクチ
ンとを産生する。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないこ
とを特徴とする、これらの突然変異株を14CO2分析に基
づいて突然変異誘発コロニーから単離する。この方法で
は、〔14C−１〕−２−オキソイソカプロン酸または〔
14C−１〕−２−オキソ−３−メチル吉草酸または〔14C
−１〕−２−オキソ−３−メチル酪酸の基質から透過細
胞による14CO2放出のないことが分枝鎖２−オキソ酸デ
ヒドロゲナーゼ活性の存在しないことを示唆する。
ここに述べた、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
性を有さない突然変異株がアベルメクチン、特に非天然
アベルメクチンおよびシネフンギンの存在下ではデメチ
ルアベルメクチンを産生する能力を保有することは、意
外で予想しえないことであった。これらの突然変異株
が、慣習的な培地上で増殖させた場合に、天然の脂肪ア
シル補酵素Ａ誘導体を産生できないことは、膜の完全性
が前記誘導体に依存するならば、または前記誘導体によ
る２−オキソ酸蓄積が細胞毒性をもたらすならば、致命
的な突然変異になったであろうと考えられる。さらに、
この突然変異体がＬ−イソロイシンおよびＬ−バリンの
分解代謝からアセチルCoAおよびプロピオニルCoAを合成
しうるとは予想されなかった、これらの合成にはこの突
然変異株に欠けている酵素活性が必要であるからであ
る。上記のアベルメクチン生合成にはこれらのアシルCo
A誘導体が必要であるので、この突然変異株が非天然ア
ベルメクチン産生で重度に損傷することが予想された
が、これは生じなかった。
「アベルメクチン」または「アベルメクチン類」なる用
語は、本発明のストレプトマイセス アベルミチリスに
よって25位置に25−置換基（Ｒ）が同化しうる、下記の
式（Ｉ）で示される化合物を意味する。ここで用いる
「デメチルアベルメクチン」なる用語は二糖成分の３′
−,3″−位置の一方または両方がメトキシ以外のヒドロ
キシによって置換された、Ａ型およびＢ型アベルメクチ
ンを意味する。
ここに述べる突然変異株はここに開示し、ここに例示す
る方法によって非天然デメチルアベルメクチンを製造す
るために非常に貴重である。これらの突然変異株は好ま
しいデメチルアベルメクチン、すなわちＣ−25置換基が
C1-C4アルキル基によつて任意に置換されたC4-C6シクロ
アルキルもしくはシクロアルケニル基、１−メチルチオ
エチルまたは５員もしくは６員の酸素もしくは硫黄含有
複素環基、特に３−チエニルまたは３−フリルである化
合物の製造にとって特に貴重である。
ストレプトマイセス アベルミチリス種のアベルメクチ
ン産生菌の突然変異は、紫外線照射、Ｘ線照射、Ｎ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチル
メタンスルホネート、亜硝酸およびナイトロジエンマス
タード、例えばＮ−メチルビス（２−クロロエチル）ア
ミン、または同様な処置を含む、種々な突然変異誘発剤
を用いる公知の方法によって実施される。突然変異誘発
は、例えばストレプトマイセス アベルミチリス ATCC
31272のような、天然アベルメクチンを産生しうるスト
レプトマイセス アベルミチリスの胞子または増殖性培
養物に対して行われる。
当業者に周知の方法に従って、特定の〔14C−１〕−２
−オキソ分枝鎖酸から14CO2を放出する、無作為に突然
変異を誘発した多数の細菌コロニーを検出しうる生化学
的分析方法に基づいて、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼの欠損に関して突然変異誘発コロニーを選択する
〔タボール（Tabor）等、ジェイ・バクト・（J.Bact.）
128巻,485-486頁（1976）〕。
この方法は、マイクロタイタープレートの孔中の適当な
栄養培地上で、突然変異株コロニーを増殖させる；細胞
にトルエンを透過させる；次に各孔に〔14C−１〕−２
−オキソ酸（例えば２−オキソイソカプロン酸）を加
え、発酵上の雰囲気を14CO2に関して検査することから
成る。また、〔14C−１〕−２−オキソ−イソカプロン
酸の代りに、〔14C−１〕−２−オキソ−メチル吉草酸
または〔14C−１〕−２−オキソ−３−メチル酪酸を用
いることができる。湿ったBa(OH)2飽和紙を各孔の上
において放出14CO2を捕捉して、Ba14CO3（存在する場合
には）をオートラジオグラフィによって検出することに
よって、14CO2の発生が簡単に調べられる。分枝鎖２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さない突然変異株は
ブランク対照に大体等しいオートラジオグラムを示す；
すなわち、Ba14CO3はこの突然変異株によって産生され
ない。
ここに述べる突然変異株の方法論的および培養上の特徴
は、一般に米国特許第4,429,042号に述べられている通
りである。この突然変異株の明確な特徴は分枝鎖２−オ
キソ酸デヒドロゲナーゼ活性を有さないことであり、こ
の特徴は上述のようにして検出される。この活性が存在
しないと、突然変異体は脂肪酸RCOOH（Ｒはイソプロピ
ルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである）または発酵中に
前記RCOOHに転化しうる化合物を実質的に含まない規定
（defined）培地上で増殖させたときに、天然アベルメ
クチンを産生することができない。アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（American Type Culture Collec
tion）によって実施した分類学的研究（taxonomic inve
stigation）は、上記14CO2分析によって選択した、２種
類の突然変異株Ｉ−３とHL-026の特徴が米国特許第4,42
9,042号に述べられているATCC31272親菌株の特徴に関係
する（若干の例外はあるが）ことを実証した。従って、
突然変異株Ｉ−３（ATCC53567）はATCC31272よりも有意
に少ない胞子を形成し、突然変異株HL-026（ATCC 5356
8）は空中菌糸体と胞子を実際に有さないが、これが形
成するごく少数の胞子鎖はATCC31272の胞子鎖と同じ性
質を有する。突然変異株HL-026は唯一の炭素源としてラ
フィノースを利用する能力を有するのではないかと考え
られるが、ATCC31272菌株と突然変異株Ｉ−３はラフィ
ノースを利用することができる。（出願人による実験中
に、ラフィノースはこれらの菌株のいずれの増殖も支持
するように見えなかった。）突然変異株HL-026の他の特
徴の一つは、他の２菌株よりもメラニン色素産生量が少
なく、チロシン寒天上では特有にメラニン色素を全く産
生しないことである。結局、米国特許第4,429,042号に
おけるATCC31272に関する記載とは対照的に、唯一の炭
素源としてのスクロースによって突然変異株の増殖また
はATCC31272の増殖を検出することができなかった。
ストレプトマイセス アベルミチリスＩ−３とHL-026は
ブタペスト条約の条件下で、アメリカンタイプ カルチ
ャー コレクション（メリーランド州，ロックビル）に
寄託された、この機関は永久的な寄託を可能にする公認
の受託機関であり、この出願に特許権が付与された場合
には公衆に入手可能にする。これらの菌株はそれぞれス
トレプトマイセス アベルミチリスATCC 53567と53568
なる名称を与えられている。これらの寄託菌は、この出
願の審査中はアメリカ合衆国特許庁の特許局長が37CFR
1.14および35USC122の下に、およびこの出願の対応物ま
たはその後継物を出願した国の特許法に従って、資格が
あると判定した人に利用可能である。寄託した微生物の
公衆への利用可能性に対する全ての制限は、特許の付与
時に変更不能に除去される。
適当なプライマー化合物を含む栄養培地内で発酵させた
ときに、本発明の突然変異株はＲが使用したプライマー
化合物に相当する式（Ｉ）の化合物または、より一般的
な場合には、式（Ｉ）で示される２種類以上の化合物の
混合物を産生する。米国特許第4,429,042号に用いられ
た名称によってＲ−アベルメクチンA1,A2,B1およびB2と
簡便にかつ慣用的に呼ばれている４種類までの生成物が
産生される。「Ｒ−」基は当然Ｃ−25置換基を意味す
る。例えば、Ｒがシクロペンチルである場合に、可能な
４種類のアベルメクチンは次の通りである： シネフンギンの存在下では、対応するデメチルアベルメ
クチンが産生される。デメチルアベルメクチンＡ成分量
の減少とデメチルアベルメクチンＢ成分量の増加とが一
般に観察される。
二重結合が存在し、OHが存在しない式（Ｉ）の化合物
は、この代りに、R1がOHであり、二重結合が存在しない
式（Ｉ）の対応化合物から脱水反応によって製造され
る。この反応は例えばｔ−ブチルジメチルシリルオキシ
アセチル誘導体として、５および４″位置のヒドロキシ
基を最初に選択的に保護し、次に例えば（４−メチルフ
ェノキシ）チオカルボニル クロリドのような、置換チ
オカルボニル ハライドと反応させ、次に例えばトリク
ロロベンゼンのような高沸点溶媒中で加熱することによ
って脱水させることによって行われる。最後に、生成物
を脱保護して、不飽和化合物を得る。これらの工程は適
当な試薬と反応条件とともに、米国特許第4,328,335号
に述べられている。
R3がＨである式（Ｉ）化合物も、R3がCH3である対応化
合物から脱メチル化によって製造される。この反応は５
−メトキシ化合物または適当に保護されたその誘導体を
酢酸第二水銀によって処理し、得られた３−アセトキシ
エノールエーテルを希酸で加水分解して５−ケト化合物
を得ることによって行われる。次に、この５−ケト化合
物を例えばホウ水素化ナトリウムを用いて還元して、５
−ヒドロキシ誘導体を得る。これらの工程のために適当
な試薬と反応条件は米国特許第4,423,209号に述べられ
ている。
R1がＨであり、二重結合が存在しない式（Ｉ）の化合物
は、二重結合が存在しR1が存在しない化合物から、適当
な触媒を用いる選択的接触水素化によって製造すること
ができる。例えば、ヨーロッパ特許出願公報第0001689
号およびそれに対応する米国特許第4,199,569号に述べ
られているような、トリス（トリフェニルホスフィン）
ロジウム（Ｉ）クロリドを用いて、還元が行われる。
本発明のストレプトマイセスアベルミチリスによって式
（Ｉ）のデメチルアベルメクチンの生合成に用いること
のできる化合物は式（II−Ａ）： RCOOH （II−Ａ） で示される化合物および発酵過程中に（II−Ａ）に転化
できる化合物である。前記化合物をここでは「プライマ
ー化合物」と呼ぶ。式（II−Ａ）では、Ｒはα−分枝鎖
基であり、−COOHが付着した、この基の炭素原子は水素
以外の少なくとも２個の他の原子または基にも結合す
る。この定義は当然、非環式鎖または環の要素としての
硫黄もしくは酸素のヘテロ原子を任意に含む飽和および
不飽和の非環式基および環式基を含む。
さらに詳しくは、Ｃ−25置換基になるＲはα−分枝鎖C3
-C8アルキル、アルケニル、またはアルキルチオアルキ
ル基；メチレンまたは１個以上のC1-C4アルキルもしく
はハロゲン原子（フルオロ、クロロ、ヨードもしくはブ
ロム）によって任意に置換することのできるC3-C8シク
ロアルキルまたはC5-C8シクロアルケニル基;1個以上のC
1-C4アルキル基もしくはハロゲン原子によって任意に置
換することのできる、飽和なまたは完全にもしくは部分
的に不飽和な、３員〜６員の酸素もしくは硫黄含有複素
環式基である。
発酵過程中にRCOOHに転化可能な化合物すなわちRCOOHの
前駆体は式（II−Ｂ）： Ｒ−(CH2)n−Ｚ （II−Ｂ） 〔式中、Ｒは上記で定義した通りであり； ｎは0,2,4または６であり； Ｚは-CH2OH,-CHO,-CH2NH2,-COOR5または-CONHR6であ
り；R5はＨまたはC1-C6）アルキルであり；R6はアミノ
酸、特にアスパラギン酸、グルタミン酸およびメチオニ
ンの残基、例えば-CH(COOH)CH2COOH,-CH(COOH)(CH2)2CO
OHおよび-CH(COOH)(CH2)2SCH3である〕 で示される化合物である。
本発明の化合物は、窒素、炭素、無機塩および式RCOOH
で示される化合物または発酵過程中に前記化合物に転化
可能な化合物（すなわち前駆体）の同化可能なソースを
含む水性栄養培地においてストレプトマイセス アベル
ミチリスの菌株、好ましくは分枝鎖２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性を有さない菌株によるシネフンギンまた
はその他の阻害剤の存在下での好気性発酵によって製造
される。接種時にまたは発酵中に時々酸または酸に転化
可能な化合物を発酵に加える。これは一度に全部または
発酵中に間隔をおいて少量ずつ加える。Ｓ−アデノシル
エチオニンも接種時にまたは発酵中のある時点で１度に
全部または発酵中に間隔をおいてもしくは連続的に少量
ずつ加えることができる。発酵からサンプルを採取し、
有機溶媒で抽出し、例えば高速液体クロマトグラフィを
用いた、クロマトグラフィによる生成物の表示に従っ
て、アベルメクチン生成物の産生を監視することができ
る。生成物の収量が最大になるまで、一般には４〜15日
間インキュベーションを続ける。
プライマー化合物（カルボン酸またはカルボン酸に転化
可能な化合物）の各添加の好ましいレベルは0.05〜3.0g
/lの範囲である。プライマー化合物は連続的、間欠的に
または一度に全部を発酵に加えることができる。酸はそ
のものとして、または例えばナトリウム、リチウムもし
くはアンモニウム塩のような塩として、または上記で定
義したような酸に転化可能な化合物として加える。酸が
固体である場合には、酸を水または（C1-C4）アルコー
ルのような適当な溶媒に溶解するのが好ましい。
発酵に時々、菌の成長に不利な影響を与えないようなレ
ベルでシネフンギンを加える。実際には、約0.01〜約1.
0mMの範囲の量を用いることができる。これらの量を好
ましくは接種から24〜168時間後に発酵に加えることが
できる。0.05〜0.50mMの量が好ましく、特に0.05〜0.25
mMの量が好ましい。
発酵に用いる培地は炭素、窒素および微量元素の同化可
能なソースを含み、慣習的な培地でありうる。しかし、
特定の成分が存在しないまたはＲ基がイソプロピルもし
くは（Ｓ）−sec−ブチルであるプライマー化合物の最
小量のみを含む発酵培地を用いることが好ましい。
好ましくは24℃〜33℃の範囲内の温度において数日間発
酵させた後に、発酵ブイヨンを遠心分離または過し
て、菌糸体ケーキを好ましくはアセトンまたはメタノー
ルによって抽出する。溶媒抽出物を濃縮し、次に目的生
成物を例えば塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホル
ム、ブタノールまたはメチルイソブチルケトンのよう
な、水に混和しない有機溶媒中に抽出する。溶媒抽出物
を濃縮し、粗生成物を必要に応じて、例えば調製用逆相
高速液体クロマトグラフィを用いて、クロマトグラフィ
によってさらに精製する。
生成物は一般に、R2においてR4とR5の一方または両方が
水素であり；R1は二重結合が存在しない場合にOHである
が二重結合が存在する場合には存在しない；R3はＨまた
はCH3である式（Ｉ）化合物の混合物として得られる。
しかし、この割合は特定の突然変異株、プライマー化合
物、およびある程度はシネフンギン使用量と使用条件に
依存して変化する。
Ｒ基のソースは、すなわちＲ基が直接Ｒ−COOHから生じ
たかまたは上記の前駆体からもしくは何らかの前駆体か
ら生成したかはデメチルアベルメクチンの産生にとって
重要ではない。本発明の方法のデメチルアベルメクチン
の産生にとって重要な必要な条件は、発酵過程で本発明
のストレプトマイセス アベルミチリス菌株に好ましい
Ｒ基が利用可能であるということである。
適当な化合物を次に挙げる： 2,3−ジメチル酪酸 ２−メチルヘキサン酸 ２−メチルペント−４−エン酸 ２−シクロプロピル プロピオン酸 4,4−ジフルオロシクロヘキサン カルボン酸リチウム
塩 ４−メチレンシクロヘキサン カルボン酸 ３−メチルシクロヘキサン カルボン酸 （シス／トランス） １−シクロペンテン カルボン酸 １−シクロヘキセン カルボン酸 テトラヒドロピラン−４−カルボン酸 チオフェン−２−カルボン酸 ３−クロン酸 ２−クロロチオフェン−４−カルボン酸 シクロブタン カルボン酸 シクロペンタン カルボン酸 シクロヘキサン カルボン酸 シクロヘプタン カルボン酸 ２−メチルシクロプロパン カルボン酸 ３−シクロヘキセン−１−カルボン酸 ２−メチルチオプロピオン酸 ２−メチル−４−メトキシ酪酸 チオフェン−３−カルボン酸 ヒドロキシメチルシクロペンタン ３−チオフェン カルボキシアルデヒド ３−シクロヘキシルプロピオン酸 ３−シクロペンチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒドロチオフェン−３−カルボン酸 ３−シクロペンチル−１−プロパノール ３−メチルシクロブタン カルボン酸リチウム塩 ３−フルオロシクロブタン カルボン酸 ３−メチレンシクロブタン カルボン酸リチウム塩 ２−メチル−４−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオプラン−４−カルボン酸 シクロブチルメチルアミン エチルシクロブタンシクロペンテン ４−ヒドロキシメチルシクロペンテン ２−（３−チオフェンカルボニル）プロピオン酸エチル
エステル （Ｓ）−２−メチルペンタン酸 （Ｒ）−２−メチルペンタン酸 Ｏ−メチルトランスフェラーゼ突然変異株はここに述べ
た分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰性突然変異株
から得られる。活性な分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性の突然変異がＯ−メチルトランスフェラーゼ突
然変異の一方または両方と結合した突然変異株は、RCOO
H化合物または発酵過程中にRCOOHに転化可能な化合物を
供給した場合に、主としてＢアベルメクチン、デメチル
アベルメクチンまたはデメチルアベルメクチンＢ化合物
を産生する。前記突然変異株は分枝鎖２−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼ活性を有さない、ここに述べた突然変異株
の紫外線および／または例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ
ソウレタン、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホ
ネートもしくは上記に挙げたような他の作用剤のような
化学的突然変異誘発物質による突然変異誘発によって得
られる。この代りに、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活
性の一方または両方を有さない分枝鎖２−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼ陽性突然変異株は紫外線または突然変異誘
発剤による処理によって突然変異を起して、分枝鎖２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰性突然変異株および／また
は分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ陰性突然変異株を
生ずる。
このような突然変異株によって生ずる非天然アベルメク
チンはアグリコーン成分のC5位置および／またはオレア
ンドロース成分のC3′および／またはC3″位置における
ヒドロキシ基の存在を特徴とする。
上記突然変異株はシュルマン等が述べている方法によっ
て同定する〔アンチマイクロビアル エイジェント ア
ンド ケモセラピー,29巻,620-624頁（1986）〕。これ
らの突然変異株は公知のアベルメクチンと同じ目的に、
同じように有用である。
本発明の公知の化合物は駆虫薬、外部寄生虫撲滅剤、殺
虫剤およびダニ駆除剤として特定の用途を有する非常に
活性な駆虫薬である。
このように、これらの化合物は特に、線虫と呼ばれる寄
生虫群によって非常に頻繁に誘発され、ブタ、ヒツジ、
ウマおよびウシの重度な経済的損失を招き、家畜および
家きんに影響を与える蟯虫病を含めた、内部寄生虫によ
って生ずる種々な症状の治療に有効である。この化合物
は例えばイヌのイヌ糸状虫および例えば鉤虫属（Ancylo
stoma），鉤虫（Necator），回虫（Ascaris），円虫（S
trongyloides），旋毛虫（Trichinella），毛頭虫（Cap
iliaria），鞭虫（Trichuris），蟯虫（Enterobius）の
ような胃腸寄生虫、ならびに例えばフィラリア虫および
円虫と旋毛虫の腸外期のような、血液またはその他の組
織および器官に検出される寄生虫を含めた、ヒトに感染
しうる種々な寄生虫を含めて、種々な動物種に影響を与
える線虫に対して有効である。
この化合物はまた、例えばウシおよびウマに影響を与え
るマダニ、ダニ、シラミ、ノミ、クロバエ、刺虫（biti
ng insect）および移住性双翅目幼虫のような、特に動
物および鳥の昆虫綱外部寄生虫を含めた外部寄生虫感染
症の治療にも有効である。
この化合物はまた、ゴギブリ、イガ、ヒメマルカツオブ
シムシおよびイエバエのような家庭害虫に対して有効か
つ貯蔵穀粒の害虫およびハダニ、アブラムシ、イモ虫の
ような農作物の害虫ならびにダイミョウバッタのような
移住性直翅目に対して有効である殺虫剤である。
式（Ｉ）の化合物は予定の特定の用途ならびに治療すべ
き特定の宿主動物種および関係する寄生虫または害虫に
適した製剤として投与する。駆虫薬として用いるために
は、化合物をカプセル剤、巨丸剤、錠剤または水薬とし
て経口投与する、またはこの代りに、注射によってまた
はインプラントとして投与する。このような製剤は標準
的な獣医学的方法に従って、慣習的な方法で製造され
る。従って、有効成分を例えば殿粉、ラクトース、タル
ク、ステアリン酸マグネシウム等のような、崩壊剤およ
び／または結合剤を補助的に含む、適当な微粉状希釈剤
またはキャリヤーと混合することによって、カプセル
剤、巨丸剤または錠剤を製造することができる。水薬製
剤は有効成分を分散剤または湿潤剤等とともに水溶液中
に分散させることによって製造し、注射可能な製剤は例
えば、溶液を血液と等張性にするために充分な塩または
グルコースのような、他の物質を含む無菌溶液として製
造することができる。これらの製剤では被治療宿主動物
種、感染症の重症度と種類および宿主の体重に依存し
て、有効成分量が変化する。一般に経口投与用には、１
回量または分割量として動物体重1Kgにつき約0.001〜10
mg量１日〜５日間投与が充分であるが、これより高いま
たは低い用量範囲が指示される場合も当然あり、このよ
うな用量範囲も本発明の範囲内に含まれる。
代替手段として、化合物を動物の飼料とともに投与する
こともでき、この目的には濃厚な飼料添加剤またはプレ
ミックスを通常の動物飼料との混合用に製造することが
できる。
殺虫剤として使用するため、かつ農作物の害虫を処理す
るために、本発明の化合物を標準的な農業的方法に従っ
てスプレー、ダスト、エマルジョン等として用いる。
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ欠乏ストレプトマ
イセス アベルミチリスＩ−３（ATCC53567）の生成 工程1. ストレプトマイセス アベルミチリスATCC3127
2をニュー パッチ アガール培地（New Patch Agar Me
dium）上で30℃において12日間、集密的ローン（conflu
ent lawn）として増殖させる。この培地は次の要素から
成る： Ｖ−８ジュース＊ 200ml CaCO3 3g 寒天 15g H2O 1000mlになるまで 栄養ブイヨン 1.0g/l 酢酸ナトリウム三水和物 1.4g/l イソ吉草酸 50mg/l イソ酪酸 50mg/l ２−メチル酪酸 50mg/l イソロイシン 250mg/l ロイシン 250mg/l バリン 250mg/l 微量元素溶液＊＊ 1mg/l ＊ ８種類の野菜ジュース（トマト、ニンジン、セロ
リ、ビート、パセリ、レタス、オランダガラシ、および
ホウレンソウ）と塩、アスコルビン酸、クエン酸および
天然フレーバーの混合物。キャンベル スープ カンパ
ニー（Campbell Soup Company）（ニュージャーシー
州、キャンデン）から入手される。
＊＊微量元素溶液の組成： FeCl3・6H2O 2.7g MnSO4・H2O 4.2 CuSO4・5H2O 0.5 CaCl2 11.0 H3BO3 0.62 CoCl2・6H2O 0.24 ZnCl2 0.68 Na2MoO4 0.24 上記成分を0.1N HC１中に溶解する。
このような３プレートから胞子を回収し、0.05Mトリス
マレイン酸緩衝液（pH9.0）中に懸濁させた。
工程2. この胞子懸濁液10mlをＮ−メチル−Ｎ′−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）10mgを含むバイア
ルに加えた。このバイアルをインキュベートし、28℃に
おいて60分間振とうし、次に胞子を１％NaCl溶液によっ
て充分に洗浄した。
工程3. 洗浄した胞子を１％NaCl中に懸濁させ、等量の
80％エチレングリコールと混合した。この懸濁液を−20
℃において保存し、突然変異株を調べるための細胞のソ
ースとして用いた。これは発芽したときに、約104コロ
ニー/mlを形成した。
この胞子ストックをYPDプレート上に展げ、約100コロニ
ー／プレートを形成した（YPD培地は酵母抽出物、バク
トペプトン＊（Bacto peptone）およびデキストロース
各10g/lと、バクトアガール＊（Bacto agar）15g/lを含
み、加工滅菌（auto-claving）の前にpH6.9に調節し
た。）星印を付けた成分はディフコ ラボラトリーズ
（Difco Laboratories）（デトロイト，ミシガン4823
8）から入手される。
工程4. 28℃において２〜３週間増殖させた後に、独立
コロニーをプレートから採取し、標準96孔マイクロタイ
タープレートの各孔に入れた。また、少量のコロニーを
新しい寒天培地に貼布して、突然変異株を確認する場合
に生存能力のある細胞として用いる。
工程5. 各孔に、グルコース１％、カザミノ酸0.1％な
らびにイソ吉草酸、イソ酪酸および２−メチル酪酸各0.
01％を含む液状M9塩培地約75μｌを加えた。28℃におい
て数日間インキュベーションした後に、細胞を分枝鎖２
−オキソ酸デヒドロゲナーゼの存在に関して分析した。
（M9塩培地１はNa2HPO4 6g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5gおよ
びNH4Cl 1gを含む。培地を加圧滅菌してから、殺菌1M M
gSO4と0.1M CaCl2各1mlを無菌下で加えた）。
工程6. M9塩培地中５％トルエンのミクロ懸濁液を非混
和性混合物の短時間の超音波処理によって調製した。こ
の懸濁液25mlに、〔14C−１〕−２オキソイソカプロン
酸2.5マイクロキューリー/ml、10.0マイクロキューリー
／μmol.含有溶液1.2mlを加えた。この総混合物50μｌ
を被分析コロニーを含むマイクロタイタープレートの各
孔に加えた。
工程7. タボール等のジェイ・バクテリオル（J.Bacter
iol.）128巻,485-486頁（1976）、「多重サンプル中の
14CO2の便利な検出方法；突然変異株の迅速検出への適
用（Convenient Method for detecting 14CO2 in Multi
ple Samples:Application to Rapid Screening for Mut
ants）」に述べられている方法によって、各孔から発生
する14CO2を捕捉し、可視化した。有効な分枝鎖２−オ
キソ酸デヒドロゲナーゼを含まない突然変異株は対照で
は検出されたBa 14CO3を生成しない。
Ba 14CO3形成の結果としてのオートラジオグラム上の暗
色スポットによって示される14CO2陽性分析とスポット
なしかまたは非常に淡色のスポットによって示される陰
性分析との対比を改良した、より正確な方法は次の改良
検査法である。
７〜14日間増殖（２〜３週間増殖ではなく、工程６と７
によって直接分析）後の寒天培地から独立コロニー（上
記工程４参照）を採取した。上記方法の工程５は省略す
る。14 CO2方法に関して定量的な性質であるさらに正確な分
析方法では、上記検査によって検出された突然変異株を
グルコース１％と「シンカザーbcaa（Syncasa-bcaa）」
0.1％を含むM9塩培地から成る適当な培地上で増殖させ
る（「シンカザー bcaa」とは、市販のカザミノ酸の大
体の組成を有するが、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンお
よびＬ−ロイシンが存在しないＬ−アミノ酸の合成混合
物、下記参照）。
高細胞密度に増殖した後に、細胞をM9塩培地内で洗浄
し、トルエンの乳白色分散系を生ずるように超音波処理
した、１％トルエン含有の冷M9塩培地に再懸濁した。細
胞を透過性化するために、細胞／緩衝液／トルエン懸濁
液を30℃において40分間インキュベートした。次に、透
過性化細胞をM9塩培地中で洗浄し、最後にM9培地緩衝液
の最初の量の1/5に再懸濁した。この懸濁液180μｌを検
査に用いた。
300μｌの反応量はトルエン化細胞、チアミンピロホス
フェート（TPP）0.4mM;補酵素Ａ（CoA）0.11mM;ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD） 0.68mM;ジチ
オスレイトール（DTT） 2.6mM;MgCl2 4.1mM;Tris-HCl 6
0mM;Tris-HCl 60mM;pH7.5;および〔14C−１〕−２−オ
キソイソカプロエート 6000cpm,マイクロキュリー／μ
mol.を含有した。計数率は73％であった。反応はバイア
ルのねじ込みキャップに２×2cmホワットマン（Whatma
n）♯４方形紙を押込んだ、15mlシンチレーションバ
イアル中で実施した。この紙は1Mハイアミン ヒドロ
キシド（1M Hyamine Hydroxide）〔メタノール中のメチ
ルベンズエトニウムヒドロキシドの1M溶液；シグマケミ
カル社（Sigma Chemical Co.）（ミズーリ63178,セント
ルイス）から入手可能〕30μｌを含有し、反応中に発生
する14CO2を捕捉する。２時間インキュベートした後
に、紙をベックマンアクアゾルII〔ニューイングラン
ド ニュークレア リサーチ プロダクト（New Englan
d Nuclear Research Products）（マサチュセッツ 021
18,ボストン）から入手可能な、ユニバーサル（Univers
al）LSC（液体シンチレーション計数管）〕10ml中に浸
漬し、この溶媒中で４時間以上平衡した後に液体シンチ
レーション計数管中で放射能を測定した。ブランクの対
照反応（すなわち、細胞含まず）は約50-300cpmであ
る。
突然変異株Ｉ−３とこれに似た他の突然変異株はブラン
ク対照値に比べて数倍高いカウントを示した。
ストレプトマイセス アベルミチリスＩ−３（ATCC5356
7）のHL-026誘導体の単離 ストレプトマイセス アベルミチリスＩ−３（ATCC5356
7）を栄養寒天プレート上で画線培養した。比較的高い
頻度で自然変異体が出現し、その幾つかは30℃における
４日間のインキュベーションで気生菌糸体を示さなかっ
た。このような変異体の幾つかを単離し、シクロペンタ
ンカルボン酸を加えたAP−５培地内で培養させた場合に
非天然アベルメクチンを産生しうるか否かを検査した。
単離物の多くは天然アベルメクチンを含まない非天然ア
ベルメクチンを生成したが、この中から親菌株のストレ
プトマイセス アベルミチリスＩ−３（ATCC 53567）よ
りも高い力価のアベルメクチンをフラスコ実験で生ずる
菌株に確認番号HL-026（ATCC 53568）を割当てた。
「シンカザーbcaa」の組成、100倍濃縮物 g/l Ｌ−アラニン ３ Ｌ−アルギニン ４ Ｌ−アスパラギン酸 ６ Ｌ−システィン １ Ｌ−グルタミン酸 20 グリシン １ Ｌ−ヒスチジン ２ Ｌ−リシン ７ Ｌ−メチオニン ３ Ｌ−フェニルアラニン ６ Ｌ−プロリン 10 Ｌ−セリン ６ Ｌ−スレオニン ４ Ｌ−チロシン ４ Ｌ−トリプトファン １ 混合物をpH7に調整して、フィルター殺菌する。濃縮物
１容量部を培地99容量部に加えて、標準使用濃度にす
る。次の例に用いた培地の組成を下記に示す： AS−７培地 g/l 希薄澱粉ａ 20 アルダミンpH(Ardamine pH)b ５ ファルマメディア(Pharmamedia)c 15 CaCO3 ２ ａ バチルス リチェニホルミス（Bacillus lichenifo
rmis）からのα−アミラーゼ〔ノボ エンザイム（Novo
Enzymes）（コネチカット州，ウイルトン）から入手可
能、商品名「ターマミル（Termamyl）」で販売。）によ
る殿粉から40％〜50％に等しいデキストロースへの加水
分解によって調製。
ｂ イースト プロダクツ（Yeast Products,Inc.）
（ニュージャーシー07012,クリフトン）から。
ｃ トレイダー プロティン（Trader Protein）（テネ
シー 38108,メンフィス）から。
NaOHによってpHを7.2に調節。
AP−５ 培地 g/l 希薄殿粉 80 アルダミンpH ５ K2HPO4 １ MgSO4・7H2O １ NaCl １ CaCO3 ７ FeSO4・7H2O 0.01 MnCl2・7H2O 0.001 ZnSO4・7H2O 0.001 Ｐ−2000（消泡剤） 1ml/l 25％NaOHによりpHを6.9に調節。
一般高速液体クロマトグラフィ（HPLC）処置移動相： 水 150ml アセトニトリル 70ml メタノールを加えて、全量を１にする。
カラム： ウルトラスフェアー（Ultrasphere）CDS25cm〔バックマ
ン インストルーメント（Beckman Instruments）（カ
ルフォルニア92634-3100,フレルトン）〕 流量:0.75ml/分 検出：紫外線 240nm 減衰：約６ サンプル希釈剤（Ｄ）： アセトニトリル35ml＋メタノール390ml 標準： 1.アベルメクチンA2A 0.5mgを10mlフラスコに繰り入
れ、メタノールによって10mlにする。
2.試験生成物0.5mgを10mlフラスコに繰り入れ、メタノ
ールによって10mlにする。
１と２は標準ストック溶液であり；標準溶液をランに用
いるには： （１） 100μｌと（２）100μｌをバイアルに入れ、移
動相800μｌを加える。
サンプル： 1.充分に振とうしたブイヨン1mlを採取し；遠心分離す
る 2.ペレットを妨害することなく、できるだけ多くの上清
を除去する 3.ペレットにHPLC水100μｌを加え、混合物を攪拌して
分散させる 4.希釈剤（Ｄ）2mlを加え、充分に混合する 5.同混合物を過し、HPLCを実施する。
天然アベルメクチンに対して、このHPLCクロマトグラフ
ィ処置を実施し、各アベルメクチンのピークの保持時間
を存在するオリゴマイシンＡに対して観察された保持時
間で除す、これは特定HPLC測定の内部標準として役立
つ。オリゴマイシンＡはスペクトロマイセス アベルミ
チリス発酵の副生成物として、HPLCによって殆んど常に
観察される、これはRCOOH（Ｒはここで定義した通りで
ある）で示される酸を含まない培地中で、またはRCOOH
（Ｒはここで定義した通りである）で示される酸に転化
しうる化合物を含まない培地中でここに述べた変異株を
培養した場合に産生され、HPLCで認められる唯一の生成
物である。オリゴマイシンＡの保持時間は典型的に12.5
〜14分間である。保持時間（RT）の比はアベルメクチン
生成物の同一性と収率を比較するために重要な根拠を与
える。HPLC上のアベルメクチン生成物の一般的な出現順
序はB2,A2,B1およびA1である。天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） B2b 0.70 B2a 0.84 A2b 0.90 A2a 1.09 B1b 1.40 B1a 1.83 A1b 1.83 A1a 2.42 B1aとA1bが不溶であることに注意する。非天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） シクロペンチルB2 0.94 シクロペンチルA2 1.23 シクロペンチルB1 1.99 シクロペンチルA1 2.62 保持時間は日によって１〜２分間変化し、オリゴマイシ
ンＡは一般に約12.5〜14分間に出現する。
次の例では、アベルメクチンを上記HPLC処置によって測
定した。
例１ 脱メチル化シクロヘキシルアベルメクチン ストレプトマイセス アベルミチリスHL-026（ATCC 535
68）の凍結バイアルを用いて、500ml−バッフル フラ
スコ（baffled flask）中のAS−７培地100mlに接種し、
これを28-30℃において24-28時間、振とうしながらイン
キュベートした。次に、この培養物1mlを用いて、AP−
５（NaClを減じて、グルタミン酸0.6g/lを添加）培地40
mlを含む300ml−フラスコに接種した。28-30℃において
振とうしながら約96時間インキュベートした後に、シク
ロヘキサンカルボン酸（ナトリウム塩）0.2g/lとシネフ
ンギン0.1mMとを加えた。312時間サンプルのHPLCクロマ
トグラフィは対応シクロヘキシルアベルメクチンに対し
て次の保持時間比を示す、脱メチル化シクロヘキシルア
ベルメクチンB2,A2およびB1の存在を示した： di-Demet CH-B2/CH-B2＝0.470 mono-Demet CH-B2/CH-B2＝0.515 di-Demet CH-A2/CH-A2＝0.466 mono-Demet CH-A2/CH-A2＝0.520 di-Demet CH-B1/CH-B1＝0.486 mono-Demet CH-B1/CH-B1＝0.517。
di-Demet＝ジデメチル mono-Demet＝モノデメチル CH＝シクロヘキシル 例２ 脱メチル化シクロペンチル アベルメクチン ストレプトマイセス アベルミチリスHL-026（ATCC 535
68）を用いて、500ml−バッフルフラスコ中のAS−７培
地100mlに接種し、これを28-30℃において24-28時間振
とうしながらインキュベートした。次に、この培養物1m
lを用いて、AP−５（NaClを減じて、グルタミン酸0.6g/
lを添加）培地40mlを含む300ml−フラスコに接種した。
28-30℃において振とうしながら約96時間インキュベー
トした後に、シクロペンタン カルボン酸（ナトリウム
塩）0.4g/lとシネフンギン0.1mMとを加えた。312時間サ
ンプルのHPLCクロマトグラフィは、対応シクロヘキシル
アベルメクチンに対して次の保持時間比を示す、脱メチ
ル化シクロヘキシルアベルメクチンB2、A2およびB1の存
在を示した： di-Demet CP-B2/CP-B2＝0.519 mono-Demet CP-B2/CP-B2＝0.564 di-Demet CP-A2/CP-A2＝0.513 mono-Demet CP-A2/CP-A2＝0.567 di-Demet CP-B1/CP-B1＝0.538 mono-Demet CP-B1/CP-B1＝0.593 CP＝シクロペンチル 例３ 脱メチル化シクロブチルアベルメクチン ストレプトマイセス アベルミチリスHL-026（ATCC 535
68）を用いて、500ml−バッフル フラスコ中のAS−７
培地100mlに接種し、これを28-30℃において24-28時間
振とうしながらインキュベートした。次に、この培養物
1mlを用いて、AP−５（NaClを減じて、グルタミン酸0.6
g/lを添加）培地40mlを含む300ml−フラスコに接種し
た。28-30℃において振とうしながら約96時間インキュ
ベートした後に、シクロブタン カルボン酸（ナトリウ
ム塩）0.4g/lとシネフンギン0.1mMとを加えた。312時間
サンプルのHPLCクロマトグラフィは、対応シクロヘキシ
ルアベルメクチンに対して次の保持時間比を示す、脱メ
チル化シクロブチル（CB）アベルメクチンB2,A2およびB
1の存在を示した： di-Demet CB-B2/CB-B2＝0.581 mono-Demet CB-B2/CB-B2＝0.627 di-Demet CB-A2/CB-A2＝0.570 mono-Demet CB-A2/CB-A2＝0.626 di-Demet CB-B1/CB-B1＝0.574 mono-Demet CB-B1/CB-B1＝0.623。
CB＝シクロブチル 例４ 脱メチル化２−ペンチルアベルメクチン ストレプトマイセス アベルミチリスHL-026（ATCC 535
68）の凍結バイアルを用いて、500ml−バッフルフラス
コ中のAS−７培地100mlに接種し、これを28-30℃におい
て24-28時間、振とうしながらインキュベートした。次
にこの培養物1mlを用いて、AP−５（NaClを減じて、グ
ルタミン酸0.6g/l添加）培地40mlを含む300mlフラスコ
に接種した。28-30℃において振とうしながら約96時間
インキュベートした後に、２−メチル吉草酸（ナトリウ
ム塩）0.4g/lとシネフンギン0.1mMを加えた。312時間サ
ンプルのHPLCクロマトグラフィは対応２−ペンチルアベ
ルメクチンに対して次の保持時間比を示す、脱メチル化
２−ペンチル（IP）アベルメクチンB2,A2およびA1の存
在を示した： di-Demet IP-B2/IP-B2＝0.497 mono-Demet IP-B2/IP-B2＝0.541 di-Demet IP-A2/IP-A2＝9.493 mono-Demet IP-A2/IP-A2＝0.545 IP＝２−ペンチル 例５ 脱メチル化１−メチル−３−ブテニルアベルメクチン ストレプトマイセス アベルミチリスHL-026（ATCC 535
68）の凍結バイアルを用いて、500ml−バッフルフラス
コ中のAS−７培地100mlに接種し、これを28-30℃におい
て24-28時間振とうしながらインキュベートした。次に
この培養物1mlを用いて、AP−５（NaClを減じて、グル
タミン酸0.6g/lを添加）培地40mlを含む300ml−フラス
コに接種した。28-30℃において振とうしながら約96時
間インキュベートした後に、２−メチル−４−ペンテン
酸（ナトリウム塩）0.4g/lとシネフンギン0.1mMとを加
えた。312時間サンプルのHPLCクロマトグラフィは対応I
M3Bアベルメクチンに対して次の保持時間比を示す脱メ
チル化１−メチル−３−ブテニル（IM3B）アベルメクチ
ンB2,A2およびB1の存在を示した： di-Demet 1M3B-B2/1M3B-B2＝0.547 mono-Demet 1M3B-B2/1M3B-B2＝0.591 di-Demet 1M3B-A2/1M3B-A2＝0.532 mono-Demet 1M3B-A2/1M3B-A2＝0.586 di-Demet 1M3B-B1/1M3B-B1＝0.551 1M3B＝１−メチル−３−ブテニル 例６ シクロペンチル アベルメクチン ストレプトマイセス アベルミチリスHL-026（ATCC 535
68）の凍結バイアルを用いて、500ml−バッフルフラス
コ中のAS−７培地100mlに接種し、これを28-30℃におい
て24-28時間インキュベートした。次に、この培養物1ml
を用いて、AP−５（NaClを減じて、グルタミン酸0.6g/l
を添加）培地40mlを含む300ml−フラスコに接種した。2
8-30℃において振とうしながら96時間インキュベートし
た後に、シクロペンタン カルボン酸（ナトリウム塩）
0.4g/lを加えた。216時間サンプルのHPLCクロマトグラ
フィはそれぞれ12.32分間、15.86分間、25.28分間およ
び32.96分間の保持時間を有するシクロペンチル アベ
ルメクチンB2,A2,B1およびおよびAIの存在を示した。
例７ シクロヘキシル アベルメクチン この例では、シクロペンタン カルボン酸の代りに96時
間目にシクロヘキサンカルボン酸0.2g/lを加えた、他の
条件は全て例６に述べた条件と同じであった。240時間
サンプルのHPLCクロマトグラムでは、４種類のシクロヘ
キシルアベルメクチンが同定された。シクロヘキシルア
ベルメクチンB2,A2,B1およびAIの保持時間はそれぞれ、
14.84分間、19.26分間、31.46分間および41.14分間であ
った。
例８ ２−ペンチル アベルメクチン この例では、シクロペンタンカルボン酸の代りに96時間
目に、２−メチル吉草酸0.2g/lを加えた、他の条件は全
て例６に述べた条件と同じであった。312時間サンプル
のHPLCクロマトグラムでは、４種類の２−ペンチルアベ
ルメクチンが同定された。２−ペンチルアベルメクチン
B2,A2,B1およびAIの保持時間はそれぞれ12.88分間、16.
58分間、31.90分間および41.92分間であった。
例９ １−メチル−３−ブテニル アベルメクチン この例では、シクロペンタンカルボン酸の代りに96時間
目に、２−メチル−４−ペンテン酸0.2g/lを加えた、他
の条件は全て例６に述べた条件と同じであった。312時
間サンプルのHPLCクロマトグラムでは、４種類の１−メ
チル−３−ブテニルアベルメクチンが同定された。１−
メチル−３−ブテニルアベルメクチンB2,A2,B1およびAI
の保持時間はそれぞれ11.13分間、14.78分間、22.10分
間および28.92分間であった。
例10 シクロペンチル アベルメクチン A2 ストレプトマイセス アベルミチリスＩ−３（ATCC 535
67）をAS−５培地中、28〜30℃において振とうしながら
24時間インキュベートした。これの5ml量を用いて、AS
−７培地100ml含有500ml−フラスコに接種し、同じ条件
下で24時間インキュベートし；この培養物の1mlを用い
てAP−５培地（300ml−フラスコ中に40ml）に接種し、
この培地に24時間後にシクロペンタンカルボン酸（ナト
リウム塩）0.4g/lを加えた。生成物フラスコを28〜30℃
において振とうしながらインキュベートした。240時間
までに、シクロペンチルアベルメクチンA2 35mg/lが産
生されたが、対応する天然A2aの力価は０であった。他
のシクロペンチルアベルメクチンも産生された。
シクロペンタンカルボン酸の代りに下記のプライマー化
合物を用いて、上記手順をくり返した。特定の発酵から
同定されたアベルメクチン〔R2がオレアンドロース二糖
成分であり、R,R1およびR3は上記の通りである式（Ｉ）
化合物〕も下記に示す： 上記化合物の幾つかに関する他の物理化学的データを下
記に示す。化合物 物理化学的データ ６（A2） 白色粉末；融点135-140℃.; 分子量＝925;m/e596,454, 321,303,275,237,219, 209,191,179,167,145, 127,113,111,95および87。
６（A1） 白色粉末；融点120-124℃.; 分子量＝907;m/e578,303, 275,257,219,191,167, 145,127,113,111,95 および87。
６（B2） 白色粉末；融点110-112℃.; 分子量＝911;m/e321,303, 261,257,237,219,209, 191,179,167,145,127, 113,111,95および87。
６（B1） 白色粉末；融点135-138℃.; 分子量＝893;m/e303,261, 257,219,191,167,145, 127,113,111,95および87。
８（A2） 白色粉末；融点112-117℃.; 分子量＝953;m/e624,482, 349,349,331,275,265, 247,237,219,207,195, 179,145,127,113,111, 95および87。
10（A2） 白色粉末；融点131-135℃.; 分子量＝951;m/e624,480, 347,329,275,263,245, 235,217,205,193,179, 145,127,113,111,95および 87。
12（A2） 白色粉末；融点167℃； 分子量＝953;m/e349,331, 275,265,257,247,237, 219,195,145,127,113, 95および87。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/62 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 シー−ジェン・エドワード・リー アメリカ合衆国コネチカット州ウォーター フォード，ウォータービュー・ドライブ 12

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： ［式中、22-23位置の破線は任意の二重結合を表す； R1は二重結合が存在しない場合に、ＨまたはOHであり、
    二重結合が存在する場合には、R1は存在しない； Ｒはα−分枝鎖C3〜C8アルキル、アルケニルまたはアル
    キルチオアルキル基； 任意にメチレンまたは１個以上のC1-C4アルキル基もし
    くはハロゲン原子によって置換される、C3-C8シクロア
    ルキルまたはC5-C8シクロアルケニル基；または飽和ま
    たは完全にもしくは部分的に不飽和であり、任意に１個
    以上のC1-C4アルキル基またはハロゲン原子によって置
    換される、３員〜６員の酸素もしくは硫黄含有複素環で
    ある、但し、Ｒがアルキル基である場合はイソプロピル
    およびsec−ブチル以外のアルキル基である； R2は式： （式中、R4とR5はそれぞれ水素もしくはメチルである
    が、R4とR5の少なくとも一方は水素である）で示される
    二糖成分であり； R3は水素またはメチルである］ で示される化合物。
  2. 【請求項２】Ｒがシクロアルキルである特許請求の範囲
    第１項記載の化合物。
  3. 【請求項３】Ｒがシクロヘキシルであり、R1がOHである
    特許請求の範囲第２項記載の化合物。
  4. 【請求項４】R3が水素であり、R4とR5がそれぞれ水素で
    ある特許請求の範囲第３項記載の化合物。
  5. 【請求項５】R3がメチルであり、R4とR5がそれぞれ水素
    である特許請求の範囲第３項記載の化合物。
  6. 【請求項６】Ｒがシクロペンチルであり、R1がOHであ
    り、R4とR5の一方が水素であり、R3がメチルである特許
    請求の範囲第２項記載の化合物。
  7. 【請求項７】Ｒが、飽和または不飽和である３員〜６員
    の酸素もしくは硫黄含有複素環である特許請求の範囲第
    １項記載の化合物。
  8. 【請求項８】Ｒが３−チエニル、R1がOH、R3がメチルで
    あり、R4とR5が水素である特許請求の範囲第７項記載の
    化合物。
  9. 【請求項９】Ｒが３−フリル、R1がOH、R3が水素であ
    り、R4とR5の各々が水素である特許請求の範囲第７項記
    載の化合物。
  10. 【請求項１０】Ｒが１−メチルチオエチルであり、22-2
    3位置に二重結合が存在し、R3がメチルであり、R4とR5
    がそれぞれ水素である特許請求の範囲第１項記載の化合
    物。
  11. 【請求項１１】特許請求の範囲第１項記載の化合物を不
    活性な希釈剤または担体とともに含む、ヒトおよび動物
    における寄生虫感染症の治療および予防用組成物。
  12. 【請求項１２】液状水薬または経口製剤もしくは注射可
    能製剤としての特許請求の範囲第11項記載の組成物。
  13. 【請求項１３】動物の飼料、あるいは動物飼料に添加す
    るためのプレミックスまたは補助剤としての特許請求の
    範囲第11項記載の組成物。
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