FI90091B - Foerfarande foer producering av icke-naturliga demetylavermektiner - Google Patents
Foerfarande foer producering av icke-naturliga demetylavermektiner Download PDFInfo
- Publication number
- FI90091B FI90091B FI880280A FI880280A FI90091B FI 90091 B FI90091 B FI 90091B FI 880280 A FI880280 A FI 880280A FI 880280 A FI880280 A FI 880280A FI 90091 B FI90091 B FI 90091B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- acid
- avermectins
- avermitilis
- compound
- branched
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/22—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains four or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/10—Anthelmintics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Description
Menetelmä ei-luonnollisten demetyyliavermektiinien tuot tamiseksi 1 Q n o f· i Tämä keksintö koskee menetelmää loislääkkeinä käy-5 tettävien aineiden, so. ei-luonnollisten demetyyliavermektiinien tuottamiseksi.
US-patenteissa 4 310 519 ja 4 429 042 esitetään avermektiinejä, läheisesti yhteenkuuluvien aineiden kokonaisuutta, jolla on tehokas loisten vastainen aktiivisuus, 10 sekä näiden yhdisteiden tuottamista fermentoimalla aerobisesti Streptomyces avermitilis -kantoja, so. S. avermiti-lis -kantoja ATCC 31267, 31271 ja 31272. Kaksi viimeksi mainittua kantaa edustavat pakastettua sekä lyofilisoitua UV-säteilytyksen avulla S. avermitilis -kannasta ATCC 15 31267 saatua kantaa sisältävää putkea.
18.3.1987 julkaistussa, 16.7.1986 jätettyä US-pa-tenttihakemusta 886 867 vastaavassa EP-julkaisussa esitetään useita luonnollisten tai tunnettujen avermektiinien läheisiä sukulaisyhdisteitä (joita kutsutaan tässä ei-20 luonnollisiksi avermektiineiksi), joilla on 25-asemassaan uusi substituenttiryhmä, sekä menetelmää näiden tuottamiseksi fermentoimalla avermektiiniä tuottavaa organismia määrättyjen, spesifisten karboksyylihappojen tai näiden prekursoreiden tai johdannaisten läsnäollessa. Uusien 25 C-25-substituoitujen avermektiinien tuottamisessa käyte tyt S. avermitilis -organismit ovat S. avermitilis -kannat ATCC 31267, 31271, 31272 ja NCIB 12121. Viimeksi mainittu, EP-julkaisussa 214 731 esitetty organismi on johdettu S. avermitilis -kannasta ATCC 31271. Tällä saadaan 30 parannettuja saantoja uusia C-25-substituoituja avermek tiinejä, kun sitä viljellään puolisynteettisessä alustassa. Sekä ATCC 31267, 31271, 31272 että MCIB 12121 voivat uuden C-25-substituoidun johdannaisen lisäksi tuottaa myös vaihtelevia määriä tunnettuja tai luonnollisia aver-35 mektiinejä, joissa 25-substituentti on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli (1-metyylipropyyli).
2 Π Π f 1
Avermektiinien hiilirunko (esitetään alla olevassa kaavassa I) on asetaateista ja propionaateista johdettu ja luonnollisten avermektiinien C-25-substituentti L-isoleu-siinista (R = (S)-sek-butyyli) tai L-valiinista (R = iso-5 propyyli) [Fischer ja Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984), luku 14], "Tunnetuilla" tai "luonnollisilla" avermektiineil-lä tarkoitetaan niitä S, avermitilis -kantojen ATCC 31267, 31271 ja 31272 tuottamia avermektiinejä, joissa 25-10 aseman substituentti on joko isopropyyli tai (S)-sek-bu-tyyli (1-metyylipropyyli ). Avermektiinejä, joissa 25-ase-man substituentti on muu kuin isopropyyli tai sek-butyyli (S-muoto), kutsutaan tässä uusiksi tai ei-luonnollisiksi avermektiineiksi.
15 Yllä mainituissa US-patenteissa mainitut S. aver mitilis -kannat tuottavat ryhmää yhdisteitä, joita tässä kutsutaan yhteisnimityksellä C-076. Ryhmään kuuluu kahdeksan erillistä, mutta läheistä sukua olevaa yhdistettä, C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a ja B2b. Yhdistei-20 den "a"-sarja koostuu luonnollisista avermektiineistä, joissa 25-substituentti on (S)-sek-butyyli, ja "b"-sarja niistä, joissa 25-substituentti on isopropyyli. Merkinnät "A" ja "B" viittaavat avermektiineihin, joissa 5-substi-tuentti on metoksi tai vastaavasti hydroksi. Lopuksi nu-25 mero "1" tarkoittaa avermektiinejä, joissa on kaksoissi-dos 22 - 23-asemassa; ja numero "2" avermektiinejä, joissa on vety 22-asemassa ja hydroksi 23-asemassa.
Tässä selitysosassa ei käytetä tämänkaltaisia tunnisteita ei-luonnollisten avermektiinien 25-substituentin 30 suhteen. AI-, A2-, Bl- ja B2-tunnisteita käytetään edelleen viittaamaan ei-luonnollisiin avermektiineihin, joilla on yllä mainitut luonnollisten avermektiinien rakenteelliset ominaisuudet.
Haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuu-35 den suhteen negatiivisten mutant tien tuotantoa on esitet- 3 ^ I) f!! '\ ty bakteerille Bacillus subtilis julkaisussa Willecke ja Pardee, J. Biol. Chem. 246 (1971) 5264 - 72 sekä bakteerille Pseudomonas putida, Martin et ai., J. Bacteriology, 115 (1973) 198 - 204, muttei Streptomyces-bakteerille.
5 US-patentissa 4 285 963 kuvataan avermektiini A- johdannainen, jonka 25-asema on substituoitu metyyli- ja etyyliryhmällä ja 23-asemassa substituentti on hydroksi.
US-patentti 4 378 353 esittää C-076:n sukulaisyh-disteitä sekä näiden valmistamista viljelemällä S. aver-10 mitilis ATCC 31272:n mutanttikantaa MA-5218, joka saadaan säteilyttämällä UV-valolla. Mutanttia kutsutaan ATCC 31780:ksi. Tämän mutanttikannan tuottamista C-076:n suku-laisyhdisteistä puuttuu C-076:n furaanirengas. Lisäksi joissakin esitetyissä yhdisteissä joko toinen tai molem-15 mat oleandroosisokeriosat on pilkottu, kun taas toisissa 5-aseman ryhmä on hapetettu ketoryhmäksi.
Ruby et ai., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Unkari, 26. - 30.8. (1985), ja Schulman et ai., Antimicrobial Agents and Che-20 motherapy 31 (1987) 744 - 7, ovat esittäneet kolme ryhmää S. avermitilisin O-metyylitransferaasimutantteja, jotka tuottavat avermektiinejä, joista O-metyyliryhmät puuttuvat. Ensimmäinen ryhmä tuottaa pääosin B-avermektiinejä, koska nämä eivät pysty metyloimaan makrosyklisen lakto-25 nirenkaan C-5-hydroksyyliä. Toinen ryhmä tuottaa 3'-0, 3"-0-bis-demetyyliavermektiinejä (avermektiinejä, joiden kummastakin oleandroosimonosakkaridijäännöksestä puuttuu O-metyylisubstituentti 3-asemassa), joita kutsutaan deme-tyyliavermektiineiksi. Kolmas ryhmä ei pysty metyloimaan 30 missään asemassa.
Julkaisussa Schulman et ai.. Fed. Proc. 44 (1985) 931 esitetään parannettua B-avermektiinituotantoa fermen-toimalla S. avermetilis -kantaa sinefungiinin, S-adeno-syylitioniinin ja S-adenosyylihomokysteiinin kaltaisten 35 yhdisteiden läsnäollessa, jotka inhiboivat aglykoniryhmän 4 '· r| O f ; C-5-hydroksiryhmän metylointia avermektiini-B-O-metyyli-transferaasientsyymin avulla. Streptomyces avermitilis -mutantteja, joista O-metyylitransferaasiaktiivisuus puuttuu, ja jotka tuottavat kohonneita määriä B-avermek-5 tiiniyhdisteitä on esitetty myös julkaisussa Schulman et ai., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29 (1986) 620 - 624.
Julkaisussa Schulman et ai., J. Antibiot. 38(11), (1985) 1494 - 1498 esitettiin, että S. avermitilis -kanta 10 Agly-1, mutanttikanta, joka tuottaa pääosin vain avermek-tiiniaglykoneja Ala ja A2a, tuotti kohonneita määriä avermektiiniaglykoni B-yhdisteitä fermentoinnissa, jossa sinefungiini on läsnä. Samaten tehokas avermektiinituottaja, S. avermitilis 08 -kanta, tuotti avermektiinejä, 15 joista O-metyyliryhmät aglykonin 5-asemasta ja oleandroo-sidisakkaridiosasta puuttuivat, kun sitä fermentoitiin O-metyylitransferaasi-inhibiittorin, sinefungiinin, läsnäolossa.
Myös julkaisussa Chemical Abstracts, voi 107 20 (1987) 55462k kuvataan demetyyliavermektiinien valmistus menetelmiä, eristämistä ja karakterisointia. Patenttijulkaisussa FI-C-57 781 kuvataan menetelmä luonnollisten avermektiininen valmistamiseksi.
Mutageneesin avulla saadaan S. avermitilis -mu-25 tantteja, joista puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehyd-rogenaasin aktiivisuus. Näillä mutanteilla ei enää ole kykyä tuottaa huomattavia määriä luonnollisia avermektiinejä, kun läsnä ei ole lisättyä R-COOH-yhdistettä, jossa R on isopropyyli tai (S)sek-butyyli, tai fermen-30 tointiprosessin aikana R-C00H:ksi muuttuvaa yhdistettä. Yllättävästi ja odottamattomasti on kuitenkin todettu, että nämä mutantit tuottavat luonnollisia ja ei-luonnol-lisia avermektiinejä, jos fermentointi suoritetaan lisätyn R-COOH-yhdisteen, jossa R on isopropyyli tai (S)-sek-35 butyyli tai muu tässä esitetty ryhmän tai R-COOH-yhdis- 5 v n o i'-· *i teen prekursorin läsnäollessa. On jopa yllättävämpää, että tässä esitetyt mutantit, joilta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus ja jotka eivät pysty hajottamaan L-isoleusiinia tai L-valiinia, pystyvät assi-5 miloimaan laajan yhdisteryhmän avermektiinien biosyntee-sireittiin, jolloin muodostuu ei-luonnollisia avermektii-nejä, joiden seassa ei ole luonnollisia avermektiinejä.
Luonnolliset avermektiinit tuotetaan, kuten on mainittu, kompleksisena kahdeksan erillisen, mutta lähei-10 sesti toisiinsa liittyvän yhdisteen seoksena; kaava I, R on isopropyyli ja (S)-sek-butyyli. Vaikka niitä onkin saatu talteen pääosin puhtaassa muodossa (ks. US-patentti 4 429 042), tämä menetelmä on parhaimmillaankin työläs. Ei-luonnollisten avermektiinien tuottaminen EP-patentti-15 hakemuksen 214 731 mukaista menetelmää käyttäen voi myös johtaa joidenkin luonnollisten avermektiinien muodostumiseen vaihtelevina määrinä, mikä johtuu haarautuneen 2-ok-sihapon dehydrogenaasin ja L-valiini- ja L-isoleusiini-aminohappojen läsnäolosta tuotannossa käytetyn S. aver-20 mitilis -mikro-organismin solussa. Ennestään tunnettujen S. avermitilis -kantojen viljely S-adenosyylimetioniini-analogin, sinefungiinin, läsnäollessa tuottaa A- ja B-sarjan demetyyliavermektiinejä.
Mahdollisuus valita, tuotetaanko luonnollisia tai 25 ei-luonnollisia avermektiinejä, jolloin tuotteiden määrä ja kompleksisuus minimoidaan ja täten nostetaan valitun avermektiinin puhtautta, jolloin erotusmenetelmät yksinkertaistuvat, on haluttu päämäärä.
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää parasiit-30 tisidisten demetyyliavermektiinien valmistamiseksi, joil la on kaava 6 u Π O f. 'i R1 C"3 22^k^CH3 r2VJV^V°^n I 25
5 T R
3 I O I (I)
S V
I OH
10 (l) °— ch3 OR3 15 jossa katkoviiva asemassa 22 - 23 edustaa mahdollista kak-soissidosta; R1 on H tai OH ja kaksoissidos puuttuu, tai kaksoissidos esiintyy ja R1 puuttuu; R on α-haarautunut C3_ e-alkyyli, -alkenyyli tai -alkyylitioalkyyliryhmä; C5_8-syk-20 loalkyylialkyyliryhmä, jossa alkyyliryhmä on a-haarautunut C2_5-alkyyli ryhmä; C3.8-sykloalkyyli- t^i C5.8-sykloalkenyyli-ryhmä, joista kumpi tahansa voi mahdollisesti olla substi-tuoitu yhdellä tai useammalla C^-alkyyliryhmällä; tai 3 -6 -jäseninen, happea tai rikkiä sisältävä heterosyklinen 25 rengas, joka voi olla tyydyttynyt tai kokonaan tai osittain tyydyttymätön ja joka mahdollisesti voi olla substi-tuoitu yhdellä tai useammalla C^-alkyyliryhmällä; sillä rajoituksella, että kun R on alkyyli, se ei ole isopropyy-li eikä sek-butyyli; R2 on disakkaridiryhmä, jolla on kaava 30 ch3 ch3 »
RO RO
7 c> n n v ί jossa R4 ja R5 ovat vetyjä tai metyylejä, jolloin kuitenkin vähintään toinen niistä on vety; ja R3 on vety tai metyyli, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että fer-mentoidaan aerobisissa olosuhteissa sinefungiinin läsnä-5 ollessa Streptomyces avermitilis -kantaa, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, vesipohjaisessa viljelyalustassa, joka sisältää assimiloitavan typpilähteen, hiililähteen sekä epäorgaanisia suoloja 10 ja yhdistettä, jolla on kaava
R-COOH
tai yhdistettä, jonka S. avermitilis pystyy muuttamaan 15 mainituksi hapoksi, jolloin R on edellä määritelty.
S. avermitilis -kannat, joilta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, tuotetaan muta-toimalla avermektiiniä tuottavia S. avermitilis -kantoja 20 ja erityisesti mutatoimalla S. avermitilis -kantoja ATCC 31267, 31271, 31272 tai NCIB 12121. Mutantit eivät pysty syntetisoimaan luonnollisia avermektiinejä, paitsi jos fermentointialustaan lisätään rasvahappoa tai sen prekur-soria, jossa on isopropyyli tai sek-butyyli (S-muoto). Ne 25 pystyvät tuottamaan luonnollisia ja ei-luonnollisia avermektiinejä, jos niitä fermentoidaan aerobisissa olosuhteissa vesipohjaisessa viljelyalustassa, jossa on asianomainen lähtöhappo tai fermentointiprosessissa täksi muuttuva yhdiste. Kun fermentointi suoritetaan keksinnön 30 mukaisesti sinefungiinin läsnäollessa, tuotetaan demety-loituja A- ja B-avermektiinejä, joista puuttuu toinen tai molemmat metoksiryhmät disakkaridiosan 3’- ja/tai 3"-ase-masta, jolloin sanotussa asemassa on yksi tai useampi hydroksiryhmä.
35 Mutantit, joille haarautuneen 2-oksihapon dehydro- genaasiaktiivisuuden puute on tunnusomaista, eristetään 8 <) n o: Ί mutagenoiduista pesäkkeistä 14C02-menetelmää käyttäen. Tässä menetelmässä 14C02:n muodostumisen puute permeabili-soiduissa soluissa substraatin ollessa [14C-1]-2-oksi-iso-kapronihappo tai [14C-1]-2-okso-3-metyylivaleriaanahappo 5 tai [14C-1]-2-okso-3-metyylivoihappoa on osoitus haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasin puutteesta.
Oli yllättävää ja odottamatonta, että esitetyillä mutanteilla, joilta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon de-hydrogenaasiaktiivisuus, edelleen on kyky tuottaa aver-10 mektiinejä, erityisesti ei-luonnollisia avermektiinejä sekä sinefungiinin läsnäollessa demetyyliavermektiinejä. Mutanttien kyvyttömyys tuottaa luonnollisia rasvaasyyli-koentsyymi-A-johdannaisia, kun niitä viljellään tavanomaisilla alustoilla, olisi voinut muodostua letaaliksi 15 mutaatioksi, mikäli membraanien koskemattomuus olisi riippuvainen sanotuista johdannaisista tai jos mutaation aiheuttama 2-oksihapon akkumuloituminen johtaisi sytotok-sisuuteen. Ei myöskään ollut odotettavissa, että mutantit olisivat pystyneet syntetisoimaan asetyyli-CoA:ta ja pro-20 pionyyli-CoA:ta L-isoleusiinista ja L-valiinista degrada-tiivisen metabolian avulla, koska tämä vaatii entsyymiaktiivisuutta, jota mutanteilta puuttuu. Näiden asyyli-CoA--johdannaisten yllä mainittu tarve avermektiinibiosyntee-sissä johti olettamukseen, että mutantit olisivat pahasti 25 toimintakyvyttömiä ei-luonnollisten avermektiinien tuotan non suhteen, mikä yllättävästi ei kuitenkaan pitänyt paikkaansa.
Käsitteitä "avermektiini" tai "avermektiinit" käytetään tässä tarkoittaen alla olevan kaavan I mukaisia yh-30 disteitä, joissa 25-substituentti (R) voi olla mikä tahan sa ryhmä, jota esillä olevan keksinnössä käytetty S. ave-rmitilis assimiloi sanotussa asemassa. Käsitettä "demetyy-liavermektiinit" käytetään tässä kuvaamaan A- ja B-tyyp-pisiä avermektiinejä, joissa toinen tai molemmat disakka-35 ridin 3'- tai 3"-asemista on substituoitu hydroksilla eikä metyylillä.
9 9 Π G S1
Esillä olevassa keksinnössä käytetyt mutantit ovat hyvin arvokkaita ei-luonnollisten avermektiinien tuottamisessa käyttäen tässä esitettyjä ja kuvattuja menetelmiä. Ne ovat erityisen arvokkaita, kun tuotetaan halut-5 tuja demetyyliavermektiinejä, so. yhdisteitä, joissa C-25-substituentti on C1.4-alkyyliryhmällä mahdollisesti substituoitu C4.6-sykloalkyyli tai -sykloalkenyyli; 1-me-tyylitioetyyli tai 5- tai 6-atominen, happea tai rikkiä sisältävä heterosyklinen ryhmä, erityisesti 3-tienyyli tai 10 3-furyyli.
Streptomyces avermitilis -lajiin kuuluvan, aver-mektiiniä tuottavan organismin mutaatio suoritetaan tunnettujen menetelmien mukaisesti käyttäen mitä tahansa useista mahdollisista mutaation aiheuttajista, kuten UV-15 säteilytys, röntgensäteilytys, N-metyyli-N'-nitro-N-nit- rosoguanidiini, etyylimetaanisulfonaatti, typpihapoke ja typpisinapit, kuten N-metyyli-bis-(2-kloorietyyliJämiini, tai vastaavia käsittelyjä. Mutageneesi voidaan suorittaa käyttäen itiöitä tai vegetatiivisia S. avermitilis -vil-20 jelmiä, jotka pystyvät tuottamaan luonnollisia avermek- tiinejä, esim. S. avermitilisia ATCC 31272.
Käyttäen menetelmiä, jotka alan asiantuntijat hyvin tuntevat, mutagenoidut pesäkkeet valikoidaan haarautuneen 2-oksihappodehydrogenaasin puutteen perusteella 25 käyttäen biokemiallista testimenetelmää, joka mahdollis taa suuren, sattumanvaraisesti mutagenoidun bakteeripesä-kemäärän seulonnan haarautuneista [ 14C—1]-1-oksihapoista peräisin olevan 14C02-tuotannon suhteen [Tabor et ai., J. Bact. 128 (1976) 485 - 486].
30 Menetelmässä mutanttipesäkkeitä viljellään mikro- tiitterilevyn kuopissa sopivassa ravintoalustassa, solut permeabilisoidaan tolueenilla, minkä jälkeen lisätään [ 14C-1]-2-oksihappoa (esim. 2-oksi-isokapronihappoa) jokaiseen kuoppaan ja tarkistetaan mahdollinen 14C02:n fer-35 mentointi. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää [14C-1]-2-ok- si-3-metyylivaleriaanahappoa tai [ 14C-1]-2-oksi-3-metyy- ίο <,η0?·ϊ livoihappoa [14C-1]-2-oksi-isokapronihapon tilalla. 14C02:n muodostuminen voidaan yksinkertaisesti tarkistaa sijoittamalla kostea, Ba(0H)2:lla kyllästetty suodatinpaperi jokaisen kuopan yläpuolelle, jotta mahdollisesti vapautu-5 nut 14C02 jää sen alle, ja mahdollinen Ba14C03 detektoidaan autoradiografiän avulla. Mutantit, joista haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus puuttuu, antavat au-toradiogrammin, joka vastaa tyhjökontrollia; so. mutantit eivät tuota Ba14C04:a.
10 Esillä olevassa keksinnössä käytettyjen mutanttien morfologia ja viljelyominaisuudet ovat yleisesti ottaen US-patentissa 4 429 042 esitetyt. Mutanttien tunnusomainen ominaisuus on haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaa-siaktiivisuuden puute, joka ominaisuus määritetään, kuten 15 tässä esitetään. Sanotun aktiivisuuden puuttuminen johtaa siihen, etteivät mutantit pysty tuottamaan luonnollisia avermektiinejä, kun niitä viljellään määrätyllä alustalla, josta pääosiltaan puuttuvat rasvahapot R-COOH, joissa R on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli, tai yhdisteet, joista 20 fermentoinnin avulla muodostuu R-COOH. American Type Culture Collection -talletuslaitoksen suorittama taksonominen tutkimus vahvisti, että yllä mainitun 14C02-testin avulla valikoidut mutanttikannat 1-3 ja HL-026 ovat erittäin läheistä sukua US-patentissa 4 429 042 esitetylle alkuperäi-25 selle ATCC 31272 kannalle, mutta muutamia eroavuuksia löytyy. Täten mutanttikanta 1-3 (ATCC 53567) muodostaa harvempia itiöketjuja kuin ATCC 31272 ja mutanttikannasta HL-026 (ATCC 53558) puuttuu lähes kokonaan ilmamyseeli ja itiöt, mutta ne hyvin harvat itiöketjut, joita se muodos-30 taa, ovat verrannollisia ATCC 31272:n muodostamiin itiö-ketjuihin. Mutantti HL-026:11a on myös hyvin kyseenalainen kyky käyttää hyväkseen raffinoosia ainoana hiililähteenä, kun taas ATCC 31272 -kanta ja mutanttikanta 1-3 pystyvät hyödyntämään raffinoosia. (Keksinnön tekijöiden suoritta-35 missä kokeissa raffinoosi ei ylläpitänyt minkään kannan kasvua.) Lisäksi mutanttikannan HL-026 ominaisuuksia on 11 ^ΠΓΗ'; se, että se tuottaa vähemmän melaniinipigmenttiä verrattuna kahteen muuhun kantaan eikä tuota sitä ollenkaan ty-rosiiniagarilla. Päinvastoin kuin US-patentissa 4 429 042 ATCC 31272:n suhteen esitettiin, mutanttien tai ATCC 5 31272:n kasvua ei pystytty toteamaan käyttäen sakkaroosia ainoana hiililähteenä.
Streptomyces avermitilis -kannat 1-3 ja HL-026 on tallennettu Budapestin sopimuksen mukaisesti American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, Rockville, 10 Maryland, USA, tunnettuun talletuslaitokseen, jossa tallennettujen kantojen pysyvyys on taattu ja josta ne ovat yleisesti saatavina, mikäli keksinnölle myönnetään patenttisuoja. Niille annettiin tunnisteet Streptomyces avermitilis ATCC 53567 ja vastaavasti 53568.
15 Kun esillä olevassa keksinnössä käytettäviä mu- tantteja fermentoidaan asianmukaisia lähtöyhdisteitä sisältävässä ravintoalustassa, ne tuottavat kaavan I mukaisia yhdisteitä tai useimmiten ne muodostavat seosta, joka sisältää kahta tai useampaa kaavan I mukaista yhdistettä, 20 jossa R vastaa käytettyä lähtöyhdistettä. Täten voidaan tuottaa jopa neljä lopputuotetta, joita tarkoituksenmukaisesti ja yksinkertaisesti kutsutaan R-avermektiineiksi AI, A2, B1 ja B2 US-patentin 4 429 042 mukaista kuvausta käyttäen. "R"-ryhmä viittaa tietenkin C-25-substituenttiin. 25 Esimerkiksi, kun R on syklopentyyli, mahdolliset neljä . . avermektiiniä ovat:
Triviaalinimi R1 R^ syklopentyyli- 30 avermektiini AI kaksoissidos CHg syklopentyyli- avermektiini A2 hydroksi CH^ 35 syklopentyyli-
avermektiini B1 kaksoissidos H
syklopentyyli-
avermektiini B2 hydroksi H
12 ‘’Π0!·Ί
Sinefungiinin läsnäollessa tuotetaan vastaavia de-metyyliavermektiinejä. Alentunut demetyyliavermektiini-A-tuotanto ja kohonnut demetyyliavermektiini-B-tuotanto on yleisesti todettavissa.
5 Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa on kaksois- sidos ja OH-ryhmä puuttuu, voitaisiin vaihtoehtoisesti valmistaa dehydratoimalla vastaavaa kaavan I mukaista yhdistettä, jossa R1 on OH ja josta kaksoissidos puuttuu. Reaktio suoritetaan siten, että hydroksiryhmät asemista 5 10 ja 4" ensin suojataan selektiivisesti, esim. t-butyylidi-metyylisilyylioksiasetyylijohdannaisina, ja saatetaan sen jälkeen reagoimaan substituoidun tiokarbonyylihalogeni-din, kuten 4-metyylifenoksitiokarbonyylikloridin kanssa, minkä jälkeen suoritetaan dehydratointi kuumentamalla 15 liuottimessa, jonka kiehumispiste on korkea, esim. tri-k-looribentseenissä. Lopuksi tuotteesta poistetaan suojaus, jolloin saadaan tyydyttymätön yhdiste. Nämä vaiheet ja siihen soveltuvat reagenssit ja reaktio-olosuhteet on kuvattu US-patentissa 4 328 335.
20 Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R3 on H, voi taisiin myös valmistaa vastaavasta yhdisteestä, jossa R3 on CH3, käyttäen demetylointia. Tämä reaktio suoritetaan käsittelemällä 5-metoksiyhdistettä tai sen sopivaa suojattua johdannaista elohopea-asetaatilla ja hydrolysoi-25 maila saatu 3-asetoksienolieetteri laimennetulla hapolla, jolloin saadaan 5-ketoyhdiste. Tämä pelkistetään tämän jälkeen käyttäen esim. natriumboorihydridiä, jolloin saadaan 5-hydroksijohdannainen. Näiden vaiheiden sopivat reagenssit ja reaktio-olosuhteet on esitetty US-patentis-: 30 sa 4 423 209.
Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R1 on H ja kaksoissidos puuttuu, voidaan valmistaa vastaavasta yhdisteestä, jossa on kaksoissidos, josta R1 puuttuu, selektiivisen katalyyttisen hydrogenoinnin avulla käyttäen sopivaa 35 katalyyttiä. Pelkistys voidaan esimerkiksi suorittaa käyt-
13 Q Π G
täen tris(trifenyylifosfiini)rodium(I)kloridia, kuten EP-julkaisussa 0 001 689 ja sitä vastaavassa, 22.4.1980 myönnetyssä US-patentissa 4 199 569 on esitetty.
Esillä olevassa keksinnössä käytettävät S. aver-5 mitilis -kannat pystyvät hyödyntämään kaavan R-C00H mukaisia yhdisteitä sekä yhdisteitä, joita voidaan muuttaa R-COOH-yhdisteiksi fermentointiprosessin aikana, kaavan I mukaisten demetyyliavermektiinien biosynteesissä. Näitä yhdisteitä kutsutaan tässä "lähtöyhdisteiksi".
10 Edullisia R-COOH:ksi fermentointiprosessissa muu tettavissa olevia yhdisteitä, so. prekursoreita, ovat yhdisteet, joilla on kaava R- ( CH2 )n-Z (II-B) 15 jossa R on edellä määritelty; n on 0, 2, 4 tai 6; ja Z on CH20H, -CHO, -C00R5, -CH2NH2 tai -CONH2, jolloin R5 on H tai Cx_6-alkyyli, esim. -CH(C00H)CH2C00H, -CH(COOH) (CH2)2COOH ja -CH(COOH)(CH2)2SCH3, tai, jos S. avermitilis -kannalta puut-20 tuu vain haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, R-COOH-substraatiksi muutettavissa oleva yhdiste on R-CO-Z.
Ryhmä R-COOH voi olla myös kaavan II-A mukaisten yhdisteiden isomeerimuoto sekä yhdiste, joka voidaan 25 muuttaa siksi fermentointiprosessin aikana.
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan fermentoimalla aerobisesti sinefungiinin läsnäollessa S. avermitilis -kantaa, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasiaktiivisuus vesipohjaisessa ra-30 vintoalustassa, joka sisältää assimiloitavaa typpeä, hiiltä, epäorgaanista suolaa ja kaavan R-C00H mukaista yhdistettä tai sanotuksi yhdisteeksi fermentoinnin aikana muutettavaa yhdistettä (so. prekursoria). Happo tai hapoksi muutettava yhdiste lisätään fermentointiin joko siirros-35 tuksen yhteydessä tai määräajoin fermentoinnin aikana. Se 14 voidaan lisätä kaikki kerrallaan tai annoksittain fermen-toinnin aikana. Avermektiiniyhdisteiden muodostumista voidaan seurata ottamalla näytteitä fermentoinnista, uuttamalla orgaanisella liuottimena ja seuraamalla tuotteen 5 ilmentymistä kromatografiän avulla, esimerkiksi käyttäen korkeapainenestekromatografiaa. Inkuboidaan, kunnes tuotteen saanto on maksimoitu, yleensä noin 4-15 vuorokautta.
Lähtöyhdistettä (karboksyylihappoa tai karboksyy-10 lihapoksi muuttuvaa yhdistettä) lisätään joka kerta edullisesti noin 0,05 - 3,0 g litraa kohden. Lähtöyhdistettä voidaan lisätä fermentointiin jatkuvasti, jaksoittain tai kaikki kerrallaan. Happoa (R-COOH) lisätään sellaisenaan tai suolana, kuten natrium-, litium- tai ammoniumsuolana, 15 tai yhdisteenä, joka on muutettavissa hapoksi kuten yllä määritettiin. Jos happo on kiinteässä muodossa, se liuotetaan edullisesti sopivaan liuottimeen, kuten veteen tai C1.4-alkoholiin.
Sinefungiini lisätään fermentointiin sellaisella 20 aikavälillä ja sellaisina määrinä, ettei mikro-organismin kasvu häiriinny. Käytännössä voidaan käyttää suuruusluokkaa 0,01 - 1,0 mM määriä. Tämänkaltaisia määriä voidaan lisätä fermentaatioon edullisesti 24 - 168 tunnin kuluttua inokulaatiosta. Suosittuja ja edullisia määriä ovat 25 0,05 - 0,50 mM sekä vastaavasti 0,05 - 0,25 mM.
Fermentoinnissa käytetty alusta voi olla tavanomainen alusta, jossa on assimiloitavaa hiiltä, typpeä ja hivenaineita. On kuitenkin edullista käyttää fermentoin-tialustaa, josta puuttuu valittuja aineosia tai jossa 30 esiintyy vain vähäisiä määriä lähtöyhdisteitä, joissa R-ryhmä on isopropyyli tai (S)-sek-butyyli.
Kun fermentointia on jatkettu useita vuorokausia lämpötilassa, joka edullisesti on suuruusluokkaa 24 -33 °C, fermentointiliuos sentrifugoidaan tai suodatetaan 35 ja myseelikakku uutetaan edullisesti asetonilla tai meta- 15 Qr]Qc' nolilla. Liuotinuutos väkevöidään ja haluttu tuote uutetaan tämän jälkeen veteen sekoittumattomaan orgaaniseen liuottimeen, kuten metyleenikloridiin, etyyliasetaattiin, kloroformiin, butanoliin tai metyyli-isobutyyliketoniin.
5 Liuotinuutos väkevöidään ja raakatuote puhdistetaan vielä tarvittaessa kromatografiän avulla, esimerkiksi prepara-tiivisella käänteisfaasi-HPLC-kromatografiällä.
Tuote saadaan yleensä seoksena, jossa on kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R2, joko R4 tai R5 tai molem-10 mat ovat vetyjä; R1 on OH ja kaksoissidos puuttuu tai R1 puuttuu, jolloin esiintyy kaksoissidos; ja R3 on H tai CH3. Suhteet voivat kuitenkin vaihdella käytetystä mutan-tista ja lähtöyhdisteestä sekä jossain määrin käytetystä sinefungiinimäärästä ja käytetyistä olosuhteista riippuen. 15 R-ryhmän lähteet ovat samantekeviä demetyyliaver- mektiinien muodostumiselle, so. ei ole väliä, tuleeko se suoraan R-C00H:sta tai muodostuuko se yllä mainitusta pre-kursorista. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä kriittinen vaatimus näiden muodostumiselle on se, että 20 haluttu R-ryhmä fermentointiprosessin aikana on S. aver-mitilis -kannan saatavilla.
Sopivia yhdisteitä ovat: 2,3-dimetyylivoihappo 2-metyyliheksaanihappo 25 2-metyylipent-4-eenihappo 2- syklopropyy1ipropionihappo 4-metyleenisykloheksaanikarboksyylihappo 3- metyylisykloheksaanikarboksyylihappo (cis/trans) 1-syklopenteenikarboksyylihappo 30 1-syklohekseenikarboksyylihappo tetrahydropyraani-4-karboksyy1i happo tiofeeni-2-karboksyylihappo 3-furaanihappo syklobutaanikarboksyylihappo 35 syklopentaanikarboksyylihappo 16 Ci Π Ο ί Ί sykloheksaanikarboksyylihappo sykloheptaanikarboksyylihappo 2- metyylisyklopropaanikarboksyylihappo 3- syklohekseeni-l-karboksyylihappo 5 2-metyylitiopropionihappo 2- metyyli-4-metoksivoihappo tiofeeni-3-karboksyylihappo hydroksimetyylisyklopentaani 3- tiofeenikarboksialdehydi 10 3-sykloheksyylipropionihappo 3-syklopentyylipropionihappo hydroksimetyylisyklobutaani tetrahydrotiofeeni-3-karboksyylihappo 3-syklopentyy1i-1-propanoli 15 3-metyylisyklobutaanikarboksyylihapon litiumsuola 3- metyleenisyklobutaanikarboksyylihapon litiumsuola 2-metyyli-4-metyylitiovoihappo tetrahydrotiopyraani-4-karboksyylihappo syklobutyy1imetyy1i ami ini 20 etyylisyklobutaanikarboksylaatti 4- hydroksimetyylisyklopenteeni 2-(3-tiofeenikarbonyyli)propionihapon etyyliesteri (S)-2-metyylipentaanihappo (R)-2-metyylipentaanihappo 25 O-metyylitransferaasimutantit voidaan johtaa tässä esitetyistä haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasinega-tiivisista mutanteista. Mutantit, joissa on mutaatio haarautuneen 2-oksihapon dehydrogeenasin aktiivisuudessa, yhdistetään yhteen tai useampaan O-metyylitransferaasi-30 mutaatioon, jolloin saadaan S. avermitilis -kantoja, jot ka tuottavat pääosiltaan B-avermektiinejä, demetyyliaver-mektiinejä tai demetyyliavermektiini-B-yhdisteitä, kun niille syötetään R-COOH-yhdisteitä tai R-COOH-yhdisteiksi muutettavia yhdisteitä fermentointiprosessin aikana. Sa-35 notut mutantit saadaan mutagenoimalla tässä esitettyjä mu- 17 on Oi ': tenttejä, joista puuttuu haarautuneen 2-oksihapon de-hydrogenaasiaktiivisuus käyttäen UV-valoa ja/tai kemiallisia mutageenejä, kuten N-metyyli-N-nitrosouretaania, nitrosoguanidiiniä, etyylimetaanisulfonaattia tai muuta 5 yllä esitettyä ainetta. Vaihtoehtoisesti haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasipositiivista mutanttia, josta puuttuu toinen tai molemmat O-metyylitransferaasit, voidaan mutatoida UV-valokäsittelyllä tai mutagenoivalla aineella, jolloin saadaan haarautuneen 2-oksihapon dehydro-10 genaasinegatiivisia ja/tai haarautuneen aminohapon trans- aminaasinegatiivisia mutantteja.
Tämänkaltaisten mutanttien tuottamia ei-luonnolli-sia avermektiineja karakterisoi se, että niillä on hydrok-siryhmiä aglykoniosan C-5-asemassa ja/tai oleandroosiosien 15 C-3'- ja/tai C-3"-asemissa.
Yllä kuvatut mutantit tunnistetaan julkaisussa Schulman et ai., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29 (1986) 620 - 624, esitetyn menetelmän mukaisesti. Ne ovat käyttökelpoisia samoihin tarkoituksiin ja samalla tavalla 20 kuin tunnetut avermektiinit.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat hyvin aktiivisia parasiittien vastaisia aineita, joiden käyttökelpoisuus on erityisen hyvä matolääk-keenä, ulkoloisten myrkkynä, hyönteismyrkkynä ja punkkien 25 tuhoaineena.
Täten yhdisteet ovat tehokkaita hoidettaessa erinäisiä sisäloisten aiheuttamia tauteja, kuten erityisesti matotautia, jota yleensä aiheuttaa ryhmä parasiittisia sukkulamatoja ja joka voi aiheuttaa suurtakin taloudellis-30 ta tappiota sika-, lammas-, hevos- ja karjataloudessa sekä voi myös aiheuttaa tauteja kotieläimille ja linnuille. Yhdisteet ovat myös tehokkaita muita sukkulamatoja vastaan, jotka tartuttavat eri eläinlajeja, kuten esimerkiksi Dirofilaria koirilla, ja erilaisia ihmisiä tartuttavia 35 parasiitteja, kuten suolistoparasiitit Ancylostoma, Neca- is no*'.
tor, Ascaris, Strongyloides, Trinchinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, ja verestä ja muista kudoksista löydettyjä parasiitteja, kuten rihmamatoja ja suolistonul-koisia Strongyloides ja Trichinella -muotoja vastaan.
5 Yhdisteet ovat myös arvokkaita ulkoloisten aiheut tamien infektioiden hoidossa, erityisesti eläinten ja lintujen niveljalkaisia ulkoloisia, kuten puutiaisia, punkkeja, täitä, kärpäsiä, raatokärpäsiä, purevia hyönteisiä sekä karjaa ja hevosia tartuttavia liikkuvia kärpästoukkia, 10 vastaan.
Yhdisteet ovat myös aktiivisia hyönteismyrkkyjä kotitalouksien tuhoeläimiä, kuten torakkaa, koita, tur-kiskuoriaista ja huonekärpästä, vastaan ja niitä voidaan käyttää varastoidun viljan viljelykasvien tuholaisia, ku-15 ten kirvoja, lehtitäitä, toukkia ja liikkuvia suorasiipi-siä, kuten heinäsirkkoja, vastaan.
Kaavan I mukaisia yhdisteitä annetaan määrättyyn käyttötarkoitukseen ja määrätylle hoidettavalle isäntä-eläinlajille tai kyseessä olevalle loiselle tai hyöntei-20 selle soveltuvana formulaationa. Matolääkkeenä yhdisteet voidaan antaa oraalisesti kapselina, boluksena, tablettina tai nestemäisenä pakkolääkityksenä, tai ne voidaan vaihtoehtoisesti antaa ruiskeena tai siirrännäisenä. Tämänkaltaiset formulaatiot valmistetaan käyttäen tavan-25 omaisia menetelmiä tavanomaista eläinlääketieteellistä käytäntöä noudattaen. Täten kapselit, bolukset tai tabletit voidaan valmistaa sekoittamalla aktiivinen aineosa sopivaan hienojakoiseen laimentavaan aineeseen tai kantajaan, joka lisäksi sisältää hajottavaa ainetta ja/tai si-30 tovaa ainetta, kuten tärkkelystä, laktoosia, talkkia, mag-nesiumstearaattia jne. Nestemäinen pakkolääkitysformulaa-tio voidaan valmistaa dispergoimalla aktiivinen aineosa vesipohjaiseen liuokseen yhdessä dispergoivan tai kosteuttavan aineen ja muun kanssa ja injisoitavat formulaatiot 35 voidaan valmistaa steriileinä liuoksina, joissa voi olla 19 (ϊΠθ! muitakin aineita, kuten esimerkiksi tarpeellinen määrä suolaa tai glukoosia, jotta liuoksesta tulee isotoninen vereen nähden. Nämä formulaatiot vaihtelevat aktiivisen aineosan painon suhteen riippuen hoidettavasta isäntä-5 eläinlajista, infektion voimakkuudesta ja tyypistä sekä isäntäorganismin ruumiinpainosta. Oraalisesti annettuna noin 0,001 - 10 mg/kg eläimen painoa yksittäisannoksena tai jaettuna annoksina noin 1-5 vuorokauden aikana, on yleensä tyydyttävä annos, mutta tietenkin voi esiintyä 10 tilanteita, joissa korkeammat tai matalammat annosrajat ovat tarpeellisia ja nämäkin kuuluvat tämän keksinnön piiriin.
Vaihtoehtoisesti yhdisteet voidaan antaa sekoitettuna eläimen ruokaan ja tätä tarkoitusta varten voidaan 15 valmistaa ruokaan lisättävä tiiviste tai ns. premix, jota sekoitetaan eläimen normaaliin ruokaan.
Hyönteismyrkkynä tai maataloustuholaismyrkkynä yhdisteet käytetään sumutteena, pölynä, emulsiona tai vastaavana, tavanomaista maataloudellista käytäntöä noudat-20 taen.
S. avermitilis 1-3 -kannan (ATCC 53567), jolta puuttuu haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasi, tuottaminen_
Vaihe 1: S. avermitilisia ATCC 31272, kasvatettiin . 25 yhtenäiseksi matoksi New Patch Agar -alustalla 12 vuoro kautta 30 °C:ssa. Alustan koostumus oli: V-8 vihannesmehu* 200 ml
CaCOg 3 g agar 15 g 30 H20 ad 1 000 ml ravintoliemi 1,0 g/1 natriumasetaatti · 3H20 1,4 g/1 isovaleriaanahappo 50 mg/1 isovoihappo 50 mg/1 35 2-metyylivoihappo 50 mg/1 20 ('/Πθ!;'ί isoleusiini 250 mg/1 leusiini 250 mg/1 vallini 250 mg/1 hivenaineliuos** 1 ml/1 5 * Kahdeksan vihannesmehun seos (tomaatti, porkkana, selleri, sokerijuurikas, persilja, salaatti, vesikrassi ja pinaatti) + suolaa, askorbiinihappoa, sitruunahappoa, ja luonnollisia makuaineita. Saatavana Campbell Soup Companyltä, Camden, NJ.
10 ** Hivenaineliuoksen koostumus:
FeCl3-6H20 2,7 g
MnS04-H20 4,2
CuS04*5H20 0,5
CaCl2 11,0 15 H3B03 0,62
CoCl2«6H20 0,24
ZnCl2 0,68
Na2Mo04 0,24
Yllä olevat aineet liuotetaan 1 litraan 0,1 N HC1.
20 Kolmelta maljalta kerättiin itiöitä, jotka suspen- doitiin 20 ml:aan 0,5 M tris-malonihappopuskuria, pH 9,0.
Vaihe 2: 10 ml itiösuspensiota lisättiin putkeen, jossa oli 10 mg N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinia (NTG). Putkea inkuboitiin ja ravisteltiin 28 °C:ssa 60 mi-25 nuuttia ja itiöt pestiin runsaassa l-%:isessa NaCl-liuok-sessa.
Vaihe 3: Pestyt itiöt suspendoitiin l-%:iseen NaCl:iin ja sekoitettiin samaan tilavuuteen 80-%:ista ety-leeniglykolia. Tätä suspensiota säilytettiin -20 °C:ssa ja 30 käytettiin solulähteenä, kun mutantit seulottiin. Idätettäessä saatiin noin 104 pesäkettä/ml.
Itiökanta levitettiin YPD-maljoille siten, että saatiin noin 100 pesäkettä maljaa kohden (YPD-alusta sisältää 10 g/1 hiivauutetta, Bacto-peptonia* ja dekstroo-
21 f) Π Of·' I
sla; sekä 15 g/1 Bacto-agaria*, pH säädettiin arvoon 6,9 ennen autoklavointia). Tähdellä merkityt aineosat ovat kaupallisesti saatavina Difco Laboratories -yhtiöstä, Detroit, Michigan 48238, USA.
5 Vaihe 4; Yksittäisiä pesäkkeitä poimittiin mal joilta 2-3 viikon kasvatuksen jälkeen 28 °C:ssa ja siirrettiin omiin kuoppiin tavanomaiselle 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle. Pieni osa jokaista pesäkettä siirrettiin myös tuoreelle agaralustalle käytettäväksi elävien 10 solujen lähteenä, kun mutantteja tunnistettiin.
Vaihe 5: Jokaiseen kuoppaan lisättiin noin 75 mik-rolitraa nestemäistä M9-suola-alustaa, joka sisälsi 1 % glukoosia, 0,1 % kasaminohappoja ja 0,01 % isovaleriaana-happoa, isovoihappoa ja 2-metyylivoihappoa. Inkuboitiin 15 useita vuorokausia 28 °C:ssa, minkä jälkeen solut testattiin haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasin suhteen. (M9-suola-alusta sisälsi 6 g NaH2P0^:a, 3 g lO^PO^ja, 0,5 g NaCl:a ja 1 g NH^Cl:a litraa kohden. Alusta auto-klavoitiin ja 1 ml steriloitua IM MgSO^ra ja 1 ml steri-20 loitua 0,1 M CaC^ia lisättiin aseptisesti.)
Vaihe 6: Valmistettiin 5-%:inen tolueenin mikrosus-pensio M9-suola-alustassa sonikoimalla sekoittumatonta seosta nopeasti. 25 ml:aan tätä suspensiota lisättiin 1,2 ml [14C-1]-2-okso-isokapronihappoa, 2,5 pCi/ml ja - 25 10,0 pCi/pmol, sisältävää liuosta. 50 mikrolitraa tätä li uosta lisättiin jokaiseen mikrotiitterilevyn kuoppaan, jossa testattavat pesäkkeet olivat.
Vaihe 7: Jokaisessa kuopassa muodostunut 14C02 suljettiin talteen ja visualisoitiin julkaisussa Tabor et : 30 ai., J. Bacteriol. 128 (1976) 485 - 486, "Convenient Method for Detecting 14C02 in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants", esitettyä menetelmää käyttäen. Mutantit, joista aktiivinen haarautuneen 2-oksihapon dehydrogenaasi puuttuu, eivät tuota Ba14C03:a sen enempää - 35 kuin kontrollitkaan.
22 (> Π Ο ί
Kehittyneempi menetelmä, jossa ero radiogrammissa Ba14C03:n muodostumisesta johtuvana tummana läikkänä näkyvän 14C02-positiivisen testin ja negatiivisen testin, jossa ei näy läikkää tai näkyy erittäin heikko läikkä, käsit-5 tää seuraavan modifioidun seulonnan.
Yksittäisiä pesäkkeitä (ks. vaihe 4 yllä) poimittiin 7-14 vuorokauden kasvatuksen jälkeen (ei 2 - 3 viikon kasvatuksen jälkeen, kuten yllä, ja ne testattiin suoraan kuten vaiheissa 6 ja 7 yllä). Yllä olevan menetel-10 män vaihe 5 jätettiin pois.
Vieläkin kehittyneempi menetelmä, joka on luonteeltaan kvantitatiivinen vapautuneen 14C02:n suhteen, on seuraavanlainen. Yllä esitetyssä seulonnassa tunnistettuja mutantteja kasvatettiin sopivalla alustalla, joka koostui 15 M9-suola-alustasta, johon oli lisätty 1 % glukoosia ja 0,1 % "Syncasa-bcaa" -tuotetta (synteettinen L-aminohappo-jen seos, jonka koostumus vastaa kaupallisesti saatavia kasaminohappoja, mutta L-valiini, L-isoleusiini ja L-leu-siini puuttuvat, ks. alla).
20 Solut kasvatettiin suureen solutiheyteen, minkä jälkeen ne pestiin M9-suola-alustalla ja suspendoitiin uuteen kylmään, 1 % tolueenia sisältävään M9-suola-alus-taan, joka oli sonikoitu, kunnes saatiin maidonvalkea to-lueenidispersio. Solu/puskuri/tolueeni -suspensiota in-25 kuboitiin 40 minuuttia 30 °C:ssa, jotta solut tulivat läpäiseviksi. Permeabilisoidut solut pestiin tämän jälkeen M9-suola-alustalla ja otettiin lopuksi viidesosaan alkuperäisestä tilavuudesta M9-alustapuskuriin. Testiä kohden : käytettiin 180 mikrolitraa tätä puskuria.
30 300 μ1:η reaktiotilavuus sisälsi toluenisoidut so lut, 0,04 mM tiamiinipyrofosfaattia (TPP); 0,11 mM koent-syymi A:ta (CoA); 0,68 mM nikotiiniamidiadeniinidinukleo-tidia (NAD), 2,6 mM ditiotreitolia (DTT); 4,1 mM MgCl2:a; 60 mM Tris-HCl:a; pH 7,5; ja [ 14C-1]-2-oksi-isokaproaattia, • 35 6 000 cpm, pCi/pmol. Laskennan tehokkuus oli 73 %. Reaktio 23 9 π O S 'j suoritettiin 15 ml:n nestetuikelaskentaputkissa, joiden kierrekorkkeihin oli painettu 2x2 cm:n Whatman nro 4 -paperineliöitä. Paperissa oli 30 mikrolitraa 1 M hyamii-nihydroksidia (1 M metyylibentsetoniumhydroksidia metano-5 lissa; saatavana Sigma Chemical Co -yhtiöstä. St. Louis, MO 63178, USA), joka sitoo reaktiossa vapautuvan 14C02:n. Inkuboitiin kaksi tuntia, minkä jälkeen paperit upotettiin 10 ml:aan Beckman Aquasol II -nestettä (yleistuikeneste), joka saadaan kaupallisesti New England Nuclear Research 10 Products -yhtiöstä, Boston, MA 02118, USA) ja annettiin tasapainottua neljän tai useamman tunnin ajan tässä nesteessä, minkä jälkeen radioaktiivisuus määritettiin neste-tuikelaskijassa. Tyhjökontrollireaktio (so. ei soluja) antoi noin 50 - 300 cpm.
15 Mutantti 1-3 ja muut vastaavat antoivat cpm-luke- mia, jotka olivat pienempiä tai samaa suuruusluokkaa kuin tyhjökontrolli, kun taas alkuperäiskannan arvot olivat useita kertoja korkeampia kuin tyhjöarvot.
S. avermitilis I-3:sta (ATCC 53567) johdetun 20 HL-026 -kannan (ATCC 53568) eristäminen S. avermitilis 1-3 -kantaa (ATCC 53567) levitettiin ravintoagarmaljoille. Spontaaneja variantteja esiintyi suhteellisen suurella tiheydellä; joistakin puuttui ilmamyseeli neljän päivän inkubaation jälkeen 30 °C:ssa. 25 Useita tämänkaltaisia variantteja eristettiin ja niiden kykyä tuottaa ei-luonnollisia avermektiinejä fermentoi-taessa AP-5-alustassa, johon oli lisätty syklopentaani-karboksyylihappoa, testattiin. Moni isolaatti tuotti ei-luonnollisia avermektiinejä ilman luonnollisia avermek-: 30 tiinejä, ja näistä valittiin yksi kanta, joka tuotti korkeampia avermektiinitiittereitä pullokasvatuksissa verrattuna alkuperäiskantaan S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), ja jonka tunnistuskoodiksi annettiin HL-026 (ATCC 53568).
- 35 24 11 ^ Π ! ' "Syncasa-bcaa":n koostumus, 100-kertainen väkevyys g/litra L-alaniini 3 L-arginiini 4 5 L-asparagiinihappo 5 L-kysteiini χ L-glutamiinihappo 20
Glysiini X
L-h±stidiini 2 10 L-lysiini 7 L-metioniini 3 L-fenyylialaniini 6 L-proliini X0 L-seriini 6 15 L-treoniini 4 L-tyrosiini 4 L-tryptofaani χ
Seoksen pH säädettiin arvoon 7 ja steriilisuoda-tettiin. Yksi tilavuus tiivistettä lisätään 99 tilavuu-20 teen kasvatusliuosta, jolloin saadaan tavanomainen käyt-töväkevyys.
Alla esitetään seuraavissa esimerkeissä käytetyt kasvatusalustat.
AS-7-alusta 25 q/1
Ohennettua tärkkelystä3 20 L.
Ardamiini pH° 5
Pharmamediac 15
CaCOo 2 g 30 Valmistetaan hydrolysoimalla tärkkelystä Bacillus licheniformisin a-amylaasilla (saatavana kaupallisesti Nove Enzymes -yhtiöltä, Wilton, CT, USA, kauppanimellä "Termamyl") dekstroosi-ekvivalenttiin 40 % ± 5 %. k Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012, USA.
• 35 c Traders Protein, Memphis, TN 38108, USA. pH säädettiin arvoon 7,2 NaOHrlla.
25 ('0Q( · AP-5 alusta all
Ohennettua tärkkelystä 80
Ardamiini pH 5 5 K2HP04 1
MgS04·7H20 1
NaCl 1
CaC03 7
FeS04-7H20 0,01 10 MnCl2*7H20 0,001
ZnS04‘7H20 0,001 P-2000 (vaahdonesto) 1 ml/1 pH säädetään arvoon 6,9 lisäämällä 25-%:sta Na0H:a.
15 Yleiset korkeaDainenestekromatoarafia(HPLC) -mene telmät
Liikkuva faasi: 150 ml vettä 70 ml asetonitriiliä 20 Tilavuus säädetään 1 litraksi metanolilla Pylväs:
Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100, USA) nopeus: 0,75 ml/min 25 detektio: UV, 240 nm vaimennus: melkein 6 Näytelaimennusliuos (D): 35 ml asetonitriiliä + 390 ml metanolia Standardit: Y; 30 1. 0,5 mg avermektiini A2A:ta punnittiin 10 ml:n pulloon ja tilavuus säädettiin metanolilla.
2. 0,5 mg testituotetta punnittiin 10 ml:n pulloon ja tilavuus säädettiin metanolilla.
1 ja 2 ovat standardikantaliuoksia; standardikäyttöliuok-35 siä varten otettiin 100 μΐ (l):tä ja 100 (2):ta putkeen ja lisättiin 800 μΐ liikkuvaa faasia.
26 Π O 5 'ί Näytteet: 1. 1 ml hyvin ravisteltua lientä otettiin ja sent-rifugoitiin.
2. Mahdollisimman paljon supernatanttia poistettiin 5 vahingoittamatta pellettiä.
3. 100 μΐ HPLC-vettä lisättiin pellettiin ja dis-pergoitiin sekoittamalla vortex-laitteella.
4. 2 ml laimenninta (D) lisättiin ja seos sekoitettiin hyvin.
10 5. Seos suodatettiin ja HPLC ajettiin.
Luonnollisilla avermektiineilla ajettiin tämä HPLC-kromatografia, ja yksittäisten avermektiini-huippujen re-tentioajalla jaettiin sisäisenä standardina jokaisessa HPLC-määrityksessä toimineen oligomysiini A: n retentio-15 ajalla. Oligomysiini A esiintyy melkein aina HPLC:ssä S. avermitilis -fermentointien sivutuotteena ja on ainoa HPLC:ssä näkyvä tässä esitettyjen mutanttien tuote, jos ne viljellään R-COOH-happoja sisältämättömässä alustassa, tai alustassa, josta puuttuu kaavan R-COOH mukaisiksi hapoiksi 20 muutettavissa olevia yhdisteitä, jolloin R on kuten tässä määritetty. Tavallisesti oligomysiini A:n retentioaika on 12,5 - 14 min. Retentioaikojen (RT) suhde antaa paremman pohjan avermektiinituotteiden luonteen ja saannon vertaamiselle. Yleensä avermektiinituotteet esiintyvät HPLC:ssä - 25 järjestyksessä B2, A2, B1 ja AI.
Luonnolliset avermektiinit RT/RT (oligomysiini A) B2b 0,70 B2a 0,84 ·': 30 A2b 0,90 A2a 1,09
Blb 1,40
Bla 1,83
Alb 1,83 35 Ala 2,42
Huomattakoon, etteivät Bla ja Alb ole erottuneet.
27 9noi»i
Ei-luonnolliset avermektiinit RT/RT (ollqomyslini A) Syklopentyyli-B2 0,94
Syklopentyyli-A2 1,23
Syklopentyyli-Bl 1,99 5 Syklopentyyli-Al 2,62
Retentioajat vaihtelevat 1-2 min päivästä toiseen, jolloin oligomysiini A yleensä esiintyy noin 12,5 -14 min kohdalla.
Seuraavissa esimerkeissä avermektiinit määritettiin 10 yllä esitettyä HPLC-menetelmää käyttäen.
Esimerkki 1
Demetvloidut svkloheksvvliavermektiinit Käytettiin pakastettua S. avermitilis -kantaa HL-026 (ATCC 53568) sisältävää putkea inokuloitaessa 15 100 ml AS-7-alustaa 500 ml:n väliseinällisessä pullos sa, jota inkuboitiin ravistellen 24 - 28 tuntia 28 -30 °C:ssa. Yksi millilitra tätä viljelmää käytettiin ino-kuloimaan 40 ml AP-5-alustaa (vähemmän NaCl:a, mutta 0,6 g/1 glutamiinihappoa lisätty) sisältävä 300 ml:n pul-20 lo. Inkuboitiin noin 96 tuntia 28 - 30 °C:ssa ravistellen, minkä jälkeen lisättiin 0,2 g/1 sykloheksaanikarboksyyli-happoa (natriumsuolana) ja 0,1 mM sinefungiinia. 312 tunnin näytteen HPLC-kromatografia osoitti demetyloituja syk-loheksyyliavermektiinejä B2, A2 ja Bl, joilla oli seuraa-25 vat retentioajat verrattuna vastaaviin sykloheksyyliaver-mektiineihin, didemet CH-B2/CH-B2 = 0,470 monodemet CH-B2/CH-B2 * 0,515 didemet CH-A2/CH-A2 = 0,466 - 30 monodemet CH-A2/CH-A2 = 0,520 didemet CH-B1/CH-B1 = 0,486 monodemet CH-B1/CH-B1 = 0,517 CH = sykloheksyyli demet = demetyyli 35 28 f"'CI!!i
Esimerkki 2
Demetvloidut svklopentvvliavermektiinit Käytettiin pakastettua S. avermitilis -kantaa HL-026 (ATCC 53568) sisältävää putkea inokuloitaessa 5 100 ml AS-7-alustaa 500 ml:n väliseinällisessä pullos sa, jota inkuboitiin ravistellen 24 - 28 tuntia 28 -30 eC:ssa. Yksi millilitra tätä viljelmää käytettiin ino-kuloimaan 40 ml AP-5-alustaa (vähemmän NaCl:a, mutta 0,6 g/1 glutamiinihappoa lisätty) sisältävä 300 ml:n pullo. 10 Inkuboitiin noin 96 tuntia 28 - 30 °C:ssa ravistellen, minkä jälkeen lisättiin 0,4 g/1 syklopentaanikarboksyyli-happoa (natriumsuolana) ja 0,1 mM sinefungiinia. 312 tunnin näytteen HPLC-kromatografia osoitti demetyloituja syk-loheksyyliavermektiinejä B2, A2 ja Bl, joilla oli seuraa-15 vat retentioajat verrattuna vastaaviin syklopentyyliaver-mektiineihin: didemet CP-B2/CP-B2 = 0,519 monodemet CP-B2/CP-B2 = 0,564 didemet CP-A2/CP-A2 = 0,513 20 monodemet CP-A2/CP-A2 = 0,567 didemet CP-B1/CP-B1 = 0,538 monodemet CP-B1/CP-B1 = 0,593 CP - syklopentyyli ' 25 Esimerkki 3
Demetvloidut svklobutvvliavermektiinit Käytettiin pakastettua S. avermitilis -kantaa HL-026 (ATCC 53568) sisältävää putkea inokuloitaessa 100 ml AS-7-alustaa 500 ml:n väliseinällisessä pullos-30 sa, jota inkuboitiin ravistellen 24 - 28 tuntia 28 -30 °C:ssa. Yksi millilitra tätä viljelmää käytettiin inokuloimaan 40 ml AP-5-alustaa (vähemmän NaCl:a, mutta 0,6 g/1 glutamiinihappoa lisätty) sisältävä 300 ml:n pul lo. Inkuboitiin noin 96 tuntia 28 - 30 °C:ssa ravistellen, -- 35 minkä jälkeen lisättiin 0,4 g/1 syklobutaanikarboksyyli- 29 ΟΠΟ!" happoa (natriumsuolana) ja 0,1 mM sinefungiinia. 312 tunnin näytteen HPLC-kromatografia osoitti demetyloituja syk-lobutyyliavermektiinejä B2, A2 ja Bl, joilla oli seuraavat retentioajat verrattuna vastaaviin syklobutyyliavermektii-5 neihin: didemet CB-B2/CB-B2 = 0,581 monodemet CB-B2/CB-B2 = 0, 627 didemet CB-A2/CB-A2 = 0,570 monodemet CB-A2/CB-A2 = 0,626 10 didemet CB-B1/CB-B1 = 0,574 monodemet CB-B1/CB-B1 = 0,623 CB = syklobutyyli
Esimerkki 4 15 Demetvloidut 2-pentvvliavermektiinit Käytettiin pakastettua S. avermitilis -kantaa HL-026 (ATCC 53568) sisältävää putkea inokuloitaessa 100 ml AS-7-alustaa 500 ml:n väliseinällisessä pullossa, jota inkuboitiin ravistellen 24 - 28 tuntia 28 -20 30 °C:ssa. Yksi millilitra tätä viljelmää käytettiin inokuloimaan 40 ml AP-5-alustaa (vähemmän NaCl:a, mutta 0,6 g/1 glutamiinihappoa lisätty) sisältävä 300 ml:n pul lo. Inkuboitiin noin 96 tuntia 28 - 30 °C:ssa ravistellen, minkä jälkeen lisättiin 0,4 g/1 2-metyylivaleriaanahappoa . . 25 (natriumsuolana) ja 0,1 mM sinefungiinia. 312 tunnin näyt teen HPLC-kromatografia osoitti demetyloituja 2-pentyyli-avermektiinejä B2 ja A2, joilla oli seuraavat retentioajat verrattuna vastaaviin 2-pentyyliavermektiineihin: didemet IP-B2/IP-B2 = 0,497 30 monodemet IP-B2/IP-B2 = 0,541 didemet IP-A2/IP-A2 = 0,493 monodemet IP-A2/IP-A2 = 0,545 IP 2-pentyyli ' 35 30
Esimerkki 5
Demetyloidut_l-metyyli-3-butenwliavermektiinit Käytettiin pakastettua S. avermitilis -kantaa HL-026 (ATCC 53568) sisältävää putkea inokuloitaessa 100 ml 5 AS-7-alustaa 500 ml:n väliseinällisessä pullossa, jota inkuboitiin ravistellen 24 - 28 tuntia 28 - 30 °C:ssa. Yksi millilitra tätä viljelmää käytettiin inokuloimaan 40 ml AP-5-alustaa (vähemmän NaClra, mutta 0,6 g/1 gluta-miinihappoa lisätty) sisältävä 300 ml:n pullo. Inkuboitiin 10 noin 96 tuntia 28 - 30 °C:ssa ravistellen, minkä jälkeen lisättiin 0,4 g/1 2-metyyli-4-penteenihappoa (natriumsuo-lana) ja 0,1 mM sinefungiinia. 312 tunnin näytteen HPLC-kromatografia osoitti demetyloituja 1-metyyli-3-butenyyli-avermektiinejä B2, A2 ja Bl, joilla oli seuraavat reten-15 tioajat verrattuna vastaaviin IM3B-avermektiineihin: didemet 1M3B-B2/1M3B-B2 = 0,547 monodemet 1M3B-B2/1M3B-B2 = 0,591 didemet 1M3B-A2/1M3B-A2 = 0,532 monodemet 1M3B-A2/1M3B-A2 = 0,586 20 didemet 1M3B-B1/1M3B-B1 = 0,551 1M3B = l-metyyli-3-butenyyli
Esimerkki 6
SvklODentvvliavermektiinit . 25 Käytettiin pakastettua S. avermitilis -kantaa HL- 026 (ATCC 53568) sisältävää putkea inokuloitaessa 100 ml AS-7-alustaa 500 ml: n väliseinällisessä pullossa, jota inkuboitiin ravistellen 24 - 28 tuntia 28 - 30 °C:ssa. Yksi millilitra tätä viljelmää käytettiin inokuloimaan 30 40 ml AP-5-alustaa (vähemmän NaCl:a, mutta 0,6 g/1 glu- tamiinihappoa lisätty) sisältävä 300 ml:n pullo. Inkuboitiin noin 96 tuntia 28 - 30 °C:ssa ravistellen, minkä jälkeen lisättiin 0,4 g/1 syklopentaanikarboksyylihappoa (natriumsuolana). 216 tunnin näytteen HPLC-kromatografia 35 osoitti syklopentyyliavermektiinejä B2, A2 ja Bl, joilla 3i c,nO!>' oli seuraavat retentioajat 12,32, 15,86, 25,28 ja vastaavasti 32,96 min.
Esimerkki 7
Svkloheksyvli-avermektiinit 5 Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 0,2 g/1 sykloheksaanikarboksyylihappoa syklopentaanikar-boksyylihapon tilalla; kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 6 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä sykloheksyyliavermektiiniä 240 tunnin 10 näytteestä. Sykloheksyyliavermektiinien B2, A2, B1 ja AI retentioajat olivat 14,84, 19,26, 31,46 ja vastaavasti 41,14 min.
Esimerkki 8 2-pentvvli-avermektiinit 15 Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen 0,2 g/1 2-metyylivaleriaanahappoa syklopentaanikarboksyyliha-pon tilalla; kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 6 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä 2-pentyyliavermektiiniä 312 tunnin näytteestä. 2-20 pentyyliavermektiinien B2, A2, B1 ja AI retentioajat olivat 12,88, 16,58, 31,90 ja vastaavasti 41,92 min.
Esimerkki 9 l-metvvli-3-butenvvli-avermektiinit Tässä esimerkissä lisättiin 96 tunnin jälkeen : 25 0,2 g/1 2-metyyli-4-penteenihappoa syklopentaanikarbok- syylihapon tilalla; kaikki muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 6 esitettiin. HPLC-kromatografiällä tunnistettiin neljä l-metyyli-3-butenyyliavermektiiniä 312 tunnin näytteestä, l-metyyli-3-butenyyliavermektiinien B2, A2, B1 • 30 ja AI retentioajat olivat 11,13, 14,78, 22,10 ja vastaa vasti 28,92 min.
Esimerkki 10
Svklopentvvli-avermektiini A2 S. avermitilis -kantaa 1-3 (ATCC 53567) viljeltiin 32 f)nO!:'; 28 - 30 °C:ssa 24 tuntia AS-7-alustassa ravistellen. Siir-rostamiseen käytettiin 5 ml:n näytettä 500 ml:n pulloa kohden, jossa oli 100 ml AS-7-liuosta, ja inkuboitiin samoissa olosuhteissa 24 tuntia; 1 ml tätä viljelmää käytet-5 tiin siirrostamaan AP-5-alusta (40 ml 300 ml:n pullossa), johon 24 tuntia myöhemmin lisättiin 0,4 g/1 syklopentaa-nikarboksyylihappoa (natriumsuolana). Tuotantopulloja ravisteltiin 28 - 30 °C:ssa. Inkuboitiin 240 tuntia, minkä jälkeen oli tuotettu 35 mg/1 syklopentyyliavermektiiniä 10 A2, kun vastaavan luonnollisen avermektiinin A2a tiitteri oli 0. Muitakin syklopentyyliavermektiinejä oli tuotettu.
Yllä esitetty menetelmä toistettiin, mutta syklo-pentaanikarboksyylihappo korvattiin alla luetelluilla läh-töyhdisteillä. Myös määrätyssä fermentoinnissa tunnistetut 15 avermektiinit (kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R2 on oleandroosidisakkaridiosa ja R, R1 ja R3 ovat kuten esitetään) luetellaan alla.
33 πηοί·';
in Ν' ΙΟ Οι Οι Ν' CO CO O
m rH Ν' CTi OJvDxi CO
(N CN CO Ή -¾1 Oinro o H ' ' ' ' ' ' ‘ '
<| CO <N (N <N 1—I NJ (S CO CN
CiNM'M'incoin'^Ovo in oo cn co m ^ cn ^ in in cm
•H^fVDt^lDrHO^CTiin rH
£ rH <* * * * *> *» % * % *
rl CQI CN H I—I rH rH rH H H CN CN
•H
CO
S.
O in o co h in co vd m co co O) co σ» co cn cn o co oo m cn Ν'
H CN O rH o ID Ν' σι CN in CTi CN
rH CN ' h h v s * * * s ». I
O rtjl rHrHrHrH Ο Ο ^ Η Ή Η H
05 \ co ^ in co o id in
EH in o 00 CNvOOlO
Oj co σι Ν' c^ σ cn o< ·· CN v » » ' > * '
Cl) CQI iH O O O o o iH I-H rH
P
0 3
Eh -rl
rH I
St Η ·Η ·Η H
>1 l Ή rH I-H rH I
•H I C tH rH >, S S' CO
rH CN 0) H >i >1 Si >ι I
Si CO n-hS-p CD +> CO
Sc* Si h -p c * a* I a) a) I >, 3 a) a) a) a) cn-p jx on >, -Q ft sx x: x: h
ic o I no o o o OH
PO) H-HC 3 H H H H H S
C a * H Q) 4H* * * * * Si
d) I St Si H I Si St s Si SiC
051 Οι Ό1 coS-p coco CO CD CO COO)
o III
Oft I H -rl -rl
ft ft I ‘H rH (—I rH I
ft (0 I Ή HStSS1"1 ® x: * h StSSSffl X3 H 0 >i Si CO CO CO * (0 C X3 S. C0***i ca)Mco *oooh
- co a) co * ο X3 x> xa I
(01 * Ο X3 M M M *H
. . Htst-rlXJ M (0 (0 (0 C
• Ml CMO(0***a)
a) -P (0 (0 ft X -H -rl -rl a) O
a) h c to * ftH c c c coft :: -pioa) co I ioc (0 co <o * ft co > ft * o cn sx (0 co a) (0 a)(0 •η η ή a) ft I -h ro -p co -p x: x: Ό H H XJft-rl C-P c * ft ft Ή xjSSi oioc (03 a) a) a) oh
- s Si Si h x5 a) cox) ft sx sx hS
o-p -P * H d)0 m oo oo oo oo * St pa) a) SHiMftSHftHftHaHftSico x: e e io>iOft|M*ft*ft*ft*aco*
«Jl I I Si -H (0 I Si(0 Si (0 S(0 s<o IO
j cn cn rH co -p x: co cox: cox: cox: cox: coxa a) •p co •rl Ό sx o
Shcn co •o1 in io n· co cn h in o in o m o ...: H rH cn cn co 34 f'"0!·· 00
iH CO
in oo
H CO
rtll * I—i f—l < σι in m
Η ΓΗ O
C H O
•H CQ| - Γ-Ι
H i—I
(0 >4
E
0 cn o> O 00
H 00 >D on (-- vO vO vO
rH OH C- V 0- rH 00 0 <1 - O ccccc -—r O C C c η η ή ·η ή H H H 3 3 3 3 3 333λ:λ:λ;λ;λ; ds x .* .* \ (O' (0 (0 (0 (0 (0
HinootOiOtOEEEEE
0iioinEEE(0(0i0(0(0 N in - (0(0(0(001(0(00) ·· ffil * O (0 (0 (0
Q) O
p 0 3 E-*
I H Η Η H
Ο Ή f—( rH *H r—1 *H *H
H H >4 Η >4 >4 rH >1 rH rH
ΜΗ S H >4 S S >4 >4 >4 •H S P >4 (0 P >4 P N >4
HSC^JCCPCPP
S' 0) I 0)0)30)33
Shoo a oo £ α X3 a λ λ PHI o I O 0 0 0 00
(DSC H C rH rH rH rH i—IrH
ESO) X 0) X X X x XX
_ I P H >4 H >, >4 >, >4 >4 >4
Oil H 0) P (0 P (0 (0 (0 (0 (0(0
*H
I * c
I ·Η ·Η *H
•H c C Ή
I h I O O I E
H >4 o H H 0 (0 c S h I a a h hi
O01JÄHOOJÄIHH
HJKS(0PP>4H>4C
a o to a a to i >i(0 ΟΛΗ O H H H H +j (0
P P Η Λ H H H rH 0) -PH
a (0 S P S S >4 >4 E3-P
<i>oäS(oSssshä-p ph I -P x οι -μ -μ -μ ηολ 01-μ 00 0) H X C 0) C >hH(0
H H I E C 0) 0) E 0) H >4 Ji H
Ό H H H H 0) H JS a H a H 4-> >4 S
Λ S C (OCOJOO O (OH OO 3 (0 (0 > S 0) J* (0 H >4 H H C H C Λ H Ji
Ό -μο 0)0 0(0 0 £ *0 .* O 0(0 JC (0 O HO
p aia na pp hqj >.a sa p« >4a h s>Q
λ Ea oa ό c pt3 toa toa op to o λ; Sp «0 1(0 H (0 >40) IH 1(0 1(0 >43 lp >4P(0 •J m λ p λ raooio n c oo r λλ oo a to 11^: 0) p (0
H
Ό Λη (N 00 ^ in vo o- 00 cr> o
>4 rH rH rH rH i—I t—I τ—f f—4 r4 OH
in o in o in o : H rH OH oh oo 35 C>nO!·':
00 VO
(N H Γ0 m in pj H » s »
<| PJ rH CM
— CO ID
< (N H*
ON H
H
C H '—I '—I
•h cal
•H
(0 >1 e O vo h m o> vo co
O) CM CO ON CO O CO
-H lO H CMOi-Ht^ (MO
H CM '
O <1 G G rHrHrHO rH rH
w -rl -rl 3 3 EH X X im
OS CM CM CO O
\ ca (0 h co ro oo
Eh g e co co m
OS <0 (0 ' ' > O
cm ω en o o o ·· CQI 0)
P
O i
3 I -H CM I
EH O rH I O
H >i G H -H
X N 0) X H
H -rl >ι I -H >1 >i
H H CO CM P CO N
N N Ή I ·Η ·Η ·Η O4
N ΡΊ H *ri C 1—I 1—I 1—i *H O
P I >1 H Q) >1 >1 NH tH
3 CO N N P NN N N a
X3 I PNC )HP P N O
0 C 0)Ol<U 3 0) -rl 0) Oi rH
rH <d e o a p ε h e o .* X ·Η I Vh I I 1 >1 1 Vh >1
N p H ft CM CN in >1 rH a. CD
osi co O 0 1
XZ Q, -H
Vh I a 1 H
(0 -rl (0 H N
1 X C XZ C >1
O -rl CO -H I (0 CO
JQOCCOC CMtO* tn a a) h a a> 1 a o coaoipo o) -h o xz .* (0 P P Vh O I CO Vh O Vh mx: oco aa cm ai a aa co >-h ή -ri ίο o a 1 o a) a o a x
N C P C H (0 P a P (0 H (0 H
0) NO 1 O X XZ G a ΟΛ X XZ G P P -H CO -H N -H 0) (0 -H -H >1 -H (0 m aa ^ a en h a .c p h co h <o •H JQ O I O Ή >1 -H -H -rl >1 -rl >1 a
Ό o Vh CM Vh H N h C H N H N O
xz rH a ia n en n co n co nco vh > X'-' -h ^ n .* n (0 >ix ><x a
O N-H H-H PO P H PO PO OO
P CO H N rH Q) Ä 0) 3 0) XZ 0) X) na xz —n NN e vh e p evn evn x a M3 IN PN 1(0 I I 1(0 1(0 Neo
J CM C O) C H .* CM CM in JC H JC CO XZ
0)
P
CO
Ή Ό
CHCMcOTrinvorsco NCM (N (N CM CMCM (N CM
in o m o m
H H CM CM
36 '"'O!-:
Muita fysikaalis-kemiallisia tietoja annetaan alla olevassa taulukossa joidenkin yllä esitettyjen yhdisteiden kohdalla.
Yhdiste Fysikaalis-kemiallinen tieto 5 6 (A2) valkoinen jauhe; sp. 135 - 140 °C.; mole- kyylipaino = 925; m/e 596, 454, 321, 303, 275, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
10 6 (AI) valkoinen jauhe; sp. 120 - 124 °C.; mole- kyylipaino = 907; m/e 578, 303, 275, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
15 6 (B2) valkoinen jauhe; sp. 110 - 112 °C.; mole- kyylipaino = 911; m/e 321, 303, 261, 257, 237, 219, 209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
20 6 (Bl) valkoinen jauhe; sp. 135 - 138 °C.; mole- kyylipaino = 893; m/e 303, 261, 257, 219, 191, 167, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
8 (A2) valkoinen jauhe; sp. 112 - 117 °C.; mole- 25 kyylipaino = 953; m/e 624, 482, 349, 349, 331, 275, 265, 247, 237, 219, 207, 195, 179, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
10 (A2) valkoinen jauhe; sp. 131 - 135 °C.; mole- 30 kyylipaino = 951; m/e 624, 480, 347, 329, 275, 263, 245, 235, 217, 205, 193, 179, 145, 127, 113, 111, 95 ja 87.
12 (A2) valkoinen jauhe; sp. 167 “C.; molekyyli- 35 paino = 953; m/e 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127, 113, 95 ja 87.
Claims (4)
1 CH3 OR3 jossa katkoviiva asemassa 22 - 23 edustaa mahdollista kak-20 soissidosta; R1 on H tai OH ja kaksoissidos puuttuu, tai kaksoissidos esiintyy ja R1 puuttuu; R on a-haarautunut C3_8-alkyyli, -alkenyyli tai -alkyylitioalkyyliryhmä; C5.8-sykloalkyylialkyyliryhmä, jossa alkyyliryhmä on a-haarautunut C2_5-alkyyliryhmä; C3_8-sykloalkyyli- tai C5.8-sykloal-25 kenyyliryhmä, joista kumpi tahansa voi mahdollisesti olla substituoitu yhdellä tai useammalla C1.4-alkyyliryhmällä; tai 3-6 -jäseninen, happea tai rikkiä sisältävä hetero-syklinen rengas, joka voi olla tyydyttynyt tai kokonaan tai osittain tyydyttymätön ja joka mahdollisesti voi olla . .· 30 substituoitu yhdellä tai useammalla C1.4-alkyyliryhmällä; sillä rajoituksella, että kun R on alkyyli, se ei ole iso-propyyli eikä sek-butyyli; R2 on disakkaridiryhmä, jolla on kaava . . 35 38 'ίΠ0ί ; CH3 CH3 «o-rv-o_ry* 5 5 )-' 4 y-' RO RO jossa R4 ja R5 ovat vetyjä tai metyylejä, jolloin kuitenkin vähintään toinen niistä on vety; ja R3 on vety tai me-10 tyyli, tunnettu siitä, että fermentoidaan aerobisissa olosuhteissa sinefungiinin läsnäollessa Streptomyces avermitilis -kantaa, jolta puuttuu haarautuneen 2-oksiha-pon dehydrogenaasiaktiivisuus ja/tai haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, vesipohjaisessa viljelyalus-15 tässä, joka sisältää assimiloitavan typpilähteen, hiili-lähteen sekä epäorgaanisia suoloja ja yhdistettä, jolla on kaava R-COOH 20 tai yhdistettä, jonka S. avermitilis pystyy muuttamaan mainituksi hapoksi, jolloin R on edellä määritelty.
1. Menetelmä yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava . fH3 l·5 10 3 ]lo I (I) S "V H OH 15 o-L
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Streptomyces avermitilis on . 25 Streptomyces avermitilis ATCC 53567 tai ATCC 53568 tai niiden jälkeläinen.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että RCOOH-substraatiksi muutettavissa oleva yhdiste on 30 R-(CH2)n-Z jossa R on edellä määritelty; n on 0, 2, 4 tai 6; ja Z on CHz0H, -CHO, -C00R5, -CH2NH2 tai -C0NH2, jolloin R5 on H tai 35 C^j-alkyyli; tai, jos S. avermitilis -kannalta puuttuu vain 39 :·!'Π! haarautuneen aminohapon transaminaasiaktiivisuus, R-COOH-substraatiksi muutettavissa oleva yhdiste on R-CO-Z.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on syklopentyyli, syklohek-5 syyli, 3-tienyyli, 3-furyyli tai 1-metyylitioetyyli. 40 90 G!' Ί
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US651287A | 1987-01-23 | 1987-01-23 | |
| US651287 | 2000-08-30 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI880280A0 FI880280A0 (fi) | 1988-01-22 |
| FI880280A FI880280A (fi) | 1988-07-24 |
| FI90091B true FI90091B (fi) | 1993-09-15 |
| FI90091C FI90091C (fi) | 1993-12-27 |
Family
ID=21721247
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI880280A FI90091C (fi) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Foerfarande foer producering av icke-naturliga demetylavermektiner |
| FI880281A FI90088C (fi) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Foerfarande foer framstaellning av b-avermektiner och vid foerfarandet anvaendbar odling |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI880281A FI90088C (fi) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Foerfarande foer framstaellning av b-avermektiner och vid foerfarandet anvaendbar odling |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0276103B1 (fi) |
| JP (2) | JPH0681757B2 (fi) |
| KR (2) | KR900004419B1 (fi) |
| CN (1) | CN1056883C (fi) |
| AR (1) | AR241798A1 (fi) |
| AT (2) | ATE96174T1 (fi) |
| AU (2) | AU595673B2 (fi) |
| BG (1) | BG51051A3 (fi) |
| BR (1) | BR8800271A (fi) |
| CZ (1) | CZ279782B6 (fi) |
| DD (2) | DD267512A5 (fi) |
| DE (2) | DE3884973T2 (fi) |
| DK (2) | DK175720B1 (fi) |
| EG (1) | EG18797A (fi) |
| ES (2) | ES2059498T3 (fi) |
| FI (2) | FI90091C (fi) |
| GR (1) | GR3007586T3 (fi) |
| HU (2) | HU201973B (fi) |
| IE (2) | IE61483B1 (fi) |
| IL (2) | IL85118A (fi) |
| IN (1) | IN167980B (fi) |
| MA (1) | MA21160A1 (fi) |
| MY (1) | MY103514A (fi) |
| NZ (2) | NZ223272A (fi) |
| PL (2) | PL156763B1 (fi) |
| PT (2) | PT86583B (fi) |
| RU (1) | RU1806198C (fi) |
| SK (1) | SK40788A3 (fi) |
| YU (1) | YU47878B (fi) |
| ZA (3) | ZA88447B (fi) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4806527A (en) * | 1987-03-16 | 1989-02-21 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
| US4874749A (en) * | 1987-07-31 | 1989-10-17 | Merck & Co., Inc. | 4"-Deoxy-4-N-methylamino avermectin Bla/Blb |
| DE3881147T2 (de) * | 1987-10-23 | 1993-09-02 | Pfizer | Verfahren zur herstellung von aglykonen von avermectin und sie enthaltende kulturen. |
| GB8807280D0 (en) * | 1988-03-26 | 1988-04-27 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
| GB8811036D0 (en) * | 1988-05-10 | 1988-06-15 | Glaxo Group Ltd | Chemical compounds |
| GB8813760D0 (en) * | 1988-06-10 | 1988-07-13 | American Cyanamid Co | Chemical process |
| GB8815967D0 (en) * | 1988-07-05 | 1988-08-10 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
| NZ231773A (en) * | 1988-12-23 | 1992-09-25 | Merck & Co Inc | Avermectin derivatives, preparation and parasiticidal pharmaceutical compositions thereof |
| NZ231772A (en) * | 1988-12-23 | 1992-11-25 | Merck & Co Inc | Avermectin derivatives, preparation and parasiticidal compositions thereof |
| US5015630A (en) * | 1989-01-19 | 1991-05-14 | Merck & Co., Inc. | 5-oxime avermectin derivatives |
| US4897383A (en) * | 1989-02-13 | 1990-01-30 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
| US5252474A (en) * | 1989-03-31 | 1993-10-12 | Merck & Co., Inc. | Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
| US5057499A (en) * | 1989-06-02 | 1991-10-15 | Merck & Co. Inc. | Avermectin derivatives |
| US5030622A (en) * | 1989-06-02 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
| US5023241A (en) * | 1989-07-31 | 1991-06-11 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
| US5830875A (en) * | 1989-10-30 | 1998-11-03 | Merck & Co., Inc. | 24-and 25-substituted avermectin and milbemycin derivatives |
| JP2888586B2 (ja) * | 1990-03-05 | 1999-05-10 | 社団法人北里研究所 | エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法 |
| US5169839A (en) * | 1990-05-11 | 1992-12-08 | Merck & Co., Inc. | Derivatives of 3'- and 3"-o-desmethyl avermectin compounds, compositions and methods of treating melmintic and parasitic infections |
| US5208222A (en) * | 1991-03-28 | 1993-05-04 | Merck & Co., Inc. | 4"-and 4'-alkylthio avermectin derivatives |
| US5240915A (en) * | 1991-10-15 | 1993-08-31 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
| US6103504A (en) * | 1992-03-25 | 2000-08-15 | Pfizer Inc. | Process for production of avermectins and cultures therefor |
| US5292647A (en) * | 1992-11-30 | 1994-03-08 | Eli Lilly And Company | Strain of streptomyces for producing avermectins and processes therewith |
| CN1038330C (zh) * | 1993-07-05 | 1998-05-13 | 塞泰克斯公司 | 阿弗麦菌素的生产与分离 |
| ATE248916T1 (de) * | 1993-07-30 | 2003-09-15 | Pfizer | Gene, die verzweigte-alpha-ketosäure- dehydrogenasekomplexe von streptomyces avermitius kodieren |
| KR100186946B1 (ko) * | 1993-10-05 | 1999-04-01 | 알렌 제이.스피겔 | 도라멕틴의 구충활성 중간체 및 도라멕틴의 제조방법 |
| FI942725A (fi) * | 1993-12-16 | 1995-06-17 | Pfizer | Haaraketjuista alfaketohappodenydrogenaasikompleksia koodaavia geenejä Streptomyces avermitiliksesta |
| US5701591A (en) * | 1995-04-07 | 1997-12-23 | Telecommunications Equipment Corporation | Multi-function interactive communications system with circularly/elliptically polarized signal transmission and reception |
| EP1053335A1 (en) * | 1998-02-13 | 2000-11-22 | Pfizer Products Inc. | Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins |
| CA2380872C (en) * | 1999-08-12 | 2007-11-27 | Yan Chen | Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins |
| KR100415395B1 (ko) * | 2000-08-02 | 2004-01-16 | 한국생명공학연구원 | 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법 |
| ATE426659T1 (de) | 2002-02-12 | 2009-04-15 | Pfizer Prod Inc | Streptomyces avermitilis gen zur regulierung des verhaltnisses der b2:b1 avermectine |
| WO2023203038A1 (en) | 2022-04-19 | 2023-10-26 | Syngenta Crop Protection Ag | Insect, acarina and nematode pest control |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE434277B (sv) * | 1976-04-19 | 1984-07-16 | Merck & Co Inc | Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis |
| NZ188459A (en) * | 1977-10-03 | 1982-09-07 | Merck & Co Inc | Derivatives of c-076 compounds and pesticidal compositions |
| US4429042A (en) * | 1978-09-08 | 1984-01-31 | Merck & Co., Inc. | Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds |
| ES8800986A1 (es) * | 1985-07-27 | 1987-12-01 | Pfizer | Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina |
| GB8606120D0 (en) * | 1986-03-12 | 1986-04-16 | Glaxo Group Ltd | Process |
-
1987
- 1987-12-10 IN IN1059/DEL/87A patent/IN167980B/en unknown
-
1988
- 1988-01-18 ES ES88300354T patent/ES2059498T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 EP EP88300354A patent/EP0276103B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 IL IL85118A patent/IL85118A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-01-18 BG BG82657A patent/BG51051A3/xx unknown
- 1988-01-18 AT AT88300354T patent/ATE96174T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-01-18 DE DE88300354T patent/DE3884973T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-19 MY MYPI88000037A patent/MY103514A/en unknown
- 1988-01-19 MA MA21397A patent/MA21160A1/fr unknown
- 1988-01-20 EP EP88300426A patent/EP0276131B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-20 ES ES88300426T patent/ES2053719T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-20 AT AT88300426T patent/ATE87927T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-01-20 DE DE8888300426T patent/DE3879975T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-21 PT PT86583A patent/PT86583B/pt unknown
- 1988-01-21 PL PL1988270238A patent/PL156763B1/pl unknown
- 1988-01-21 PL PL1988270239A patent/PL156764B1/pl unknown
- 1988-01-21 SK SK407-88A patent/SK40788A3/sk unknown
- 1988-01-21 IL IL85165A patent/IL85165A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-01-21 EG EG3588A patent/EG18797A/xx active
- 1988-01-21 PT PT86584A patent/PT86584B/pt unknown
- 1988-01-21 CZ CS88407A patent/CZ279782B6/cs unknown
- 1988-01-22 DK DK198800290A patent/DK175720B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 ZA ZA88447A patent/ZA88447B/xx unknown
- 1988-01-22 DK DK028988A patent/DK28988A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-01-22 FI FI880280A patent/FI90091C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 ZA ZA88449A patent/ZA88449B/xx unknown
- 1988-01-22 NZ NZ223272A patent/NZ223272A/xx unknown
- 1988-01-22 DD DD88312394A patent/DD267512A5/de unknown
- 1988-01-22 AR AR88309888A patent/AR241798A1/es active
- 1988-01-22 NZ NZ223271A patent/NZ223271A/en unknown
- 1988-01-22 KR KR1019880000470A patent/KR900004419B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 RU SU884355079A patent/RU1806198C/ru active
- 1988-01-22 JP JP63012462A patent/JPH0681757B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-22 IE IE16088A patent/IE61483B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 AU AU10696/88A patent/AU595673B2/en not_active Expired
- 1988-01-22 ZA ZA88448A patent/ZA88448B/xx unknown
- 1988-01-22 CN CN88100649A patent/CN1056883C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-22 HU HU88260D patent/HU201973B/hu unknown
- 1988-01-22 YU YU11988A patent/YU47878B/sh unknown
- 1988-01-22 FI FI880281A patent/FI90088C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 IE IE16188A patent/IE61066B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 HU HU88261A patent/HU200487B/hu unknown
- 1988-01-22 DD DD88312393A patent/DD290214A5/de unknown
- 1988-01-23 KR KR1019880000506A patent/KR910002225B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-01-23 JP JP63011881A patent/JPH0817693B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-25 BR BRPI8800271-3A patent/BR8800271A/pt not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-02-15 AU AU71110/91A patent/AU631298B2/en not_active Expired
-
1993
- 1993-04-08 GR GR930400638T patent/GR3007586T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI90091B (fi) | Foerfarande foer producering av icke-naturliga demetylavermektiner | |
| US5077278A (en) | Non-natural demethylavermectins compositions and method of use | |
| FI90087C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av avermektiner samt vid detta foerfarande anvaendbara streptomyces avermitilis -stammar | |
| US5234831A (en) | Cultures for production of B avermectins | |
| US5238848A (en) | Cultures for production of avermectins | |
| EP0313297B1 (en) | Process for production of avermectin aglycones and cultures therefor | |
| US5240850A (en) | Cultures for production of avermectin aglycones | |
| US5387509A (en) | Ethylated avermectins | |
| AP64A (en) | "Process for production of B avermectins and cultures therefor". | |
| EP0640142A1 (en) | Process for production of avermectins and cultures therefor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: PFIZER INC |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: PFIZER INC. |
|
| MA | Patent expired |