SK40788A3

SK40788A3 - Streptomyces avermitilis and method of avermectin b preparation

Info

Publication number: SK40788A3
Application number: SK407-88A
Authority: SK
Inventors: Edmund W Hafner; Kelvin S Holdom; Shin-Jen Edward Lee
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-21
Publication date: 1998-10-07
Also published as: CN88100649A; DK29088A; FI90091C; PL270239A1; KR880009027A; ZA88449B; ATE96174T1; SK279351B6; ES2053719T3; FI880280A0; JPS63270684A; NZ223271A; FI880281A0; EP0276131A2; PT86583B; IL85165A0; AU7111091A; FI880280A; PL156763B1; DE3879975T2

Description

STREPTOMYCES AVERMITILIS ’ A SPÔSOB VÝROBY

AVERMEKTÍNU B

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby derivátov avermektínu B, ktoré je možné získať pestovaním kmeňov Streptomyces avermitilis. ktoré nemajú avermektín B-O-metyltransferázovú účinnosť a účinnosť dehydrogenázy 2oxokyselín v bočnom reťazci. Je možné získať prírodné i polosyntetické deriváty avermektínu B.

Doterajší stav techniky

V US patentových spisoch č. 4 310 519 a 4 429 042 sa popisujú avermektíny ako komplex príbuzných látok, ktoré majú vysokú antiparazitárnu účinnosť a tiež ich výroba aeróbnou fermentáciou kmeňov Streptomyces avermitilis. a to hlavne S. avermitilis ATCC č. 31267, 31271 a 31272. Obzvlášť dva uvedené posledné kmene sú k dispozícii v zmrazenej alebo lyofilizovanej forme a boli získané ožiarením kmeňa S. avermitilis ATCC 31267 ultrafialovým svetlom.

V európskom patentovom spise č. 214 731, uverejnenom 18. marca 1987, ktorý zodpovedá US patentovej prihláške č. 886 867, podanej 16. júla 1986, sa uvádza celý rad zlúčenín, ktoré sú príbuzné prírodným alebo známym avermektínovým derivátom, avšak nie sú prírodného pôvodu a majú nový substituent v polohe 25. V spise sa rovnako popisuje spôsob výroby týchto látok fermentáciou mikroorganizmov, produkujúceho avermektín za prítomnosti určitých karboxýlových kyselín alebo derivátov týchto kyselín alebo ich prekurzorov. Mikroorganizmy S. avermitilis, použité na výrobu uvedených nových avermektínových derivátov, substituovaných na uhlíkovom atóme v polohe 25, sú S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 a NCIB 12121. Posledný z týchto organizmov, popísaný v európskom patentovom spise č.

214 731 je odvodený od S. avermitilis ATCC 31271. Pri použití tohto mikroorganizmu je možné získať zlepšené výťažky nových avermektínových derivátov, substituovaných v polohe 25 v prípade, že sa tieto mikroorganizmy pestujú na určitom prostredí. Každý z kmeňov ATCC 31267, 31272, 31271 a NCIB 12121 môže tiež produkovať okrem nových derivátov, substituovaných v polohe 25 ešte rôzne množstvá známych prírodných avermektínov, v ktorých je substituentom v polohe 25 izopropylová alebo sek.butylová skupina (1metylpropyl).

Uhlíková kostra avermektínu, ktorá bude ďalej znázornená, je odvodená od acetátov a propionátov a substituent v polohe 25 prírodných avermektínov je odvodený od L-izoleucínu (R=(S)-sek.-butyl) alebo od L-valínu (R=izopropyl), ako bolo popísané v publikácii Fisher a Mrozik, Macrolide Antibiotics, Academic Press (1984), kap. 14.

Pod pojmom známe alebo prírodné avermektíny sa chápu tie látky, ktoré sú produkované S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 a ATCC 31272, pričom substituentom v polohe 25 je buď izopropyl alebo (S)-sek.-butyl-(lmetylpropyl). Avermektín, ktorý nesie v polohe 25 iný substituent ako izopropyl alebo sek.-butyl (S)-forma sa nazývajú nové avermektíny alebo avermektíny iného ako prírodného pôvodu.

Kmene S. avermitilis, ktoré sú uvedené v hore uvedených US patentových spisoch, produkujú skupinu látok, ktoré sa súhrnne označujú ako C-076. Táto skupina látok pozostáva z ôsmich zreteľne odlišných, avšak blízko príbuzných zlúčenín, ktoré sa zvyčajne označujú ako C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a a B2b. Skupina a uvedených zlúčenín zahrňuje prírodné avermektíny, v ktorých je substituentom v polohe 25 (S)-sek.-butyl, skupina b uvedených zlúčenín zahrňuje tie látky, v ktorých je substituentom v polohe 25 izopropylový zvyšok. Označenie A a B sa týka avermektínov, v ktorých substituentom v polohe 5 je v prvom prípade metoxyskupina a v druhom hydroxylová skupina. Číslo 1 znamená avermektíny, v ktorých sa v polohe 22

- 23 nachádza dvojitá väzba a číslo 2 sa týka avermektínov, ktoré obsahujú v polohe 22 atóm vodíka a v polohe 23 hydroxylovú skupinu.

V priebehu tejto prihlášky nebude použité žiadne identifikujúce označenie, pokiaľ ide o substituent v polohe 25 nových avermektínov. Označenie A1, A2, B1 a B2 bolo zachované pre nové avermektíny, ktorých štruktúrne vlastnosti zodpovedajú hore uvedeným štruktúrnym vlastnostiam doteraz známych avermektínových derivátov.

Tvorba mutans, zbavených účinnosti dehydrogenázy 2-oxokyselín bočného reťazca už bolo uvedené pre Bacillus subtilis v publikácii Willecke a Pardee, J. Biol. Chem. 246', 5264 - 5272 (1971) a pre Pseudomonas putida v publikácii Martin a ďalší, J. Bacteriology, 115, 198 - 204 (1973), tvorba podobných mutans však nebola ešte nikdy popísaná v prípade čeľade Streptomyces.

S. avermitilis Agly-1, mutant, ktorý produkuje v podstate iba aglykóny avermektínu A1a a A2a, bola popísaná v publikácii Schulman a ďalší, J. Antibiot. 38 (11), 1494 - 1498 (1985). V publikácii sa popisuje tiež fermentácia S. avermitilis Agly-1 za prítomnosti sinefungínu, čím je možné dokázať zvýšené produkcie zložiek aglykónu avermektínu B. Rovnako tak pri pestovaní S. avermitilis 0,8, vysoko produkčného kmeňa za prítomnosti sinefungínu ako inhibítora O-metyltransferáz dochádza k produkcii avermektínových derivátov, ktoré sú zbavené O-metylovej skupiny na aglykóne na uhlíkovom atóme v polohe 5 a v oleandrózovej disacharidovej skupine.

US patentový spis č. 4 378 353 popisuje zlúčeniny, príbuzné skupine C076 a ich získavanie pestovaním MA-5218, čo je mutant kmeňa S. avermitilis ATCC 31272, získaný ožiarením tohto kmeňa ultrafialovým svetlom. Mutant je identifikovaný ako ATCC 31780. Zlúčeniny, príbuzné skupine C-076, produkované fermentáciou tohto mutantu nemajú C-076 furánový kruh. Okrem toho v niektorých týchto látkach došlo k odštepeniu jednej alebo obidvoch oleandrózových sacharidových skupín, pričom v iných látkach tejto skupiny došlo k oxidácii skupiny v polohe 5 na ketoskupinu.

Tri skupiny O-metyltransferázových mutantov S. avermitilis, ktorí sú schopné produkovať avermektínové deriváty, v ktorých chýbajú O-metylové skupiny, boli popísané v publikácii Rub a ďalší, 6th International Symposium on the Biology of Actinomycetes, Debrecín, Maďarsko, 26. - 30. augusta 1985 a v publikácii Schulman a ďalší, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744 747 (1987). Prvá z týchto skupín produkuje prevažne avermektíny B vzhľadom k neschopnosti metylácie hydroxylovej skupiny v polohe 5 makrocyklického laktónového kruhu. Druhá skupina týchto mutantov produkuje 3-0, 3-O-bisdemetylavermektíny (avermektíny, ktoré nemajú O-metylový zvyšok ako substituent v polohe 3 na obidvoch oleandrózových monosacharidových zvyškoch), tieto látky sa nazývajú dimetylavermektíny. Tretia skupina mutantov nie je schopná metylácie v žiadnej polohe.

V publikácii Schulman a ďalší, Fed. Proc. 44, 931 (1985) sa popisuje zvýšená produkcia avermektínu B fermentáciou S. avermitilis za prítomnosti rôznych látok, napríklad sinefungínu, S-adenozyletionínu a Sadenozylhomocysteínu, ktoré inhibujú metyláciu hydroxylovej skupiny v polohe 5 aglykónovej skupiny pôsobením enzýmu avermektín B-O-metyltransferázy. Mutanty Streptomyces avermitilis, ktoré nemajú O-metyltransferázovú účinnosť a produkujú zvýšené množstvo zložiek avermektínu B, ktoré boli rovnako popísané napríklad v publikácii Schulman a ďalší, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29, 620 - 624 (1986).

Mutagenézou S. avermitilis je možné získať také mutanty, ktoré už nemajú účinnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín v bočnom reťazci. Tieto mutanty už nemajú schopnosť produkovať väčšie množstvo prírodných avermektínov v neprítomnosti pridaných zlúčenín vzorca RCOOH, v ktorých R znamená izopropyl alebo (S)-sek.-butyl alebo zlúčenín, ktoré je možné previesť na zlúčeniny vzorca RCOOH v priebehu fermentácie. Je však prekvapujúce a neočakávané, že pri pestovaní týchto mutantov došlo k produkcii avermektínov, prírodných i neprírodných v prípade, že tieto mutanty boli pestované za pridania zlúčeniny vzorca R-COOH, v ktorom R je izopropyl alebo (S)-sek.butyl alebo prekurzora zlúčeniny RCOOH. Je ďalej prekvapujúce, že uvedené mutanty, ktorým chýba účinnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín bočného reťazca a ktoré sú neschopné rozkladať L-izoleucín, L-leucín alebo L-valín, sú schopné asimilovať celý rad rôznych zlúčenín do biosyntetických procesov, ktoré prebiehajú pri tvorbe neprírodných avermektínov, pričom dochádza k tvorbe týchto látok, ktoré sú zbavené prítomnosti prírodných avermektínov.

Mutagenézou takto získaných jednoducho blokovaných mutantov vznikajú mutanty, ktoré sú zbavené účinnosti dehydrogenázy 2-oxokyseiín v bočnom reťazci a účinnosti O-metyltransferázy avermektínu B. Takto dvojnásobne blokované mutanty sú neočakávane schopné produkovať v podstate iba prírodné a neprírodné avermektíny B v prípade, že sú pestované v prostredí, ku ktorému bola pridaná zlúčenina všeobecného vzorca R-COOH, v ktorom R má hore uvedený význam.

Ako už bolo uvedené, sú prírodné avermektíny produkované ako komplexná zmes ôsmich od seba odlišných, avšak blízko príbuzných zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorom R znamená izopropyl alebo (S)-sek.-butyl. Jednotlivé zložky tohto komplexu boli izolované v podstate čistej forme, ako bolo uvedené v US patentovom spise č. 4 429 042, pričom spôsob izolácie jednotlivých zložiek je prinajmenšom pracný. Avermektíny B majú zvyčajne vyššiu antihelmintickú účinnosť ako zodpovedajúce avermektíny A. Pri produkcii neprírodných avermektínov (zložky A a B) spôsobom, popísaným v európskom patentovom spise č. 214 731, môže rovnako dochádzať k vzniku prírodných avermektínov v rôznom množstve vzhľadom k prítomnosti dehydrogenázy 2-oxokyseliny v bočnom reťazci a aminokyselín L-valínu a Lizoleucínu v bunkách mikroorganizmov S. avermitilis a v prostredí, v ktorom sú tieto mikroorganizmy pestované.

Schopnosť produkovať iba účinnejšie zložky B prírodného alebo neprírodného pôvodu, minimalizácia kompiexity produktu a počtu zložiek a zvýšenie čistoty zvoleného derivátu avermektínu, a tým i zjednodušenie izolácie jednotlivých zložiek celého komplexu by teda bolo veľmi žiaduce.

Podstata vynálezu

Kmene S. avermitilis, ktoré nemajú účinnosť dehydrogenázy 2oxokyselín s rozvetveným reťazcom, je možné získať mutáciou kmeňov S. avermitilis, produkujúcich avermektín, a to hlavne mutáciou kmeňov S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 alebo NCIB 12121. Získané mutanty nie sú schopné syntetizovať prírodné avermektíny s výnimkou prípadu, že sa do živného prostredia, v ktorých sú tieto mutanty pestované, pridá alifatická kyselina alebo prekurzor alifatickej kyseliny, nesúci izopropylovú alebo sek.-butylovú skupinu (S-formu). Tieto mutanty sú schopné produkovať prírodné a neprírodné avermektíny v prípade, že sú fermentované vo vodnom prostredí za aeróbnych podmienok, pričom živné prostredie obsahuje príslušnú kyselinu alebo zlúčeninu, ktorú je možné na príslušnú kyselinu previesť v priebehu fermentácie.

Tie mutanty, ktoré nemajú účinnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, sa izolujú zo získaných kolónií pri použití 1⁴CO2. Pri tomto postupe je neprítomnosť ^C02 v bunkách, pestovaných na substráte s obsahom [^C-lj^-izolaprónovej kyseliny alebo [¹⁴C-1]-2-oxo-3-metylvalerovej kyseliny alebo [^⁴C-1]-2-oxo-metylmaslovej kyseliny dôkazom neprítomnosti účinnosti dehydrogenázy 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom.

Je prekvapujúce a neočakávané, že popísané mutanty, ktoré nemajú účinnosť dehydrogenázy 2-oxo-kyselín s rozvetveným reťazcom, si uchovávajú schopnosť produkovať avermektíny, hlavne neprírodného pôvodu. Neschopnosť týchto mutantov k produkcii derivátov prírodného koenzýmu A pre acylovú skupinu alifatických kyselín pri pestovaní na bežnom prostredí by mohla byť letálnou mutáciou v prípade, že by integrita membrány závisela od derivátov 2-oxokyselín alebo keby nahromadenie ľ -oxo kyselín bolo cytotoxické. Okrem toho by nebolo možné očakávať, že by uvedené mutanty mohli syntetizovať acetyl CoA alebo propionyl CoA pri degradácii L-izoleucínu a L-valínu, pretože vznik týchto zlúčenín zvyčajne vyžaduje účinnosť enzýmu, ktorú mutanty nemajú. Nutnosť prítomnosti acyl CoA-derivátov pre biosyntézu avermektínu viedla k očakávaniu, že mutanty zrejme nebudú schopné produkcie neprírodných avermektíriov, tento predpoklad však proti všetkému očakávaniu nebol potvrdený.

Neprítomnosť účinnosti dehydrogenázy 2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom v hore popísaných mutantoch má za následok prekazenie syntézy CoA s naviazaným rozvetveným acylovým zvyškom alifatických kyselín z degradácie L-izoleucínu, L-leucínu a L-valínu, takže do fermentačného prostredia sa pridáva kyselina všeobecného vzorca R-COOH (v ktorom R znamená (S)-sek.-butyl alebo izopropyl) alebo prekurzor tejto kyseliny.

Ďalšou mutáciou mutantov, ktorým chýba dehydrogenáza 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, je možné získať mutanty, ktorým okrem iného chýba Ometyltransferáza avermektínu B. Mutanty, ktorým chýba táto 0metyltransferázová účinnosť avermektínu B, nie sú schopné metylácie v polohe C-5 aglykónovej skupiny avermektínu. Mutanty, ktoré uvedenú účinnosť nemajú, produkujú v podstate iba avermektíny B, pretože nie sú schopné produkcie avermektínu A.

Je zrejmé, že je možné na tento účel použiť akýkoľvek mikroorganizmus, ktorý je možné získať transformáciou, transdukciou, genetickou rekombináciou alebo niektorými inými genetickými postupmi pri použití nukleových kyselín alebo ekvivalentného materiálu z popísaných mikroorganizmov, a tak prenesenie vlastností týchto mikroorganizmov na ďalšie mikroorganizmy.

Pod pojmom avermektín alebo avermektíny, tak, ako sa používajú v priebehu prihlášky, sa chápu zlúčeniny ďalej uvedeného vzorca I, v ktorom substituentom R. v polohe 25 môže byť akákoľvek skupina, ktorá je v tejto polohe asimilovateľná určitým kmeňom S. avermitilis, používaným v priebehu spôsobu podľa vynálezu.

Popísané mutanty sú veľmi cenné pre produkty neprírodných avermektínov spôsobom, ktorý bude ďalej popísaný a ilustrovaný jednotlivými príkladmi. Postup je obzvlášť cenný pre výrobu výhodných avermektinových derivátov, t.j. zlúčenín, v ktorých substituentom v polohe 25 je cykloalkyl alebo cykloalkenyl vždy so 4 až 6 atómami uhlíka, prípadne substituovaný alkylovým zvyškom s 1 až 4 atómami uhlíka, 1-metyl-tioetyl alebo heterocyklický kruh s 5 alebo 6 atómami v kruhu a s obsahom kyslíka alebo síry, obzvlášť 3-tienyl alebo 3-furyl.

Mutácia určitého kmeňa čeľade Streptomyces avermitilis, produkujúceho avermektín, sa vykonáva známym spôsobom a je možno pri nej použiť celý rad mutačných činidiel, ako sú napríklad ultrafialové svetlo, X-lúče, pridanie Nmetyl-N¹- nitro-N-nitrózoguanidínu, etylmetánsulfonátu, kyseliny dusitej a horčičného dusíka, napríklad N-metylbis(2-chlóretyl) amínu a podobne. Tvorbu mutácií je možné uskutočniť ako na spórach, tak na vegetatívnych kultúrach kmeňov S. avermitilis, ktoré sú schopné produkovať prírodné avermektíny, je napríklad možné použiť kmeň S. avermitilis ATCC 31272.

Na základe postupov, ktoré sú v odbore veľmi dobre známe, je možné kolónie, získané mutagenézou, podrobiť selekcii na neprítomnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom pri použití biochemických postupov, ktoré dovoľujú vyšetrenie veľkého počtu bakteriálnych kolónií, ktoré boli podrobené náhodnej mutagenéze podľa produkcie ¹⁴CO2 zo zvolených [¹⁴C-1] 2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom, ako bolo popísané v publikácii Tábor a ďalší, J. Bact. 128, 485 - 486, 1976.

Tento postup spočíva v tom, že sa pestujú kolónie získaných mutantov vo vyhĺbeniach mikrotitračnej platne na vhodnom živnom prostredí, prestupnosť buniek sa zvýši pôsobením toluénu a potom sa pridá zvolená [1⁴C-1] 2-oxo kyselina, napríklad kyselina 2-oxoizokaprónová do každého vyhĺbenia a prostredie sa vyšetruje nad jednotlivými vyhĺbeniami na prítomnosť značeného oxidu uhličitého. Je možné tiež použiť kyselinu [1⁴C-1]-2-oxo -3-metylvalerovú alebo kyselinu [^⁴C-1]-2-oxo-3-metylmaslovú namiesto hore uvedenej kyseliny [¹⁴C-1] -2-oxo-izokaprónovej. Produkcia značeného oxidu uhličitého sa ľahko zisťuje tak, že sa jednotlivé vyhĺbenia prekryjú vlhkým filtračným papierom, nasýteným hydroxidom bárnatým, aby bolo možné zachytiť akýkoľvek značený oxid uhličitý a preukázať ho vo forme značeného uhličitanu bárnatého autorádiografiou. Mutanty, ktorým chýba dehydrogenáza 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, poskytujú autorádiogramy, ktoré sa približujú tým, ktoré boli získané od nenaočkovaných kontrolných kolónií, to znamená, že mutanty neprodukujú žiaden značený uhličitan bárnatý.

Takto získané mutanty sa potom podrobia ďalšej m· tagenéze pri použití akéhokoľvek hore uvedeného činidla, ktoré môže spôsobiť vznik mutácie. Takto získané kolónie sa skúšajú na neprítomnosť účinnosti O-metyltransferázy avermektinu B chromatografiou na tenkej vrstve alebo vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou po predchádzajúcej fermentácii, ktorá sa vykonáva za prítomnosti pridaného prekurzora, napríklad kyseliny 2metylmaslovej. Avermektíny A sú v podstate neprítomné v prostrediach, v ktorých boli pestované uvedené mutanty.

Okrem produkcie požadovaných alel daného kmeňa mikroorganizmu mutagenézou umožňuje fúzia protoplastov včlenenie požadovaných alel jedného kmeňa do chromozómu ďalšieho kmeňa. Napríklad kmeň S. avermitilis, ktorému chýba dehydrogenáza 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom a O-metyltransferáza avermektinu B, môže fúziou protoplastov s kmeňom S. avermitilis, ktorý obsahuje hore uvedenú účinnosť, produkovať kmeň S. avermitilis, ktorému chýba iba O-metyltransferáza avermektinu B. Ako je v odbore známe, je možné získať fúziou protoplastov rôzne kombinácie žiaducich alel z divergentných línií a spojiť ich v jedinom kmeni.

Morfologické vlastnosti a vlastnosti pri pestovaní v kultúre sú pre mutantov, získaných v priebehu spôsobu podľa vynálezu podstatne zhodné s vlastnosťami, ktoré boli popísané v US patentovom spise č. 4 429 042. Rozlišujúcou vlastnosťou mutantov, získaných hore uvedeným spôsobom je skutočnosť, že tieto mutanty neobsahujú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom alebo O-metyltransferázu avermektinu B. Tieto vlastnosti je možné preukázať hore uvedeným spôsobom. Nedostatok týchto vlastností má za následok neschopnosť mutantu produkovať prírodné avermektíny B pri pestovaní na definovanom prostredí, ktoré je v podstate zbavené alifatických kyselín všeobecného vzorca RCOOH, v ktorom R znamená izopropyl alebo (S)-sek.butyl alebo zlúčenín, ktoré je možné v priebehu fermentácie na zlúčeninu všeobecného vzorca RCOOH previesť. Taxonomické výskumy, ktoré boli vykonávané v zbierke American Type Culturé Collection, potvrdili, že vlastnosti mutantu 1-3, izolovaného pri použití značeného oxidu kremičitého, sú veľmi blízke vlastnostiam pôvodného kmeňa ATCC 31272, popísaného v US patentovom spise č. 4 429 042 s niektorými výnimkami. Mutant I-3 (ATCC 53567) tvorí podstatne menší počet reťazcov spór ako materský kmeň ATCC 31272. V našich pokusoch nebolo možné použitím rafinózy zlepšiť rast mutantu I-3. Na rozdiel od pokusu, ktorý je uvedený pre kmeň ATCC 31272 v US patentovom spise č. 4 429 024 nebolo možné pozorovať rast mutantu alebo kmeňa ATCC 31272 pri použití sacharózy ako jediného zdroja uhlíka. Mutant I-3 nemá dehydrogenázu 2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom. Dvojnásobne deficientný mutant, kmeň S. avermitilis 7881, ktorý nemá ani dehydrogenázu 2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom, ani O-metyltransferázu avermektínu B, produkovaný ďalšou mutagenézou pri použití kmeňa I-3 (ATCC 53567), má k pôvodnému materskému kmeňu ATCC 31272 podobné taxonomické vzťahy ako mutant i-3.

Kmene Streptomyces avermitilis i-3 a 7881 boli uložené v medzinárodnej zbierke kultúr American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, odkiaľ je možné obidva uvedené kmene voľne získať, len čo bude udelený patent na pôvodnú prihlášku. Tieto kmene boli označené Streptomyces avermitilis ATCC 53567 a ATCC 53692. Uložené kultúry sú v priebehu konania materskej prihlášky dostupné iba podľa ustanovení Commissioner of the United States Patent and Trademark Office pod označením 37 CFR 1.14 a 35 USC 122 v súlade so zákonom. Všetky obmedzenia dostupnosti uvedených mikroorganizmov, uložených v uvedenej zbierke však budú neodvolateľné zrušené, len čo bude na pôvodnú prihlášku udelený patent.

Každý z kmeňov S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 a NCÁB 12121 je schopný produkcie prírodných avermektínov, ktoré je možné označiť všeobecným vzorcom I

prerušovaná čiara v polohe 22 - 23 znamená prípadnú dvojitú väzbu

R¹ znamená hydroxylovú skupinu iba v prípade, že nie je prítomná dvojitá väzba

R2 znamená 4'-(a-L-oleandrozyl)-a-L-oleandrozylskupinu vzorca

CH₃O

ch₃o

R3 znamená atóm vodíka alebo metyl a

R znamená izopropyl alebo (S)-sek.-butyl.

V US patentovom spise č. 4 285 963 sa popisuje avermektín všeobecného vzorca I, ktorý je v polohe 25 substituovaný metylovou a etylovou skupinou, RÍ znamená hydroxylovú skupinu a r3 znamená metylový zvyšok.

V avermektínoch iného ako prírodného pôvodu, ktoré je možné získať spôsobom podľa vynálezu, znamená R odlišný substituent od izopropylovej alebo (S)-sek.-butylovej skupiny.

Zlúčeniny, ktoré sú nevyhnutné pri biosyntéze zlúčenín všeobecného vzorca I, sa nachádzajú v bunke S. avermitilis a v živnom prostredí. Tieto látky vznikajú rozkladom L-valínu a L-izoleucínu alebo z ich zodpovedajúcich 2oxokyselín dekarboxyláciou týchto 2-oxokyselín príslušnou dehydrogenázou za súčasnej väzby získaného produktu na koenzým A. Prítomnosť týchto látok zaisťuje súčasnú produkciu zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorých je substituentom izopropylová skupina a (S)-sek.butylová skupina. Samozrejme, vznikajú problémy pri oddeľovaní derivátov s obsahom izopropylovej skupiny od derivátov, ktoré obsahujú (S)-sek.butylovú skupinu.

V prípade fermentácie v živnom prostredí, ktoré obsahuje príslušné východiskové látky, sú mutanty, získané hore uvedeným spôsobom schopné produkovať zlúčeninu všeobecného vzorca I alebo častejšie zmes dvoch zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorých substituent R zodpovedá použitej východiskovej látke. Je možné získať dva produkty, ktoré sa zvyčajne nazývajú R-avermektín B1 a B2, podľa označenia, ktoré bolo použité v US patentovom spise č. 4 429 0.42. Substituent R sa nachádza v polohe 25 získaného výsledného produktu. Napríklad v prípade, že R znamená cyklopentylový zvyšok, je možné získať nasledujúce dva avermektínové deriváty:

Triviálny názov	R¹	R3
cyklopentyl-avermektín B1	dvojitá väzba	H
cyklopentyl-avermektín B2	hydroxyskupina	H

V avermektínových derivátoch neprírodného pôvodu má substituent R v polohe 25 všeobecného vzorca I odlišný význam od izopropylovej alebo (S)sek.butylovej skupiny.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých je prítomná dvojitá väzba a ktoré neobsahujú hydroxylovú skupinu, je možné získať tiež zo zodpovedajúcich zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorom R¹ znamená hydroxylovú skupinu a zlúčenina neobsahuje dvojitú väzbu dehydratáciou. Reakcia sa vykonáva tak, že sa najprv selektívne chránia hydroxylové skupiny, ktoré sa nachádzajú v polohách 5 a 4, napríklad naviazaním terc.butyldimetylsilyloxyacetylovej skupiny, načo sa vykonáva reakcia so substituovaným tiokarbonylhalogenidom, napríklad so (4-metylfenoxy) tiokarbonylchloridom s následným zahrievaním vo vysoko vriacom organickom rozpúšťadle, napríklad v trichlórbenzéne kvôli dosiahnutiu dehydratácie. V získanom produkte sa potom odštepia ochranné skupiny, čím sa získa nenasýtená výsledná látka. Tento postup spolu s príslušnými reakčnými činidlami a reakčnými podmienkami bol popísaný v US patentovom spise č. 4 328 335.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorom RÍ znamená atóm vodíka a dvojitá väzba nie je prítomná, je možné získať zo zodpovedajúcich zlúčenín, ktoré obsahujú dvojitú väzbu a neobsahujú substituent R1 selektívnou katalytickou hydrogenáciou pri použití príslušného katalyzátora. Redukciu je možné uskutočniť napríklad pri použití tris-(trifenylfosfín)ródiumchloridu s obsahom jednoväzobného rodia, ako bolo popísané v uverejnenej európskej patentovej prihláške č. 0001689 a v zodpovedajúcom US patentovom spise č. 4 199 569, vydanom 22. apríla 1980.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorom R² znarrená atóm vodíka, je možné získať zo zodpovedajúcich zlúčenín, v ktorých R² znamená 4'-(a-Loleandrozyl)-a-L-oleandrozyloxyskupinu tak, že sa odstráni 4'-(a-L-oleandrozyl)α-L-oleandrózová skupina miernou hydrolýzou pôsobením kyseliny v zmesi vody a organického rozpúšťadla, čím sa získa aglykón s hydroxyskupinou v polohe 13. Tento aglykón sa potom halogenuje, napríklad reakciou s benzénsulfonyihalogenidom, čím sa získa 13-deoxy-13- halogénovaný derivát, ktorý sa potom podrobí selektívnej redukcii, napríklad pri použití hydridu tributyicínu. Aby bolo možné zabrániť nežiaducim vedľajším reakciám, je žiaduce chrániť akúkoľvek ďalšiu hydroxylovú skupinu, napríklad naviazaním ochrannej terc.-butyldimetylsilylovej skupiny. Túto skupinu je potom možno ľahko odstrániť po vykonanej halogenácii alebo redukcii pôsobením metanolu, ktorý obsahuje malé množstvo kyseliny. Všetky tieto postupy sú spolu s príslušnými reakčnými činidlami a reakčnými podmienkami pri ich vykonávaní popísané v uverejnenej európskej patentovej prihláške č. 0002615.

Zlúčeniny, ktoré je možné využiť pri fermentácii S. avermitilis pre biosyntézu avermektínov ako prírodného, tak neprírodného pôvodu, je možné vyjadriť všeobecným vzorcom ll-A

R-COOH (ll-A) vrátane zlúčenín, ktoré je možné previesť na zlúčeniny ll-A v priebehu fermentačného postupu. Tieto látky sú tiež nazývané priméry. Vo všeobecnom vzorci ll-A znamená R skupinu s reťazcom, vysvetleným v α-polohe, pričom atóm uhlíka, ku ktorému je viazaná skupina -COOH, je rovnako viazaná na aspoň dva ďalšie atómy alebo skupinu, odlišné od atómu vodíka. Je zrejmé, že toto vymedzenie zahrňuje nasýtené i nenasýtené acyklicke a cyklické skupiny, vrátane skupín, ktoré prípadne obsahujú ako heteroatóm atóm kyslíka alebo síry ako člen acyklického reťazca alebo kruhu.

Substituent R, ktorý sa nachádza v polohe 25, môže teda byť alkylový zvyšok, alkenylový zvyšok, alkinylový, alkoxyalkylový alebo alkyltioalkylový zvyšok vždy s 3 až 8 atómami uhlíka, rozvetvený v polohe a, cykloalkylalkylový zvyšok s 5 až 8 atómami uhlíka, v ktorom alkylová skupina obsahuje 2 až 5 atómov uhlíka a je rozvetvená v polohe a, ďalej cykloalkyl s 3 až 8 atómami uhlíka alebo cykloalkenyl s 5 až 8 atómami uhlíka, vždy prípadne substituovaný metylénovým zvyškom alebo jednou alebo väčším počtom alkylových skupín s 1 až 4 atómami uhlíka alebo atómami halogénu, a to fluóru, chlóru, jódu alebo brómu, ďalej heterocyklický zvyšok s 3 až 6 atómami v kruhu s obsahom kyslíka alebo síry, a to nasýtený alebo celkom alebo čiastočne nenasýtený a prípadne substituovaný jednou alebo väčším počtom alkylových skupín alebo atómov halogénu.

Zlúčeniny, ktoré je možné previesť na zlúčeniny všeobecného vzorca RCOOH, t.j. prekurzory, ktoré je možné v priebehu fermentačného postupu na tieto zlúčeniny prevádzať, je možné vyjadriť všeobecným vzorcom ll-B

R - (CH₂)_n - Z (Π-B) kde R má hore uvedený význam, n znamená 0, 2, 4 alebo 6 a

Z znamená skupiny -CH2OH, -CHO, -CH2NH2, -COOR^ alebo CONHR⁵, kde

R4 znamená atóm vodíka alebo alkylový zvyšok s 1 až 6 atómami uhlíka a'

R⁵ znamená atóm vodíka, alkylový zvyšok s 1 až 4 atómami uhlíka alebo zvyšok aminokyseliny, najmä asparágovej, glutamovej alebo metionínu, napríklad

-CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)2COOH a

-CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃.

Do vynálezu spadajú rovnako izomérne formy zlúčenín všeobecného vzorca ll-A a zlúčeniny, ktoré je na tieto zlúčeniny možno previesť v priebehu fermentačného postupu, a teda i spôsob izomérnych avermektínov v polohe 25, ktoré je možné získať pri použití hore uvedených zlúčenín spôsobom podľa vynálezu.

Spôsob podľa vynálezu sa vykonáva tak, že sa pestuje za aeróbnych podmienok kmeň S. avermitilis, ktorý neobsahuje dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom ani O-metyltransferázu avermektínu B vo vodnom živnom prostredí, ktoré obsahuje využiteľné zdroje dusíka, uhlíka, anorganické soli a zlúčeninu všeobecného vzorca RCOOH alebo zlúčeninu, ktorú je možné na uvedenú zlúčeninu previesť, t.j. prekurzor, ktorý sa na uvedenú látku prevádza v priebehu fermentácie. Uvedená kyselina alebo zlúčenina, ktorú je na túto kyselinu možno previesť, sa do fermentačného prostredia pridáva buď pri naočkovaní živného prostredia alebo v rôznych intervaloch v priebehu fermentácie. Výroba avermektínových derivátov sa sleduje tak, že sa odoberajú vzorky fermentačného prostredia, tieto vzorky sa extrahujú organickým rozpúšťadlom a produkcia analyzuje chromatograficky, napríklad pri použití vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie. Inkubácia trvá tak dlho, kým sa nedosiahne maximálny výťažok výsledného produktu, za bežných podmienok 4 až 15 dní.

S výhodou sa pridáva hore uvedená zlúčenina, a to karboxylová kyselina alebo zlúčenina, ktorú je možné na túto karboxylovú kyselinu previesť v množstve 0,05 až 3,0 g na liter. Zlúčeninu je možné pridávať kontinuálne, prerušovane alebo je možné pridať celé množstvo naraz. Kyselinu všeobecného vzorca RCOOH je možné pridať ako takú alebo vo forme soli, napríklad vo forme soli sodnej, lítnej alebo amónnej alebo vo forme zlúčeniny, ktorú je možné na uvedenú kyselinu previesť, ako už bolo uvedené. V prípade, že sa kyselina nachádza v pevnej forme, s výhodou sa rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad vo vode alebo v alkohole s 1 až 4 atómami uhlíka.

Prostredie, ktoré sa používa pre fermentáciu, môže byť, a to najmä v prípade, že substituentom v polohe 25 má byť izopropylový zvyšok alebo (S)sek.butylový zvyšok, niektoré z bežných prostredí, ktoré obsahujú využiteľné zdroje uhlíka, dusíka a stopových prvkov. V prípade, že substituentom v polohe 25 má byť skupina, ktorá sa v prírodných avermektínoch nevyskytuje, t.j. skupina, odlišná od izopropylovej alebo (S)-sek.butylovej skupiny, je fermentačné prostredie zvolené tak, aby zvolené zložky neobsahovali látky, v ktorých R znamená izopropyl alebo (S)-sek.butyl alebo aby obsahovali iba veľmi malé množstvo týchto látok.

Po fermentácii, ktorá trvá niekoľko dní pri teplote, pohybujúcej sa s výhodou v rozmedzí 24 až 33 °C, sa fermentačné prostredie odstredí alebo sfiltruje a takto oddelené mycélium sa extrahuje, s výhodou pri použití acetónu alebo metanolu. Organický extrakt sa zahustí a požadovaný produkt sa potom extrahuje organickým rozpúšťadlom, miešateľným s vodou, napríklad metylénchloridom, etylacetátom, chloroformom, butanolom alebo metylizobutylketónom. Takto získaný extrakt sa potom odparí do sucha a takto získaný surový produkt sa potom ďalej čistí podľa potreby chromatograficky, napríklad pri použití preparatívnej chromatografie v reverznej fáze alebo vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie.

Výsledný produkt sa zvyčajne získa vo forme zmesi zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorom R2 znamená 4'-(a)-L- oleandrozyl)-a-Loleandrozyloxyskupinu a buď R¹ znamená hydroxylovú skupinu a dvojitá väzba nie je prítomná alebo R“1 znamená atóm vodíka a zlúčenina obsahuje dvojitú väzbu, r3 znamená atóm vodíka. K produkcii zlúčenín, v ktorých znamená metylový zvyšok, v podstate nedochádza. Podiel určitých zlúčenín v získanom produkte sa však môže meniť v závislosti od použitého mutantu mikroorganizmu a od použitého priméru, ako i od použitých fermentačných podmienok.

Zdroje substituentov R, a to či priamo zlúčeniny všeobecného vzorca RCOOH alebo niektorého z ich prekurzorov nemajú žiaden podstatný vplyv na produkciu avermektínového derivátu. Kritickou požiadavkou na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu pre výrobu uvedených derivátov je skutočnosť, aby požadovaná skupina R bola dostupná pre použité kmene S. avermitilis v priebehu fermentačného postupu.

Ako priméry je možné použiť hlavne nasledujúce zlúčeniny:

kyselina 2,3-dimetylmaslová, kyselina 2-metylhexánová, kyselina 2-metyl-4-penténová, kyselina 2-cyklopropylpropiónová, kyselina 4,4-difluórcyklohexánkarboxyiová vo forme lítnej soli, kyselina metyléncyklohexánkarboxylová, kyselina 3-metylcyklohexánkarboxylová (cis/trans), kyselina 1 -cyklopenténkarboxylová, kyselina 1-cyklohexénkarboxylová, kyselina tetrahydropyrán-4-karboxylová, kyselina tiofén-2-karboxylová, kyselina 3-a-furánkarboxylová, kyselina 2-chlórtiofén-4-karboxylová, kyselina cyklobutánkarboxylová, kyselina cyklopenténkarboxylová, kyselina cyklohexánkarboxylová, kyselina cykloheptánkarboxylová, kyselina 2-metylcyklopropánkarboxylová, kyselina 3-cyklohexén-1 -karboxylová, kyselina 2-metylpropiónová, kyselina 2-metyl-4-metoxymaslová, kyselina tiofén-3-karboxylová, hydroxymetylcyklopentán,

3-tiofénkarboxaldehyd, kyselina 3-cyklohexylpropiónová, kyselina 3-cyklopentylpropiónová, hydroxymetylcyklobután, kyselina tetrahydrotiofén-3-karboxylová,

3-cyklopentyl-1 -propanol,

3- metylcyklobutánkarboxylová kyselina vo forme lítnej soli, kyselina 3-fluórcyklobutánkarboxylová, kyselina 3-metyléncyklobutánkarboxylová vo forme lítnej soli, kyselina 2-metyl-4-metyltiomaslová, kyselina tetrahydrotiopyrán-4-karboxylová, cyklobutylmetylamín, etylcyklobutánkarboxylát,

4- hydroxymetylcyklopentén, etylester kyseliny 2-(3-tiofénkarbonyl)propiónovej, kyselina S-2-metylpentánová, kyselina R-2-metylpentánová.

Z mutantov, ktoré neobsahujú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom a ktoré boli popísané, je možné získať tri skupiny mutantov s ohľadom na prítomnosť O-metyltransferázy. Mutanty, v ktorých je mutácia dehydrogenázovej účinnosti pre 2-oxokyseliny s rozvetveným reťazcom spojená s jednou alebo väčším počtom mutácií O-metyltransferázy, dávajú vznik kmeňom S. avermitilis, ktoré budú schopné pri dodaní zlúčenín všeobecného vzorca RCOOH do živného prostredia alebo pri dodaní zlúčenín, ktoré je možné na uvedené látky previesť v priebehu fermentačného procesu, produkovať primárne avermektíny B, demetyl avermektíny alebo avermektíny, ktoré už nie sú vôbec metylované. Uvedené mutanty je možné získať získaním ďalších mutantov z mutantov hore uvedených, ktoré neobsahujú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, a to bežnými postupmi, ako je pôsobenie ultrafialového svetla a/alebo pôsobením chemických mutagénov, napríklad N-metyl-N-nitrózouretánu, nitrózoguanidínu alebo ďalších zlúčenín tak, ako boli hore uvedené. Je tiež možné postupovať tým spôsobom, že sa použijú mutanty, ktoré obsahujú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, avšak neobsahujú jednu alebo väčší počet 0metyltransferáz a dosiahnuť ďalšie mutácie pôsobením ultrafialového svetla alebo pôsobením niektorých mutagénov chemického pôvodu za získania mutantov, ktoré už neobsahujú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom.

Avermektíny neprírodného pôvodu, ktoré sú produkované takto získanými mutantmi, sú charakterizované prítomnosťou hydroxylovej skupiny v polohe 5 aglykónového zvyšku a/alebo v polohe 3' a/alebo v polohe 3 oleandrózovej skupiny.

Hore uvedené mutanty boli identifikované spôsobon·, ktorý bol popísaný v publikácii Schulman a ďalší, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620 - 624 (1986). Takto získané avermektínové deriváty je možné použiť rovnakým spôsobom a na rovnaké účely ako známe avermektínové deriváty.

Podobne je možné získať veľké množstvo avermektínov B vrátane derivátov, ktoré neobsahujú metylovú skupinu na oleandrózovej disacharidovej skupine tak, že sa k fermentácii použijú hore uvedené mutanty, ktoré neobsahujú účinnú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom za prítomnosti niektorých látok, napríklad sinefungínu, S-adenozyletionínu alebo

S-adenoxylhomocysteínu, ktoré spôsobujú inhibíciu účinnosti 0metyltransferázy.

I

Zlúčeniny, získané spôsobom podľa vynálezu sú vysoko účinné antiparazitárne látky, ktoré je možné použiť hlavne ako antelmintiká, ektoparaziticídne, insekticídne a akaricídne prostriedky.

Hore uvedené látky sú teda účinné pri liečení rôznych stavov, ktoré sú spôsobené endoparazitmi, a to hlavne helmintiázy, ktorá je najčastejšie spôsobená skupinou parazitických hlíst, ktoré sa označujú ako nematódy a ktoré môžu spôsobiť ťažké hospodárske straty u bravov, oviec, koní a dobytka i u ďalších hospodárskych zvierat, vrátane hydiny. Uvedené látky sú rovnako účinné proti ďalším nematódom, ktoré napadajú najrôznejšie čeľade zvierat, ako sú napríklad Dirofilaria u psov a voči ďalším parazitom, ktoré môžu napadnúť i človeka vrátane parazitov, ktorí žijú v tráviacej sústave ako Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius a vrátane parazitov, ktorí sa nachádzajú v krvi a ďalších tkanivách, ako sú červy a mimočrevné štádiá Strongyloides a Trichinella.

Tieto látky sú rovnako účinné pri liečení ektoparazitárnych infekcií, ktoré zahrňujú hlavne artropody u zvierat i vtákov, ako sú muchy, ovady, bodalky, ďalší bodavý hmyz a tiež migrujúce larvy čeľade dvojkrídlych, ktoré môžu napadať dobytok a kone.

Uvedené látky majú rovnako insekticídny účinok proti domácim škodcom, ako sú napríklad šváby, mole a mucha domáca. Sú účinné i proti hmyzu na osive a proti parazitom na plodinách, ako i proti migrujúcim jedincom rodu Orthoptera.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa podávajú vo forme prostriedkov, ktoré sú prispôsobené špecifickému použitiu týchto látok a potrebám hostiteľa, je potrebné tiež mať ohľad na to, proti akému parazitovi alebo hmyzu sú zlúčeniny použité. V prípade použitia ako antihelmintika je možné zlúčeniny, získané spôsobom podľa vynálezu podať perorálne ako kapsule, bolus, tabletku alebo v kvapalnej forme alebo možno tieto látky podávať injekčné alebo i v implantovanej forme. Všetky tieto prostriedky je možné pripravovať bežným spôsobom. Kapsule, bolus alebo tabletka sa pripravujú tak, že sa účinná zložka zmieša s vhodným jemne práškovaným riedidlom alebo nosičom, ktorý ďalej obsahuje ešte činidlo, napomáhajúce rozpadu a/alebo spojivo, napríklad škrob, laktózu, mastenec, stearan horečnatý a podobne. Kvapalný prostriedok je možné pripraviť tak, že sa účinná látka disperguje vo vodnom roztoku spolu s dispergačným činidlom alebo zmáčadlom a podobne, prostriedky pre injekčné podanie je možné pripraviť napríklad v forme sterilných roztokov, ktoré môžu obsahovať ešte ďalšie zložky, napríklad dostatočné množstvo solí alebo glukózy, aby bol roztok izotonický s krvou. Tieto prostriedky budú obsahovať rôzne množstvo účinnej látky v závislosti od typu hostiteľa, od závažnosti a typu infekcie a od hmotnosti hostiteľa. Pri perorálnom podaní sa zvyčajne podáva dávka 0,001 až 10 mg/kg hmotnosti v jedinej dávke alebo rozdelene celkom 1 až 5 dní, zásadne je však možné použiť i vyššie alebo nižšie dávky.

Zlúčeniny, získané spôsobom podľa vynálezu, je možné podávať tiež v krmive pre zvieratá, na tento účel je možné pripraviť tiež príslušné koncentráty a prídavné krmivá, určené na premiešanie s bežným krmivom.

Pri použití ako insekticídy a proti poľnohospodárskym škodcom sa zlúčeniny, získané spôsobom podľa vynálezu používajú ako postreky, poprašky, emulzie a podobne bežným spôsobom.

Fermentácia S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567)

Stupeň 1.

S. avermitilis ATCC 31272 sa pestuje v súvislej vrstve na agarovom prostredí (New Patch) po dobu 12 dní pri teplote 30 °C. Použije sa živné prostredie s nasledujúcim zložením:

šťava V-8* 200 ml

CaCO3 agar voda živný bujón octan sodný.3H2O kyselina izovalerová kyselina izomaslová kyselina metylmaslová izoleucín

3g

15g do 1 000 ml

1,0 g/l 1,4 g/l 50 mg/l 50 mg/l 50 mg/l 250 mg/l leucín 250 mg/l valín 250 mg/l roztok stopových prvkov** 1 mg/l * Šťava V-8 je zmes ôsmich zeleninových štiav (paradajka, mrkva, zeler, repa, petržlen, šalát, rerucha a špenát), soli, kyseliny aspergovej a citrónovej a prírodných príchutí (Campbell Soup Company, Camden, N.J.).

** Zloženie roztoku stopových prvkov:

Zložka Množstvo v g

FeCl3.6H₂O 2,7

MnSO4_H2O 4,2

CUSO4.5H2O 0,5

CaCI₂ 11,0

H3BO3 0,62

COCI2.6H2O 0,24

ZnCI₂ 0,68

Na₂MoO4 °.24

Zložky sa rozpustia v 1 I 0,1 N HCl.

Spóry sa odoberú z troch platní a uvedú sa do suspenzie v 20 ml 0,05 M tris-pufra s kyselinou maleinovou s pH 9,0.

Stupeň 2 ml suspenzie spór sa pridá do fľaštičky s obsahom 10 mg N-metyl-N'nitro-N-nitrózoguánidínu (NTG). Fľaštička sa inkubuje za pretrepávania pri teplote 28 °C celkovo 60 minút, načo sa spóry dôkladne premyjú 1 % roztokom chloridu sodného.

Stupeň 3

Premyté spóry sa uvedú do suspenzie v 1 % roztoku chloridu sodného a suspenzia sa zmieša s rovnakým objemom 80 % etylénglykolu. Táto suspenzia sa uchováva pri teplote -10 °C a používa sa ako zdroj buniek, ktoré sa sledujú na prítomnosť mutantov. Z tohto množstva je možné získať približne 10⁴ kolónií buniek/ml.

Tieto spóry sa nanesú na platne s prostredím YPD tak, aby vzniklo približne 100 kolónií na jednej platni. Prostredie YPD obsahuje vždy 10 g/l extraktu z kvasníc, peptónu Bacto a dextrózy a 15 g/l agaru Bacto, prostredie sa upravuje na pH 6,9 pred sterilizáciou v autokláve. Zložky, označené (x) je možné získať od Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238.

Stupeň 4

Jednotlivé kolónie sa izolujú z platní po 2 až 3 týždňoch rastu pri teplote 28 °C a uložia sa do jednotlivých vyhĺbení štandardnej mikrotitračnej platne s 96 vyhĺbeninami. Malé množstvo každej kolónie sa tiež nanesie na čerstvé agarové prostredie, aby bolo možné získať z kolónie ďalší zdroj životaschopných buniek v prípade, že by kolónia bola identifikovaná ako mutant.

Stupeň 5

Do každého vyhĺbenia sa pridá približne 75 mikrolitrov prostredia M9 v kvapalnom stave s obsahom 1 % glukózy, 0,1 % aminokyselín z kazeínu a 0,01 % každej z kyselín izovalerovej, izomaslovej a 2-metylmaslovej. Po niekoľkých dňoch inkubácie pri teplote 28 °C sa bunky sledujú na prítomnosť dehydrogenázy 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom.

Každý liter prostredia M9 obsahuje 6 g hydrogénfosforečnanu sodného, 3 g dihydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu sodného a 1 g chloridu amónneho. Prostredie sa sterilizuje v autokláve a potom sa pridá 1 ml sterilizovaného 1 M síranu horečnatého a 1 ml 0,1 M chloridu vápenatého za aseptických podmienok.

Stupeň 6

Mikrosuspenzia 5 % toluénu v prostredí M9 sa pripraví tak, že sa nemiešateľná zmes podrobí pôsobeniu ultrazvuku. K 25 ml získanej suspenzie sa pridá 1,2 ml roztoku s obsahom [^⁴C-1]-2-oxokaprónovej kyseliny v množstve 2,5 pc/ml a 10,0 pc/pmól. 50 mikrolitrov tejto zmesi sa potom pridá do každého vyhĺbenia nitrotitračnej platne, ktorá obsahuje skúmané kolónie. Stupeň 7

Značený oxid uhličitý, vznikajúci v jednotlivých vyhĺbeniach, sa zachytáva a stanoví spôsobom, popísaným v publikácii Tábor a ďalší, J. Bacteriol. 128, 485 - 486 (1976) Convenient Method for Detecting ^CO2 in Multiple

Samples: Application to Rapid Screening for Mutants. Mutanty, ktoré nemajú dehydrogenázu 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom, neprodukujú väčšie množstvo značeného uhličitanu bárnatého ako kontrolné kolónie.

Ďalším spôsobom, ktorý zlepšuje kontrast medzi kontrolnými pokusmi a pozitívnym pokusom na značený oxid uhličitý, bolo možné preukázať tmavou škvrnou na autorádiograme tvorbu značeného uhličitanu bárnatého, pričom negatívny výsledok nie je vyznačený žiadnou škvrnou alebo iba veľmi svetlou škvrnou.

Jednotlivé kolónie v hore uvedenom stupni 4 sa odoberajú z agarového prostredia už po 7 až 14 dňoch rastu a nie až po dvoch až troch týždňoch ako hore a potom sa priamo sledujú podľa hore uvedených stupňov 6 a 7. Pôvodný stupeň 5 sa v tomto prípade vynechá.

Ešte citlivejší spôsob, ktorým je možné kvantitatívne zisťovať uvoľňovanie značeného oxidu uhličitého, spočíva v tom, že sa zistené mutanty pestujú na vhodnom prostredí, ktoré pozostáva z prostredia M9 s obsahom 1 % glukózy a 0,1 % Syncasa-bcaa, čo je syntetická zmes L-aminokyselín, približne zodpovedajúca bežným aminokyselinám kazeínu, avšak bez L-valínu,

L-izoleucínu a L-leucínu.

Po vypestovaní buniek do vysokej hustoty sa bunky premyjú prostredím M9 a znova sa uvedú do suspenzie v tom istom prostredí s obsahom 1 % toluénu. Toluén bol vopred rozptýlený pôsobením ultrazvuku, takže vznikla mliečne biela disperzia toluénu v prostredí M9. Suspenzia buniek, pufru a toluénu sa inkubuje 40 minút pri teplote 30 °C, čím sa bunky stanú priepustnými. Takto zmenené bunky sa potom premyjú v prostredí M9 a potom sa znova uvedú do suspenzie v 1/5 pôvodného objemu uvedeného prostredia. Na vykonanie skúšky sa potom použije 180 mikrolitrc j takto pripravenej suspenzie.

Reakčný objem 300 mikrolitrov obsahuje bunky, zmenené pôsobením toluénu, 0,4 mM tiamínpyrofosfátu (TPP), 0,11 mM koenzýmu A (CoA), 0,68 mM nikotínamidadeníndinukleotidu (NAD), 2,6 mM ditiotreitolu (DTT), 4,1 mM chloridu horečnatého, 60 mM tris-HCI, s pH 7,5 a 6 000 cpm p^C-1J-2oxoizokapronátu mikrocurie na mikromól. Účinnosť počítania impulzov bola 73 %. Reakcia sa vykonávala v 15 ml scintilačných nádobkách s obsahom 2x2 cm papiera Whatman 4, ktorý bol natlačený do skrutkového uzáveru fľaštičky. Papier obsahuje 30 mikrolitrov 1 M Hyaminhydroxidu (1 M roztok metylbenzetonímhydroxidu v metanole, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), ktorý zachytáva značený oxid uhličitý, vyvíjajúci sa pri reakcii. Zmes sa inkubuje 2 hodiny, načo sa papier ponorí do 10 ml Peckman Aquasol II (univerzálny LSS (kvapalina pre scintilačný počítač), New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118) a rádioaktivita sa meria kvapalinovým scintilačným počítačom po dosiahnutí rovnovážneho stavu v hore uvedenom rozpúšťadle po dobu aspoň 4 hodiny. Slepá kontrola, ktorá neobsahuje žiadne bunky, poskytuje 50 až 300 impulzov za minútu.

Mutant 1-3 a podobné mutanty poskytujú počty impulzov, ktoré približne zodpovedajú slepej reakcii, ktorá neobsahuje bunky, pričom pôvodný kmeň poskytuje niekoľkokrát vyššie počty impulzov ako slepá kontrola.

Zloženie stonásobného koncentrátu Syncasa-bccaa

Zložka g/l

L-alanín 3

L-arginín 4

L-asparágová kyselina 6

L-cystín 1 l_-glutamová kyselina 20 glycín 1

L-histidín 2

L-lyzín 7

L-metionín 3

L-fenylalanín 6

L-prolín 10

L-serín 6

L-treonín 4

L-tyrozín 4

L-tryptofán 1

Zmes sa upraví na pH 7 a sterilizuje sa filtráciou. Jeden objem koncentrátu sa pridá k 99 objemom prostredia, aby bolo možné dosiahnuť štandardné výsledné koncentrácie.

Produkcia dvojnásobne blokovaných mutantov S. avermitilis7881 (ATCC 53692), ktorým chýba dehydrogenáza 2-oxokyselín s rozvetveným reťazcom a O-metyltransferáza pre avermektín B

Stupeň 1

S. avermitilis ATCC 53567 sa pestuje v súvislej vrstve na agarovom prostredí (New Patch) celkovo 12 dní pri teplote 30 °C.

Spóry sa odoberú z troch platní a vedú sa do suspenzie v 20 ml 0,05 M tris-pufra s kyselinou maleinovou s pH 9,0.

Stupeň 2 ml získanej suspenzie spór sa pridá do liekovky, ktorá obsahuje 10 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidínu (NTG). Fľaštička sa inkubuje za stáleho pretrepávania 60 minút pri teplote 28 °C, načo sa spóry dôkladne premyjú 1 % roztokom chloridu sodného.

Stupeň 3

Premyté spóry sa uvedú do suspenzie v 1 % roztoku chloridu sodného a zmiešajú sa s rovnakým objemom 80 % etylénglykolu. Táto suspenzia sa uchováva pri teplote -20 C a používa sa ako zdroj buniek, skúmaných na prítomnosť mutantov.

Spóry sa potom nanesú na platne s prostredím YPD tak, aby sa získalo približne 100 kolónií na jednej platni. Kolónie, ktoré boli spracované pôsobením nitrozoguanidínu so vzniknutými mutáciami kmeňa Streptomyces avermitilis I-3 (ATCC 53567), sa izolujú a nanesú sa na agarové prostredie nasledujúceho zloženia (gramy/liter): 80 škrobu, 1 hydrogénfosforečnanu draselného, 1 MgSO4.7H2O, 5 prostriedku Ardamine pH, 5 uhličitanu vápenatého, 1 ml P2000, 0,01 FeSO₄.7H2O, 0,001 MnCl2.4H₂O, 0,001 ZnSO4.7H₂O, 17 Bacto agaru, destilovaná voda do 980 ml. Potom sa upraví pH na 7,0 hydroxidom sodným, načo sa zmes sterilizuje v autokláve 20 minút pri teplote 121 °C. Po sterilizácii v autokláve sa pridá 20 ml sterilného 5 % zásobného roztoku kyseliny (±)-2-metylmaslovej s pH 7,0.

Agarové kultúry sa inkubujú 8 až 12 dní pri teplote 28 °C. Potom sa bunky (mycelia) z povrchu agaru odoberú a vložia sa do 250 mikrolitrov acetónu. Potom sa 25 mikrolitrov acetónového extraktu nanesie na chromatografické platne pre chromatografiu na tenkej vrstve (Analtech Silica Gel GF). Chromatogram sa vyvíja 30 až 40 minút pri použití etylacetátu ako rozpúšťadla, načo sa usuší a potom sa postrekuje trojpercentným roztokom vanilínu v etanole. Potom sa platne uložia do sušiacej pece pri teplote 100 °C na 1 až 3 minúty, načo sa postriekajú 3 % roztokom kyseliny sírovej v etanole a znova uložia do pece pri teplote 100 °C na 10 až 15 minút Mutanty, ktorým chýba O-metyltransferáza avermektínu B, je možné identifikovať zmenou chromatogramu, škvrny, zodpovedajúcej avermektínu B (Rf približne 0,54, 0,42 pre B1 a B2) sú stále prítomné, avšak škvrny, zodpovedajúce zložkám avermektínu A (Rf približne 0,68, 0,58 pre A1 a A2) chýbajú.

Postup s použitím vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie

Mobilná fáza:

150 ml vody ml acetonitrilu do 1 litra metanol

Stĺpec:

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 926343100) prietok: 0,75 ml/min detekcia: ultrafialovým svetlom a 240 nm zoslabenie: približne 6

Riedidlo pre vzorku (D):

ml acetonitrilu + 390 ml metanolu Štandardy:

1. Naváži sa 0,5 mg avermektínu A2A do banky s objemom 10 ml a objem sa doplní metanolom.

2. Naváži sa 0,5 mg skúmanej látky do banky s objemom 10 ml a objem sa doplní metanolom.

Roztoky 1 a 2 sú štandardné zásobné roztoky. V prípade použitia sa zmieša 100 μΙ roztoku 1 a to isté množstvo roztoku 2 vo fľaštičke a pridá sa 200 μΙ mobilnej fázy.

Vzorky:

1. 1 ml pretrepaného bujónu sa odstredí.

2. Odstráni sa čo najväčšie množstvo supernatantu bez porušenia usadeniny.

3. Pridá sa 100 μΙ vody, vhodnej pre vysokotlakovú chromatografiu k usadenine a usadenina sa teraz disperguje.

4. Pridajú sa 2 ml riedidla D a všetko sa premieša.

5. Výsledná zmes sa sfiltruje a vykoná sa chromatografia.

Avermektínové deriváty prírodného a neprírodného typu tak, ako boli v priebehu prihlášky popísané, boli podrobené hore uvedenej vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii a doba retencie vrcholu pre jednotlivé avermektínové deriváty bola delená retenčnou dobou pre oligomycín A, ktorý bol použitý ako vnútorný štandard. Oligomycín A je takmer vždy pozorovaný pri vysokotlakovej kvapalinovej chromatografii ako vedľajší produkt pri fermentácii S. avermitilis a je jediným produktom, ktorý je možné odlíšiť vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou v produktoch popísaných mutantov v prípade, že tieto mutanty sú pestované v prostredí, zbavenom kyselín všeobecného vzorca RCOOH, v ktorom R má hore uvedený význam alebo prostredí, zbavenom zlúčenín, ktoré je na uvedené kyseliny možné previesť. Typický retenčný čas pre oligomycín A je 12,5 až 14 minút. Podiel retenčných dôb (RT) poskytuje možnosť porovnať totožnosť a výťažky avermektínových derivátov. Poradie, ako sa vymývajú pri vykonaní chromatografie avermektínové deriváty, je B2, A2, B1 a A1 (Obr. 2).

Prírodný RT/RT avermektín (oligomycín A)

B2b	0.70
B2a	0.84
A2b	0.90
A2a	1.09
B1b	1.40
B1a	1.83
A1b	1.83
A1a	2.42

Z tabuľky je zrejmé, že nedošlo k oddeleniu derivátu B1a a A1b od seba navzájom.

Neprírodný avermektín

RT/RT (oligomycín A)

cyklopentyl B2	0.94
cyklopentyl A2	1.23
cyklopentyl B1	1.99
cyklopentyl A1	2.62

Doba retencie bola v rozmedzí 1 až 2 minúty, oligomycín A sa zvyčajne vymýva približne po 12,5 až 14 minútach.

V nasledujúcich príkladoch boli avermektínové deriváty stanovené hore uvedeným postupom, ak nie je uvedené inak.

Boli použité nasledujúce živné prostredia:

Prostredie AS-7 _g£ hydrolyzovaný škrob³ 20

Ardamine pH*³ 5

Pharmamedia^c 15

CaCO₃ 2 ³ Pripravený hydrolýzou škrobu pôsobením α-amylázy z Bacillus licheniformis (Novo Enzymes, Wilton, CT obchodný názov Termamyl), dextrózový ekvivalent je 40 % ± 5 %.

b Je produkt Yeast Products, Inc., Clifton, MJ 07012 ^c Produkt Traders Protein, Memphis, TN 38108.

Prostredie sa upraví na pH 7,2 hydroxidom sodným.

Prostredie AP-5 g/1 hydrolyzovaný škrob 80

Ardamine pH 5

K₂HPO₄ 1

MgSO₄.7H2O 1

NaCl 1

CaCO₃ 7

FeSO₄.7H₂O 0,01

MnCI₂.7H₂O 0,001

ZnSO₄.7H₂O 0,001

P-2000 (protipenivé činidlo)³ 1 ml/l ³ Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640 pH sa upraví na 6,9 25 % hydroxidom sodným.

Príklady 1 až 4

Avermektíny kmeňa Streptomyces avermitilis I-3 (ATCC 53567)

S. avermitilis I-3 (ATCC 53567) zo sporulovanej platne V-8 sa naočkuje do 80 ml prostredia AS-7 v banke s objemom 500 ml. Banka sa inkubuje na rotačnej trepačke za miešania 200 ot./min. pri teplote 28 až 30 °C. Po 24 hodinách inkubácie sa 1 ml živného prostredia použije na naočkovanie buniek s objemom 300 ml a obsahom 40 ml prostredia AP-5. Každá fermentácia sa vykonáva dvakrát pri teplote 28 až 30 °C za prítomnosti 400 ppm každého z hore uvedených primérov, ktoré sa pridávajú po 24 hodinách.

Po 312 hodinách sa vzorky s objemom 2 ml zmiešajú s 8 ml zmesi metanolu a acetonitrilu v pomere 390 : 35. Po filtrácii sa 50 pl vzorky vstrekne do stĺpca Beckman Ultrasphere ODS s rozmerom 3,9 x 250 mm. Stĺpec sa premýva zmesou metanolu, acetonitrilu a vody v pomere 89 : 14 : 7 pri prietoku 0,8 ml/min. a eluát sa sleduje v ultrafialovom svetle pri 240 nm. Retenčné doby nových avermektínov sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:

Primér

1. Kyselina ±2-metylmaslová

2. Kyselina cyklopentánkarboxylová

3. Kyselina cyklohexánkarboxylová

4. Kyselina + 2-metylmaslová

Retenčné doby v minútach

B2	A2	B1	A1
*11.60	*14.75	23.1	29.82
12.40	16.10
12.32	15.86	25.28	32.96
14.84	19.26	31.46	41.14
11.60	14.75	23.1	29.82

* Do avermektínových derivátov je možné včleniť kyselinu +metylmaslovú i metyimaslovú. Za použitia chromatografických podmienok bolo dosiahnuté vzájomné oddelenie + a - avermektínu iba v prípade derivátu B2 a A2.

Príklad 5

Cyklohexyl avermektínu, produkovaný kmeňom Streptomyces avermitilis 7881 (ATCC 53692)

Zmrazená kultúra S. avermitilis 7881 (ATCC 53692) sa naočkuje do 100 ml prostredia AS-7 v bankách s objemom 500 ml. Banky sa inkubujú na rotačnej trepačke pri 200 ot./min. a teplote 28 až 30 °C. Po 28 hodinách inkubácie sa vždy 5 ml prostredia použije na naočkovanie ďalších 100 ml prostredia AS-7, obsiahnutého v banke s objemom 500 ml. Tieto banky sa znova inkubujú na rotačnej trepačke pri 200 ot./min. s teplotou 28 až 30 °C. Po 24 hodinách inkubácie sa 1 ml prostredia použije na naočkovanie baniek s objemom 300 ml s obsahom 40 ml prostredia AP-5. Banky sa inkubujú pri teplote 28 až 30 °C pri 200 ot./min. Po 24 hodinách sa pridá 400 ppm kyseliny cyklohexánkarboxylovej, po 312 hodinách sa odoberú vzorky s objemom 2 ml a vykonáva sa vysokotlaková kvapalinová chromatografia spôsobom podľa príkladu 1. Za týchto podmienok sa jediné zložky avermektínu, zistené vo fermentačnqm prostredí, vymývali po 14,84 minútach (54,9 mg/l) a po 31,46 minútach (32,1 mg/l), čo zodpovedá avermektínu cyklohexyl B2 a B1.

Príklad 6

Sek.butyl avermektínové deriváty zo 53692) ivermitilis 7881 (ATCC

Bol opakovaný spôsob podľa príkladu 5 s tým rozdielom, že bolo použitých 400 ppm kyseliny ±2-metylmaslovej namiesto kyseliny cyklohexánkarboxylovej, inak boli podmienky rovnaké ako v príklade 2. Vo fermentačnom prostredí bolo možné preukázať iba sek.butyl avermektín B2 (11,60, 12,40 minút, 63,5 a 42,4 mg/l) a sek.butylavermextín B1 (23,1 minút, 105,5 mg/l).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Streptomyces avermitilis ATCC 53692 , ktorý nemá dehydrogenázovú aktivitu 2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom a O-metyltransferázovú aktivitu avermektínu B charakterizovaný neschopnosťou svojich permeabilizovaných buniek produkovať ¹⁴ C0₂ z pridanej [¹⁴C-1 ] -2-oxoizokaprónovej kyseliny.

2. Spôsob prípravy avermektínu B, vyznačujúci sa tým, že sa za aerobných podmienok fermentuje kmeň Streptomyces avermitilis, ktorý nemá dehydrogenázovú aktivitu 2-oxo kyselín s rozvetveným reťazcom a 0metyltransferázovú aktivitu avermektínu B, po dobu až 15 dní, pri teplote v rozmedzí od 24°C do 33°C vo vodnom živnom prostredí obsahujúcom využiteľný zdroj dusíka, uhlíka a anorganických solí, ako je hydrolyzovaný škrob, Ardamine pH, uhličian vápenatý CaCO₃, hydrogénfosforečnan draselný K2HPO4, síran horečnatý MgSÔ₄, chlorid sodný NaCl, síran železnatý FeSO₄, chlorid manganatý MnCI₂ a síran zinočnatý ZnSO₄ a zlúčeninu schopnú utilizácie pri biosyntéze avermektínu, ktorá má všeobecný vzorec

R-COOH v ktorom znamená R skupinu s α-rozvetveným reťazcom, ktorého uhlíkový atóm, na ktorý je viazaná skupina -C00H, je viazaný na prinajmenšom dva iné atómy, alebo skupiny iné ako vodík, alebo zlúčeninu, ktorú je možné na uvedenú zlúčeninu previesť v priebehu fermentácie.

3. spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že ako zlúčenina, ktorá je premeniteľná na substrát všeobecného vzorca R-COOH, sa použije zlúčenina všeobecného vzorca

R-(CH₂)_n-Z v ktorom má R už uvedený význam n je 0,2,4 alebo 6

Zje skupina -CH₂OH, -CHO, -COOR⁴ , -CH₂NH₂ alebo -CONHR⁵, v ktorých R⁴ je atóm vodíka, alebo alkylová skupina obsahujúca 1 až 6 atómov vodíka a

R⁵-je atóm vodíka, alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, -CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH , alebo -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃.

4. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že v uvedenej zlúčenine ja skupinou R cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina, cyklohexylová skupina, cykloheptylová skupina , 2-metylcyklopropylová skupina, 3cyklohexenylová skupina, 1-cyklopentenylová skupina, 1-cyklohexenylová skupina, 3-metylcyklohexenylová skupina (cis/trans), 4 metyléncyklohexylová skupina, 3-metylcyklobutylová skupina, 3-metyléncyklobutylová skupina, 3cyklopentenylová skupina, 1-cyklopropyletylová skupina, 3-fluórcyklobutylová skupina, 4,4-difluórcyklohexylová skupina, izopropylová skupina, sekundárna butylová skupina, 2-pentylová skupina, 2,3-dimetylpropylová skupina, 2hexylová skupina, 2-pent-4-enylová skupina, 2-metyltioetylová skupina, S-2pentylová skupina, R-2-pentylová skupina, 2-tienylová skupina, 3-tienylová skupina, 4-tetrahydropyranylová skupina, 3-furylová skupina, 2-chlórtienylová skupina, 3-tetrahydrotienylová skupina, 4-metyltio-2-butylová skupina, 4tetrahydrotiopyranylová skupina, 4-metoxy-2-butylová skupina, alebo 4metyltio-2-butylová skupina.

I

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že skupina R je odvodená od karboxylovej skupiny všeobecného vzorca R-COOH.

6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že, R je cyklopentylová skupina, cyklohexylová skupina, alebo tienylová skupina.

7. Spôsob úpodľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že, skupina R je odvodená od zlúčeniny premeniteľnej na zlúčeninu R-COOH v priebehu fermentačného postupu, pričom táto zlúčenina má všeobecný vzorec

R-(CH₂)„-z v ktorom má R už uvedený význam, n je 0,2,4 alebo 6

Zje skupina -CH₂OH, -CHO, -COOR⁴, -CH₂NH₂ alebo -CONHR⁵, v ktorých R⁴ je atóm vodíka, alebo alkylová skupina obsahujúca 1 až 6 atómov vodíka a

R⁵ je atóm vodíka, alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, -CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH , alebo -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃.

8. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že,skupinou R je arozvetvená alkylová skupina obsahujúca 3 až 8 atómov uhlíka, ktorou nie je izopropylová skupina, alebo (S)-sek.butylová skupina.

9. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že, uvedeným kmeňom