KR100415395B1 - 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법 - Google Patents

에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100415395B1
KR100415395B1 KR10-2000-0044896A KR20000044896A KR100415395B1 KR 100415395 B1 KR100415395 B1 KR 100415395B1 KR 20000044896 A KR20000044896 A KR 20000044896A KR 100415395 B1 KR100415395 B1 KR 100415395B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
evermectin
gene
methyltransferase
dna fragment
streptomyces
Prior art date
Application number
KR10-2000-0044896A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020011558A (ko
Inventor
이정준
홍영수
이정형
김항섭
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR10-2000-0044896A priority Critical patent/KR100415395B1/ko
Publication of KR20020011558A publication Critical patent/KR20020011558A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100415395B1 publication Critical patent/KR100415395B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제(Avermectin B C-5-O-methyltransferase)의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스(Strepto-myces avermitilis) 변이균주 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우수한 구충활성을 보이는 에버멕틴 B 계열 화합물을 에버멕틴 A 계열 화합물로 변환시키는 효소인 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴되어 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산하는 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주는 에버멕틴 A 계열 화합물의 생산이 차단되어 우수한 구충활성을 보이는 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산함으로써 생산성이 향상되고 분리정제 공정이 단순화되어 에버멕틴 B 계열 화합물의 대량생산에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

에버멕틴 Ｂ Ｃ-5-Ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조방법{Streptomyces avermitilis mutant, which avermectin B C-5-O-methyltransferase gene is destroyed and a method for preparing it}
본 발명은 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제(Avermectin B C-5-O-methyltransferase)의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스(Strepto-
myces avermitilis) 변이균주 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우수한 구충활성을 보이는 에버멕틴 B 계열 화합물을 에버멕틴 A 계열 화합물로 변환시키는 효소인 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴되어 에버멕틴 B 화합물만을 생산하는 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
에버멕틴은 1979년경 처음으로 발견되었으며 가축에 기생하는 기생충인 네마토드(nematodes), 각종 곤충 및 진드기(insects, lice, mites 및 ticks)에 대하여 구충활성을 나타내는 화합물이다(Burg, R. W.et al., Antimicrob. Agent. Chemother. 15, 563-571, 1979). 에버멕틴은 무척추동물에서 신경전달 물질로 작용하는 γ-아미노부티릭 산(γ-aminobutylic acid; GABA) 수용체와의 비가역적인 결합을 통하여 염소이온 통로(Chloride ion channel)를 개방함으로써 기생충의 지속적인 근육마비를 유발하여 살충효과를 나타내는 것으로 알려져 있는데(Needleman, P.et al., Ann. Rev. Biochem. vol. 55, 69-102, 1986), 이러한 작용기작은 구충활성을 나타내는 다른 화합물에서는 볼 수 없는 독특한 작용기작이다. 또한, 에버멕틴은 기존의 기생충약제에 내성을 갖는 기생충들에도 살충효과가 뛰어나고, 일반적으로 알려진 살충제 및 항 진드기제와의 상호저항성(cross-resistant)도 나타내지 않는다.
하기 화학식 1로 나타내는 에버멕틴은 16 개의 탄소를 가진 마크로사이클릭 락톤(16-membered macrocyclic lactone)에 두 개의 당이 결합된 구조를 가지며 치환기에 따라 8 개의 유사한 화합물들로 나누어진데, 이들 8 가지 화합물들은 하기 표 1에 나타나 있다.
<화학식 1>
<표 1>
에버멕틴 화합물은 상기 화학식 1의 5 번 탄소에 존재하는 수산기(Hydroxy group)가 메틸화(Methylation) 되었는가에 따라 에버멕틴 A 계열과 B 계열로 나누어지고, 탄소 22 번과 23 번 사이에 이중결합(Double bond)을 가지고 있는 에버멕틴 화합물은 "1"로 표시하고 탄소 23 번에 수산기를 포함한 단일결합(Single bond)을 가지는 화합물은 "2"로 표시한다. 또한, 탄소 25 번에 부틸기(sec-butyl)를 갖는 화합물은 "a"로 표시하며 이소프로필기(isopropyl)를 갖는 화합물은 "b"로 표시한다. 상기와 같이 구분되는 에버멕틴 화합물들 중 에버멕틴 B1a 및 B1b로 구성되는 혼합물은 동물에 기생하는 기생충에 대하여 우수한 항기생충 효과를 나타내는 항기생충제(antiparasitic agents)로 이용되고 있을 뿐만 아니라, 인간에게 온코서시아시스(onchocerciasis, river blindness)라는 실명증을 유발하는 사상충(filarial worm)의 일종인 온코서카 볼부러스(Onchocerca volvulus)에 대해서도 우수한 항기생충 효과를 나타내어 온코서시아시스의 치료제로 이용되고 있다.
상기한 바와 같이, 에버멕틴 화합물 중에서는 에버멕틴 B 계열 화합물만이 우수한 구충활성을 나타내는데, 일반적인 에버멕틴 생산균주는 8 개의 에버멕틴 유사화합물을 동시에 생산하기 때문에 우수한 항기생충 효과를 나타내는 에버멕틴 B 계열 화합물의 정제가 용이하지 않으며 생산량도 적다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 항기생충 효과가 우수한 에버멕틴 B 계열 화합물의 생산량을 증가시키면서 효율적으로 정제할 수 있는 새로운 균주 개발의 필요성이 제시되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 에버멕틴 B 계열 화합물을 A 계열 화합물로 전환시키는 효소로 작용하는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주를 개발하여 우수한 구충활성을 가지는 에버멕틴 B 계열 화합물의 생산증대와 정제공정의 단순화를 가능하게 함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 우수한 구충활성을 보이는 에버멕틴 B 계열 화합물의 생산증대와 정제공정의 단순화를 위하여 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴되어 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산하는 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 에버멕틴 생합성 유전자를 포함하는 코스미드 클론(Cosmid clone) pKC3-37 DNA 단편의 개열지도 및 상기 DNA 단편을BamHI으로 절단하여 얻어지는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자와 폴리키타이드 합성효소(Polyketide synthase, 이하 'PKS'로 약칭함) 유전자의 일부를 포함하는 3.4 kb DNA 단편의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 2는 상기도 1의 DNA 단편을 이용하여 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자 파괴용 벡터의 제작과정 및 개열지도를 나타낸 것이고,
도 3은도 1의 3.4 kb DNA 단편을 탐침(Probe)으로 이용하여 에버멕틴 A 계열 화합물을 생산하지 못하는 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주의 염색체를 DNA를 서던 블러팅(Southern blotting)한 결과를 나타낸 것이고,
M: 분자량 마커(size marker)
1: 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6 야생균주의 염색체 DNA
2: 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주의 염색체 DNA
도 4는 네오마이신 내성유전자(Neomycin resistant gene)를 탐침으로 이용하여 에버멕틴 A 계열 화합물을 생산하지 못하는 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이주의 염색체를 DNA를 서던 블러팅한 결과를 나타낸 것이고,
M: 분자량 마커(size marker)
1: 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6 야생균주의 염색체 DNA
2: 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주의 염색체 DNA
도 5는 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6 야생균주의 추출액내 에버멕틴 화합물들을 고속 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, 이하 'HPLC'로 약칭함)로 분석한 결과를 나타낸 것이고,
B1a, B1b, B2a, B2b, A1a, A1b 및 A2a : 에버멕틴 화합물
올리고 A 및 C : 올리고마이신 A 및 C
도 6은 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주의 추출액내 에버멕틴 화합물들을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
B1a, B1b, B2a, B2b, A1a, A1b 및 A2a : 에버멕틴 화합물
올리고 A 및 C : 올리고마이신 A 및 C
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에버멕틴 B 계열 화합물을 A 화합물로 변환시키는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 절편의 중간에 항생제 내성유전자가 삽입된 DNA 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 단편을 함유하는 넉아웃 벡터(knockout vector)를 제공한다.
더불어, 본 발명은 상기 넉아웃 벡터로 형질전환되어 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 유전자 변이균주를 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 유전자 변이균주의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 에버멕틴 B 계열 화합물을 에버멕틴 A 계열 화합물로 변환시키는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 절편의 중간에 항생제 내성유전자가 삽입된 DNA 단편을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자에 제 1 제한효소를 처리하여 상기 유전자의 일부를 포함하는 DNA 단편을 분리하고, 상기 DNA 단편내에 위치하는 제 2 제한효소 절단 위치에 항생제 내성유전자를 삽입시킨 DNA 단편을 제공한다.상기에서, 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 일부분을 포함하는 DNA 단편을 제조하기 위한 제 1 제한효소와 항생제 내성유전자를 삽입시키기 위하여 사용하는 제 2 제한효소는 동일할 수도 있고 또한 다를 수도 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 제 1 제한효소로SalI 제한효소를 사용하였고 제 2 제한효소로BspEI 제한효소를 사용하였으나, 반드시 여기에 한정되지 않음은 당업자에게 있어서 자명하다.
상기 DNA 단편에는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 전체가 포함될 수 있지만 효율적인 클로닝을 위하여 상기 유전자의 일부분이 포함되는데, 이 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 일부분은 에버멕틴 생산균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스 ATCC 31271의 염색체 DNA 라이브러리 클론(Chromosomal DNA library)에서 유래한 것이다(도 1참조).
또한, 본 발명자들은 바람직한 실시예로서 상기 DNA 단편에 포함된 항생제 내성유전자로 pFDNEO-S 벡터(Denis, F. and Brezezinski, R., FEMS Microbiology Letters81, 261-264, 1991)에서 유래한 네오마이신 내성유전자를 이용하였지만(도 2참조), 티오스스랩톤(Thiostrepton), 하이그로마이신(Hygromycin), 테트라사이클린(tetracyclin) 등의 다른 항생제에 대한 내성유전자도 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 단편을 함유하는 넉아웃 벡터를 제공한다.
상기 DNA 단편이 삽입된 넉아웃 벡터를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 온도 감수성 벡터에 본 발명의 DNA 단편을 클로닝하였다(도 2참조). 본 발명에서이용하는 온도 감수성 벡터는 대장균 및 스트렙토마이세스에서 복제할 수 있는 셔틀벡터이고 아프라마이신(apramycin) 내성유전자를 포함하고 있어 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체의 선별이 용이하다.
본 발명의 DNA 단편을 상기 온도 감수성 벡터에 클로닝하여 넉아웃 벡터를 제조하였기 때문에 본 발명의 넉아웃 벡터는 온도 감수성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 넉아웃 벡터가 형질전환된 균주를 고온에서 배양하면 항생제 내성유전자가 효율적으로 염색체 DNA내의 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자에 삽입된다. 본 발명에서 넉아웃 벡터를 제조하기 위하여 이용한 온도 감수성 벡터 이외에 DNA 단일가닥 DNA(Single strand DNA) 또는 파아지(Phage)등도 삽입수단으로 이용될 수 있다
더불어, 본 발명은 상기 넉아웃 벡터로 형질전환되어 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 유전자 변이균주를 제공한다.
본 발명자들은 상기에서 제조된 넉아웃 벡터를 에버멕틴 고생산 균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스에 형질전환시켜 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자를 파괴함으로써 에버멕틴 B 계열 화합물만 생산하는 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주를 제조하여 '스트렙토마이세스 에버미티리스 M21'이라 명명하고 2000년 6 월 13일자로 생명공학연구소 유전자은행(수탁번호 : KCTC 18023P)에 기탁하였다.
본 발명의 넉아웃 벡터를 에버멕틴 고생산 균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스에 형질전환시키면 넉아웃 벡터내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 일부 염기서열과 염색체내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 염기서열이 동일하여 염기서열간의 상동 재조합 현상(Homologous recombination)이 유도된다. 상기 상동 재조합 현상으로 염색체내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 일부와 벡터내 DNA 단편(네오마이신 내성유전자 + 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 일부)이 교환되어 네오마이신 내성유전자가 염색체내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자에 삽입됨으로써 상기 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주가 제조된다.
본 발명자들은 서던 블러팅을 수행하여 본 발명에서 개발한 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주의 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된 것을 확인하였고(도 3및도 4참조), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, 이하 'TLC'로 약칭함) 및 HPLC를 이용하여 상기 변이균주가 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산함을 확인하였다(도 5및도 6참조).
마지막으로, 본 발명은 상기 유전자 변이균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 유전자 변이균주의 제조방법은
1) 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻는 단계(단계 1);
2) 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계(단계 2);
3) 상기 재조합 벡터에 클로닝된 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 DNA 단편에 항생제 내성유전자를 삽입하는 단계(단계 3);
4) 제한효소를 처리하여 항생제 내성유전자를 포함하는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 DNA 단편을 얻고, 이를 포함하는 넉아웃 벡터를 제조하는 단계(단계 4);
5) 상기 넉아웃 벡터를 에버멕틴 고생산균주에 형질전환시키는 단계(단계 5); 및
6) 항생제를 이용하여 상기 넉아웃 벡터가 형질전환되어 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된 변이균주를 선별하는 단계(단계 6)로 이루어진다.
상기 단계 1을 구체적으로 설명하면, 코스미드 벡터를 이용하여 에버멕틴 생산균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스 ATCC 31271로부터 염색체 DNA 라이브러리(Chromasomal DNA library)를 제조한 후 이 라이브러리로부터 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 및 PKS 유전자가 포함된 클론을 선별하여BamHI 3.4 kb DNA 단편을 얻었다.
상기 단계 2를 구체적으로 설명하면, 상기 DNA 단편에 제한효소SalI을 처리하여 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 일부가 포함된 1.4 kb 단편을 얻고, 이 단편을 대장균 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 제조하였다.
상기 단계 3을 구체적으로 설명하면, pFDNEO-S 벡터를 제한효소SalI으로 절단하여 네오마이신 내성유전자를 포함하는 1.1 kb의 DNA 단편을 얻은 후 이를 상기 재조합 벡터내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 단편 중간에 존재하는 제한효소 부위에 삽입하였다.
상기 단계 4를 구체적으로 설명하면, 네오마이신 내성유전자를 포함하는 2.5 kb DNA를 얻고, 이 2.5 kb DNA 단편을 대장균/스트렙토마이세스 셔틀벡터의 일종인 온도 감수성 벡터에 클로닝하여 넉아웃 벡터를 제조하였다.
상기 단계 5를 구체적으로 설명하면, 상기 단계 4에서 제조된 넉아웃 벡터를 에버멕틴 고생산 균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6에 표준방법을 이용하여 형질전환시켰다.
상기 단계 6을 구체적으로 설명하면, 형질전환 후 아프라마이신(apramycin)이 첨가된 배지에서 배양하여 형질전환체를 일차적으로 선별하고, 선별된 형질전환체를 네오마이신이 함유된 배지에 배양하여 염색체 DNA내로 넉아웃 벡터내 네오마이신 유전자가 삽입된 유전자 변이균주를 선별하였다.
상기와 같이 선별된 유전자 변이균주는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴되어 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산하는 균주로서 에버멕틴 B 계열 화합물의 생산량을 증가시키고 정제를 용이하게 하여 에버멕틴 B 계열 화합물의 대량생산에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 클로닝
에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자를 클로닝하기 위하여, 스트렙토마이세스 에버미티리스 ATCC 31271 균주의 염색체 DNA 라이브러리를 코스미드 벡터 pKC505(Richardson, M.A.et al.,Gene61, 231-241, 1987)를 이용하여 구축한 후 상기 라이브러리에서 PKC 유전자가 포함된 클론들을 콜로니 하이브리디제이션(Colony hybridization)을 통하여 선별하고, 상기 클론들로부터 분리한 DN에 제한효소BamHI을 처리하여 아가로스 겔상에서 절단된 DNA 단편들의 양상을 분석하였다. 이 때,BamHI DNA 단편 양상이 이미 보고된 것(Hong, Y.S.et al., Biotechnology letters, vol. 20(10), 991-995, 1998)과 일치하는 클론을 선별하고 이를 'pKC3-37'이라 명명하였다(도 1). 상기 클론으로부터 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 및 PKC 유전자를 포함한BamHI DNA 단편을 얻기 위하여, 3.4 kbBamHI DNA 단편을 아가로스 겔에서 절개한 후 제솝 키트(Jetsorb kit, Genomid Co, Germany)를 이용하여 겔로부터 상기 DNA 단편을 정제하였다. 상기 3.4 kb의BamHI 단편을 대장균/스트렙토마이세스 셔틀 벡터인 pWHM3(Hutchinson, C. R., University of Wisconsin, Madison, USA)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였고, 이 벡터를 'pWHM-Met'이라 명명하였다. 상기 재조합 벡터 pWHM-Met를 스트렙토마이세스 리비단스 1326 균주에 형질전환시키기 위하여, 먼저 스트렙토마이세스 리비단스 1326 균주를 R2YE 배지(Hopwood, D. A.et al., Genetic ManipulationofStreptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, England, 1985, P 236)에서 72 시간 배양하여 모든 균체를 10.3% 수크로즈(Sucrose) 용액으로 2 회 세척한 후 일반적인 방법으로 원형질체(competent cell)를 제조하였다. 상기 원형질체에 재조합 벡터 pWHM-Met를 형질전환시킨 후 100 ㎍/㎖의 아프라마이신이 함유된 R2YE 한천배지에 배양하여 형질전환체를 선별하였다.
상기 형질전환체에 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 클로닝 되었는지 확인하기 위하여, 상기 형질전환된 스트렙토마이세스 리비딘스 1326 균주에 에버멕틴 A를 첨가해준 후 에버멕틴 B로 전환되는 비율을 측정한 결과 첨가된 에버멕틴 A의 30%가 에버멕틴 B로 전환되었다. 또한, 상기 형질전환 균주는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 생전환 활성측정을 위한 기질로 사용되는 밀베마이신 D(Milbemycin D, Takiguchi, Y.et al. J. Antibiotics33, 1120-1127, 1980)를 메틸화 형태의 밀베마이신 G로 전환시켰다(Hong, Y.S.et al., Biotechnology letters, vol. 20(10), 991-995, 1998). 이러한 결과는 상기 재조합 벡터 pWHM-Met에 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자를 포함하는 3.4 kb DNA 단편이 삽입되었음을 의미한다.
<실시예 2> 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자내 네오마이신 내성유전자가 삽입된 넉아웃 벡터의 제조
에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자를 파괴하기 위한 넉아웃 벡터를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1에서 얻은 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자와 PKS 유전자를 포함하는 3.4 kbBamHI DNA 단편을 제한효소SalI으로 절단하여 아가로스 겔 상에서 분리한 후, 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자일부만을 포함하는 1.4 kb DNA 단편을 젤에서 절개하고 겔로부터 DNA를 정제하였다. 상기 정제된 1.4 kb의 DNA 단편을 pUC19 벡터(Yanisch-Perron, C.et al.,Gene33, 103-119, 1985)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 'pUC-Met14'이라 명명하였다(도 2).
네오마이신 내성유전자를 포함하는 pFDNEO-S 벡터(Denis, F. and Brezezinski, R., FEMS Microbiology Letters81, 261-264, 1991)를 제한효소SalI으로 절단하여 네오마이신 내성유전자를 포함하는 1.1 kb의 DNA 단편을 얻은 후 이를 상기 재조합 벡터 pUC-Met14의 1.4 kb DNA 단편내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 중간에 존재하는 제한효소BspE1 부위에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 'pUC-Met'이라 명명하였다(도 2).
상기 재조합 벡터 pUC-Met를 대장균 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 50 ㎍/㎖의 앰피실린(ampicillin)을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 한천배지에서 배양하여 형질전환체를 선별하였다(Sambrook, J.et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual).
상기 형질전환체에서 분리된 재조합 벡터 pUC-Met를 제한효소EcoRI 및HindIII로 각각 절단하고 아가로스 겔상에서 분리한 후 2.5 kb의EcoRI/HindIII DNA 단편을 제솝 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 2.5 kb의EcoRI/HindIII DNA 단편을 온도 감수성 벡터인 pKC1139(Bierman, M.,et al.,Gene116, 43-49, 1992)에 삽입하여 제조합 벡터를 제조하였고(도 2), 상기 넉아웃 벡터를 'pKC-Met'이라 명명하였다.
<실시예 3> 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주의 제조
에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴되어 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산하는 유전자 변이균주를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 넉아웃 벡터 pKC-Met를 에버멕틴 고생산균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6에 형질전환시킨 후 25 ㎍/㎖의 아프라마이신(apramycin)이 함유된 R2YE 한천배지에서 배양하여 형질전환체를 선별하였다
선별된 형질전환체중 넉아웃 벡터 pKC-Met내 네오마이신 유전자가 염색체 DNA에 삽입된 유전자 변이균주를 선별하기 위하여, 네오마이신이 첨가된 액체 R2YE 배지에 접종한 후 39℃에서 3 일간 배양한 다음, 25 ㎍/㎖의 네오마이신이 포함된 한천배지에서만 성장하는 유전자 변이균주를 선별하였다. 본 발명자들은 상기 유전자 변이균주를 '스트렙토마이세스 에버미티리스 M21'이라 명명하여 생명공학연구소 유전자 은행에 2000년 6월 13일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 18023P).
상기 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주의 염색체 DNA내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 넉아웃 벡터 pKC-Met의 삽입에 의하여 파괴되었음을 확인하기 위하여, 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6 야생균주 및 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주를 네오마이신이 포함되지 않은 액체배지에 배양하여 각각의 염색체 DNA를 분리하여 제한효소BamHI으로 절단한 후 실시예 1의 3.4 kbBamHI DNA 단편 및 실시에 2의 네오마이신 내성유전자를 포함하는 1.1 kb DNA 단편을 탐침으로 이용하여 서던 블러팅을 수행하였다. 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 3.4 kbBamHI DNA 단편을 탐침으로 이용한 결과, 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6 야생균주의 염색체 DNA에서는 3.4 kb 크기의 DNA 밴드(band)가 탐지되었고, 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주의 염색체 DNA에서는4.5 kb 크기의 DNA 밴드가 탐지되었다. 이러한 결과는 본 발명의 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주의 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 중간에 1.1 kb 네오마이신 내성유전자 단편이 삽입되어 있음을 나타낸다(도 3). 또한, 네오마이신 내성유전자를 탐침으로 이용한 결과, 야생균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6의 염색체 DNA에서는 네오마이신 내성유전자를 포함하는 4.5 kb의 DNA 단편이 탐지되지 않았지만, 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된 균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21의 염색체 DNA에서는 4.5 kb의 DNA 단편이 탐지되어 본 발명의 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주의 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자 중간에 1.1 kb 네오마이신 내성
유전자 단편이 삽입되어 있음을 다시 확인하였다(도 4).
<실시예 4> 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 균주의 에버멕틴 생산양상 조사
본 발명의 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주가 염색체 DNA내 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 파괴로 인하여 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산함을 확인하기 위하여, 상기 유전자 변이균주가 생산하는 에버멕틴 화합물들의 종류를 HPLC 및 TLC를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 야생균주 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6 및 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된 본 발명의 변이균주 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21를 일차 생산배지 [전분(starch) 20 g, 파마미디아 (Pharmamedia) 15 g, 효모 추출액(Yeast extract) 5 g, 탄산칼슘(CaCO3) 1 g]에 접종한 후 28℃에서 2 일간 배양하였다. 이차 발효배지[전분(starch) 80 g, 탄산칼슘(CaCO3) 7 g, 파마미디아 (Pharmamedia) 5 g, 인산염(K2HPO4) 1 g, 황산마그네슘(MgSO4) 1 g, 글루탐산(Glutamic acid) 0.6 g, 10 배 농축 미량원소(10X trace element, Hopwoodet al., Genetic Manipulation ofStreptomyces,A Laboratory Manual) 2 ㎖]에 상기 일차 배양액을 최종 5% 농도로 접종한 후 28℃에서 10 일간 배양하였다. 배양액으로부터 균체만을 모아 파쇄한 후 균체량의 두 배의 아세톤(acetone)을 첨가하여 추출하였다. 상기 추출액을 원심분리하여 균체를 제거하고 아세톤 용액층을 취하여 감압농축한 후 클로로포름(chloroform)으로 재추출하였다. 상기 클로로포름 추출액을 완전히 감압농축한 후 잔사를 메탄올에 용해시켜 TLC 및 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 고. 정상으로 YMC ODS C-18 칼럼(YMC Co., Kyoto, Japan)을 사용하고 이동상으로아세토나이트릴-메탄올-물(60:16:24)의 혼합액을 1.25 ㎖/분의 유속으로 주입하면서 분석하였다. 상기 HPLC는 245 nm에서 작동하는 자외선(UV) 검출기 및 데이터 모듈(Data module)을 사용하여 고정상인 칼럼에서 이동상인 용매가 이동하는 속도를 0.25 cm/분으로 기록하였다.
TLC 및 HPLC 분석결과, 본 발명의 변이균주 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21은 에버멕틴 A를 생산하지 못하고 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산하였으며, 특히 우수한 구충활성을 가지는 에버멕틴 B1a 및 B1b 화합물의 생산량이 야생균주인 스트렙토마이세스 에버미티리스 M6보다 50% 이상 증가하는 양상을 나타내었다(도 5및도 6). 따라서, 에버멕틴 B 계열 화합물을 A 화합물로 전환시키는 효소인 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된 본 발명의 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주가 에버멕틴 계열 화합물 중에서 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산함을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주는 에버멕틴 B 계열 화합물을 에버멕틴 A 계열 화합물로 전환시키는 효소인 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴되어 에버멕틴 A의 생산이 차단됨으로써 우수한 구충활성을 가지는 에버멕틴 B 계열 화합물만을 생산하는 균주이다. 따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 에버미티리스 M21 변이균주는 에버멕틴 B 계열 화합물의 생산성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 생산된 상기 화합물을 효율적으로 정제할 수 있어 동물 구충제로 사용되는 에버멕틴 B 계열 화합물의 대량생산에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제(Avermectin B C-5-O-methyltransferase) 유전자에SalI 제한효소를 처리하여 상기 유전자의 일부를 포함하는 1.4 kb 크기의 DNA 단편을 분리하고, 상기 DNA 단편내에 위치하는BspE1 제한효소 절단 위치에 항생제 내성유전자를 삽입시킨 DNA 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 항생제 내성유전자는 네오마이신 내성유전자인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
  3. 삭제
  4. 제1항의 DNA 단편을 포함하여 염색체 DNA내 에버멕틴 B C-5-0-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된도 2의 개열지도로 나타내어지는 pKC-Met 넉아웃 벡터.
  5. 제 4항의 넉아웃 벡터로 형질전환되어 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에브미티리스(Streptomyces avermitilis) M21 변이균주(수탁번호:KCTC 18023P).
  6. 1) 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻는 단계;
    2) 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    3) 상기 재조합 벡터에 클로닝된 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 DNA 단편에 항생제 내성유전자를 삽입하는 단계;
    4) 제한효소를 처리하여 항생제 내성유전자를 포함하는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자의 DNA 단편을 얻고, 이를 포함하는 넉아웃 벡터를 제조하는 단계;
    5) 상기 넉아웃 벡터를 에버멕틴 고생산균주에 형질전환시키는 단계; 및
    6) 항생제를 이용하여 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제 유전자가 파괴된 변이균주를 선별하는 단계를 포함하는 에버멕틴 B C-5-O-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 유전자 변이균주의 제조방법.
KR10-2000-0044896A 2000-08-02 2000-08-02 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법 KR100415395B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0044896A KR100415395B1 (ko) 2000-08-02 2000-08-02 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0044896A KR100415395B1 (ko) 2000-08-02 2000-08-02 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020011558A KR20020011558A (ko) 2002-02-09
KR100415395B1 true KR100415395B1 (ko) 2004-01-16

Family

ID=19681477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2000-0044896A KR100415395B1 (ko) 2000-08-02 2000-08-02 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100415395B1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0276103A2 (en) * 1987-01-23 1988-07-27 Pfizer Inc. Process for production of B avermectins and cultures therefor
US5565359A (en) * 1987-01-23 1996-10-15 Pfizer Inc. Cultures for production of B avermectins
KR20010039119A (ko) * 1999-10-29 2001-05-15 김선진 아버멕틴의 정제방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0276103A2 (en) * 1987-01-23 1988-07-27 Pfizer Inc. Process for production of B avermectins and cultures therefor
KR880009122A (ko) * 1987-01-23 1988-09-14 원본미기재 B아베르멕틴의 제조방법 및 이를 위한 배양물
US5565359A (en) * 1987-01-23 1996-10-15 Pfizer Inc. Cultures for production of B avermectins
US5576199A (en) * 1987-01-23 1996-11-19 Pfizer Inc. Process for production of B avermectins
KR20010039119A (ko) * 1999-10-29 2001-05-15 김선진 아버멕틴의 정제방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antimicorb Agents Chemother 1987년 5월 vol.31 (no.5), page 744 ∼ 747 *
Gene 1998 Jan 12;206(2):175-80 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20020011558A (ko) 2002-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kitani et al. Characterization of a regulatory gene, aveR, for the biosynthesis of avermectin in Streptomyces avermitilis
Stutzman‐Engwall et al. Engineering the aveC gene to enhance the ratio of doramectin to its CHC‐B2 analogue produced in Streptomyces avermitilis
Song et al. Cytochrome P450-mediated hydroxylation is required for polyketide macrolactonization in stambomycin biosynthesis
Zhang et al. Construction of ivermectin producer by domain swaps of avermectin polyketide synthase in Streptomyces avermitilis
KR100415395B1 (ko) 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법
Joon-Hyoung et al. Alternative production of avermectin components in Streptomyces avermitilis by gene replacement
US8008078B2 (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
Sun et al. Identification of a gene cluster encoding meilingmycin biosynthesis among multiple polyketide synthase contigs isolated from Streptomyces nanchangensis NS3226
AU752343C (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
US7259241B2 (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
Singh et al. Precursor for biosynthesis of sugar moiety of doxorubicin depends on rhamnose biosynthetic pathway in Streptomyces peucetius ATCC 27952
US7858340B2 (en) Polynucleotides and methods of directing the ratio of B2:B1 avermectins in Streptomyces avermitilis host cells
Hong et al. Biotransformation of milbemycin D to milemycin G by Streptomyces lividans conferring avermectin O-methyltransferase activity
Ji-Jia et al. CP-640186 is identified as a novel β-cell GLTprotective small molecule with nanomolar potency. Menu
Singh et al. Exploration of two epimerase homologs in Streptomyces peucetius ATCC 27952
KR100914251B1 (ko) 신규한 올리보실 틸락톤 및 그 제조 방법
Praseuth et al. APPLIED CELLULAR PHYSIOLOGY AND METABOLIC ENGINEERING
KR20040064524A (ko) 에버멕틴 제조용 벡터
AU1881902A (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20080108

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee