SK11722000A3 - Gén streptomyces avermitilis riadici pomer b2 : b1 avermektínov - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka prostriedkov a spôsobov na produkciu avermektinov a primárne spadá do oblasti zdravia živočíchov. Presnejšie sa predkladaný vynález týka polynukleotidových molekúl obsahujúcich nukleotidové sekvencie kódujúce produkt AveC génu, ktoré môžu byť použité na ovplyvnenie pomeru avermektinov triedy 2 a 1, ktoré sú produkované fermentáciou kultúr Streptomyces avermitilis a prostriedkov a spôsobov na vyhľadávanie takýchto polynukleotidových molekúl. Predkladaný vynález sa ďalej týka vektorov, transformovaných hostiteľských buniek a nových mutantných kmeňov Streptomyces avermitilis, v ktorých bol aveC gén mutovaný tak, aby ovplyvňoval pomer produkovaných avermektinov triedy 2 a 1.

Doterajší stav techniky

Avermektiny

Druhy Streptomyces produkujú veľké množstvo sekundárnych metabolitov, vrátane avermektinov, ktoré sú tvorené sériou ôsmych podobných šestnásťčlenných makrocyklických laktonov, ktoré majú silnú antihelmintickú a insekticídnu aktivitu. Osem odlišných, ale blízko príbuzných zlúčenín, je označovaných ako Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a a B2b. „a” séria zlúčenín označuje prirodzené avermektiny, v ktorých je substituentom v C25 pozícii (S) sekundárny butyl a „b označuje tie zlúčeniny, v ktorých je substituentom v C25 pozícii izopropyl. Označenie „A a „B označuje avermektiny, v ktorých je substituent v C5 pozícii metoxy- a hydroxy- skupina, v príslušnom poradí. Číslica „1 označuje avermektiny, ktoré obsahujú dvojitú väzbu v pozícii C22, 23 a číslica „2 označuje avermektiny, ktoré obsahujú vodík v pozícii C22 a hydroxy- skupinu v pozícii C23. Z príbuzných avermektinov má avermektín typu BI najúčinnejšiu antiparazitárnu a pesticídnu aktivitu a je preto komerčne najžiadanejším avermektínom.

Avermektiny a ich produkcia aerobnou fermentáciou kmeňov S. avermitilis sú popísané v U.S. patentoch 4310519 a 4429042. Predpokladá sa, že biosyntéza prirodzených avermektinov je iniciovaná endogénne z CoA tioesterových analógov kyseliny izomaslovej a kyseliny S— ( + )—2metylmaslovej .

Kombinácia úprav kmeňov náhodnou mutagenézou a použitie exogénne dodávaných mastných kyselín viedla k zlepšeniu analógov produkcie avermektinov. Mutanty S.avermitilis, ktoré sú deficientné v dehydrogenácii rozvetvených 2-oxo kyselín (bkd deficientné mutanty) môžu produkovať avermektiny iba vtedy, ak sú fermentácie dopĺňané mastnými kyselinami. Vyhladávanie a izolácia deficientných mutantov v dehydrogenázovej aktivite na rozvetvené reťazce (napríklad S.avermitilis ATCC 53567) sú popísané v Európskej patentovej prihláške (EP) 276103. Fermentácia takýchto mutantov v prítomnosti exogénne dodávaných mastných kyselín vedie k produkcii iba štyroch avermektinov, ktoré zodpovedajú použitým mastným kyselinám. Tak vedie doplňovanie fermentácie S. avermitilis (ATCC 53567) kyselinou S-(+)-2 metylmaslovou k produkcii prirodzených avermektínov Ala, A2a, Bla a B2a; doplňovanie fermentácie kyselinou izomaslovou k produkcii prirodzených avermektínov Alb, A2b, Blb, B2b; a doplňovanie fermentácie kyselinou cyklopentankarboxylovou k produkcii štyroch nových cyklopentylavermektinov Al, A2, BI a B2 .

Keď sú dodávané iné mastné kyseliny, tak sú produkované nové avermektíny. Pri testovaní viac než 800 potenciálnych prekurzorov bolo identifikovaných viac než 60 nových avermektínov (viď napríklad Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44: 357-365; a Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Ďalej, mutanty S.avermitilis deficientné v 5-0metyltransferazovej aktivite produkujú v podstate iba B analógy avermektínov. V dôsledku toho produkujú mutanty deficientné ako v dehydrogenázovej aktivite na rozvetvené 2oxo kyseliny, tak i v 5-0-metyltransferasovej aktivite, iba B avermektíny zodpovedajúce mastným kyselinám použitým na doplňovanie fermentácie. Tak vedie dodávanie kyseliny S—(+)— 2-metylmaslovej k takým dvojitým mutantom k produkcii iba prirodzených avermektínov Bla a B2a, zatiaľ čo dodávanie kyseliny izomaslovej a kyseliny cyklopentankarboxylovej vedie k produkcii prirodzených avermektínov Blb a B2b alebo nových cyklopentylových BI a B2 avermektínov, v príslušnom poradí. Dodávanie kyseliny cyklopentankarboxylovej k takýmto dvojitým mutantom je výhodnou metódou na produkciu komerčne významného nového avermektínu, cyklohexylavermektínu BI (doramektínu) . Izolovanie a charakteristiky takýchto dvojitých mutantov, napríklad S.avermitilis (ATCC 53692), sú popísané v EP 276103.

Gény zúčastňujúce sa biosyntézy avermektínov

V mnohých prípadoch sú gény zúčastňujúce sa na produkcii sekundárnych metabolitov a gény kódujúce určité antibiotiká prítomné v zoskupení na chromozóme. Tak je tomu napríklad v prípade Strepromyces génového zoskupenia polyketid-syntázy (PKS) (viď Hopwood and Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 37-66). Preto je jednou stratégiou na klonovanie génov rezistenciu na chromozómu na v biosyntetickej dráhe izolovania lieky a potom testovanie susedných iné antibiotika.

Inou zúčastňujúcich sa gény súvisiace s biosyntézou stratégiou na klonovanie biosyntézy významných metabolitov génu na regiónov určitého génov je komplementácia mutantov.

Napríklad, časti DNA knihovne z organizmov schopných produkcie určitého metabolitu sú vkladané do mutantov neprodukujúcich tento metabolit a transformanty sú vyšetrované na produkciu metabolitu. Ďalej bola na identifikáciu a klonovanie génov v biosyntetickej dráhe použitá hybridizácia knihovne sondami z rodu Streptomyces.

Gény zúčastňujúce sa v biosyntéze avermektínov (ave gény), podobne ako gény nutné na biosyntézu iných sekundárnych metabolitov Streptomyces (napríklad PKS), sa nachádzajú v génovom zoskupení na chromozóme. Mnoho ave génov bolo úspešne klonovaných pri použití vektorov dopĺňajúcich mutanty S.avermitilis s blokovanou biosyntézou avermektínov. Klonovanie takýchto génov je popísané v U.S. patente 5252474. Okrem toho, Ikada et al., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534, popisujúca lokalizáciu chromozomálneho regiónu nevyhnutného k stupňu dehydrogenázie 022,23 (aveC) na 4,82 kb BamHI fragment S.avermitilis, rovnako ako popisujú mutácie v aveC géne, ktoré vedú ku vzniku mutanta produkujúceho iba B2a. Pretože ivermektín, účinná antihelmintická zlúčenina, môže byť produkovaný chemicky z avermektínu B2a, sú takéto kmene produkujúce iba avermektín B2a významné na komerčnú produkciu ivermektinu.

Identifikácia mutácií v aveC géne, ktoré minimalizujú komplexnosť produkcie avermektínov, ako sú napríklad mutácie znižujúce pomer avermektínov B2:B1, zjednoduší produkciu a prečistenie komerčne významných avermektínov.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález obsahuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu kompletnú aveC ORF S. avermitilis alebo jeho významnú časť, kde táto izolovaná polynukleotidová molekula neobsahuje ďalší kompletný ORF, ktorý je in situ v chromozóme S. avermitilis umiestnený za aveC ORF. Izolovaná polynukleotidová molekula podľa predkladaného vynálezu výhodne obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako sekvencia kódujúca AveC génový produkt

S.avermitilis v plazmide pSE186 (ATCC 209604), alebo je rovnaká, ako nukleotidová sekvencia aveC ORF podía obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo jej významná časť.

Predkladaný vynález ďalej molekulu obsahujúca nukleotidovú k sekvencii kódujúcej pSE186 aveC ORF homológna

S.Avermitilis k nukleotidovej NO:1) alebo jej v plazmide sekvencii významnej časti .

Predkladaný vynález obsahuje polynukleotidovú sekvenciu, ktorá je produkt alebo

AveC (ATCC podľa génový

209604) obr. 1 (SEQ ID ďalej obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna k aminokyselinovej sekvencii kódovanej kódujúcou sekvenciou na AveC génový produkt S.avermitilis v plazmide pSE186 (ATCC 209604), alebo k aminokyselinovej sekvencii podlá obr. 1 (SEQ ID N0:2) alebo jej významnej časti.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC produkt homológneho génu z S.hygroscopicus, kde produkt homológneho génu obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:4 alebo jej významnú časť. Vo výhodnom uskutočnení obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula podlá predkladaného vynálezu, ktorá kóduje AveC produkt homológneho génu S.hygroskopicus, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID N0:3 alebo jej významnú časť.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homológna s nukleotidovou sekvenciou

SEQ

ID NO:3

S. hygroscopicus.

Predkladaný vynález ďalej obsahuj e polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid, ktorý je homológny k AveC produktu homológneho génu S-hygroscopicus, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:4.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje oligonukleotidy, ktoré hybridizujú na polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo SEQ ID NO:3, alebo na polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k nukleotidovej sekvencii podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo k SEQ ID NO:3 .

Predkladaný vynález ďalej obsahuje rekombinantné klonovacie vektory a expresné vektory, ktoré sú použiteľné na klonovanie a expresiu polynukleotidu podľa predkladaného vynálezu, vrátane polynukleotidových molekúl obsahujúcich aveC ORF S.avermitilis alebo aveC homológ ORF. V príkladnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), ktorý obsahuje celý ORF aveC génu S.avermitilis. Predkladaný vynález ďalej obsahuje transformované hostiteľské bunky obsahujúce polynukleotidovú molekulu alebo rekombinantný vektor podľa predkladaného vynálezu a nové kmene alebo bunečné línie odvodené od týchto buniek.

vynález ďalej obsahuje re kombinantne homologického bol významne týchto spôsob na

Predkladaný produkt AveC génu alebo produkt alebo jeho významnú časť, ktorý a izolovaný, rovnako ako homológy Predkladaný vynález ďalej obsahuje ktorý obsahuje produkovaný

AveC génu prečistený produktov.

produkciu rekombinantného produktu AveC génu, kultiváciu hostiteľskej bunky transformovanej rekombinantným expresným vektorom, kde uvedený rekombinantný expresný vektor obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidová sekvenciu kódujúcu produkt AveC génu alebo produkt AveC homologického génu, kde táto polynukleotidová molekula je operatívne naviazaná na jeden alebo viacero regulačných elementov, ktoré kontrolujú expresiu polynukleotidovej molekuly v hostiteľskej bunke, kde táto kultivácia je realizovaná za podmienok umožňujúcich produkciu rekombinantného produktu AveC génu alebo produktu homologického AveC génu z bunečnej kultúry.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidová sekvenciu, ktorá je inak rovnaká, ako sekvencia kódujúca produkt AveC génu S.avermitilis v plazmide pSE186 (ATCC 209604) alebo nukleotidové sekvencia aveC ORF S.avermitilis, ako je uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO:1), ale ktorá ďalej obsahuje jednu alebo viac mutácii, ktoré spôsobia, že bunky

S.avermitilis kmeňa ATCC 53692, aveC alela inaktivovaná a ktoré molekulu obsahujúcu mutovanú v ktorých bola prirodzená exprimujú polynukleotidovú nukleotidovú sekvenciu, produkujú iný pomer alebo množstvo avermektinov, než ktorý je produkovaný bunkami S.avermitilis kmeňa ATCC 53692, ktoré exprimujú iba vynálezu môžu na prípravu detekovatelné prirodzenú aveC alelu. Podlá predkladaného byť takéto polynukleotidové molekuly použité nových kmeňov S.avermiti 1i s, v produkcii avermektinov ktoré exprimujú iba uskutočnení sú takéto zmeny s rovnakými kmeňmi, alelu. Vo výhodnom molekuly použiteľné na produkciu S.avermitilis, ktoré produkujú avermektíny na ktoré vykazujú v porovnaní prirodzenú aveC polynukleotidové nových kmeňov v zníženom pomere tiredy 2 ku tirede 1, v porovnaní s rovnakými kmeňmi, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. V ďalšom výhodnom uskutočnení sú takéto polynukleotidové molekuly použiteľné na produkciu nových kmeňov S.avermitilis, ktoré produkujú vyššie množstvá avermektinov v porovnaní s rovnakými kmeňmi, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení sú takéto polynukleotidové molekuly výhodné na prípravu nových kmeňov S.avermitilis, v ktorých je aveC gén inaktivovaný.

Predkladaný vynález obsahuje spôsoby na identifikáciu mutácií aveC ORF S.avermitilis, ktoré menia pomer a/alebo množstvo produkovaných avermektinov. Vo výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález spôsob na identifikáciu mutácii aveC ORF, ktoré menia pomer produkovaných avermektinov triedy 2:1, ktorý obsahuje:

(a) stanovenie pomerov produkovaných avermektinov triedy (b) (c)

2: triede na kmeň

S.avermitilis , v ktorom bola inaktivovaná prirodzená aveC alela a do ktorého bola vložená molekula mutovaný ktorom je obsahujúca exprimovaná sekvenciu nukleotidovú polynukleotidové kódujúcu produkt aveC génu;

stanovenie pomerov produkovaných avermektinov triedy

2: triede 1 na rovnaký kmeň S.avermitilis ako v kroku ktorý však experimentuje obsahujúcu (SEQ ID NO homológna k porovnanie iba aveC alelu nukleotidovú sekvenciu

1) alebo nukleotidovú tejto sekvencii; a

ORF podľa sekvenciu, pomeru avermektinov triedy ktorá triede je produkovaných bunkami

S.avermitilis z kroku (a) s pomerom avermektinov triedy triede produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku (b); preto pokial sa pomer avermektinov triedy triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis kroku (a) líši od pomeru avermektinov triedy triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis kroku (b) , tak bola identifikovaná mutácia aveC ORF schopná meniť pomer avermektinov triedy 2 triede

Vo výhodnom uskutočnení je pomer avermektinov triedy mutácie.

znížený v dôsledku triedy 1

V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje vynález spôsob na identifikáciu mutácií predkladaný aveC

ORF alebo genetických konštruktov obsahujúcich aveC

ORF, ktoré menia množstvo produkovaných avermektinov, (a) stanovenie množstva ktorý obsahuje:

avermektinov produkovaných bunkami kmeňa

S.avermitilis, v ktorom bola inaktivovaná prirodzená aveC alela a do ktorého bola vložená a v ktorom je exprimovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný produkt aveC génu alebo obsahujúci genetický konštrukt obsahujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt;

(b) stanovenie množstva avermektinov produkovaných rovnakým kmeňom S.avermitilis ako v kroku (a), ktorý však exprimuje iba aveC alelu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homológna k tejto sekvencii; a (c) porovnanie množstva avermektinov produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku (a) s množstvom avermektinov produkovaných bunkami

S.avermitilis z kroku (b);

preto pokial sa množstvo avermektinov produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku (a) líši od množstva avermektinov produkovaných bunkami

S.ave rmi t i 1i s z kroku (b) , tak bola identifikovaná mutácia aveC

ORF alebo genetický konštrukt, ktoré sú schopné meniť množstvo avermektinov. Vo výhodnom uskutočnení je množstvo produkovaných avermektinov zvýšené v dôsledku mutácie.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje rekombinantné napríklad, predkladaný vynález obsahuje vektory, ktoré môžu byť použité na cielené vloženie akejkoľvek polynukleotidovej molekuly obsahujúcej mutované nukleotidové sekvencie podľa predkladaného vynálezu do miesta aveC génu na chromozóme

S.avermitilis, kde tieto polynukleotidy sú použité na inzerciu alebo nahradenie aveC ORF alebo jeho časti pomocou homológnej rekombinácie. I tak, podľa predkladaného vynálezu môže polynukleotidová molekula obsahujúca mutovanú nukleotidovú sekvenciu podľa predkladaného vynálezu tiež modulovať biosyntézu avermektinov vtedy, ak je inzertovaná do chromozómu S. avermitilis v mieste inom než v aveC géne, alebo pokial je v bunkách S.avermitilis prítomná epizomálne. Tak obsahuje predkladaný vynález tiež vektory obsahujúce polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu podľa predkladaného vynálezu, ktoré môžu byť použité na inzerciu polynukleotidovej molekuly v inom mieste chromozómu S.avermitilis než v aveC géne, alebo na epizomálnu lokalizáciu. Vo výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález vektory na nahradzovanie génov, ktoré môžu byť použité na inzerciu mutovanej aveC alely do chromozómu S.avermitilis na prípravu nových bunkových kmeňov, ktoré produkujú avermektíny so zníženým pomerom triedy 2 : triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje spôsoby na prípravu nových kmeňov S.avermitilis, ktoré sú tvorené bunkami, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu a ktoré produkujú pozmenené pomery a/alebo množstvo avermektinov v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis, ktorý exprimuje iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nových kmeňov S.avermitilis, ktoré sú tvorené bunkami, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu a ktoré produkujú pozmenené pomery avermektinov triedy 2 : triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis, ktorý exprimuje iba prirodzenú aveC alelu, kde uvedený spôsob obsahuje transformáciu buniek kmeňa S.avermitilis vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu, ktorá kóduje génový produkt, ktorý mení pomer avermektínov triedy 2 : triede 1 produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa

S.avermitilis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu;

a selekciu transformovaných buniek, ktoré produkujú avermektíny v pozmenenom pomere triedy 2 triede 1 v porovnaní s pomerom triedy 2 triede 1, ktorý je produkovaný bunkami exprimujúcimi iba prirodzenú aveC alelu.

Vo výhodnom uskutočnení je v bunkách nového kmeňa pomer produkovaných avermektínov triedy 2 : triede 1 znížený.

V inom výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nových kmeňov S.avermitilis, ktoré sú tvorené bunkami, ktoré produkujú pozmenené množstvá avermektínov, ktorý obsahuje transformáciu buniek kmeňa S.avermitilis vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorého expresia vedie k produkcii pozmeneného množstva avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu; a selekciu transformovaných buniek, ktoré produkujú avermektíny v pozmenenom množstve v porovnaní s množstvom avermektínov, ktoré je produkované bunkami exprimujúcimi iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnom uskutočnení je v bunkách nového kmeňa produkované väčšie množstvo avermektínov.

V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález spôsob prípravy nových kmeňov S.avermitilis, kde bunky týchto kmeňov obsahujú inaktivovanú aveC alelu, kde uvedený spôsob obsahuje transformáciu buniek S.avermitilis, ktoré exprimujú prirodzenú aveC alelu, vektorom, ktorý inaktivuje aveC alelu; a selekciu transformovaných buniek, v ktorých bola aveC alela inaktivovaná.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje nové kmene S.avermitilis tvorené bunkami, ktoré boli transformované akoukoľvek polynukleotidovou molekulou alebo vektorom obsahujúcim mutované nukleotidové sekvencie podľa predkladaného vynálezu. Vo výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález nové kmene S.avermitilis tvorené bunkami, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu miesto, alebo súčasne s prirodzenou aveC alelou, kde tieto bunky nového kmeňa produkujú avermektíny v pozmenenom pomere triedy 2 : triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnejšom uskutočnení produkujú bunky nového kmeňa avermektíny v zníženom pomere triedy 2 : triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Takéto nové kmene sú užitočné na priemyselnú produkciu komerčne žiadúcich avermektínov, ako je doramektín.

V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález nové kmene S.avermitilis tvorené bunkami, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu miesto, alebo súčasne s prirodzenou aveC alelou, čo vedie k produkcii iných množstiev avermektínov v porovnaní s množstvom avermektínov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnom uskutočnení produkujú bunky nového kmeňa avermektíny vo vyššom množstve.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje predkladaný vynález nové kmene S.avermitilis tvorené bunkami, v ktorých bol aveC gén inaktivovaný. Takéto kmene sú užitočné ako z hľadiska odlišného spektra produkovaných avermektínov v porovnaní s prirodzenými kmeňmi, tak na komplementačné vyhľadávacie testy, ako sú tu popísané, na stanovenie toho, či cielená alebo náhodná mutagenézia aveC génov ovplyvňuje produkciu avermektínov.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje spôsob na produkciu avermektínov, ktorý obsahuje kultiváciu buniek kmeňa S.avermiti 1 i s, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu, ktorá kóduje génový produkt, ktorý mení pomer avermektínov triedy 2 : triede 1 produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa neexprimujúcimi mutovanú aveC alelu, ale iba prirodzenú aveC alelu, v kultivačnom médiu za podmienok umožňujúcich alebo indukujúcich produkciu avermektínov; a získanie uvedených avermektínov z kultúry. Vo výhodnom uskutočnení je pomer avermektínov triedy 2 : triede 1 produkovaných bunkami exprimujúcimi mutáciu znížený. Tento spôsob umožňuje dosiahnutie vyššej účinnosti produkcie komerčne hodnotných avermektínov, ako je doramektín.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje spôsob na produkciu obsahuje kultiváciu buniek exprimujú mutovanú aveC avermektínov, ktorý kmeňa

S.avermitilis, ktoré alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, kde táto kultivácia vedie k produkcii pozmenených množstiev avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimuj úcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa neexprimujúcimi mutovanú aveC alelu ani genetický konštrukt, ale iba prirodzenú avec alelu, v kultivačnom médiu za podmienok umožňujúcich alebo indikujúcich produkciu avermektínov;

a získanie uvedených avermektínov z kultúry. Vo výhodnom uskutočnení je množstvo avermektínov produkovaných bunkami exprimujúcimi mutáciu alebo genetický konštrukt zvýšené.

predakldaný vynález ďalej obsahuje nové prostriedky obsahujúce avermektíny produkované kmeňmi S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu podlá predkladaného vynálezu, kde tieto avermektíny sú produkované v zníženom pomere triedy 2 : triedy 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa neexprimujúcimi mutovanú aveC alelu, ale iba prirodzenú aveC alelu. Nové prostriedky obsahujúce avermektín môžu byť vo forme produkovanej vo fermentačnej kultivačnej kvapaline, alebo môže byť získané z tejto kvapaliny.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Obr. 1: DNA sekvencia (SEQ ID NO:1) obsahujúca S.avermitilis aveC ORF a odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID N0:2).

Obr. 2: Plazmidový vektor pSE186 (ATCC 209604) obsahujúci celý ORF aveC génu S.avermitilis.

Obr. 3: Génový substitučný vektor pSE180 (ATCC 209605) obsahujúci ermE gén Sacc.erythraea inzertovaný do aveC ORF S.avermitilis.

Obr. 4: BamHI reštrikčná mapa génového zoskupenia avermektin-syntázového génu z S.avermitilis s piatimi identifikovanými prekrývajúcimi s kozmidovými klonmi (t. j. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Tiež je vyznačený vzťah pSE118 a pSE119.

Obr. 5: HPLC analýza fermentačných produktov produkovaných kmeňmi S.avermitilis. Kvantifikácia piku bola uskutočnená porovnaním so štandartnými množstvami cyklohexyl-Bl. Retenčný čas cyklohexyl-B2 bol 7,4 - 7,7min; retenčný čas cyklohexyl-Bl bol 11,9 - 12,3min.

Obr. 5A:

Kmeň SE180-11 S.avermitilis s inaktivovaným aveC

ORF.

Obr. 5B:

Kmeň SE180-11 S. avermitilis transformovaný pSE186

(ATCC 209604).

Obr. 5C: Kmeň SE180-11 S.avermitilis transformovaný pSE187.

Obr. 5D: Kmeň SE180-11 S.avermitilis transformovaný pSE188.

Obr. 6: Porovnanie odvodenej aminokyselinovej sekvencie kódovanej aveC ORF S. avermitilis (SEQ ID NO : 2), čiastočného ORF aveC homológu z S.griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) a ORF aveC homológu z S.hygroscopicus (SEQ ID NO: 4). Valinový zvyšok uvedený tučným písmom je predpokladané štart-miesto na proteín. Konzervované zvyšky sú uvedené velkými písmenami na homológiu vo všetkých troch sekvenciách a malými písmenami na homológii v dvoch z troch sekvencii. Aminokyselinové sekvencie mali približne 50% identitu sekvencie.

Obr. 7: Hybridný plazmidový konštrukt obsahujúci 564 bp BsaAI/KpnI fragment z aveC homologického génu

S.hygroscopicus inzertovaný do BsaAI/KpnI miesta v S.avermitilis avec ORF.

sa identifikácie týka molekúl obsahujúcich AveC génový produkt kmeňov S.avermitilis, ktoré môžu byť použité na testovanie mutovaných AveC génových produktov na ich vplyv na produkciu avermektínov a zistenie, že niektoré mutované AveC génové znižovať pomer B2:B1

Predkladaný a charakterizácie vynález polynukleotidových nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú z S.avermitilis, konštrukcia nových použité na testovanie avermektínov pomer

S . avermitilis. Vynález je molekuly je rovnaká

S.avermitilis v plazmide ďalej popísaný obsahujúcej buď ako sekvencia produkty môžu produkovaných na príklade nukleotidovú génový 209604), kóduj úca pSE186

AveC (ATCC (SEQ

ID NO:1) od tejto sekvencie .

polynukleotidovej sekvenciu, ktorá produkt alebo nukleotidovú sekvenciu ORF podlá obr. 1 na príklade polynukleotidových molekúl odvodených sekvencie obsahujúcej

I tak, princípy uvedené analogicky použité na vrátane aveC homologických napríklad mutované nukleotidové môžu byť molekuly, Streptomyces, a S.griseochromogenes.

vrátane

Polynukleotidové

S.avermitilis molekuly

Predkladaný polynukleotidovú S. avermitilis alebo jeho izolovaná polynukleotidová kompletný ORF, ktorý je in umiestnený po aveC ORF.

predkladanom vynáleze iné polynukleotidové z iných kmeňov S.hygroscopicus génov kódujúce AveC génový produkt vynález molekulu obsahujúcu významnú molekula poskytuj e kompletnú časť, kde uvedená neobsahuje ďalší situ v chromozóme S.avermitilis izolovanú aveC ORF

Izolovaná polynukleotidová molekula podlá predkladaného vynálezu výhodne obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako sekvencia kódujúca AveC génový produkt S.avermiti 1 i s v plazmide pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá je rovnaká ako nukleotidová sekvencia ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo jej významná časť. Termín „významná časť izolovanej polynukleotidovej molekuly obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu kódujúca AveC génový produkt S.avermitilis, ako je tu použitý, označuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu aspoň 70% sekvencie kompletného aveC ORF, ako je uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO:1), ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt. Termín „funkčne ekvivalentný AveC génový produkt je v tejto súvislosti definovaný ako génový produkt, ktorý pri expresii v S.avermitilis kmeňa ATCC 53692, v ktorom bola inaktivovaná prirodzená alela aveC, vedie k produkcii v podstate rovnakých pomerov a množstva avermektinov, ako sú produkované v S.avermitilis kmeňa ATCC 53692, ktorý exprimuje iba prirodzenú, funkčnú aveC alelu prirodzenú na S.avermitilis kmeň ATCC 53692.

Okrem nukleotidovéj sekvencie aveC ORF môže izolovaná polynukleotidová molekula podľa predkladaného vynálezu obsahovať nukleotidové sekvencie, ktoré za prirodzených podmienok susedia s aveC génom in situ v S.avermitilis, ako sú napríklad susedné nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO:1) .

Termíny „polynukleotidová molekula, polynukleotidová sekvencia, „kódujúca sekvencia, „otvorený čítací rámec a „ORF, ako sú tu použité, označujú ako DNA, tak RNA molekuly, ktoré môžu byť jednoreťazcové alebo dvojreťazcové a ktoré môžu byť transkribované alebo translatované (DNA) alebo translatované (RNA) na AveC génový produkt alebo, ako bude uvedené ďalej, na AveC homológny génový produkt, alebo na polypeptid, ktorý je homológny k AveC génovému produktu alebo AveC homológnemu génovému produktu, vo vhodnom bunečnom expresnom systéme, pri použití vhodných regulačných elementov. Kódujúca sekvencia môže obsahovať, bez obmedzenia, prokaryotické sekvencie, cDNA sekvencie, genomové DNA sekvencie a chemicky syntetizované DNA a RNA sekvencie .

Nukleotidová sekvencia uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO:1) obsahuje štyri rôzne GTG kodóny v pozíciách 42, 174, 177 a 180 bp. Ako je uvedené ďalej, viacpočetné delécie 5'regiónu aveC ORF (obr. 1; SEQ ID N0:l) boli vytvorené na definovanie toho, ktoré kodóny môžu pôsobiť v aveC ORF ako štart kodónu na expresiu proteinu. Delécia prvého GTG miesta v bp 42 neeliminovala aktivitu AveC. Ďalšie delécie všetkých troch GTG kodónov v pozíciách 174 , 177 a 180 bp dohromady eliminovali aktivitu AveC, čo ukazuje, že tento región je nutný na expresiu proteinu. Predkladaný vynález preto zahŕňa aveC ORF rôznej dĺžky, ktoré zahajujú transláciu v akomkoľvek z GTG miest umiestnených v pozíciách 174, 177 alebo 180 bp, ako sú uvedené na obr. 1 (DEQ ID NO:1) a príslušné polypeptídy na každý ORF.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homologická k sekvencii kódujúcej AveC génový produkt S. avermitilis v plazmide pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá je homologická k nukleotidovej sekvencii aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo jej významnej časti. Termín „homologická použitý v súvislosti s polynukleotidovou molekulou homologickou ku kódujúcej sekvencii na AveC génový produkt označuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu:

a) ktorá kóduje rovnaký AveC génový produkt ako sekvencia kódujúca AveC génový produkt S.avermitilis v plazmide pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá kóduje rovnaký AveC génový produkt ako nukleotidová sekvencia aveC ORF podía obr. 1 (SEQ ID NO:1), ale ktorá obsahuje jednu alebo viac silentných zmien nukleotidovej sekvencie v súlade s degeneráciou genetických kódov; alebo

b) ktorá hybridizuje na molekulu obsahujúcu kóduje aminokyselinovú kódujúcou AveC 209604), alebo komplementárnu polynukleotidovú nukleotidovú sekvenciu, ktorá sekvenciu kódovanou sekvenciou génový ktorá podľa obr. 1 podmienok, t.j. filter v (SEQ za lmM EDTA pri 42°C

Protocols

0,5 M pri (viď in

Publishing sodnom (SDS),

SSC/0, 1% SDS

1989, Current produkt v plazmide pSE186 (ATCC kóduje aminokyselinovú sekvenciu ID NO:2), za stredne prísnych hybridizácie na DNA viazanú na

NaHPO₄, 7% dodecylsíranu 65°C, s preplachmi v 0,2 x

Ausubel et. al., (vyd.),

Molecular Biology, zväzok I, Green Inc., a John Wiley and Sons, York, str. 2.10.3) a ktorá kóduje funkčne produkt, ako bol definovaný

Associates,

Inc . , New ekvivalentný AveC génový vyššie.

Vo výhodnom uskutočnení hybridizuje polynukleotidová molekula na komplementárnej sekvencii k nukleotidovej sekvencii kódujúcej AveC génový produkt v plazmide pSE186 (ATCC 209604), alebo na komplementárnej sekvencii k nukleotidovej sekvencii uvedenej na obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo na jej významnú časť, za podmienok vysokej prísnosti, t.j. za hybridizácie na DNA viazanú na filter v 0,5 M NaHPO₄, 7% dodecylsíranu sodnom (SDS), lmM EDTA pri 65°C, s preplachmi v 0,1 x SSC/0,1% SDS pri 68°C (viď Ausubel et.

al., 1989, vyššie) a ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt, ako bol definovaný vyššie.

Aktivita AveC génového produktu a jeho potenciálnych funkčných ekvivalentov môže byť stanovená pomocou HPLC analýzy produktov fermentácie, ako je popísané v príkladoch uvedených ďalej. Polynukleotidové molekuly obsahujúce nukleotidové sekvencie kódujúce funkčné ekvivalenty AveC génového produktu S.avermitilis zahŕňajú prirodzené aveC gény prítomné v iných kmeňoch S. avermitilis, aveC homológne gény prítomné v iných druhoch Streptomyces a mutované aveC alely, či už prirodzené, alebo geneticky upravené.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú sekvenciu polypeptid homologická se kvenciou sekvenciu, sekvencii kódujúcu ktorá je kódovanej kóduj úcou (ATCC 209604) alebo k 1 (SEQ ID NO:2) alebo časť aminokyselinovej molekulu obsahujúcu nukleotidovú majúci aminokyselinovú k aminokyselinovej

AveC génový produkt plazmidu pSE186 aminokyselinovej sekvencii podía obr. jej významnej časti. Termín sekvencie podía obr. 1 (SEQ „významná ID NO:2), ako je tu použitý, označuje polypeptid obsahujúci aspoň 70% aminokyselinovej sekvencie uvedenej na obr. 1 (SEQ ID NO:2), ktorý tvorí funkčne ekvivalentný AveC bol definovaný vyššie.

génový produkt, ako

Ako je tu použitý sekvenciami, ktoré sú sekvencii AveC génového termín „homologický v súvislosti homologické produktu S.avermitilis, polypeptid kódovaný s aminokyselinovými k aminokyselinovej označuje se kvenciou kódujúcou AveC génový produkt plazmidu pSE186 (ATCC 209604) alebo majúci aminokyselinovú sekvenciu podía obr. 1 (SEQ ID

NO:2), v ktorom bol jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov konzervatívne substituovaný iným aminokyselinovým zvyškom tak, že takéto konzervatívne substitúcie vedú ku vzniku funkčne ekvivalentného génového produktu, ako bol definovaný vyššie.

Konzervatívne aminokyselinové substitúcie sú dobre známe v obore. Pravidlá na takéto substitúcie sú uvedené napríklad v Dayhof, M . D . ,

1978, Nat.

Biomed. Res .

Found., Washington, D.C., zväzok

5, Sup.

Presnej šie, konzervatívne aminokyselinové substitúcie sú také substitúcie, ktoré prebiehajú v skupine aminokyselín, ktoré sú podobné z hľadiska polarity, acidity alebo charakteru vedľajších reťazcov. Geneticky kódované aminokyseliny sú zvyčajne delené do štyroch skupín:

(1) acidické = aspartat, glutamat;

(2) bázické = lyzin, arginín, histidín;

(3) nepoláme = alanin, valin, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán; a (4) polárna bez náboja = glycín, asparagín, glutamín, cysteín, serín, treonín, tyrozín.

Fenylalanín, tryptofán a tyrozín sú tiež spoločne označované ako aromatické aminokyseliny. Jedna alebo viac substitúcií uskutočnených v určitej skupine, napríklad substitúcie leucinu za izoleucín alebo valin, alebo aspartatu za glutamat, alebo treonínu za serin, alebo akékoľvek iné aminokyseliny za štrukturálne podobnou aminokyselinu, napríklad za aminokyselinu s podobnou aciditou, polaritou, veľkosťou vedľajších reťazcov alebo s kombinovanou podobnosťou týchto charakteristík, nemajú obyčajne vplyv na funkciu peptidu.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu génový produkt homologický k AveC. Termín „génový produkt homologický k AveC, ako je tu použitý, je definovaný ako génový produkt majúci aspoň 50% identitu aminokyselinovej sekvencie s AveC génovým produktom S.avermitilis obsahujúcim aminokyselinovú sekvenciu kódovanú sekvenciou kódujúcou AveC génový produkt plazmidu pSE186 (ATCC 209604) alebo aminokyselinovou sekvenciou podlá obr. 1 (SEQ ID NO:2). V príkladnom uskutočnení je génový produkt homologický k AveC získaný z S.hygroscopicus (ako je popísané v EP prihláške 0298423; depozitum FERM BP-1901) a obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:4 alebo jej významnú časť. Termín „významná časť aminokyselinovej sekvencie podlá SEQ ID NO:4 označuje polypeptid obsahujúci aspoň 70% aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO:4, ktorý tvorí funkčne ekvivalentný génový produkt homologický k AveC. „Funkčne ekvivalentný génový produkt homologický k AveC je definovaný ako génový produkt, ktorý pri expresii v S.hygroscopicus kmeňa FERM BP-1901, v ktorom je natívna alela homologická k AveC inaktivovaná, vedie k produkcii v podstate rovnakých množstiev a pomerov milbemycinov, ako je produkované v S.hygroscopicus kmeňa FERM BP-1901 exprimujúcim iba prirodzenú, funkčnú alelu homologickú k AveC, ktorá je prirodzená na S.hygroscopicus kmeň FERM BP1901. V príkladnom uskutočnení obsahuje izolovaná polynukleotidové molekula podlá predkladaného vynálezu, ktorá kóduje S.hygroscopicus génový produkt homologický k AveC, nukleotidovú sekvenciu SEQ

ID NO:3 významnú časť.

Termín „významná časť alebo jej izolovanej polynukleotidovéj molekuly obsahuj úcej nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO:3, ako je tu použitý, označuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu aspoň 70% aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID NO:3, ktorá kóduje funkčne ekvivalentný génový produkt homologický k AveC, ako bol definovaný vyššie.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúci nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homologická k nukleotidovej sekvencií S.hygroscopicus uvedenej v SEQ ID NO:3. Termín „homologická použitý v súvislosti s polynukleotidovou molekulou homologickou ku kódujúcej sekvencií na S.hygroscopicus génový produkt homologický k AveC označuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu:

a) ktorá kóduje rovnaký génový produkt ako nukleotidová sekvencia SEQ ID N0:3 alebo jej významná časť, ale ktorá obsahuje jednu alebo viac silentných zmien nukleotidovej sekvencie v súlade s degeneráciou genetických kódov; alebo

b) ktorá hybridizuje na komplementárnu polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID N0:4, pri stredne prísnych podmienkach, t. j. za hybridizácie na DNA viazanú na filter v 0,5 M NaHPO_4z 7% dodecylsiranu sodnom (SDS), lmM EDTA pri 65°C, s preplachmi v 0,2 x SSC/0,1% SDS pri 42°C (viď Ausubel et. al., vyššie) a ktorá kóduje funkčne ekvivalentný génový produkt homologický k AveC, ako bol definovaný vyššie.

Vo výhodnom uskutočnení hybridizuje polynukleotidová molekula na komplementárnu sekvenciu k nukleotidovej sekvencií SEQ ID NO:3 kódujúcej génový produkt homologický k AveC alebo na jej významnú časť, za podmienok vysokej prísnosti, t. j. za hybridizácie na DNA viazanú na filter v 0,5 M NaHPO₄, 7% dodecy1s1ranu sodnom (SDS), lmM EDTA pri 65°C, s preplachmi v 0,1 x SSC/0,1% SDS pri 68°C (viď Ausubel et. al., 1989, vyššie) a ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt, ako bol definovaný vyššie.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidová molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorý je homologický ku génovému produktu S.hygroscopicus homologickému k AveC. Ako je tu použitý v súvislosti s polypeptidmi, ktoré sú homologické ku génovému produktu homologickému k AveC sekvencie SEQ ID NO:4 z S.hygroscopicus, označuje termín „homologický polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu podlá SEQ ID N0:4, v ktorom bol jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov konzervatívne substituovaný iným aminokyselinovým zvyškom tak, že takéto konzervatívne substitúcie vedú ku vzniku funkčne ekvivalentného génového produktu, ako bol definovaný vyššie.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje oligonukleotidy, ktoré hybridizujú na polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu podlá obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo SEQ

ID NO:3, nukleotidovú alebo na polynukleotidovú sekvenciu, ktorá molekulu je obsahujúcu komplementárna k nukleotidovej SEQ ID N0:3.

približne 10 sekvencií podľa obr. 1

Takéto oligonukleotidy nukleotidov, lepšie 15 (SEQ ID NO:1) alebo majú dĺžku aspoň až 30 nukleotidov a hybridizujú na jednu z vyššie uvedených polynukleotidových molekúl pri podmienkach vysokej prísnosti, t. j. pri výplachoch v 6xSSC/0,5% pyrofosforečnan sodný pri približne 37°C na oligonukleotidy s dĺžkou 14 báz, približne 48°C na oligonukleotidy s dĺžkou 17 báz, pri približne 55°C na oligonukleotidy s dĺžkou 20 báz a pri približne 60°C na oligonukleotidy s dĺžkou 23 báz. Vo výhodnom uskutočnení sú oligonukleotidy komplementárne k časti jednej z vyššie uvedených polynukleotidových molekúl. Tieto oligonukleotidy sú použiteľné na rôzne účely, vrátane kódovania alebo pôsobenia ako proti zmyslové molekuly použiteľné v génovej regulácii, alebo ako priméry na amplifikácii polynukleotidových molekúl kódujúcich AveC alebo AveC homológy.

Ďalšie gény homologické k aveC môžu byť identifikované v ďalších druhoch alebo kmeňoch Streptomyces pri použití polynukleotidových molekúl alebo oligonukleotidov popísaných v predkladanom vynáleze a známych oligonukleotidové molekula obsahujúca nukleotidovej sekvencie podľa obr. 1 časť S.hygroscopicus nukleotidovej sekvencie SEQ ID môže byť detekovateľne knihovne techník. Napríklad, časť S.avermitilis (SEQ ID NO:1) alebo ktorý podmienok

NO: 3, značená a použitá na prehľadávanie konštruovanej predmetom je vybraná v tomto prípade ku skúmanému organizmu.

sú dobre známe z DNA je genetickej z organizmu, hybridizačných referenčného organizmu, S.hygroscopicus, podmienky a takéto záujmu. podľa S.avermitilis získanej Prísnosť vzťahu alebo prísnosti podmienky organizme, sekvencie.

Požiadavky na odborníkom v rôzne obore nukleotidov špecifickom a vyznačené aspoň 15 oligonukleotidy popísané Amplifikácia homologických použití týchto technik, ako je iné amplifikačné ligázová reťazová reakcia, a iných polymerázová techniky budú pravdepodobne závisieť na z ktorého je získaná

Takéto oligonukleotidy i a patria medzi ne v nasledujúcich génov môže byť realizovaná oligonukleotidov a reťazová reakcia známe v obore, ako môžu byť tiež použité.

knihovňa majú dĺžku napríklad príkladoch. Pri štandartných (PCR), i keď je napríklad

Klony identifikované ako klony obsahujúce nukleotidové sekvencie homologické k aveC môžu byť testované na schopnosť kódovať funkčný génový produkt homologický k AveC. Na tento účel môžu byť klony podrobené analýze sekvencie, pomocou ktorej sa identifikujú vhodné čítacie rámce, rovnako ako iniciačné a terminačné signály. Alternatívne, alebo okrem toho môžu byť klonované DNA sekvencie inzertované do vhodného expresného vektora, t.j. do vektora, ktorý obsahuje nutné elementy na transkripciu a transláciu inzertované kódujúce sekvencie na proteín. Môže byť použitý ktorýkoľvek z mnohých systémov vektor/hostitel, vrátane bakteriálnych systémov, ako sú plazmidové, bakteriofágové alebo kozmidové expresné vektory.

Vhodné hostiteľské bunky transformované takýmito vektormi obsahujúcimi potenciálny aveC homologické kódujúce sekvencie môžu byť potom analyzované na aktivitu AveC typu pri použití metód, ako je HPLC analýza fermentačných produktov, ako je popísaná napríklad ďalej.

Produkcie a spracovanie polynukleotidových molekúl podlá predkladaného vynálezu sú známe v obore a môžu byť realizované pri použití rekombinantných techník, ktoré sú popísané napríklad v Maniatis et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laporatory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al., (ed.), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; a Erlich (ed.), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, ktoré sú tu všetky uvedené ako odkazy. Polynukleotidové klony kódujúce AveC génové produkty alebo génové produkty homologické k AveC môžu byť identifikované pri použití akejkoľvek metódy známej v obore, ako sú napríklad metódy uvedené ďalej. Genómové DNA knihovne môžu byť prehľadávané na aveC a aveC homologické kódujúce sekvencie pri použití techník ako je technika popísaná v Benton and Davis, 1977, Science 196: 180 na bakteriofágové knihovne a v Grunstein and Hogness,- 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965 na plazmidové knihovne. Polynukleotidové molekuly, o ktorých je známe, že obsahujú aveC ORF, ako je napríklad molekula prítomná v plazmide pSE186 (ATCC 209604) alebo v plazmide pSE119 (ako je uvedený ďalej), môžu byť použité ako sondy pri tomto prehľadávaní. Alternatívne môžu byť syntetizované oligonukleotidové sondy, ktoré zodpovedajú nukleotidovým sekvenciám odvodeným z čiastočnej alebo kompletnej aminokyselinovej sekvencie prečisteného génového produktu homologického k AveC.

Rekombinantné systémy

Klonovanie a expresné vektory

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantné klonovacie vektory a expresné vektory, ktoré sú použiteľné na klonovanie alebo expresiu polynukleotidových molekúl podľa predkladaného vynálezu obsahujúcich, napríklad, aveC ORF S.avermitilis alebo ORF akéhokoľvek homológu aveC. V príkladnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), ktorý obsahuje kompletný ORF aveC génu S.avermitilis.

Všetok nasledujúci popis týkajúci sa aveC ORF S.avermitilis alebo polynukleotidovej molekuly obsahujúcej aveC ORF S.avermitilis alebo jeho časť, alebo AveC génového produktu S.avermitilis, sa tiež týkajú aveC homológov a génových produktov homologických k AveC, pokial nie je výslovne uvedené inak.

Rôzne vektory boli vyvinuté na špecifické použitie v Streptomyces, vrátane fágov, plazmidov s vysokým počtom kópií, plazmidov s nízkym počtom kópií a E.coli-Streptomyces kyvadlových vektorov a akýkoľvek z týchto vektorov môže byť použitý na uskutočnenie predkladaného vynálezu. Zo Streptomyces bolo tiež klonované mnoho génov na liekovú rezistenciu a niekoľko z týchto génov bolo použitých vo vektoroch ako selektovatelné markery. Príklady v súčasnosti používaných vektorov na Streptomyces sú uvedené, napríklad, v Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16: 169-190.

Rekombinantné vektory podľa predkladaného vynálezu, najmä expresné vektory, sú výhodne konštruované tak, že kódujúca sekvencia na polynukleotidovú molekulu podía predkladaného vynálezu je v operatívnej asociácii s jedným alebo viacero regulačnými elementmi nevyhnutnými na transkripciu a transláciu kódujúcej sekvencie za vzniku polypeptidu. Termín „regulačné elementy, ako je tu použitý, označuje - bez obmedzenia - nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú indukovateľné a neindukovateľné promótory, zosilňovače transkripcie, operátory a iné elementy známe v obore, o ktorých je známe, že slúžia na riadenie a/alebo reguláciu expresie polynukleotidových kódujúcich sekvencií. Výraz „kódujúce sekvencie je v operatívnej asociáci s jedným alebo viacero regulačnými elementmi znamená, že regulačné elementy účinne riadia a umožňujú trasnkripciu kódujúcej sekvencie alebo transláciu jej mRNA, alebo obidva tieto deje .

Typickými plazmidovými vektormi, ktoré môžu byť upravené tak, aby obsahovali polynukleotidovú molekulu podľa predkladaného vynálezu, sú pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) a kyvadlový vektor pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881), napríklad.

Spôsoby na konštrukciu rekombinantných vektorov obsahujúcich určité kódujúce sekvencie v operatívnej asociácii s vhodnými regulačnými elementmi sú v obore dobre známe a môžu byť použité pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu. Medzi tieto metódy patria rekombinantné techniky in vitro, syntetické techniky a genetické rekombinácie in vivo. Viď napríklad techniky popísané v Maniatis et al., 1989, vyššie; Ausubel et al . , 1989, vyššie; Sambrook et al., 1989, vyššie; Innis et al., 1995, vyššie; a Erlich et al., 1992, vyššie.

Regulačné elementy týchto vektorov sa môžu líšiť vo svojej dĺžke a špecifikách. Podlá použitého systému hostiteľ/vektor môže byť použitých mnoho vhodných transkripčných a translačných elementov. Príklady transkripčných regulačných regiónov alebo promótorov na baktérie sú β-gal promótor, T7 promótor, TAC promótor, λ ľavý a pravý promótor, trp a lac promótory, trp-lac fúzne promótory a, na Streptomyces, promótory ermE, melC a tipA atď. V konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej bol pripravený expresný vektor obsahujúci aveC ORF klonovaný do susedstva silného konštitutívneho ermE promótoru zo Saccharopolyspora erythraea. Vektor bol transformovaný do S.avermitilis a potom realizovaná HPLC analýza produktov fermentácie ukázala zvýšený titer produkovaných avermektínov v porovnaní s produkciou v rovnakom kmeni, ktorý exprimuje prirodzenú aveC alelu.

Expresné vektory na fúzne proteíny môžu byť použité na expresiu AveC génového produktu - fúzneho proteínu. Prečistený fúzny proteín môže byť použitý na zisknie antiséra proti AveC génovému produktu, na štúdium biochemických vlastností AveC génového produktu, na prípravu AveC fúznych proteínov s odlišnými biochemickými vlastnosťami alebo na uľahčenie identifikácie alebo prečistenie exprimovaných AveC génových produktov. Možnými expresnými vektormi na fúzne proteíny sú, napríklad, vektory obsahujúce sekvencie kódujúce β-galaktosidasu a trE fúzie, fúzie obsahujúce väzbový proteín na maltózu, fúzia obsahujúca glutatión-S-transferázu a polyhistidinové fúzie (nosičové regióny). V alternatívnom uskutočnení môže byť AveC génový produkt alebo jeho časť fúzovaný na génový produkt homologický k AveC alebo jeho časť, ktorá pochádza z iného druhu alebo kmeňa Streptomyces, napríklad zo S . hygroscopicus alebo S.griseochromogenes . V konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej a zobrazenom na obr. 7 bol pripravený chimerický plazmid obsahujúci 564 bp región ORF homologický k aveC zo S.hygroscopicus, ktorý nahradil 564 bp región ORF aveC S.avermitilis. Takéto hybridné vektory môžu byť transformované do buniek S.avermitilis a môžu byť testované na určenie ich vplyvu napríklad na pomer produkovaných avermektínov triedy 2: triede 1.

AveC fúzne proteíny môžu byť upravené tak, aby obsahovali región užitočný na prečistenie. Napríklad, fúzia AveC-väzbový proteín na maltózu môžu byť prečistené pri použití amylózovej živice; fúzne proteíny AveC-glutatión-Strasnferáza môžu byť prečistené pri použití glutatiónagarózových korálok; a fúzne proteíny AveC-polyhistidín môžu byť prečistené pri použití divalentnej niklovej živice. Alternatívne môžu byť na prečistenie fúznych proteínov afinitnou chromatografiou použité protilátky proti proteínovému alebo peptidovému nosičovi. Napríklad, nukleotidová sekvencia kódujúca cielový epitop monoklonárnej protilátky môže byť vložená do expresného vektora v operatívnej asociácii s regulačnými elementmi a môže byť umiestnená tak, že exprimovaný epitop je fúzovaný na VaeC polypeptid. Napríklad, nukleotidová sekvencia kódujúca FLAG™ epitop (Internátional Biotechnologies, Inc.), čo je hydrofilný markerový pepítd, môže byť inzertovaná pri použití štandartných technik do expresného vektora v mieste zodpovedajúcom, napríklad, polypeptidu. Exprimovaný FLAG™ epitop môže byť pri použití prečistený protilátok karboxylovému fúzny proteín AveC potom komerčne detekovaný dostupných koncu AveC polypeptida afinitne anti-FLAG™

Expresný vektor kódujúci AveC proteín môže byť tiež upravený tak, aby obsahoval polylinkerové sekvencie, ktoré kódujú špecifické väzobné miesta na proteázy, preto exprimovaný AveC polypeptid môže byť uvoľnený z nosiča alebo fúzneho partnera reakciou so špecifickou proteázou. Napríklad môže vektor na fúzny proteín obsahovať DNA sekvencie kódujúce štepiace miesta na trombín alebo faktor Xa .

Signálna sekvencia umiestnená pred a v čítacom rámci s aveC ORF môže byť vložená do expresného vektora pri použití známych techník a slúži na transport a sekréciu exprimovaného génového produktu. Príklady takýchto génových sekvencii sú napríklad signálne sekvencie z a-faktoru, imunoglobulínov, vonkajších membránových proteínov, penici1linázy a receptorov T-buniek.

Na uľahčenie selekcie hostiteľských buniek transformovaných alebo transfektovaných klonovacimi alebo expresnými vektormi podľa predkladaného vynálezu môže byť vektor upravený tak, aby obsahoval kódujúcu sekvenciu na produkt reportérového génu alebo iný selektovatelný marker. Takáto kódujúca sekvencia je výhodne v operatívnej asociácii s kódujúcimi sekvenciami na regulačné elementy, ako boli popísané vyššie. Reportérové gény použiteľné v predkladanom vynáleze sú dobre známe v obore a patria medzi ne napríklad gény kódujúce zelený fluorescentný proteín, luciferázu, xylE a tyrosinázu. Nukleotidové sekvenie kódujúce selektovateľné markery sú dobre známe v obore a patria medzi ne napríklad gény kódujúce rezistenciu na antibiotiká alebo antimetabolity, alebo gény, ktoré dopĺňajú auxotrofné požiadavky. Príklady takýchto sekvencii sú napríklad sekvencie kódujúce rezistenciu na erytromycín, tiostrepton alebo kanamycín.

Transformácie hostiteľských buniek

Predkladaný vynález ďalej obsahuje transformované hostiteľské bunky obsahujúce polynukleotidovú molekulu alebo rekombinantný vektor podľa predkladaného vynálezu a nové kmene alebo bunečné línie získané z týchto buniek. Hostiteľskými bunkami vhodnými na uskutočnenie vynálezu sú výhodné bunky Streptomyces, i keď môžu byť použité tiež iné prekaryotické a eukaryotické bunky. Takéto transformované hostiteľské bunky zvyčajne zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, mikroorganizmy, ako sú baktérie transformované rekombinantnými bakteriofágovými DNA, plazmidovými DNA alebo kozmidovými DNA vektormi, alebo kvasinky transformované rekombinantnými vektormi.

Polynukleotidové molekuly podlá predkladaného vynálezu sú určené na bunky Streptomyces, ale môžu byť transformované tiež do iných bakteriálnych alebo eukaryotických buniek, napríklad za účelom klonovania alebo expresie. Typicky môže byť použitý kmeň E.coli, ako je napríklad DH5a kmeň, dostupný od Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (prírastkové č. 31343) a z komerčných zdrojov (Stratagene). Výhodnými eukaryotickými hostiteľskými bunkami sú kvasinky, i keď môžu byť použité tiež cicavčie bunky a hmyzie bunky.

Rekombinantný expresný vektor podľa predkladaného vynálezu je výhodne transformovaný alebo transfektovaný do jednej alebo viacerých buniek v podstate homogénnej kultúry buniek. Expresný vektor je zvyčajne vložený do hostiteľských buniek pri použití známych techník, ako je napríklad protoplastová transformácia, zrážanie fosforečnanom vápenatým, spracovávanie chloridom vápenatým, mikroinj ekcie, elektroporácie, transfekcie kontaktom s rekombinantným virom, lipozómy - sprostredkovaná transfekcia, DEAEdextranová transfekcia, transdukcia, konjugácia alebo ostreľovanie mikročasticami. Selekcia transformantov môže byť uskutočnená pri použití štandartných techník, ako je selekcia buniek exprimujúcich selektovateľný marker, napríklad gén na rezistenciu na antibiotiká, ktorý je asociovaný s rekombinantným vektorom, ako bolo uvedené vyššie.

Po vložení expresného vektora do hostiteľskej bunky môže byť integrácia a udržiavanie aveC kódujúcej sekvencie v chromozóme hostiteľskej bunky alebo epizomálne potvrdená pri použití štandartných technik, ako je southernov prenos, analýza reštrikčnými enzýmami, PCR analýza, vrátane PCR s reverznou transkripciou (RT-PCR), alebo imunologickými testmi detekujúcimi predpokladaný génový produkt.

Hostiteľské bunky obsahuj úce a/alebo exprimuj úce rekombinantnú aveC kódujúcu sekvenciu môžu byť identifikované akoukoľvek z najmenej štyroch všeobecných technik známych v obore, ktoré sú:

i) DNA-DNA, DNA-RNA alebo RNA-proti zmys 1ová RNA hybridizácia;

ii) detekcia prítomnosti funkcií markerového génu;

iii) hodnotenie úrovne transkripcie podľa expresie aveC- špecifických mRNA transkriptov v hostiteľskej bunke; a iv) detekcia prítomnosti zrelého polypeptidového produktu, ktorá je uskutočnená napríklad imunotestom alebo detekciou AveC biologickej aktivity (napríklad, produkcia špecifických pomerov a množstva avermektinov ukazuje na AveC aktivitu v, napríklad, S.avermitilis hostiteľských bunkách).

Expresia a charakterizácia rekombinantného produktu

Po stabilnom vložení aveC kódujúcej

AveC génového sekvencie do vhodnej hostiteľskej bunky môžu byť transformované hostiteľské bunky klonálne propagované a získané bunky môžu byť kultivované pri podmienkach umožňujúcich maximálnu produkciu AveC génového produktu. Takéto podmienky zvyčajne obsahujú kultiváciu buniek do vysokej hustoty. Pokiaľ obsahuje expresný vektor indukovateľný promótor, tak môžu byť na indukciu expresie použité vhodné indukčné podmienky, ako je napríklad zmena teploty, vyčerpanie živín, pridanie indukčných činidiel (napríklad analógov karbohydrátov, ako je izopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG)), akumulácia nadbytočných vedľajších produktov metabolizmu.

Pokial zostáva AveC génový produkt vo vnútri hostitelských buniek, tak sú bunky pozbierané a uskutoční sa lýza buniek a produkt sa izoluje a prečistí z lyzátu pri extrakčných podmienkach známych v obore, ktoré minimalizujú degradáciu proteínov, napríklad pri 4°C, a/alebo pri prítomnosti inhibítorov proteáz. Pokiaľ je exprimovaný AveC génový produkt secernovaný hostitelských buniek, tak môže byť odobraté iba vyčerpané živné médium a produkt môže byť izolovaný z tohto média.

Exprimovaný AveC génový alebo významne prečistený z kultivačného média, pri vrátane napríklad akejkoľvek zrážanie síranom amónnym, ionomeničová chromatografia, a afinitná chromatografia . génový produkt biologickú aktivitu, čistoty prípravku sledované v pomocou vhodného testu. Pokial génový produkt biologickú aktivitu, napríklad podľa špecifickou na sekvencie .

veľkosti alebo

AveC, alebo produkt môže byť izolovaný z bunečných lyzátov alebo použití štandartných metód, kombinácie nasledujúcich metód: frakcionácia podľa veľkosti, HPLC, odstredenie podľa hustoty

Pokial vykazuje exprimovaný AveC tak môže byť zvyšovanie každom stupni prečisťovania nevykazuje exprimovaný AveC tak môže byť detekovaný reaktivity s protilátkou podľa prítomnosti fúznej

Predkladaný exprimovaný AveC aminokyselinovú génový produkt aminokyselinovú vynález génový sekvenciu tak produkt kódovanú plazmidu pSE186 poskytuje rekombinantne S.avermitilis obsahujúci sekvenciou kódujúcou AveC (ATCC 209604) , alebo sekvenciu podľa obr. 1 (SEQ ID NO:2) alebo jej významnú časť a jeho homológy.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantné exprimovaný génový produkt homologický k AveC S. hygroscopicus obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID N0:4 alebo jej významnú časť a jeho homológy.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob na produkciu AveC génového produktu, ktorý obsahuje kultiváciu hostiteľských buniek transformovaných rekombinantným expresným vektorom, kde uvedený vektor obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt, kde táto polynukleotidová molekula je v operatívnej asociácii s jedným alebo viacerými regulačnými elementmi, ktoré kontrolujú expresiu polynukleotidovej molekuly v hostiteľskej bunke, kde táto kultivácia je realizovaná pri podmienkach umožňujúcich produkciu rekombinantného AveC génového produktu a získanie AveC génového produktu z bunečnej kultúry.

Rekombinantné produkovaný AveC génový produkt S.avermiti 1 i s je použiteľný na rôzne účely, vrátane vyhľadávania zlúčenín, ktoré alternujú funkciu AveC génového produktu a tak ovplyvňujú biosyntézu avermektínov a na prípravu protilátok namierených proti AveC génovému produktu.

Po získaní AveC génového produktu dostatočnej čistoty môže byť tento produkt charakterizovaný pri použití štandartných technik, ako je SDS-PAGE, chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti, analýza aminokyselinovej sekvencie, hodnotenie biologickej aktivity v produkcii správnych metabolitov v biosyntetickej dráhe avermektínov, atď. Napríklad, aminokyselinová sekvencia AveC génového produktu môže byť stanovená pri použití štandartných techník na sekvenovanie peptidov. AveC génový produkt môže byť ďalej charakterizovaný pomocou analýzy hydrofilnosti (viď napríklad Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824), alebo analógovými softwarovými algoritmami, na identifikáciu hydrofóbnych a hydrofilných regiónov AveC génového produktu. Štrukturálna analýza môže byť uskutočnená na identifikáciu regiónov AveC génového produktu, ktoré určujú špecifické sekundárne usporiadania. Biofyzikálne metódy, ako je rontgenová kryštalografia (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), počítačové modelovanie (Fletterick and Zoller (ed.), 1986, v:

Currennt

Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) a nukleárna magnetická rezonancia (NMR), môžu byť použité na mapovanie a štúdium miest interakciou medzi AveC génovým produktom a jeho substrátom. Informácie získané z týchto štúdii môžu byť použité na výber nových miest na mutácie v aveC ORF, ktoré by viedli k zisku nových kmeňov S.avermitilis majúcich výhodnejšie charakteristiky produkcie avermektínov.

Konštrukcia a použitie AveC mutantov

Predkaldaný vynález poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako sekvencia kódujúca AveC génový produkt S.avermitilis v plazmide pSE186 (ATCC 209604) alebo nukleotidová sekvencia aveC ORF S. avermitilis uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO:1), ale ktorá obsahuje jednu alebo viac mutácií, preto bunky S.avermitilis kmeňa ATCC 53692, v ktorých bola prirodzená aveC alela inaktivovaná a ktoré exprimujú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu produkujú iné pomery alebo množstvá avermektínov než bunky kmeňa S.avermitilis ATCC 53692, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu.

Podľa predkladaného polynukleotidové molekuly S.avermiti 1 is, ktoré v produkcii avermektinov ktorý exprimuje iba uskutočnení sú takéto vynálezu môžu byť takéto použité na produkciu nových kmeňov vykazujú detekovatelné v porovnaní prirodzenú aveC polynukleotidové s rovnakým alelu. Vo zmeny kmeňom, zníženom rovnakým alelu. V ktoré i výhodnom použiteľné produkujú tirede 1 exprimuje iba molekuly nových kmeňov S.avermitilis, pomere triedy kmeňom, ktorý inom výhodnom uskutočnení sú takéto prípravu vyššie ktorý uskutočnení na produkujú rovnakým kmeňom, ďalšom nových množstvá na prípravu avermektíny v porovnaní prirodzenú aveC polynukleotidové molekuly použiteľné kmeňov S.avermiti 1 i s, ktoré avermektinov v porovnaní s iba prirodzenú aveC alelu. V ešte polynukleotidové molekuly použiteľné na kmeňov S.avermiti 1 i s, v ktorých bol exprimuj e sú takéto nových inaktivovaný.

produkciu aveC gén

Mutácie aveC kódujúcej sekvencie zahŕňajú akékoľvek mutácie, ktoré spôsobujú aminokyselinové delécie, adície alebo substitúcie v AveC génovom produkte, alebo ktoré vedú ku skráteniu AveC génového produktu, alebo k akejkoľvek kombinácii vyššie uvedených zmien a ktoré vedú k požadovaným výsledkom. Napríklad, predkladaný vynález poskytuje polynukleotidové molekuly obsahujúce sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt S.avermitilis v plazmide pSE186 (ATCC 209604) alebo nukleotidovú sekvenciu aveC ORF S.avermiti 1 i s uvedenú na obr. 1 (SEQ ID N0:l), ale ktorá ďalej obsahuje jednu alebo viac mutácií, ktoré kódujú substitúcie aminokyselinových zvyškov inými aminokyselinovými zvyškami vo vybraných pozíciách v AveC génovom produkte. V niekoľkých príkladných realizáciách, ktoré sú uvedené ďalej, môžu byť takéto substitúcie realizované v akejkoľvek aminokyselinovéj pozícii 55, 138, 139 alebo 230, alebo v niekoľkých týchto pozíciách.

Mutácie aveC kódujúcej sekvencie sú realizované akoukoľvek známou technikou, vrátane chybovej PCR alebo kazetovej mutagenézie. Napríklad, oligonukleotidy - riadená mutagenézia môže byť použitá na alteráciu aveC ORF sekvencie definovaným spôsobom, napríklad viac reštrikčných miest alebo špecifických regiónov v aveC ORF spôsob popísaný v U.S. patente náhodnú fragmentáciu, opakované môžu byť tiež knihovní po vložení jedného alebo terminančných kodónov, do sekvencií. Spôsoby, ako je 5605793, ktorý obsahuje cykly mutagenézie a zmien použité na polynukleotidov sekvencie kódujúcej aveC mutácie.

nukleotidov, rozsiahlych nukleotidové generovanie obsahujúcich

Riadené mutácie môžu byť výhodné, alebo slúžia na alternáciu jedného aminokyselinových zvyškov v Napríklad, porovnanie odvodených

AveC génových produktov a génových produktov homologických k AveC z

AveC vtedy, pokiaľ konzervovaných génovom produkte, aminokyselinových sekvencií najmä viac (SEQ ID uvedené

S.avermitilis (SEQ ID NO:2), S.griseochromogenes (SEQ ID N0:4), ako je významnej konzervácie týmito kmeňmi. Riadená jedného alebo viacerých

NO:5) a S.hygroscopicus na obr.

6, ukazuje zvyškov medzi vedie ku zmene aminokyselinových mutagenézia, ktorá zvyškov, môže byť najmä účinná v produkcii nových mutantných kmeňov vykazujúcich požadované alternácie v produkcii avermektínov.

Náhodná mutagenézia môže byť tiež užitočná a môže byť realizovaná pomocou vystavenia buniek S.avermitilis ultarfialovému žiareniu alebo rontgenovému žiareniu, alebo pôsobením chemických mutagénov, ako je N-metyl-N'nitrosoguanin, etylmetansulfonat, kyselina dusitá alebo nitrogénmustard. K prehľadu technik mutagenézie pozri napríklad Ausubel et al., 1989, vyššie.

Po pripravení mutovaných polynukleotidových molekúl sú tieto molekuly testovaní na určenie toho, či môžu modulovať syntézu avermektínov v S.avermitilis. Vo výhodnom uskutočnení je polynukleotidová molekula obsahujúca mutované nukleotidové sekvencie testovaná pomocou komplementácie gén inaktivovaný pri pozadia. V príklade molekula vložená do kmeňa S.avermitilis, v ktorom bol aveC dosiahnutí aveC negatívneho (aveC‘) mutovaná polynukleotidová operatívnej asociácii elementmi, kde tento alebo viac génov plazmidu v regulačnými tiež jeden

Vo s jedným alebo plazmid výhodne rezistencie na metódy je expresného viacerými obsahuje antibiotiká umožňujúcich selekciu transformovaných buniek. Tento vektor je potom transformovaný do aveC hostiteľských buniek pomocou selektované a známych technik a transformované kultivované vo vhodnom fermentačnom podmienkach avermektínov.

bunky sú médiu pri produkciu umožňujúcich alebo indukujúcich

Produkty fermentácie sú potom analyzované HPLC na stanovenie schopnosti mutovanej polynukleotidovej molekuly komplementovať hostiteľskú bunku. Niekoľko vektorov nesúcich mutovanú polynukleotidovú pomer B2:B1 avermektínov, vrátane je uvedené ďalej.

molekulu pSE188, schopnú znižovať pSE199 a pSE231, spôsob na identifikáciu

Predkladaný vynález poskytuje mutácií aveC ORF S.avermitilis, ktoré menia pomery a/alebo množstvo produkovaných avermektinov. Vo výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález spôsob na identifikáciu mutácií aveC ORF, ktoré môžu meniť pomer produkovaných avermektinov triedy 2:triede 1, ktorý obsahuje:

a) stanovenie pomeru avermektinov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis, v ktorých bola prirodzená aveC alela inaktivovaná a do ktorých bola vložená a v ktorých je exprimovaná polynukleotidové molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný AveC génový produkt;

b) stanovenie pomeru avermektinov triedy 2 : triede 1 produkovaných bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis ako v kroku a), ktoré ale exprimujú iba aveC alelu majúcu nukleotidovú sekvenciu ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo nukleotidovú sekvenciu homologickú k tejto sekvencii; a

c) porovnanie pomeru avermektinov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis kroku a) s pomerom avermektinov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis kroku b);

keď pokiaľ je pomer avermektinov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis kroku a) odlišný od pomeru avermektinov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis kroku b), tak bola identifikovaná mutácia aveC ORF, ktorá je schopná meniť pomer avermektinov triedy 2:triede 1. Vo výhodnom uskutočnení mutácie znižuje pomer produkovaných avermektinov triedy 2:triede 1.

V ďalšom výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález spôsob na identifikáciu mutácií aveC ORF alebo genetického konštruktu obsahujúceho aveC ORF, ktoré môžu meniť množstvo produkovaných avermektinov, ktorý obsahuje:

a) stanovenie množstva avermektinov produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis, v ktorých bola prirodzená aveC alela inaktivovaná a do ktorých bola vložená a v ktorých je exprimovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný AveC génový produkt alebo obsahujúci genetický konštrukt obsahujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt;

b) stanovenie množstva avermektinov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis ako v kroku

a), ktoré ale exprimujú iba aveC alelu majúcu nukleotidovú sekvenciu

ORF podlá obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo nukleotidovú sekvenciu homologickú k tejto sekvencii;

c) porovnanie množstva avermektinov produkovaných bunkami

S.avermitilis kroku

a) s množstvom avermektinov produkovaných bunkami S.avermitilis kroku b);

keď pokial je množstvo avermektinov produkovaných bunkami

S.avermitilis korku a) odlišné od množstva avermektinov produkovaných bunkami

S.avermitilis kroku b), tak bola identifikovaná mutácia aveC

ORF alebo genetického konštruktu, ktorá je schopná meniť množstvo avermektinov. Vo výhodnom uskutočnení mutácia zvyšuje množstvo produkovaných avermektinov.

Všetky vyššie uvedené metódy na identifikáciu mutácií sú uskutočnené pri použití fermentačného kultivačného média doplneného kyselinou cyklohexankarboxylovou, i keď môžu byť použité ako prekurzory tiež iné vhodné mastné kyseliny, ako sú napríklad mastné kyseliny uvedené v tabulke 1.

Po identifikácii polynukleotidovej molekuly, ktorá moduluje produkciu avermektinov žiadúcim spôsobom, sa môže stanoviť miesto mutácie v nukleotidovej sekvencii. Napríklad, polynukleotidová molekula majúca sekvenciu nukleotidov kódujúcu mutovaný AveC génový produkt môže byť izolovaná PCR a môže byť analyzovaná na sekvenciu DNA pri použití známych metód. Porovnaním DNA sekvencie mutovanej aveC alely so sekvenciou prirodzenej aveC alely môžu byť určené mutácie zodpovedajúce za alternáciu produkcie avermektínov. V konkrétnych uskutočneniach predkladaného vynálezu spôsobujú S.avermitilis AveC génové produkty obsahujúce buď substitúcie jednej aminokyseliny v pozícii 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) alebo 230 (G230D), alebo dvoch aminokyselín v pozíciách 138 (S138T) a 139 (A139T), zmenu funkcie AveC génového produktu, ktorá mení pomer produkovaných avermektínov triedy 2:triede 1 (viď ďalej). Preto sú polynukleotidové molekuly majúce nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú mutované S.avermitilis AveC génové produkty obsahujúce aminokyselinové substitúcie v jednom alebo viacerých aminokyselinových zvyškoch 5, 138, 139 alebo 230, alebo v kombinácií týchto zvyškov, predmetom predkladaného vynálezu.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje prostriedky na prípravu nových kmeňov S. avermitilis, kde bunky uvedených kmeňov obsahujú mutovanú aveC alelu, ktorá spôsobuje alternáciu v produkcii avermektínov. Napríklad, predkladaný vynález poskytuje rekombinantné vektory, ktoré môžu byť použité na cielené vloženie akejkoľvek polynukleotidovej molekuly obsahujúcej mutované nukleotidové sekvencie podľa predkladaného vynálezu do miesta aveC génu na S.avermitilis chromozómu, za účelom inzercie alebo nahradenia aveC ORF alebo jeho časti homológnej rekombinácie. I tak, podľa predkladaného vynálezu môže polynukleotidová molekula obsahujúca mutovanú nukleotidovú sekvenciu podľa predkladaného vynálezu tiež modulovať biosyntézu avermektínov vtedy, ak je inzertovaná do chromozómu S.avermitilis v inom mieste než v aceC géne, alebo pokiaľ je prítomná v bunkách S. avermitilis epizomálne. Tak predkladaný vynález tiež poskytuje vektory obsahujúce polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu podía predkladaného vynálezu, kde tieto vektory môžu byť použité na inzerciu polynukleotidovej molekuly v inom mieste chromozómu S.avermitilis, než je aveC gén, alebo ktoré môžu byť prítomné epizomálne.

Vo výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález vektory na génovú substitúciu, ktoré môžu byť použité na inzerciu mutovanej aveC alely do buniek kmeňa S.avermitilis, čím vzniknú nové kmene S.avermitilis, ktorých bunky produkujú avermektíny v zmenenom pomere triedy 2:triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnom uskutočnení je pomer produkovaných avermektinov triedy 2:triede 1 znížený. Takéto vektory môžu byť pripravené pri použití mutovaných polynukleotidových molekúl prítomných v expresných vektoroch podía predkladaného vynálezu, ako je pSE188, pSE199 a pSE231, ktoré sú uvedené ďalej.

V ďalšom výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález vektory, ktoré môžu byť použité na inzerciou mutovanej aveC alely do buniek kmeňa S.avermitilis, čím vzniknú nové kmene, ktorých bunky produkujú avermektíny v zmenenom množstve v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnom uskutočnení je množstvo produkovaných avermektinov zvýšené. V konkrétnom uskutočnení takýto vektor ďalej obsahuje silný promótor známy v obore, ako je napríklad silný konštitutívny ermE promótor zo Saccharomyces erythraea, ktorý je umiestnený pred a ktorý je operatívne naviazaný na aveC ORF. Takýmto vektorom môže byť plazmid pSE189, ktorý je popísaný v príklade 11, alebo môže byť takýto vektor pripravený pri použití mutovanej aveC alely plazmidu pSE189.

V inom výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález vektory, ktoré sú použiteľné na inaktiváciu aveC génu v prirodzenom kmeni S.avermitilis. V príkladnom uskutočnení môžu byť takéto vektory pripravené pri použití mutovanej polynukleotidovej molekuly prítomnej v plazmide pSE180 (ATCC 209605), ktorý je popísaný ďalej (obr. 3). Predkladaný vynález ďalej poskytuje vektory, ktoré obsahujú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu alebo skladajúcu sa z nukleotidových sekvencií, ktoré v normálnej situácii susedia s aveC génom in situ v chromozóme S.avermitilis, vrátane napríklad susedných nukleotidových sekvencií podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1), kde tieto vektory môžu byť použité na deléciu S.avermitilis aveC ORF.

Predkladaný nových kmeňov exprimuj ú a/alebo vynález ďalej

S.avermitilis mutovanú množstvo rovnakého kmeňa aveC alelu obsahuje tvorených a produkujú avermektinov spôsoby na prípravu ktoré pomer s bunkami prirodzenú predkladaný

S.avermitilis, aveC alelu. Vo výhodnom vynález spôsob na prípravu bunkami, pozmenený v porovnaní ktorý exprimuje iba uskutočnení poskytuje nových kmeňov

S.avermitilis tvorených bunkami, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu a ktoré produkujú pozmenený pomer avermektinov triedy 2:triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu, kde uvedený spôsob obsahuje transformáciu buniek S.avermitilis vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu kódujúcu génový produkt, ktorý mení pomer avermektinov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu s bunkami rovnakého kmeňa

S. avermitilis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu a selekciu transformovaných buniek, ktoré produkujú pozmenený pomer avermektinov triedy 2:triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnom uskutočnení je pomer produkovaných avermektinov triedy 2:triede 1 znížený.

Vo výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nových kmeňov S.avermitilis tvorených bunkami, ktoré produkujú pozmenené množstvá avermektinov, kde uvedený spôsob obsahuje transformáciu buniek S.avermitilis vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorého expresia spôsobuje zmenu množstva avermektinov produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermit i 1 i s, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu a selekciu transformovaných buniek, ktoré produkujú pozmenené množstvo avermektinov v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Vo výhodnom uskutočnení je množstvo produkovaných avermektinov triedy zvýšené.

V inom výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nových kmeňov S.avermitilis tvorených bunkami, ktoré obsahujú inaktivnu aveC alelu, kde uvedený spôsob obsahuje transformáciu buniek S.avermiti 1 i s, ktoré exprimujú prirodzenú aveC alelu, vektorom, ktorý inaktivuj e a veC alelu a selekciu transformovaných buniek, v ktorých bola aveC alela inaktivovaná. Vo výhodnom príkladnom uskutočnení sú bunky kmeňa S.avermitilis transformované vektorom, ktorý nesie aveC alelu, ktorá bola inaktivovaná mutáciou alebo náhradou časti aveC alely heterológnou génovou sekvenciou, a selekciu transformovaných buniek, v ktorých bola prirodzená aveC alela nahradená inaktívnou aveC alelou. Inaktivácia aveC alely môže byť stanovená HPLC analýzou produktov fermentácie, ako je popísaná ďalej. V konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej je aveC alela inaktivovaná inzerciou ermE génu zo Saccharopolyspora erythaea do aveC ORF.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje nové kmene S. avermitilis tvorené bunkami, ktoré boli transformované akoukoľvek polynukleotidovou molekulou alebo vektorom podľa predkladaného vynálezu. Vo výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález nové kmene S.avermiti1is, ktorých bunky exprimujú mutovanú aveC alelu miesto alebo okrem prirodzenej aveC alely, kde bunky týchto nových kmeňov produkujú avermektíny v pozmenenom pomere triedy 2:triede 1 v porovnaní s produkciou avermektínov triedy 2:triede 1 v bunkách rovnakého kmeňa, ktorý exprimuje iba prirodzenú alelu. Vo výhodnom uskutočnení je pomer produkovaných avermektínov triedy 2:triede 1 znížený. Takéto nové kmene sú použiteľné na priemyselnú produkciu komerčne dostupných avermektínov, ako je doramektín.

Cieľom vyhľadávacích testov podľa predkladaného vynálezu je identifikácia mutovaných alel aveC génu, ktorých expresia v bunkách S.avermitilis mení, presnejšie znižuje, pomer produkovaných avermektínov triedy 2:triede 1. Vo výhodnom uskutočnení je pomer

B2:B1 avermektínov produkovaných bunkami nového kmeňa

S.avermitilis podľa predkladaného vynálezu exprimuj úcimi mutovanú aveC alelu, ktorá znižuje pomer avermektínov triedy 2:triede 1 medzi než

1,6:1 a 0:1; vo výhodnom uskutočnení je tento pomer od 1:1 do 0:1; a v najvýhodnejšom uskutočnení je tento pomer od

0,84:1 do 0:1. V konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej produkujú nové bunky podlá predkladaného vynálezu cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom než 1,6:1. V inom konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej produkujú nové bunky podlá predkladaného vynálezu cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektíny v pomere približne 0,94:1. V ešte inom konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej produkujú nové bunky podľa predkladaného vynálezu cyklohexyl B2 : cyklohexyl BI avermektíny v pomere približne 0,88:1. V ešte inom konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej produkujú nové bunky podľa predkladaného vynálezu cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektíny v pomere približne 0,84:1.

V ďalšom výhodnom kmene vynález nové exprimujú mutovanú obsahuj úci alely, kde množstvá uskutočnení poskytuje predkladaný S.avermiti 1is obsahujúce bunky, ktoré aveC alelu alebo genetický konštrukt aveC alelu, miesto alebo okrem prirodzenej aveC kmeňa produkujú pozmenené s bunkami rovnakého kmeňa, výhodnom množstvá bunky tohto nového avermektinov v porovnaní ktoré exprimujú iba produkuj ú

V uskutočnení avermektinov.

prirodzenú nové aveC kmene alelu. Vo konštrukt ďalej pormótor umiestnený pred ermE príkladnom uskutočnení silný promótor, ako zo Saccharopolyspora a v operatívnej väzbe je vyššie obsahuj e silný konštitutívny erythraea, ktorý je s aveC ORF.

genetický

V ďalšom výhodnom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález nové kmene S.avermitilis obsahujúce bunky, v ktorých bol aveC gén inaktivovaný. Takéto kmene sú použiteľné ako z dôvodov odlišného spektra avermektinov, ktoré produkujú v proovnani s prirodzenými kmeňmi, tak na stanovenie toho, ako ovplyvňuje náhodná alebo cielená mutagenézia aveC génu produkciu avermektinov. V konkrétnom uskutočnení popísanom ďalej boli hostitelské bunky S.avermitilis geneticky upravené tak, že obsahujú inaktivovaný aveC gén. Napríklad, kmeň SE 180-11, popísaný v príkladoch uvedených ďalej, bol pripravený pri použití prenosového plazmidu pSE180 (ATCC 209605) (obr. 3), ktorý bol konštruovaný na inaktiváciu aveC génu S.avermitilis inzerciou ermE génu na rezistenciu do aveC kódujúceho regiónu.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje rekombinantne exprimovaný, mutovaný S.avermitilis AveC génový produkt kódovaný akoukoľvek z vyššie uvedených polynukleotidových molekúl podía predkladaného vynálezu a spôsoby jeho prípravy.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob na produkciu ktorý obsahuje kultiváciu buniek exprimuj úcich produkt, ktorý produkovaných mutovanú avermektínov,

S . avermitilis kóduje génový : triede 1 exprimuj úcimi kmeňa, ktoré alelu kmeňa mutovanú aveC alelu, mení pomer avermektínov bunkami kmeňa ktorá triedy

S.avermitilis médiu pri a získanie uskutočnení exprimuj ú podmienkach uvedených je produkovaných v alelu znížený.

pomer kultúre

Tento v porovnaní s bunkami rovnakého prirodzenú alelu, umožňujúcich produkciu avermektínov z kultúry.

avermektínov triedy bunkami exprimujúcimi umožňuje dosiahnutie vyššej hodnotných avermektínov, ako iba v kultivačnom avermektínov

Vo výhodnom

2:triede 1 mutovanú aveC proces účinnosti pri výrobe komerčne je doramektín.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob na produkciu avermektínov, ktorý obsahuje kultiváciu buniek kmeňa

S.avermitilis exprimujúcich mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorá mení množstvo avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S.avermiti lis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré neexprimujú mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt, ale iba prirodzenú alelu, v kultivačnom médiu pri podmienkach umožňujúcich produkciu avermektínov a získaní uvedených avermektínov z kultúry. Vo výhodnom uskutočnení je množstvo avermektínov produkovaných v kultúre bunkami exprimujúcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt zvýšené.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje nové avermektínové prípravky produkované kmeňom S.avermitilis exprimujúcim mutovanú aveC alelu, ktorá kóduje génový produkt, ktorý znižuje pomer avermektínov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu, kde avermektíny v novom prípravku sú produkované s nižším pomerom triedy 2:triede 1, než je pomer avermektínov triedy 2:triede 1 produkovaný bunkami rovnakého kmeňa S.avermitiiis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu. Nové avermektínové prípravky môžu byť pripravené vo forme, v ktorej sú produkované vo vyčerpanom fermentačnom médiu, alebo môžu byť získané z tohto média. Nové avermektínové prípravky môžu byť čiastočne alebo významne prečistené z kultivačnej kvapaliny pri použití známych biochemických technik na prečistenie, ako je zrážanie síranom vápenatým, dialýza, frakcionácia podía veľkosti, ionomeničová chromátografia, HPLC a podobne.

Použitie avermektínov

Avermektiny sú vysoko účinné antiparazitárne činidlá, ktoré majú použitie ako antihelmintiká, ektoparaziticídne činidlá, insekticídy a akaricídy. Avermektínové zlúčeniny pripravené spôsobmi podlá predkladaného vynálezu sú vhodné na akékoľvek z týchto použití. Napríklad, avermektínové zlúčeniny pripravené podľa predkladaného vynálezu sú vhodné na liečbu rôznych ochorení a stavov u človeka, najmä na liečbu ochorení a stavov spôsobených parazitárnou infekciou, ako sú v obore známe. Viď napr. Ikeda an Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Presnejšie, avermektínové zlúčeniny pripravené podľa predkladaného vynálezu sú účinné na liečbu rôznych ochorení a stavov spôsobených endoparazitmi, ako sú hlísty, ktoré môžu infikovať človeka, domáce zvieratá, prasce, ovce, hydinu, kone a dobytok.

Presnejšie, avermektínové zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú účinné proti hlístam, ktoré infikujú človeka, rovnako ako proti tým, ktoré infikujú rôzne druhy zvierat. Medzi takéto hlísty patria gastrointestinálne parazity ako je Ancylosotma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobuis, Dirofilaria a parazity, ktorí sú nachádzaní v krvi a iných tkanivách alebo orgánoch, ako sú filáriové formy a extraintestinálne formy Strongyloides a Trichinella.

Avermektínové zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú tiež účinné pri liečbe ektoparazitárnych infekcií, vrátane napríklad zamorenia cicavcov a vtákov článkonožcami, ktoré sú spôsobené kliešťami, roztočmi, všami, blchami, mäsiarkami, bodavým hmyzom alebo migrujúcimi larvami dvojkrídleho hmyzu, ktoré môžu postihovať dobytok a kone, napríklad.

Avermektinové zlúčeniny podlá predkladaného vynálezu sú tiež účinné ako insekticídy proti domácim škodcom, ako sú napríklad šváby, mole šatové a muchy, rovnako ako proti hmyzu škodiacemu uskladnenému zrnu a poľnohospodárskym plodinám, ako sú napríklad pavúky, vošky, húsenice a rovnokrídly hmyz, ako sú napríklad kobylky.

Medzi zvieratá, ktoré môžu byť liečené avermektinovými zlúčeninami pripravenými podľa predkladaného vynálezu, patria ovce, dobytok, kone, vysoká zver, kozy, prasce, vtáky vrátane hydiny, psy a mačky.

Avermektinové zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu sú podané vo forme vhodnej na špecifické zamýšľané použitie, konkrétny druh liečeného zvieraťa a podľa typu parazita alebo hmyzu, ktorý spôsobuje infekciu. Pri použití ako antiparazitálne činidlo môže byť averme ktinová zlúčenina pripravená podľa predkladaného vynálezu podaná orálne vo forme kapsule, bolusu, tablety alebo kvapaliny, alebo môže byť podaná nástrekom, alebo injekciou alebo vo forme implantátu. Takéto prostriedky sú pripravené bežným spôsobom, podľa štandartnej veterinárnej praxe. Kapsule, bolusy alebo tablety môžu byť pripravené zmiešaním aktívnej zložky s vhodným jemne deleným riedidlom alebo nosičom, ktorý ďalej obsahuje činidlo podporujúce rozpadavosť a/alebo spojivo ako je škrob, laktóza, mastenec, stearan horečnatý a podobne. Veterinárne prostriedky môžu byť pripravené rozpustením aktívnej zložky vo vodnom roztoku spoločne s dispergačnými alebo zmáčavými činidlami a podobne. Injekčné prostriedky môžu byť pripravené vo forme sterilných roztokov, ktoré môžu obsahovať ďalšie substancie, ako sú napríklad soli a/alebo glukóza upravujúca izotonicitu roztoku s izotonicitou krvi.

Takéto prostriedky obsahujú rôzne aktívne zlúčeniny, v závislosti na pacientovi alebo druhu liečeného zvieraťa, na závažnosti a typu infekcie a na telesnej hmotnosti liečeného jedinca. Všeobecne, na orálne podanie je vhodná dávka aktívnej zlúčeniny od približne 0,001 do 10 mg na kg telesnej hmotnosti jedinca a je podaná v jednej dávke, prípadne je rozdelená do 1-5 denných dávok. I tak môžu nastať prípady, u ktorých sú indikované vyššie alebo nižšie dávky, ktoré sú určené lekárom alebo veterinárom podlá klinických príznakov.

Alternatívne môže byť avermektínová zlúčenina produkovaná podlá predkladaného vynálezu podaná v kombinácii s potravou pre zvieratá a na tento účel môže byť pripravená koncentrovaná potravinová prísada alebo zmes na zmiešanie s normálnou potravou pre zvieratá.

K použitiu ako insekticíd a na hubenie poľnohospodárskych škodcov môže byť avermektínová zlúčenina pripravená podľa predkladaného vynálezu použitá vo forme spreja, prášku, emulzie a podobne, podľa štandartných poľnohospodárskych zvyklostí.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Fermentácia Streptomyces avermitilis a analýza B2:B1 avermektínov

Kmene deficientné v aktivite dehydrogenázy rozvetvených

2-oxo kyselín i 5-0-metyltransferázy neprodukovali žiadne avermektíny, pokiaľ nebolo fermentačné médium doplnené mastnými kyselinami. Tento príklad ukazuje, že v takýchto mutantoch je možné získať rôzne pomery B2:B1 avermektínov, keď je biosyntéza iniciovaná prítomnosťou rôznych mastných kyselín.

1. Materiály a metódy

Streptomyces avermitilis ATCC 53692 bol skladovaný pri -70°C vo forme celého kultivačného média pripraveného v očkovacom médiu skladajúcom sa z: škrobu (NAdex, Laing National) - 20g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15g; Ardamin pH (Yeast Produkcts Inc.) - 5g; uhličitanu vápenatého - lg. Konečný objem bol upravený na 1 liter pomocou vody, pH bolo upravené na 7,2 a médium bolo autoklávované pri 121°C počas 25 minút.

2ml roztopenej suspenzie prípravku uvedeného vyššie boli použité na očkovanie do nádob obsahujúcich 50ml rovnakého média. Po 48 hodinovej inkubácii pri 28°C na rotačnej trepačke pri 180rpm boli 2ml použité na očkovanie do nádob obsahujúcich 50ml produkčného média, ktoré obsahovalo: škrob - 80g; uhličitan vápenatý - 7g; Pharmamedia - 5g; hydrogénfosforečnan vápenatý - lg; síran horečnatý - lg; kyselinu glutamovú - 0,6g; heptahydrát síranu železnatého - 0,01g; síran zinočnatý - 0,001g; síran manganatý - 0,001g. Konečný objem bol upravený na 1 liter pridaním vody, pH bolo upravené na 7,2 a médium bolo autoklávované pri 121°C počas 25 minút.

Substráty tvorené rôznymi karboxylovými kyselinami (viď tabuľka 1) boli rozpustené v metanole a boli pridané do fermentačného média 24 hodín po naočkovaní v konečnej koncentrácii 0,2g/liter. Fermentačné médium bolo inkubované počas 14 dni pri 28°C, potom bolo médium odstredené (2500rpm počas 2 minút) a supernatant bol odstránený. Myceliálna peleta bola extrahovaná acetónom (15ml), potom dichlórmetanom (30ml) a organická fáza bola separovaná, prefiltrovaná a odparená do sucha. Zvyšok bol vybraný do metanolu (lml) a bol analyzovaný HPLC pri použití HewlettPackard 1090Ά kvapalinového chromatografu vybaveného skenovacím diódovým detektorom pri 240nm. Použitou kolónou bola Beckman Ultrasphere C-18, 5 pm, 4, 6mm x 25cm, pri teplote 40°C. 25 μΐ vyššie uvedeného roztoku bolo injekčné vnesené do kolóny. Elúcia bola uskutočnená s lineárnym gradientom metanol-voda od 80:20 do 95:5 v priebehu 40 min. pri 0,85 ml/min. Dve štandartné koncentrácie cyklohexyl BI boli použité na kalibráciu detektoru a bola meraná plocha pod krivkou na B2 a BI avermektíny.

2. Výsledky

HPLC retenčné časy zistené na B2 a BI avermektíny a pomery triedy 2: triede 1 sú uvedené v tabuľke 1.

	HPLC retenčný čas (min)	Pomer
Substrát	B2	BI	B2 : BI
Kyselina 4-tetrahydropyrankarboxylová	8,1	14, 5	0,25
Kyselina izomaslová	10, 8	18, 9	0, 5
Kyselina 5-furoová	7,6	14, 6	0, 62
Kyselina S-(+)-2-metylmaslová	12, 8	21, 6	1,0
Kyselina cyklohexankarboxylová	16, 9	26,0	1,6
Kyselina 3-tiofénkarboxylová	8, 8	16,0	1,8
Kyselina cyklopentankarboxylová	14,2	23, 0	2,0
Kyselina 3-trifluormetylmaslová	10,9	18, 8	3, 9
Kyselina 2-metylpentanová	14,5	24,9	4,2
Kyselina cykloheptankarboxylová	18, 6	29,0	15,0

extrémne široké

Dáta rozmedzie ukazuje na avermektinov, čo zlúčenín triedy 2 sú závislé na charaktere konverzii uvedené v tabuľke 1 ukazujú pomerov produkovaných B2:B1 významné odlišnosti v na zlúčeniny triedy 1, ktoré východiskovej mastnej že zmeny pomerov B2:B1 proteínu musí byť

B2:BI na dodanej ukazuje, alternácie substráty.

AveC

Preto zmeny v pomere prítomnosti tohto použitie kyseliny substrátu. Tento kyseliny. Táto tabuľke vzniknuté v dôsledku môžu byť špecifické na konkrétne vyhľadávanie mutantov vykazujúcich určitý substrát realizované pri substrátu. Nasledujúci príklad popisuje cyklohexankarboxylovej ako skriningového substrát je použitý iba na ilustráciu predkladaného vynálezu a vôbec neobmedzuje jeho rozsah.

Príklad 2: Izolácia aveC génu ktorý kóduje aveC gén bol produkovaných

Tento príklad popisuje izoláciu a charakterizáciu regiónu chromozómu Streptomyces avermitilis, AveC génový produkt. Ako bude uvedené ďalej, identifikovaný ako gén modifikujúci pomer cyklohexyl-B2 : cyklohexyl-Bl avermektinov.

1. Kultivácia Streptomyces na izoláciu DNA

Nasledujúci spôsob bol použitý na kultiváciu Streptomyces. Jedna kolónia S.avermitilis ATCC 31272 (izolát č. 2) bola izolovaná na polovičnom médiu YPD-6 obsahujúcom: Difco kvasinkový extrakt - 5g; Difco Bacto-pepton - 5g; dextrózu - 2,5g; MOPS - 5g; Difco Bacto agar - 15g. Konečný objem bol upravený na 1 liter pridaním dH₂O, pH bolo upravené na 7,0 a médium bolo autoklávované pri 121°C počas 25 minút.

Mycélia kultivované na vyššie uvedenom médiu boli použité na inokuláciu 10ml TSB média (Difco Tryptic Soy Broth - 30g, v 1 litri dh₂O autoklávované pri 121 °C počas 25 minút) v skúmavke 25mm x 150mm, na rotačnej trepačke (300rpm) pri 28 °C počas 48 - 72 hodín.

2. Izolácia chromozomálnej DNA zo Streptomyces

Alikvóty (0,25ml alebo 0,5ml) mycélii kultivovaných spôsobom popísaným vyššie boli umiestnené do l,5ml mikrocentrifugačných skúmaviek a bunky boli koncentrované centri fugáciou pri 12000 x g počas 60 sekúnd. Supernatant bol odstránený a bunky resuspendované v 0_z25ml TSE pufru (20ml 1, 5M sacharózy, 2,5ml IM Tris-HCl, pH 8,0 2,5ml IM EDTA, pH 8,0 a 75ml dH2O) , ktorý obsahoval 2mg/ml lysozýmu. Vzorky boli inkubované počas 20 minút pri 37°C pri trepaní, boli vnesené do AutoGen 540™ automatizovaného prístroja na izoláciu nukleových kyselín (Integrated Separation Systems, Natick, MA) a genómová DNA bola izolovaná pri použití Cycle 159 (softwarová výbava) podľa návodu výrobcu.

Alternatívne bolo 5ml mycélii umiestnených do skúmavky 17mm x lOOmm, bunky boli koncentrované centrifugáciou pri 3000rpm počas 5 minút a supernatant bol odstránený. Bunky boli resuspendované v lml TSE pufru, boli koncentrované centrifugáciou pri odstránený. Bunky obsahujúcom 2mg/ml

3000rpm počas 5 minút boli resuspendované lysozýmu a uskutočnila a supernatant bol v lml TSE pufru sa inkubácia pri

37°C s trepaním počas 30-60 minút. Po inkubácii sa pridalo 0,5ml 10% dodecylsíranu sodného (SDS) a bunky sa inkubovali pri 37°C, pokial nebola lýza buniek dokončená. Lyzát sa inkuboval pri 65°C počas 10 minút, ochladil sa na teplotu okolia, rozdelil sa do dvoch 1,5ml Eppendorfových skúmaviek a extrahoval sa 1 x 0,5ml fenol/chloroformom (50% fenol dopredu uvedený do rovnováhy 0,5M Tris, pH 8,0; 50% chloroform). Vodná fáza sa odobrala a extrahovala sa 2 až 5 x chloroformom : izoamylalkoholom (24:1). DNA sa vyzrážala pridaním 1/10 objemu 3M octanu sodného, pH 4,8, inkubáciou zmesi na ľade počas 10 minút, centrifugovaním zmesi pri 15000rpm pri 5°C počas 10 minút a odstránením supernatantu na prečistenie skúmavky, do ktorej sa pridal 1 objem izopropanolu. Zmes supernatantu a' izopropanolu sa potom inkubovala na ľade počas 20minút, centrifugovala sa pri 15000rpm počas 20 minút pri teplote 5°C, supernatant sa odstránil a DNA peleta sa premyla 1x70% etanolom. Po usušení pelety sa DNA resuspendovala v TE pufru (lOmM Tris, lmM EDTA, pH 8,0).

3. Izolácia plazmidovej DNA zo Streptomyces

Alikvóta (l,0ml alebo 0,5ml) mycélia bola umiestnená do 1,5ml mikrocentri fugačných skúmaviek a bunky boli koncentrované centrifugáciou pri 12000 x g počas 60 sekúnd. Supernatant bol odstránený a bunky boli resuspendované v l,0ml 10,3% sacharózy a boli koncentrované centrifugáciou pri 12000 x g počas 60 sekúnd a supernatant bol odstránený. Bunky boli potom resuspendované v 0,25ml TSE pufru, ktorý obsahoval 2mg/ml lysozýmu a boli inkubované počas 20 minút pri 37°C pri trepaní a vnesené do AutoGen 540™ automatizovaného prístroja na izoláciu nukleových kyselín. Plazmidová DNA bola izolovaná pri použití Cycle 106 (softwarová výbava) podľa návodu výrobcu.

Alternatívne bolo l,5ml mycélia umiestnené do l,5ml mikrocentri fugačných skúmaviek a bunky boli koncentrované centri fugáciou pri 12000 x g počas 60 sekúnd. Supernatant bol odstránený a bunky boli resuspendované v l,0ml 10,3% sacharózy a boli koncentrované centrifugáciou pri 12000 x g počas 60 sekúnd a supernatant bol odstránený. Bunky boli potom resuspendované v 0,5ml TSE pufru, ktorý obsahoval 2mg/ml lysozýmu a boli inkubované počas 15-30 minút pri 37°C. Po inkubácii bolo pridané 0,25ml alkalického SDS (0,3 N NaOH, 2% SDS) a bunky boli inkubované pri 55°C počas 15-30 minút, pokiaľ nebol roztok číry. K roztoku DNA bol pridaný octan sodný (0,lml, 3M, pH 4,8) a roztok bol potom inkubovaný na ľade počas 10 minút. DNA vzorky boli centri fugované pri 14000rpm počas 10 minút pri 5°C. Supernatant bol odstránený na prečistenie skúmavky a bolo pridané 0,2ml fenol:chloroformu (50% fenol:50% chloroform) a realizovalo sa jemné premiesenie. DNA roztok bol centri fugovaný pri 14000rpm počas lOminút pri 5°C a horná vrstva bola odstránená na prečistenie Eppendorfnej skúmavky. Pridal sa izopropanol (0,75ml), roztok sa jemne premiesil a potom sa inkuboval pri teplote okolia počas 20 minút. DNA roztok bol centri fugovaný pri 14000rpm počas 15 minút pri 5°C, supernatant sa odstránil a DNA peleta sa premyla 70% etanolom, sušila sa a resuspendovala sa v TE pufru.

4. Izolácia plazmidovej DNA z E.coli

Jedna transformovaná kolónia E.coli bola naočkovaná do

5ml Luria-Bertani (LB) média (Bacto-Trypton - 10 g; Bactokvasinkový extrakt - 5g; a NaCI lOg v 1 litri dH₂O, pH 7,0, autoklávované pri 121°C počas 25 minút a doplnené 100 μg/ml ampicilínom). Kultúra bola inkubované cez noc a lml alikvóta bola vnesená do 1,5ml mikrocentrifugačnej z kultúry boli vnesené do AutoGen 540™ skúmavky. Vzorky automatizovaného pristroja na iuoláciu nukleových kyselín a plazmidová

DNA bola izolovaná pri použití Cycle 3 (softwarová výbava) podlá návodu výrobcu.

5. Príprava a transformácia protoplastov S.avermitilis

Jednotlivé kolónie S.avermitilis boli izolované na 1/2 YPD-6.Mycélia bola použitá na inokuláciu 10ml TSB média v skúmavke 25mm x 150mm, ktorá bola inkubovaná pri trepaní (300rpm) pri 28°C počas 48 hodín, lml mycélia bol použitý na inokuláciu 50ml YEME média. YEME médium obsahuje na liter: Difco kvasinkový extrakt - 3g; Difco Bacto-peptod - 5g;

Difco Mált extrakt - 3g; sacharózu - 300g. Po autoklávovaní pri 121°C počas 25 minút boli pridané nasledujúce zložky: 2,5M MgCl₂.6H₂O (separátne autoklávované pri 121°C počas 25 minút) - 2ml; a glycín (20%) (sterilizovaný filtráciou) 2 5ml.

Mycélia bola kultivovaná pri 30°C počas 48-72 hodín a bola získaná centri fugáciou v 50ml centri fugačnej skúmavke (Falcon) pri 3000rpm počas 20 minút. Supernatant bol odstránený a mycélia bola resuspendovaná v P pufru, ktorý obsahoval: sacharózu - 205g; K₂SO₄ - 0,25g; MgCl₂.6H₂O 2,02g; H₂0 - 600ml; K₂PO₄ (0,2%) - 10ml; roztok stopových prvkov - 20ml; CaCL₂.H₂O (3,68%) - 100mi; a MES pufr (l,0M, pH 6,5) - 10ml (roztok stopových prvkov obsahoval na liter:

ZnCl₂ - 40mg; FeCl₃.6 H₂O - 200mg; CuCl₂.2 H₂O - lOmg;

MnCl₂.4 H₂O - lOmg; Na₂B₄O₇.10 H₂O - lOmg; (NH₄) ₃Mo₇O₂₄. 4 H₂O lOmg) . pH bolo upravené na 6,5, konečný objem bol upravený na 1 liter a médium bolo horúce filtrované cez 0,45 mikrónový filter.

Mycélia boli peletované pri 3000 x rpm počas 20 minút, supernatant bol odstránený a mycélia boli resuspendované v 20ml P pufru obsahujúceho 2mg/ml lysozýmu. Mycélia boli inkubované pri 35°C počas 15 minút a potom bol mikroskopicky stanovený rozsah tvorby protoplastov. Pokiaľ bola tvorba protoplastov dokončená, tak boli protoplasty centrifugované pri 8000rpm počas 10 minút. Supernatant bol odstránený a protoplasty boli resuspendované v 10ml P pufru. Protoplasty centrifugované pri 8000rpm počas 10 minút, supernatant bol odstránený, protoplasty boli resuspendované v 2ml P pufru a približne 1 x 10⁹ protoplastov bolo umiestnených do 2,0ml kryogenických skúmaviek (Nalgene).

Skúmavka obsahujúca 1 x 10⁹ protoplastov bola centri fugovaná pri 8000rpm počas 10 minút, supernatant bol odstránený a protoplasty boli resuspendované v 0,lml P pufru. 2gg transformujúcej DNA boli pridané k protoplastom a potom bol okamžite pridaný pracovný T pufer (0,5ml). Základ na T pufer obsahoval: PEG-1000 (Sigma) - 25g; sacharóza - 2,5g; H₂O - 83ml. pH bolo upravené na 8,8 IN

NaOH (sterilizovaného filtráciou) a základ na T-pufer bol sterilizovaný filtráciou a uskladnený pri 4°C. Pracovný T pufer, pripravený v deň použitia, obsahoval: základ na T pufer - 8,3ml; K₂PO₄ (4mM) - 1,Oml; CaCl₂. 2H₂O (5M) - 0,2ml;

a TES (IM, pH8) - 0,5ml. Každá zložka pracovného T pufru bola samostatne sterilizovaná filtráciou.

V priebehu 20 sekúnd od pridania T pufru k protoplastom bol pridaný tiež lml P pufru a protoplasty boli centrifugované pri 8000rpm počas 10 minút. Supernatant bol odstránený a protoplasty boli resuspendované v 0,lml P pufru. Protoplasty boli potom umiestnené na RM14 médiu, ktoré obsahovalo: sacharózu - 205g; K₂SO₄ - 0,25ml; MgCl₂.

6H₂O - 10,12g; glukózu - lOg; Difco Casamino kyseliny

0,lg; Difco kvasinkový extrakt - 5g; Difco Oatmeal Agar 62

3g; Difco Bacto Agar - 22g; CIH2O - 800ml. Roztok bol autoklávovaný pri 121°C počas 25 minút. Po autoklávovani boli pridané nasledujúce sterilné zložky: K₂PO₄ (0,5%) 10ml; CaCl₂. 2H₂O (5M) - 5ml; L-prolin (20%) - 15ml; MES pofer (l,0M, pH 6,5) - 10ml; roztok stopových prvkov (ako bol popísaný vyššie) - 2ml; cykloheximid (25mg/ml - 40ml); a IN NaOH - 2ml. 25ml RM14 média bolo použité na platňu a platne boli sušené počas 24 hodín pred použitím.

Protoplasty boli inkubované pri 95% vlhkosti pri 30°C počas 20-24 hodín. Na selekciu transformantov rezistentných na tiostrepton bol na RM14 regeneračnej platne rovnomerne nanesený lml pufru obsahujúceho 125 gg/ml tiostreptonu. Tento pufer obsahoval na 100mi: sacharózu - 10,3g; roztok stopových prvkov (ako bol popísaný vyššie) - 2ml; a MES (IM, pH 6,5) - lml. Protoplasty boli inkubované pri 95% vlhkosti pri 30°C počas 7-14 dní, pokial neboli viditelné kolónie rezistentné na tiostrepton (Thio^r) .

6. Transformácia protoplastov

Streptomyces lividans

V niektorých prípadoch S.lividans (získané od John boli

Innes na transformáciu použité Inštitúte, Norwich, U.K.).

Metódy a prostriedky na a transformovanie S.lividans

1985, Genetic

Manual, John

Manipulation

Innes Foundation, kultiváciu, protoplastovanie sú popísané v Hopwood et al., of Streptomyces,

Norwich,

A Laboratory a boli reáli zované spôsobom popísaným v tejto Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov publi káci i.

S.lividans spôsobom popísaným vyššie.

Ί. Analýza fermentácie kmeňov S.avermitilis

Mycélia S.avermitilis kultivovaná na 1/2 YPD-6 počas 47 dní bola naočkovaná do skúmaviek 1x6 palcov obsahujúcich dopredu pripravené médium a 5mm sklenené korálky. Predpripravené médium obsahovalo: rozpustný škrob (buď riedky varom upravený škrob alebo KOSO, Japan Corn Starch Co. , Nagoya) - 20g/l; Pharmamédia - 15g/l; Ardamin pH - 5g/l (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO3 - 2 g/1; 2x bcfa („bcfa označuje mastné kyseliny s rozvetveným reťazcom) obsahujúcim konečnú koncentráciu v médiu 50ppm kyseliny 2( +/-)-metylmaslovej , 60ppm kyseliny metylmaslovej a 20ppm kyseliny izovalerovej . pH bolo upravené na pH 7,2 a médium bolo autoklávované pri 121°C počas 25 minút.

Skúmavka sa trepala pri uhle 17° pri 215rpm pri 29°C počas 3 dní. 2ml alikvóta očkovacej kultúry bola použitá na inokuláciu 300ml Erlenmeyerovej skúmavky obsahujúcej 25ml produkčného média, ktoré obsahovalo: škrob (buď riedky varom upravený škrob alebo KOSO) - 160g/l; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10g/l; Ardamin pH - 10g/l; K₂HPO, - 2g/l; MgSO, . 4H₂O - 2g/l; Fe₂SO₄. 7H₂O - 0,02g/l; MnCl₂ - 0,002g/l; ZnSO₄. 7H₂O - 0,002g/l; CaCO₃ - 14g/l; 2x bfca (ako vyššie); a kyselinu cyklohexankarboxylovú (CHC) (pripravenú ako 20% roztok pri pH 7, 0) - 800ppm. pH bolo upravené na pH 6,9 a médium bolo autoklávované pri 121°C počas 25 minút.

Po inakulácii bola skúmavka inkubované pri 29°C počas 12 dní za trepania pri 200rpm. Po inkubácii bola zo skúmavky odobratá 2ml vzorka, bola nariedená 8ml metanolu, premiesená a zmes bola centrifugovaná pri 1250 x g počas 10 minút na peletovanie drviny. Supernatant bol potom analyzovaný HPLC pri použití Beckman Ultrasphere ODS kolóny (25cm x 4,6mm ID) s prietokom 0,75ml/min a pri detekcii podía absorbancie pri 240nm. Mobilnou fázou bol metanol/voda/acetônitri1 (86/8,9/5,1).

8. Izolácia PKS génov S.avermitilis

Bola pripravená kozmidová knižnica S.avermitilis (ATCC 31272, SC-2) chromozomálna DNA a bola hybridizovaná ketosyntázovou (KS) sondou pripravenou z fragmentu génu na polyketid-syntázu (PKS) Saccharopolyspóra erythraea. Podrobný popis prípravy kozmidových knihovní je uvedený napríklad v Sambrook et al., 1989, vyššie. Podrobný popis prípravy knihovní Streptomyces chromozomálnej DNA je uvedený v Hopwood et al., 1985, vyššie. Kozmidové klony obsahujúce regióny hybridizujúce na ketosyntázu boli identifikované hybridizáciou na 2,7kb NdeI/Eco47III fragment z pEX26 (získaný od Dr. P. Leadlay, Cambridge, UK). Približne 5ng pEX26 bolo trávené Ndel a Eco47III. Reakčná zmes bola vnesená na 0,8% SeaPlague GTG agarózový gél (FMC BioProducts, Rockland, ME). 2,7kb NdeI/Eco47111 fragment bol excidovaný z gélu po elektroforéze a DNA bola získaná z gélu pri použití GELase™ od Epicentre Technologies pri použití Fast protokolu . 2,7kb NdeI/Eco47Ill fragment bol označený [a-³²P ]dCTP (deoxycytidin -5'- trifosfat, tetra (trimetylammoniová) soľ , [a-³²P ] -) (NEN-DuPont,

Boston,MA) pri použití BRL technologies, Inc.,

Nick Translation systému (BRL Life Gaithersburg, MD, podľa návodu výrobcu.

Typická reakcia bola uskutočnená v objeme 0,05ml. Po adícii

5μ1 stop pufru bola značená DNA oddelená od neinkorporovaných nukleotidov pri použití G-25 Sephadex

Quick Spin výrobcu.

TM kolóny (Boehringer Mannheim) podlá návodu

Približne 1800 kozmidových klonov bolo vyšetrovaných hybridizáciou kolónii. Bolo identifikovaných 10 klonov, ktoré hybridizovali silne na KS sondu Sacch. erythraea. E.coli kolónie obsahujúce kozmidovú DNA boli kultivované na

LB kvapalnom médiu a kultúry izoláciu na

Pri návodu

AutoGen použití kozmidová DNA bola izolovaná z každej pristrojí na výbava) podlá endonukleázami

540™

Cycle výrobcu. Mapovanie automatizovanom (softwarová reštrikčnými a southernov prenos ukázali, že päť klonov obsahuje prekrývajúce sa chromozomálne regióny. S.avermitilis genomová BamHI reštrikčná mapa piatich kozmidov (t. j. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) bola konštruovaná analýzou prekrývajúcich sa kozmidov a hybridizáciou (obr. 4).

f

9. Identifikácia DNA, ktorá moduluje pomery avermektínov B2 : BI a identifikácia aveC ORF

Nasledujúce metódy boli použité na testovanie subklonovaných fragmentov získaných z pSE66 kozmidového klonu na ich schopnosť modulovať pomery avermektínov B2:B1 v AveC mutantoch. pSE66 (5μg) bol trávený Sací a BamHI. Reakčná zmes bola vnesená na 0,8% SeaPlague™ GTG agarózový gél (FMC BioProducts, 2,9kb fragment bol excidovaný z gélu po elektroforéze a DNA bola získaná z gélu pri použití GELase™ od Epicentre Technologies, pri použití Fast protokolu. Približne 5gg kyvadlového vektora pWHM3 (Vara et al., 1989, J.Bacteriol. 171: 5872-5881) bolo trávené Sací a BamHI. Približne 0,5gg 2,9kb inzertu a 0,5pg tráveného pWHM3 bolo zmiešané a uskutočnila sa inkubácia cez noc s 1 jednotkou ligázy (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) pri 15°C, v celkovom objeme 20μ1, podľa návodu výrobcu. Po inkubácii sa 5μ1 ligačnej zmesi inkubovalo pri 70°C počas 10 minút, ochladilo sa na teplotu okolia a použilo sa na transformáciu kompetentných E.coli DH5a buniek (BRL) podľa návodu výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilin a prítomnosť 2,9kb SacI/BamHI inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený pSE119.

Protoplasty S.avermitilis kmeňa 1100-SC38 (Pfizer in house kmeň) boli pripravené a transformované pSE119 spôsobom popísaným v časti 5. Kmeň 1100-S38 je mutant, ktorý produkuje významne viac cyklohexyl-B2 formy avermektinu než cyklohexyl-Bl formy avermektinu, keď mu je dodávaná kyselina cyklohexankarboxylová (B2:B1 je približne 30:1). pSE119 použitý na transformáciu protoplastov S.avermitilis bol izolovaný buď z E.coli kmeňa GM 2163 (získaného od Dr. B.J.Bachmann, Curator, E.coli Genetic Stock Center, Yale University), E.coli kmeňa DM1 (BRL) alebo S.lividans kmeňa TK64. Transformanty kmeňa 1100-SC38 rezistentné na tiostrepton boli izolované a bola realizovaná HPLC analýza produktov fermentácie. Transformanty S.avermitilis 1100-SC38 obsahujúce pSE119 produkovali zmenený cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektínov približne (tabuľka 2) .

kmeňa pomer

3,7:1

Po potvrdení toho, že pSE119 môže modulovať pomer B2:B1 avermektínov v AveC mutantoch bola inzertovaná DNA sekvenovaná. Približne l(^g pSE119 bolo izolované pri použití kitu na izolovanie DNA (Qiagen, Valencia, CA) podľa návodu výrobcu a táto DNA bola sekvenovaná pri použití ABI

373Α Automatizovaného DNA sekvenátora (Perkin Elmer, Foster City, CA) . Sekvenačné dáta boli zostavené a editované pri použití Genetic Computer Group programov (GCG, Madison, WI). DNA sekvencia a aveC ORF sú uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO:1).

Nový plazmid, označený ako pSE118, nasledujúcim spôsobom. Približne 5gg pSE66

Sphl a BamHI. Reakčná zmes GTG agarózový gél (FMC fragment bol excidovaný z získaná z gélu pri

Technologies, pri použití Fast protokolu.

bola vnesená na

0,8% BioProducts, 2,8kb gélu po elektroforéze použití GELase™ bol pripravený bolo trávených SeaPlague™ Sphl/BamHI a DNA bola od

Epicentre

Približne 5gg kyvadlového vektora pWHM3 (Vara et al., 1989, 171: 5872-5881) bolo trávené Sphl a

J. Bacteriol.

BamHI. Približne 0,5μς

2,8kb inzertu a 0,5gg tráveného pWHM3 bolo zmiešané a uskutočnila sa inkubácia cez noc s

England Biolabs) jednotkou ligázy (New pri 15°C, v celkovom objeme 20μ1, podľa návodu výrobcu.

Po inkubácii sa 5μ1 ligačnej zmesi inkubovalo pri 70oC okolia a použilo sa DH5a buniek podľa počas 10 minút, ochladilo sa na na transformáciu kompetentných návodu výrobcu. Plazmidová teplotu

E.coli

DNA bola izolovaná z a prítomnosť reštrikčnou transformantov rezistentných na

2,8kb Sphl/BamHI analýzou. Plazmid

Inzertované DNA inzertu bola

838 nukleotidoch v pSE118 a pSE119 (obr. 4).

bol označený sa prekrývajú v ampicilín potvrdená pSE118.

približne

Protoplasty transformované

S . avermitilis kmeňa 1100-SSC38 boli pSE118 spôsobom popísaným vyššie. Transformanty kmeňa 1100-SC38 rezistentné na tiostrepton boli izolované a bola uskutočnená HPLC analýza produktov fermentácie. Transformanty S.avermitilis kmeňa 1100-SC38 obsahujúce pSE118 neprodukovali zmenený pomer cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl avermektinov v porovnaní s kmeňom 1100-SC38 (tabuľka 2) .

10. PCR amplifikácia aveC génu z chromozomálnej DNA S.avermitilis l,2kb fragment obsahujúci aveC ORF bol izolovaný z chromozomálnej DNA S.avermitilis PCR ampli fikáciou pri použití primérov navrhnutých na základe aveC nukleotidovej sekvencie uvedenej vyššie. PCR priméry boli získané od Genosys Biotechnologies Inc. (Texas). Pravostranný primér mal sekvenciu: 5'- TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6) a lavostranný primér mal sekvenciu: 5'- CATGATCGCTGAACCGAG 3' (SEQ ID NO:7) . PCR reakcia bola uskutočnená pri použití Deep Vent™ polymerázy (New England Biolabs) v pufru dodávanom výrobcom a pri prítomnosti 300μΜ dNTP, 10% glycerolu, 200pmol každého priméru, 0,lgg templátu a 2,5 jednotiek enzýmu v konečnom objeme ΙΟΟμΙ, pri použití Perkin Elmer Cetus teplotného cyklovača. Teplotný profil prvého cyklu bol 95°C počas 5 minút (denaturačný krok), 60°C počas 2 minút (tepelné spracovanie) a 72°C počas 2 minút (extenzia). Ďalších 24 cyklov malo rovnaký teplotný profil s tou výnimkou, že denaturačný krok bol skrátený na 45 sekúnd a tepelné spracovanie bolo skrátené na 1 minútu.

Produkt PCR bol spracovaný elektroforézou na 1% agarózovom géle a bol detekovaný jeden DNA prúžok veľkosti približne l,2kb. DNA bola prečistená z gélu a bola ligovaná s 25ng linearizovaného pCR- Blun vektora s lepivými koncami (Invitrogen) v molárnom pomere vektora:inzertu 1:10 podľa návodu výrobcu. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu

One Shot™ kompetentných E.coli buniek (Invitrogen) podlá návodu výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilín a prítomnosť l,2kb inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE179.

Inzertovaná

BamHI/Xbal, bola

DNA z pSE179 bola izolovaná trávením separovaná elektroforézou, bola prečistená vektorom pWHM3, ktorý DNA koncentrácii lpg z gélu a bola ligovaná s kyvadlovým bol tiež trávený BamHI/Xbal, v celkovej

1:5.

a molárnym pomerom vektor:inzert použitá na transformáciu kompetentných

Ligačná zmes bola

E.coli DH5a buniek podlá návodu výrobcu.

z transformantov rezistentných l,2kb inzertu bola potvrdená ktorý transformovaný do E.coli DM1 z transformantov rezistentných bol označený

Plazmidová DNA bola izolovaná na ampicilín a prítomnosť analýzou. Plazmid, ATCC 209604), bol reštrikčnou ako pSE186 (obr. 2, plazmidová na ampicilín.

DNA bola izolovaná

Výsledky

Bol identifikovaný 2,9kb SacI/BamHI fragment pSE119, ktorý po transformácii do S.avermitilis kmeňa 1100-SC38 významne mení pomer produkovaných avermektínov B2:BI. Za normálnych okolností má S.avermitilis kmeňa 1100-SC38 pomer B2:B1 približne 30:1, ale po transformácii vektorom obsahujúcim 2,9kb SacI/BamHI fragment sa pomer B2:B1 avermektínov zníži na približne 3,7:1. Post-fermentačná analýza kultúr transformantov potvrdila prítomnosť transformujúcej DNA.

2,9kb fragment pSE119 bol sekvencovaný a bol identifikovaný 0,9kb ORF (obr. 1) (SEQ ID NO:1), ktorý obsahuje Pstl/Sphl fragment, ktorý bol skôr mutovaný na produkciu iba B2 produktov (Ikeda et al., 1995, vyššie) . Porovnanie tohto ORF alebo jemu zodpovedajúcemu polypeptidu so známymi databázami (GenEBML, SWISS-PROT) neukázalo žiadnu silnú homológiu so známymi DNA alebo proteínovými sekvenciami.

Tabuľka 2 ukazuje fermentačnú analýzu S.avermitilis kmeňa 1100-SC38 transformovaného rôznymi plazmidmi.

Tabuľka 2

Kmeň	počet	priemerný
S.avermitilis	testovaných	pomer
(transformujúci plazmid)	trans formantov	B2 : BI
1100 - SC38 (žiadny)	9	30,66
1100 - SC38 (pWHM3)	21	31, 3
1100 - SC38 (pSE119)	12	3,7
1100 - SC38 (pSE118)	12	30, 4
1100 - SC38 (pSE185)	14	27 , 9

Príklad 3: Konštrukcia AveC mutantov S.avermiti1 i s

Tento príklad popisuje konštrukciu niekoľkých rôznych AveC mutantov S.avermiti1is pri použití prostriedkov a spôsobov popísaných vyššie. Všeobecný popis techník na vkladanie mutácií do génu Streptomyces je uvedený v Kieser and Hopwood, 1991, Meth. Enzým. 204: 430-458. Podrobnejší popis je uvedený v Anzai et al., 1988, J.Antibiot. XLI (2): 226-233 a v Stutzman-Engwall et al., 1992, J.Bacteriol. 174 (1): 144-154. Tieto práce sú tu úplné uvedené ako odkazy.

1. Inaktivácia aveC génu S.avermitilis

AveC mutanty obsahujúce inaktivované aveC gény boli konštruované pri použití niekoľkých metód, ako sú podrobne popísané ďalej.

V prvej metóde bol 640bp Sphl/PstI fragment vnútorný k aveC génu v pSE119 (plazmidu popísanému vyššie) nahradený ermE génom (na rezistenciu na erytromycín) zo Sacch. erythraea. ErmE gén bol izolovaný z pIJ4026 (od John Innes Inštitúte, Norwich, U.K.; viď tiež Bibb et al., 1985, Gene 41: 357-368) trávením reštrikčnými enzýmami BglII a EcoRI, po ktorom nasledovala elektroforéza a prečistenie fragmentu z gélu. Tento l,7kb fragment bol ligovaný do pGEM7Zf (Promega), ktorý bol trávený BamHI a EcoRI a ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek podľa návodu výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilín a prítomnosť l,7kb inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE27.

pSE118 (popísaný vyššie) bol trávený Sphl a BamHI, produkt trávenia bol spracovaný elektroforézou a 2,8kb Sphl/BamHI inzert bol prečistený z gélu. pSE119 bol trávený PstI a EcoRI, produkt trávenia bol spracovaný elektroforézou a l,5kb Pstl/EcoRI inzert bol prečistený z gélu. Kyvadlový vektor pWHM3 bol trávený BamHI a EcoRI. pSE27 bol trávený PstI a Sphl, produkt trávenia bol spracovaný elektroforézou a l,7kb Pstl/Sphl inzert bol prečistený z gélu. pSE118 (popísaný vyššie) bol trávený Sphl a BamHI, produkt trávenia bol spracovaný elektroforézou a 2,8kb Sphl/BamHI inzert bol prečistený z gélu. Všetky štyri fragmenty (t. j. 2,8kb, l,5kb, 7,2kb, l,7kb) boli ligované dohromady v štvorcestnej ligácii. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek podía návodu výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov a prítomnosť správneho inzertu rezistentných na ampicilin bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE180 (obr. 3;

ATCC

209605).

pSE180 bol transformovaný do

S . 1ikvidans

TK64 a transformované kolónie boli identifikované podía rezistencie na tiostrepton a erytromycín. pSE180 bol izolovaný zo

S.lividans a bol použitý na transformáciu protoplastov

S.avermitilis.

Boli identifikované trans formanty

S.avermitilis rezistentné na tiostrepton a boli pripravené protoplasty, ktoré boli umiestnené na platne pri neselektívnych podmienkach do RM14 média. Po regenerácii protoplastov boli jednotlivé kolónie vyšetrované na prítomnosť rezistencie na erytromycín a na neprítomnosť rezistencie na tiostrepton, čo ukazuje na chromozomálnu integráciu inaktivovaného aveC génu a na stratu voľného replikónu. Bol identifikovaný Erm^rThio^s transformant a bol označený ako kmeň SE180-11. Z kmeňa SE180-11 bola izolovaná celková chromozomálna DNA, bola trávená reštrikčnými enzýmami BamHI, HindlII, PstI alebo Sphl, bola spracovaná elektroforézou na 0,8% agarózovom géle, bola prenesená na nylonové membrány a bola hybridizovaná ermE sondou. Tieto analýzy ukázali, že došlo k chromozomálnej integrácii ermE génu na rezistenciu a súčasnej delécii 640bp Pstl/Sphl fragmentu dvojitým crossing-overom. HPLC analýza fermentačných produktov kmeňa SE180-11 ukázala, že normálne avermektíny neboli naďalej produkované (obr. 5A).

V druhej metóde na inaktiváciu aveC génu bol l,7kb ermE gén odstránený z chromozómu S.avermitilis kmeňa SE180-11, pri zanechaní 640bp Pstl/Sphl delécie v aveC géne. Génový prenosový plazmid bol konštruovaný nasledujúcim spôsobom: pSE180 bol čiastočne trávený Xbal a 11,4kb fragment bol prečistený z gélu. ll,4kb prúžok neobsahoval l,7kb ermE gén na rezistenciu. DNA bola potom ligovaná a bola transformovaná do E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilín a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Tento plazmid, ktorý bol označený ako pSE184, bol transformovaný do E.coli DM1 a plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilín. Tento plazmid bol použitý na transformáciu protoplastov S.avermitilis kmeňa SE180-11. Protoplasty boli pripravené z transformantov kmeňa SE180-11 rezistentných na tiostrepton a boli umiestnené ako jednotlivé kolónie na RM14. Po regenerácii protoplastov boli jednotlivé kolónie testované na neprítomnosť ako rezistencie na erytromycín, tak rezistencie na tiostrepton, ktorá ukazuje na chromozomálnu integráciu inaktivnej aveC alely a na stratu voľného replikónu obsahujúceho ermE gén. Bol identifikovaný jeden Erm^rThio^s transformant a bol označený ako SE184-1-13. Analýza fermentačných produktov kmeňa SE184-1-13 ukázala, že normálne avermektíny neboli naďalej produkované a že SE1841-13 má rovnaký fermentačný profil ako SE180-11.

V tretej metóde na inaktiváciu aveC génu bol do chromozomálneho aveC génu vložený posun čítacieho rámca pridaním dvoch G po C v nukleotidovej pozícii 471 pri použití PCR, čo vytvorí BspEl miesto. Prítomnosť upraveného BspEl miesta bola užitočná na detekciu génovej substitúcie. PCR priméry boli navrhnuté tak, aby vkladali mutáciu posúvajúcu čitaci rámec do aveC génu a boli získané od Genosys Biotechnologies, Inc. Pravostranný primér mal sekvenciu 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID N0:8) a lavostranný primér mal sekvenciu: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCTTC3' (SEQ ID NO:9). PCR podmienky boli rovnaké ako v príklade 2, sekcii 10. 666bp produkt bol trávený Sphl pri vzniku dvoch fragmentov dĺžky 278bp a 388bp. 388bp fragment bol prečistený z gélu.

Plazmid na génovú náhradu bol pripravený nasledujúcim spôsobom: kyvadlový vektor pWHM3 bol trávený EcRI a BamHI. pSE119 bol trávený BamHI a Sphl, produkt trávenia bol spracovaný elektroforézou a 840bp fragment bol prečistený z gélu. pSE119 bol trávený EcoRI a XmnI, produkt trávenia bol spracovaný elektroforézou a l,7kb fragment bol prečistený z gélu. Všetky štyri fragmenty (t.j. 7,2kb, 840bp, l,7kb a 388bp) boli ligované dohromady štvorcestnou ligáciou. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilín a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a potom analýzou DNA sekvencie. Tento plazmid, ktorý bol označený a plazmidová rezistentných transformáciu pSE185,

DNA bol transformovaný izolovaná do E.coli DM1 bol z transformantov na ampicilín. protoplastov 1100-SC38 rezistentné na

Tento plazmid bol použitý na S. avermitilis kmeňa 1100-SC38.

Transformanty izolované a ich fermentačné produkty boli analýzou. pSE185 nemenil po transformácii tiostrepton boli analyzovanmé HPLC do S.avermitilis kmeňa 1100-SC38 významne pomer B2:B1 avermektinov (tabuľka

2) .

pSE185 bol

S.avermitilis na použitý na transformáciu protoplastov generovanie mutácií posunu čítacieho rámca v chromozomálnom aveC géne.

Protoplasty boli pripravené z transformantov rezistentných na tiostrepton a boli naočkované ako jednotlivé kolónie na RM14. Po regenerácii protoplastov boli jednotlivé kolónie vyšetrované na absenciu rezistencie na tiostrepton. Chromozomálna DNA z kolónií rezistentných na tiostrepton bola izolovaná a bola analyzovaná PCR na prítomnosť mutácií spôsobujúcich posun čítacieho rámca, ktoré boli integrované do chromozómu. PCR priméry boli navrhnuté na základe aveC nukleotidovéj sekvencie a boli získané od Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Pravostranný PCR primér mal sekvenciu: 5'GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO:10) a lavostranný primér mal sekvenciu: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO:11). PCR podmienky boli rovnaké ako v príklade 2, sekcii 10. Získaný 543bp PCR produkt bol trávený BspEI pri vzniku troch fragmentov dĺžky 368bp, 96bp a 79bp, čo ukazuje na chromozomálnu integráciu inaktivovaného aveC gélu a na stratu voľného replikónu.

Fermentačná analýza S.avermitilis mutantov obsahujúcich mutáciu spôsobujúcich posun čítacieho rámca v aveC géne ukázala, že normálne avermektíny neboli naďalej produkované a že tieto mutanty majú rovnaké

HPLC profily fermentácie ako kmene SE180-11 a SE184-1-13.

Bol identifikovaný Thio^s transformant a bol označený ako kmeň

SE185-5a.

Ďalej boli pripravené mutácie v aveC géne, ktoré menia nukleotid v pozícii 520 z G na A, čo vedie ku zmene kodónu kódujúceho tryptofan (W) v pozícii 116 na terminačný kodón. Kmeň S.avermitilis s touto mutáciou neprodukoval normálne avermektíny a mal rovnaký fermentačný profil ako kmene SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5a.

Ďalej boli pripravené mutácie v aveC géne, ktoré menia ako: (i) nukleotid v pozícii 97 z G na A, čo meni aminokyselinu v pozícii 256 z glycínu (G) na aspartat (D); a (ii) nukleotid v pozícii 996 z T na C, čo mení aminokyselinu v pozícii 275 z tyrosínu (Y) na histidin (H) . Kmeň S.avermitilis s týmito mutáciami (G256D/Y275H) neprodukoval normálne avermektíny a mal rovnaký fermentačný profil ako kmene SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5a.

Kmene SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5 a ďalšie tu uvedené kmene S.avermitilis nesúce aveC inaktivujúcu mutáciu sú nástrojom na hodnotenie vplyvu iných mutácií v aveC géne. pSE186, ktorý obsahuje prirodzenú kópiu aveC génu, bol transformovaný do E.coli DM1 a plazmidová DNA bola izolovaná transformantov rezistentných na ampicilín. Táto pSE186 DNA bola použitá na transformáciu protoplastov kmeňa pSE180-ll S.avermitilis. Boli izolované transformanty kmeňa SE180-11 rezistentné na tiostrepton, bola stanovená prítomnosť rezistencie na erytromycín a produkty fermentácie Thio^rErm^r transformantov boli analyzované HPLC. Prítomnosť funkčného aveC génu v transformantoch nahradzovala normálnu produkciu avermektinov v kmeniSEl80-11 (obr. 5B).

2. Analýga mutácií aveC génu, ktoré ovplyvňujú pomer tried B2:B1

Ako bolo popísané vyššie, S.avermitilis kmeň SE180-11 obsahujúci inaktívny aveC gén bol komplementovaný transformáciou plazmidom obsahujúcim funkčný aveC gén (pSE186). Kmeň SE180-11 bol tiež použitý ako hostiteľský kmeň na charakterizáciu ďalších mutácií v avec géne, ako je popísané ďalej.

Chromozomálna DNA bola izolovaná z kmeňa 1100-SC38 a bola použitá ako templát na PCR amplifikáciu aveC génu. l,2kb ORF bol izolovaný PCR amplifikáciou pri použití primérov navrhnutých podľa aveC nukleotidovéj sekvencie. Pravostranný primér mal sekvenciu SEQ ID NO: 6 a lavostranný primér mal sekvenciu SEQ ID NO: 7 (viď príklad 2). Podmienky PCR a subklonovania boli rovnaké, ako je popísané v príklade 2. Analýza DNA sekvencie l,2kb ORF ukázala mutáciu v aveC géne, ktorá mení nukleotid v pozícii 337 z C na T, čo mení aminokyselinu v pozícii 55 zo serínu (S) na fenylalanin (F). aveC gén obsahujúci S55F mutáciu bol subklonovaný do pWHM3 pri vzniku plazmidu, ktorý bol označený pSE187 a ktorý bol použitý na transformáciu protoplastov S.avermitilis kmeňa SE180-11. Transformanty kmeňa SE180-11 rezistentné na tiostrepton boli izolované, bola stanovená prítomnosť rezistencie na erytromycín a produkty fermentácie Thio^rErm^r transformantov boli analyzované HPLC. Prítomnosť aveC génu kódujúceho zmenu v aminokyselinovom zvyšku 55 (S55F) nahradzovala normálnu produkciu avermektínov v kmeni SE18011 (obr. 5C); i tak však pomer cyklohexyl B2: cyklohexyl BI bol približne 26:1, v porovnaní s kmeňom SE180-11 transformovaným pSE186, ktorý mal pomer B2:B1 približne 1,6:1 (tabuľka 3), čo ukazuje na to, že jediná mutácia (S55F) ovplyvňuje pomer produkovaných cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektínov.

Bola identifikovaná iná mutácia v aveC géne, ktorá mení nukleotid v pozícii 862 z G na A, čo mení aminokyselinu v pozícii 230 z glycínu (G) na aspartat (D). Kmeň

S. avermitilis nesúci túto mutáciu (G230D) produkoval avermektíny v pomere B2:B1 približne 30:1.

3. Mutácie redukujúce pomer B2:B1

Bolo vytvorených niekolko mutácií, ktoré znižujú množstvo produkovaného cyklohexyl B2 : cyklohexyl BI.

Bola identifikovaná mutácia aveC géne, ktorá mení nukleotid v pozícii 588

G na

A, čo mení aminokyselinu v pozícii

139 z alaninu (A) na treonín (T).

aveC gén obsahujúci

A139T mutáciu bol subklonovaný do pWHM3 pri vzniku plazmidu, ktorý bol označený pSE188 a ktorý bol použitý na transformáciu protoplastov S.avermitilis kmeňa

SE180-11 .

Transformanty kmeňa SE180-11 rezistentné na tiostrepton boli izolované, bola rezistencie na erytromycín a produkty stanovená prítomnosť fermentácie Thio^rErm^r transformantov boli analyzované HPLC.

Prítomnosť mutovaného aveC génu kódujúceho zmenu v aminokyselinovom zvyšku 139 (A139T) obnovila produkciu avermektinov v kmeni SE180-11 (obr. 5D); i tak však pomer B2:B1 bol približne 0,94:1, čo ukazuje, že táto mutácia znižuje pomer cyklohexyl B2: cyklohexyl Bl. Tento výsledok bol neočakávaný, pretože publikované výsledky, rovnako ako výsledky mutácií popísaných vyššie, viedli iba k inkativácii aveC génu alebo ku zvýšeniu produkcie B2 formy avermektinov vzhľadom k Bl forme (tabuľka 3).

Pretože A139T mutácia mení B2:B1 pomer v prospech Bl, bola pripravená mutácia, ktorá kóduje treonín miesto serínu v aminokyselinovej pozícii 138. pSE186 bol trávený AcoRI a bol klonovaný do pGEM3Zf (Promega), ktorý bol trávený EcoRI. Tento plazmid, ktorý bol označený ako pSE186a, bol trávený Apal a KpnI, DNA fragmenty boli separované na agarózovom géle a dva fragmenty 3,8kb a 0,4kb boli prečistené z gélu. l,2kb DNA inzert z pSE186 bol použitý ako PCR templát na vloženie jednonukleotidovej substitúcie v pozícii 585. PCR priméry boli navrhnuté tak, aby vkladali mutáciu v nukleotidovej pozícii 585 a boli získané od Genosys Biotechnologies Inc. (Texas).

Pravostranný PCR primér mal sekvencie:

'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID N0:12); a lavostranný PCR primér mal sekvenciu:

5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO: 13). PCR reakcia bola uskutočnená pri použití Advantage GC genomic PCR kitu (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) v pufru dodávanom výrobcom za prítomnosti 200M dNTP, 200pmol každého priméru, 50ng templátovej DNA, 1,OM GC-Melt a 1 jednotky KlenTaq Polymerase Mix v konečnom objeme 50 μΐ .' Teplotný profil prvého cyklu bol 94°C počas 1 minút; potom 25 cyklov pri 94°C, 30 sekúnd s 68°C, 2 minúty; a 1 cyklus pri 68°C, 3 minúty. PCR produkt dĺžky 295bp bol trávený Apal a KpnI pri vzniku 254bp fragmentu, ktorý bol spracovaný elektroforézou a prečistený z gélu. Všetky tri fragmenty (3,8kb, 0,4kb a 254bp) boli ligované dohromady trojcestnou ligáciou. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilin a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Tento plazmid bol označený pSE198.

pSE198 bol trávený EcoRI, bol klonovaný do pWHM3, ktorý bol trávený EcoRI a bol transformovaný do E.coli DH5a. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilin a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a potom analýzou DNA sekvencie. DNA bola transformovaná

Táto plazmidová a plazmidová rezistentných na ampicilín bola potvrdená reštrikčnou do E.coli

DM1

DNA bola izolovaná a prítomnosť analýzou z transformantov správneho inzertu a potom analýzou DNA sekvencie. Tento plazmid, ktorý bol označený ako pSE199, bol použitý na transformáciu protoplastov S.avermitilis kmeňa SE180-11. Transformanty kmeňa SE180-11 rezistentné na tiostrepton boli izolované, bola stanovená prítomnosť rezistencie na erytromycín a fermentačné produkty Thio^rErm^r transformantov boli analyzované HPLC analýzou. Prítomnosť mutovaného aveC génu kódujúceho zmenu v aminokyselinovom zvyšku 138 (S138T) nahradzovala normálnu produkciu avermektínov v kmeni SE180-11; i tak však pomer B2:B1 bol približne 0,88:1, čo ukazuje, že táto mutácia znižuje produkciu cyklohexyl B2 vzhľadom k cyklohexyl BI (tabuľka 3). Tento pomer B2:B1 je ešte nižší, než pomer 0,94:1 pozorovaný na A139T mutáciu pripravenú transformáciou kmeňa

SE180-11 pSE188, ako bolo popísané vyššie.

Bola pripravená iná mutácia aminokyselinových pozícií 138 z pSE186 navrhnuté bol použitý aby tak,

585 ako DNA vkladali na vloženie treonínu do

139 .

1,2kb

DNA inzert templát. mutácie

PCR priméry boli nukleotidových pozíciách Biotechnologies, sekvenciu:

a 588 a boli získané od

Inc. (Texas). Pravostranný

Genosys

PCR primér mal

5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID NO: 14); a ľavostranný PCR primér mal sekvenciu:

5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15). PCR reakcia bola realizovaná pri podmienkach uvedených v tomto príklade vyššie. PCR produkt dĺžky 449bp bol trávený Apal a KpnI pri vzniku 254bp fragmentu, ktorý bol spracovaný elektroforézou a prečistený z gélu. pSE186a bol trávený Apal a KpnI, DNA fragmenty boli separované na agarózovom géle a dva fragmenty dĺžky 3,8kb a 0, 4kb boli prečistené z gélu. Všetky tri fragmenty (3,8kb, 0,4kb a 254bp) boli ligované dohromady trojcestnou ligáciou a ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilín a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Tento plazmid bol označený pSE230.

EcoRI, bol klonovaný do pSE230 bol trávený bol trávený EcoRI a bol transformovaný

DH5a. Plazmidová DNA bola izolovaná do pWHM3, ktorý buniek E.coli transformantov rezistentných na ampicilín bola potvrdená reštrikčnou sekvencie. Tento plazmid bol a plazmidová DNA bola rezistentných na ampicilín bola potvrdená reštrikčnou bol označený ako pSE231, protoplastov S.avermitilis kmeňa SE180-11 rezistentné

DNA a prítomnosť analýzou a potom transformovaný izolovaná správneho inzertu analýzou DNA do E. coli DM1 transformantov prítomnosť správneho inzertu analýzou. Tento bol použitý na kmeňa SE180-11.

plazmid, ktorý transformáciu

Transformanty na tiostrepton boli izolované, rezistencie na erytromycín analyzované fermentáciou.

bola stanovená prítomnosť transformanty boli dvojito mutovaného aveC génu kódujúceho nahradzovala normálnu produkciu avermektinov tak ale pomer B2:B1 bol približne táto mutácia ďalej znižuje produkciu k cyklohexyl BI (tabuľka 3) na ešte pomer, než je zníženie pozorované pri transformácii kmeňa SE180-11 pSE188 alebo pSE199, ako bolo popísané a Thio^rErm^r

Prítomnosť

S138T/A139T v kmeni

0,84:1, čo cyklohexyl nižší

SE180-11; i ukazuje, že B2 vzhľadom vyššie .

Tabuľka 3

Kmeň S.avermitilis (transformačný plazmid)	Počet testovaných trans formantov	Relatívny kone . B2	Relatívny kone. BI	Priemerný pomer B2 : BI
SE 180-11 (žiadny)	30	0	0	0
SE 180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE 180-11 (pSE186)	26	222	140	1,59
SE 180-11 (pSE187)	12	283	11	26, 3
SE 180-11 (pSE188)	24	193	206	0,94
SE 180-11 (pSE199)	18	155	171	0,88
SE 180-11 (pSE231)	6	259	309	0,84

Tieto výsledky sú prvou demonštráciou špecifických mutácií aveC génu, ktoré vedú k produkcii vyšších množstiev komerčne výhodnejších avermektínov triedy 1 vzhľadom k avermektinom triedy 2.

Príklad 4: Konštrukcia 5'-delečných mutantov

Ako bolo uvedené vyššie, S.avermitilis nukleotidová sekvencia uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO:1) obsahuje štyri rôzne GTG kodóny v pozíciách 42, 174 , 177 a 180, ktoré sú potenciálnymi štart kodónmi. Tento príklad popisuje konštrukciu mnohopočetných delécií 5' regiónu aveC ORF (obr. 1, SEQ ID NO:1), ktoré boli realizované na stanovenie toho, ktoré z týchto kodónov môžu fungovať ako štart kodóny v aveC ORF na expresiu proteínov.

Fragmenty aveC génu s rôznymi deléciami na 5' konci boli izolované z chromozomálnej DNA S.avermitilis PCR amplifikáciou. PCR priméry boli navrhnuté podľa aveC DNA sekvencie a boli získané od Genosys Biotechnologies, Inc. Pravostranné priméry mali sekvencie: 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC3' (SEQ ID N0:16) (D1F1); 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID N0:17) (D1F2); 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID N0:18) (D1F3); a 5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID N0:19) (D2F2). Ľavostranné priméry mali sekvencie: 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3 ' (SEQ ID NO:20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID N0:21); a 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID NO:22). PCR reakcia bola realizovaná spôsobom popísaným v príklade 3.

PCR produkty boli separované elektroforézou na 1% agarózovom géle a bol detekovaný jeden prúžok dĺžky buď l,0kb alebo l,lkb. PCR produkty boli prečistené z gélu a boli ligované s 25ng 1inearizovaného pCR2.1 vektora (Invitrogen) v molárnom pomere vektor:inzert 1:10, podlá návodu výrobcu. Ligačné zmesi boli použité na transformáciu One Shot™ kompetentných E.coli buniek (Invitrogen) podlá návodu výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilin a prítomnosť inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a analýzou DNA sekvencie. Tieto plazmidy boli označené pSE190 (získaný pomocou priméru D1F1), pSE191 (získaný pomocou' priméru D1F2), pSE192 (získaný pomocou priméru D1F3) a pSE193 (získaný pomocou priméru D2F2).

DNA inzerty boli všetky trávené BamHI/Xbal, boli separované elektroforézou, prečistené z gélu a oddelene ligované s kyvadlovým vektorom pWHM3, ktorý bol trávený BamHI/Xbal, v celkovej DNA koncentrácii lpg v molárnom pomere vektor:inzert 1:5. Ligačné zmesi boli použité na transformáciu kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilin a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Tieto plazmidy boli označené pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) a pSE197 (D2F2), ktoré boli každý zvlášť transformované do E.coli DM1, plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilin a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Tieto DNA boli použité na transformáciu protoplastov S.avermitilis kmeňa SE180-11. Transformanty kmeňa SE180-11 rezistentné na tiostrepton boli izolované, bola stanovená prítomnosť rezistencie na erytromycín a produkty fermentácie Thio^rErm^r transformantov boli analyzované HPLC analýzou na stanovenie toho, ktoré z GTG miest je nutné na aveC expresiu. Výsledky ukazujú, že GTG kodón v pozícii 42 môže byť eliminovaný bez narušenia aveC expresie, pretože pSE194, pSE195 a pSE196 ktoré neobsahujú GTG v pozícii

42, ale ktoré obsahujú všetky ďalšie tri GTG miesta v pozíciách 174,

177 a 180, boli schopné obnoviť normálnu produkciu avermektínov pri transformácii do SE180-11. Normálna produkcia avermektínov nebola obnovená po transformácii kmeňa SE180-11 pSE197, ktorý neobsahuje žiadne zo štyroch GTG miest (tabulka 4).

Tabulka 4

Kmeň S.avermitilis (transformačný plazmid)	Počet testovaných transformantov	Relatívny kone. B2	Relatívny kone. BI	Priemerný pomer B2 : BI
SE 180-11 (žiadny)	6	0	0	0
SE 180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE 180-11 (pSE186)	6	241	152	1, 589
SE 180-11 (pSE194)	6	35	15	2, 43
SE 180-11 (pSE195)	6	74	38	1, 97
SE 180-11 (pSE196)	6	328	208	1,58
SE 180-11 (pSE197)	12	0	0	0

Príklad 5: Klonovanie aveC homológov zo S.hygroscopicus a S.griseochromogenes

Predkladaný vynález umožňuje identifikáciu a klonovanie génov homologických k aveC z iných kmeňov Streptomyces produkujúcich avermektín alebo milbemycin. Napríklad, kozmidová knihovňa S.hygroscopicus (FERM-BP1901) genómovej DNA bola hybridizovaná s l,2kb aveC sondou z S.avermitilis, ako bola popísaná vyššie. Bolo identifikovaných niekoľko kozmidových klonov, ktoré vykazovali silnú hybridizáciu. Chromozomálna DNA bola izolovaná z týchto kozmidov a bol identifikovaný 4,9kb fragment, ktorý hybridizoval s aveC sondou. Táto DNA bola sekvenovaná a bol identifikovaný ORF (SEQ ID NO:3), ktorý vykazoval Aminokyselinová

5. hygroscopicus

6.

významnú homológiu s sekvencia (SEQ aveC

ID homologického aveC ORF

ORF

NO: 4 )

S.avermitilis.

odvodená je uvedená na od obr.

Ďalej, kozmidová knihovňa genómovej

DNA

S . griseochromogenes bola hybridi zovaná l,2kb aveC sondou z S.avermitilis, ako bola popísaná vyššie.

Bolo identifikovaných niekoľko silne hybridizujúcich kozmidových klonov.

Chromozomálna DNA bola izolovaná z týchto kozmidov a bol identifikovaný

5, 4 kb

PstI fragment, ktorý hybridizoval s aveC sondou. Táto DNA bola sekvenovaná a bol identifikovaný parciálny ORF homologický s aveC, ktorý mal významnú homológiu s aveC ORF S.avermitilis. Odvodená aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO:5) je uvedená na obr.

Analýza DNA a aminokyselinovej sekvencie aveC homológov S.hygroscopicus a S.griseochromogenes ukázali, že tieto regióny majú významnú homológiu (približne 50% identitu sekvencie na úrovni aminokyselín) ako navzájom, tak s aveC S.avermitilis a AveC génovým produktom (obr. 6).

Príklad 6

Konštrukcia plazmidu s aveC génom za ermE promotorom

1,2kb

ORF z pSE186 vektor pWHM3 kyvadlový inzertovaný ako Kpn/BamHI

1986, (viď Ward pSE186 bol bol subklonovaný obsahujúci fragment v

Mol. Gen.

v pSE34 , čo je ermE promotor

300bp

Kpn/BamHI mieste pWHM3

Genet. 203: 468-478).

trávený BamHI elektroforézou spracovaný

BamHI a HindlII. Ligačná kompetentných

E.coli DH5a a HindlII, a l,2kb

Pla zmidová

DNA bola na ampicilin produkt trávenia bol fragment bol trávený zmes bola transformovaná do buniek podľa návodu výrobcu.

i zolovaná a prítomnosť rezistentných reštrikčnou analýzou. Tento potvrdená označený a plazmidová rezistentných pSE189, bol transformovaný izolovaná

DNA bola na ampicilin.

z transformantov

1,2 kb inzertu plazmid, ktorý do E.coli

Protoplasty bola bol

DM1 z transformantov kmeňa 1100-SC38

S . avermitilis boli transformované pSE189. Transformanty kmeňa 1100-SC38 rezistentné na tiostrepton boli analyzované a produkty ich transformácie boli analyzované HPLC.

Transformanty kmeňa

1100-SC38

S.avermitilis produkovali zmenený pomer cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinov (približne 3:1), v porovnaní s kmeňom 1100SC38 (približne 34:1) a celková produkcia avermektinov bola zvýšená na približne 2,4-násobok v porovnaní s kmeňom 1100SC38 transformovaným pSE119 (tabuľka 5).

pSE189 bol transformovaný tiež do protoplastov prirodzeného kmeňa S.avermitilis. Boli izolované transformanty rezistentné na tiostrepton a produkty fermentácie boli analyzované HPLC. Celkové množstvo avermektínov produkované prirodzenými S.avermitilis transformovanými pSE189 bolo zvýšené približne na 2,2násobok v porovnaní s prirodzenými S.avermitilis transformovanými pSE119 (tabuľka 5).

Tabuľka 5

Kmeň S.avermitilis (t rans formačný plazmid)	Počet testovaných transformantov	Relat. množstvo B2	Relat. množstvo BI	Relat. množstvo celkových avermektínov	Priemerný pomer B2 : BI
1100-SC38	6	155	4,8	176	33, 9
1100-SC38 (pSE119)	9	239	50, 3	357	4,7
1100-SC38 (pSE189)	16	546	166	849	3, 3
prirodzený	6	59	42	113	1,41
prirodzený (pSE119)	6	248	151	481	1, 64
prirodzený (pSE189)	5	545	345	1,071	1, 58

Príklad 7: Chimerický plazmid obsahujúci sekvencie aveC ORF

S.avermitilis a avec homológu S.hygroscopicus

Bol pripravený hybridný plazmid označený pSE350, ktorý obsahoval 564bp časť aveC homológu S.hygroscopicus nahradzujúcu 564bp homologickú časť aveC ORF S.avermitilis (obr. 7). pSE350 bol pripravený pri použití BsaAI reštrikčného miesta, ktoréje konzervované v obidvoch sekvenciách (aveC pozície 225) a KpnI reštrikčného miesta, ktoré je prítomné v aveC géne S.avermitilis (aveC pozície 810) . KpnI miesto bolo vložené do DNA S. hygroscopicus PCR pri použití pravostranného priméru 5'CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' a lavostranného (SEQ

ID

NO:23) priméru

5'GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID NO:24) (od

Genosys

Biotechnologies), v príklade 2 . fragmenty boli použití PCR podmienok popísaných PCR bol trávený BsaAI a KpnI, separované elektroforézou na 1% agarozovom BsaAI/KpnI fragment. 10) bol trávený KpnI elektroforézou na 1% pri

Produkt bol izolovaný pSE179 (popísaný v príklade a HindlII a géle a z gélu

564bp

2, sekcii fragmenty boli géle a z trávený agarôzovom pSE179 bol separované elektroforézou na 1% separované bol izolovaný gélu

HindlII a BsaAI,

4,5kb fragment.

boli fragmenty agarozovom géle a z gélu

4, 5kb bol izolovaný 0,2kb BsaAI/HindIII fragment.

HindlII/KpnI fragmnet, 0,2kb BsaAI/HindI11 fragment a 564bp

BsaAI/KpnI fragment zo S.hygroscopicus boli ligované dohromady trojcestnou ligáciou a ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilín a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou pri použití KpnI a Aval. Plazmid bol trávený HindlII a Xbal pri zisku l,2kb inzertu, ktorý bol potom ligovaný s pWHM3, ktorý bol trávený HindlII a Xbal. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek, plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na ampicilin a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou pri použití HindlII a Aval. Táto plazmidová DNA bola transformovaná do kompetentných E.coli DM1 buniek, plazmidová DNA bola izolovaná z transformantov rezistentných na bola potvrdená ampicilin a prítomnosť reštrikčnou analýzou správneho inzertu a analýzou DNA sekvencie. Tento plazmid bol označený pSE350 a bol použitý na transformáciu protoplastov S.avermitilis kmeňa SE180-11. Transformanty kmeňa SE180-11 rezistentné na tiostrepton boli izolované, bola stanovená prítomnosť rezistencie na erytromycín a fermentačné produkty Thio^rErm^r transformantov boli analyzované HPLC analýzou. Výsledky ukazujú, že transformanty obsahujúce

S.avermitilis/S.hygroscopicus hybridný plazmid produkujú priemerný pomer B2:B1 približne

109:1 (tabulka 6).

Tabuľka 6

Kmeň S.avermitilis (transformačný plazmid)	Počet testovaných transformantov	Relatívny kone. B2	Relatívny kone. BI	Priemerný pomer B2 : BI
SE180-11 (žiadny)	8	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	8	0	0	0
SE180-11 (pSE350)	16	233	2	109

Uloženie biologických materiálov

Nasledujúci biologický materiál bol uložený v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 29.1.1998, pod nasledujúcimi prírastkovými číslami:

Plazmid plazmid pSE180 plazmid pSE186

Prírastkové číslo

209605

209604

Všetky a publikácie vyššie citované sú tu uvedené patenty, ako odkazy patentové vo svojej prihlášky úplnosti.

Predkladaný vynález špecifickými realizáciami, jednotí ivých a zložky spadajú do modifikácie vynálezu, odborníkom nie je ktoré sú obmedzený uvedené na popísanými dokreslenie metódy rôzne ekvivalentné budú jasné a pripojených

Okrem toho, modifikácii, aspektov vynálezu a funkčne rozsahu vynálezu.

okrem popísaných v obore z uvedeného popisu výkresov. Takéto modifikácie spadajú do rozsahu pripojených patentových nárokov.

Zoznam sekvencii <110> Pfizer Products Inc. (všetky prihlášky okrem U.S.)

<120>	Gén Streptomyces avermitilis	riadiaci	pomer B2:B1
avermektínov
<130>	PC9916A
<140>
<141>
<150>	60/074636
<151>	1998-02-13
<160>	24
<170>	Patentln verš. 2.0 - beta
<210>	1
<211>	1229
<212>	DNA
<213>	Streptomyces avermitilis
<220>
<221>	CDS
<222>	(174) .. (1085)
<400>	1
tcacaaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag	cgtgaaccca	tccgagccgc	60
tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc	cgatgccacg	ctctcacccg	120
acgccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact	gctgtcgttg	ccg gtg Val	176
			1

gtg gtg Val Val

tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg

tac Tyr

224

Trp

Ala Gly 5

Val

Gly

Leu Leu 10

Phe

Leu Ala

Leu Gin 15

Ala

g-g

ttc

agc

cgc

tgg

gcg

gcc

gac

ggt

ggc

tac

cgg

ctg

atc

gag

acg

272

Val

Phe

Ser

Arg

Trp

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Arg

Leu

íle

Glu

Thr

20

25

30

gcg

ggc

cag

ggt

cag

ggc

ggc

agc

aag

gat

aca

ggg

act

a cc

gat

gtg

320

Ala

Gly

Gin

Gly

Gin

Gly

Gly

Ser

Lys

Asp

Thr

Gly

Thr

Thr

Asp

Val

35

40

45

gcc

tat

CCC

gtg

att

tcc

gtc

gtc

tgc

atc

ačc

gcc

g=g

gcg

gcg

tgg

368

Vôl 50

Tyr

Pro Val

íle

Ser 55

Val

Val

Cys

íle

Thr 60

Ala

Ala

Ala

Ala

Trp 65

CtC

tcc

cgg

agg

tgc

cgt

gtc

gaa

ega

cgg

ctg

ctg

ttc

gac

gcc

ctt

416

Leu

Phe

Arg

Arg

Cys

Arg

Val

Glu

Arg

Arg

Leu

Leu

Phe

Asp

Ala

Leu

70

75

80

ctc

C C C

CtC

ggg

ccg

ctg

tcc

gcg

agc

tgg

cag

agc

ccg

ctc

atg

aac

464

Leu

Phe

Leu

Gly

Leu

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Gin

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

85

90

95

tgc

ttc

cat

tcc

gtt

ctc

gcc

tcc

aac

gcg

agt

gtg

tgg

ggc

gcg

gtg

512

Trp

Phe

His

Ser

Val

Leu

Val

Ser

Asn

Ala

Ser

Val

Trp

Gly

Ala

Val

100

105

110

ggt

tcc

tgg

ggt

ccg

tat

gcg

ccc

ggc

tgg

cag

ggg

gcg

ggc

ccg

ggt

560

Gly

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Ala

Gly

Pro

Gly

115

120

125

gcg

gag

gcg

gaa

atg

ccg

ctg

gcg

tcg

gcc

tcc

gcc

tgc

atg

tcg

get

608

Ala

Glu

Ala

Glu

Met

Pro

Leu

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Cys

Met

Ser

Ala

130

135

140

145

ctg

atc

gcc

acc

gtg

ctg

tgc

agc

aag

gca

ctg

ggg

tgg

atc

aag

gcc

656

Leu

íle

Val

Thr

Val

Leu

Cys

Ser

Lys

Ala

Leu

Gly

Trp

íle

Lys

Ala

150

155

160

cgc

cgg

ccg

gca

tgg

cgg

acc

tgg

cgg

ctg

gtc

ctg

gcc

gtg

ttc

ttc

704

Arg

Arg

Pro

Ala

Trp

Arg

Thr

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Val

Phe

Phe

165

170

175

a - —

ggc

atc

gtg

ctc

ggt

ctg

tcc

gag

ccg

ctg

ccg

tcc

gcc

tcc

ggg

752

Zle

Gly

íle

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Ala

Ser

Gly

180

185

190

atc

agc

gca

tgg

gcc

aga

gcg

ctg

ccc

gag

gtg

acc

ttg

tgg

agt

ggc

800

íle

Ser

Val

Trp

Ala

Arg

Ala

Leu

Pro

Glu

Val

Thr

Leu

Trp

Ser

Gly

195

200

205

gac

cgg

tac

cag

ttc

ccc

gtg

tat

cag

gcg

gtc

ggt

tcc

ggc

ctg

gtc

848

Glu

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Val

Tyr

Gin

Ala

Val

Gly

Ser

Gly

Leu

Val

210

215

220

225

tgc

tgc

atg

ctg

ggc

tcg

ctg

cgc

ttc

ttc

cgc

gac

gaa

cgc

gac

gag

896

Cvs

Cys

Met

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Phe

Phe

Arg

Asp

Glu

Arg

Asp

Glu

230

235

240

t CC

tgg

gtg

gaa

cgg

gga

gcc

tgg

cgg

Ctg

ccg

caa

cgg

gca

gcg

aac

944

Ser

Trp

Val

Glu

Arg

Gly

Ala

Trp

Arg

Leu

Pro

Gin

Arg

Ala

Ala

Asn

245

250

255

.tgg :Trp

gcg Ala

cgt Arg 260

ttc čťc‘ Phe Leu

gcc’gcg gtc ggt ggg gtg aac

gcc gtg atg

ttc Phe

992

Ala

Val Val 265

Gly

Gly

Val

Asn

Ala 270

Val Met

CCC

tac

acc

tgt

ttc

cat

atc

ctc

ctg

tcc

ctc

gtc

ggt

gga

cag

ccg

1040

Leu

Tyr

Thr

Cys

Phe

His

íle

Leu

Leu

Ser

Leu

Val

Gly

Gly

Gin

Pro

275

280

285

CCC

gac

caa

ctg

ccg

gac

tcc

ttc

caa

gcg

ccg

gcc

‘get

tac

tga

1085

Pro

Asp

Gin

Leu

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Ala

Pro

Ala

Ala

Tyr

290

295

300

gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc

1145 ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205 acacccctcg gttcagcgat catg <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> S. avermitilis <400> 2

1229

Val

Val

Val

Trp

Ala

Gly

Val

Gly

Leu

Leu

Phe

Leu

Ala

Leu

Gin

Ala

1

5

10

15

Tyr

Val

Phe

Ser

Arg

Trp

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Arg

Leu

íle

Glu

20

25

30

Thr

Ala

Gly

Gin

Gly

Gin

Gly

Gly

Ser

Lys

Asp

Thr

Gly

Thr

Thr

Asp

35

40

45

Val

Val

Tyr

Pro

Val

íle

Ser

Val

Val

Cys

íle

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

50

55

60

Trp

Leu

Phe

Arg

Arg

Cys

Arg

Val

Glu

Arg

Arg

Leu

Leu

Phe

Asp

Ala

65

70

75

80

Leu

Leu

Phe

Leu

Gly

Leu

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Gin

Ser

Pro

Leu

Met

85

90

95

Asn

Trp

Phe

His

Ser

Val

Leu

Val

Ser

Asn

Ala

Ser

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Val

Gly

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Ala

Gly

Pro

115

120

125

Gly Ala

Glu

Ala Glu

Met

Pro Leu 135

Ala

Ser Ala

Ser 140

Val

cys

Met

Ser

130

Ala

Leu

íle

Val

Thr

Val

Leu

cys

Ser

Lys

Ala

Leu

Gly

Trp

íle

Lys

145

150

155

160

Ala

Arg

Arg

Pro

Ala

Trp

Arg

Thr

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Val

Phe

165

170

175

Phe

íle

Gly

íle

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Ala

Ser

180

185

190

Gly

íle

Ser

Val

Trp

Ala

Arg

Ala

Leu

Pro

Glu

Val

Thr

Leu

Trp

Ser

195

200

205

Gly

Glu

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Val

Tyr

Gin

Ala

Val

Gly

Ser

Gly

Leu

210

215

220

Val

Cys

Cys

Met

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Phe

Phe

Arg

Asp

Glu

Arg

Asp

225

230

235

240

Glu

Ser

Trp

Val

Glu

Arg

Gly

Ala

Trp

Arg

Leu

Pro

Gin

Arg

Ala

Ala

245

250

255

Asn

Trp

Ala

Arg

Phe

Leu

Ala

Val

Val

Gly

Gly

Val

Asn

Ala

Val

Met

260

265

270

Phe

Leu

Tyr

Thr

cys

Phe

His

íle

Leu

Leu

Ser

Leu

Val

Gly

C-ly

Gin

275

280

285

Pro

Pro

Asp

Gin

Leu

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Ala

Pro

Ala

Ala

Tyr

290

295

300

<210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <220>

<221> CDS <222> (58).. (990) <400> 3 gtcgacaaag accggccgga ggccgccggc cgggcccata ccgcacgccg cccgcgg 57 gcg ccc acc ccc ccc gta aca ccg cgg gcg cgt gtc ggc gcg ccg gtg 105

Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val

10 15

ccg Leu

gga Gly

CCC Leu

cag Gin 20

gcg Val

tac gcg Tyr Val

ttc gcc gcc

tgg ctc gcc

gac age

ggc Gly

153

Phe

Ala 25

Ala

Trp

Leu

Ala

Asp 30

Ser

tac

ege

acc

gag

aag

gcg

tcc

ccg

gcc

agg

ggc

ggt

ggg

gac

tcg

gag

201

Tyr

Arg

íle

Glu

Lys

Ala

Ser

Pro

Ala

Arg

Gly

Gly

Gly

Asp

Ser

Glu

35

40

45

•

cgg

are

gcc

gac

gcg

ccg

atc

ccg

ctg

ctg

tcc

gtg

gtg

gga

gcg

gtg

249

Arg

íle

Ala

Asp

Val

Leu

íle

Pro

Leu

Leu

Ser

Val

Val

Gly

Ala

Val

50

55

60

gtc

CCC

gca

gcg

ege

ctg

tac

cgg

agg

tgt

cgg

gcc

agg

agg

cgg

ctg

297

Val

Leu

Ala

Val

Cys

Leu

Tyr

Arg

Arg

Cys

Arg

Ala

Arg

Arg

Arg

Leu

65

70

75

80

acg

ttc

gac

gcg

ccg

CCC

ttc

atc

ggg

ctg

ctg

tcg

gcc

agt

tgg

cag

345

Thr

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu

Phe

íle

Gly

Leu

Leu

Ser

Ala

Ser

Trp

Gin

85

90

95

agt

CCC

ttg

atg

aac

tgg

atc

aat

ccg

gtg

ctc

gcg

tca

aac

gtc

aat

393

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

Trp

íle

Asn

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Asn

Val

Asn

100

105

110

gtg

CCC

gga

gcg

gcg

gcc

tcg

tgg

ggg

ccg

tat

gtg

CCC

ggt

tgg

cag

441

Val

Phe

Gly

Ala

Val

Ala

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

115

120

125

ggg

geg

ggg

gcg

cac

cag

gag

gcc

gag

ctg

ccg

Ctg

gcg

acc

ctg

age

489

Gly

Ala

Gly

Ala

His

Gin

Glu

Ala

Glu

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

130

135

140

are

L w u

acg

acg

gcc

atg

atg

gcc

gcc

gtg

gcc

tgc

ggc

aag

ggc

atg

537

íle

Cys

Met

Thr

Ala

Met

Met

Ala

Ala

Val

Ala

Cys

Gly

Lys

Gly

Met

145

150

155

160

ggz

CCC

gcc

gcc

gcc

cgg

tgg

ccg

cgg

ctg

ggg

ccg

ctc

cgg

ctg

atc

585

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

Arg

Trp

Pro

Arg

Leu

Gly

Pro

Leu

Arg

Leu

íle

165

170

175

acg

CCC

ggc

ttt

ccg

ctc

gtc

gtg

ctc

ctc

gac

atc

gcc

gag

ccg

ctg

633

Ala

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Val'

Val

Leu

Leu

Asp

íle

Ala

Glu

Pro

Leu

180

185

190

gcg

CCC

CCC

gcg

ggc

gtc

tcc

gtg

tgg

acg

cgg

gca

gtg

CCC

gag

ctg

681

Val

Ser

Phe

Ala

Gly

Val

Ser

Val

Trp

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Leu

195

200

205

acc

acc

cgg

age

ggg

cac

tgg

tat

cag

ttc

ccg

ctg

tat

cag

atg

gtg

729

Thr

íle

Trp

Ser

Gly

His

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Leu

Tyr

Gin

Met

Val

210

215

220

get Ala 225

tcg Ser

gcg Ala

ctc ttc ggc gcc tet

ttg ggg

gcc gcg ege cac ttt

ege Arg 240

777

Leu

Phe Gly 230

Ala Ser

Leu

Gly

Ala 235

Ala

Arg

His Phe

aac

cgg

ege

ggc

gaa

acg

tgt

ctg

gag

tcc

ggg

gcg

gcc

ctc

cta

ccg

825

Asn

Arg

Arg

Gly

Glu

Thr

Cys

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Leu

Leu

Pro

245

250

255

gag

ggc

ccg

agg

cca

tgg

gtc

cgg

ctg

ctg

gcg

gtg

gtg

ggc

ggg

gcc

873

Glu

Gly

Pro

Arg

Pro

Trp

Val

Arg

Leu

Leu

Ala

Val

Val

Gly Gly

Ala

260

265

270

aac

atc

agc

atc

gcc

ctc

tac

acc

ggc

gca

cac

ggc

gca

cac

atc

ctg

921

Asn

íle

Ser

íle

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ala

His

Gly

Ala

His

íle

Leu

275

280

285

ctc

tcg

ccg

atg

gac

ggc

gcc

ccc

ccg

gac

cgg

ctc

ccc

gaa

ttc

ttc

969

Phe

Ser

Leu

Met

Asp

Gly

Ala

Pro

Pro

Asp

Arg

Leu

Pro

Glu

Phe

Phe

290

295

300

cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccaatgt1020

Arg Pro Ala Ala Gly Tyr

305310 gcccgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga ccgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 gcggccgggg1150 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 4

Val

Phe

Thr

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Trp

Ala

Cys

Val

Gly

Ala

Leu

Val

1

5

10

15

Leu

Gly

Leu

Gin

Val

Tyr

Val

Phe

Ala

Ala

Trp

Leu

Ala

Asp

Ser

Gly

20

25

30

Tyr

Arg

íle

Glu

Lys

Ala

Ser

Pro

Ala

Arg

Gly

Gly

Gly

Asp

Ser

Glu

35

40

45

Arg

íle

Ala

Asp

Val

Leu

íle

Pro

Leu

Leu

Ser

Val

Val

Gly

Ala

Val

55 60

Val 65

Leu

Ala

Val Cys

Leu 70

Tyr Arg Arg Cys Arg 75

Ala Arg

Arg Arg Leu 80

Thr

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu

Phe

íle

Gly

Leu

Leu

Ser

Ala

Ser

Trp

Gin

85

90

95

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

Trp

íle

Asn

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Asn

Val

Asn

100

105

110

Val

Phe

Gly

Ala

Val

Ala

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

115

120

125

Gly

Ala

Gly

Ala

His

Gin

Glu

Ala

Glu

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

130

135

140

Zle

Cys

Met

Thr

Ala

Met

Met

Ala

Ala

Val

Ala

Cys

Gly

Lys

Gly

Met

145

150

155

160

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

Arg

Trp

Pro

Arg

Leu

Gly

Pro

Leu

Arg

Leu

íle

165

170

175

Ala

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Val

Val

Leu

Leu

Asp

íle

Ala

Glu

Pro

Leu

*180

185

190

Val

Ser

Phe

Ala

Gly

Val

Ser

Val

Trp

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Leu

195

200

205

Thr

íle

Trp

Ser

Gly

His

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Leu

Tyr

Gin

Met

Val

210

215

220

Ala

Ser

Ala

Leu

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Ala

Arg

His

Phe

Arg

225

230

235

240

Asn

Arg

Arg

Gly

Glu

Thr

Cys

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Leu

Leu

Pro

245

250

255

Glu

Gly

Pro

Arg

Pro

Trp

Val

Arg

Leu

Leu

Ala

Val

Val

Gly

Gly

Ala

260

265

270

Asn

íle

Ser

íle

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ala

His

Gly

Ala

His

íle

Leu

275

280

285

Phe

Ser

Leu

Met

Asp

Gly

Ala

Pro

Pro

Asd

Arg

Leu

Pro

Glu

Phe

Phe

290

295

300

Ara Pro Ala Ala Gly Tyr

305 310 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400> 5

Val

íle

Gly

Trp

Ala

Ala

Leu

Gly

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Gin

Val

1

5

10

15

Tyr

Val

Phe

Ala

Arg

Trp

Thr

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

His

Leu

Ala

Asp

20

25

30

Val

Ser

Gly

Pro

Asp

Gly

Arg

Glu

Pro

Gly

His

Arg

Arg

íle

íle

Asp

35

40

45

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Met

Ala

Gly

Val

Val

Gly

Leu

Ala

Phe

50

55

60

Trp

Leu

Val

Arg

Arg

Trp

Arg

Ala

Glu

Arg

Arg

Leu

Ser

Phe

Asp

Ala

65

70

75

80

Leu

Leu

Phe

Thr

Gly

Val

Leu

Phe

Ala

Gly

Trp

Leu

Ser

Pro

Leu

Met

85

90

95

Asn

Trp

Phe

His

Pro

Val

Leu

Met

Ala

Asn

Thr

His

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Val

Gly

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Arg

Gly

Leu

Pro

Pro

115

120

125

Gly

Lys

Glu

Ala

Glu

Leu

Pro

Leu

Val

Thr

Phe

Ser

Leu

Gly

Ser

Thr

130

135

140

Val

Leu

Leu

Gly

Val

Leu

Gly

Cys

Cys

Gin

Val

Met

Ser

Arg

Val

Arg

145

150

155

160

Glu

Arg

Trp

Pro

Gly

Val

Arg

Pro

Trp

Gin

Leu

Val

Gly

Leu

Ala

Phe

165

170

175

Leu

Thr

Ala

Val

Ala

Phe

Asp

Leu

Ser

Glu

Pro

Phe

íle

Ser

Phe

Ala

180

185

190

Gly

Val

Ser

Val

Trp

Ala

Arg

Ala

Leu

Pro

Thr

Val

Thr

Leu

Trp

Arg

195

200

205

Gly

Ala

Trp

Tyr

Arg

Ala

Arg

210 215 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 ccacgaaacc ggacacac.

<210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 cacgaccgct gaaccgag <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 9 aactccggcc gactcccctt c <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 10 gcaaggatac ggggactac

100 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 11 gaaccgaccg ccvgatac <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 12 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 13 ggaaccgacc gcctgataca <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 14 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 15 ggaacatcac ggcattcacc

101 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 16 aacccatccg agccgctc <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 17 tcggcccgcc aacgaac <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 18 ccaacgaacg tgtagtag <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 19 tgcaggcgta cgtgctcagc <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 20 catgatcgct gaaccga

102

IrÍŕfc .1' i-AlňMť

V· ‘ <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 21 catgatcgct gaaccgagga <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 22 aggagcgcgg tgcgtctgga <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 23 cttcaggtgt acgtgtccg <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 24 gaactggtac cagtgccc

103

PATENTOVÉ

Claims (6)

NÁROKY

1/7

TCACGAAACCGGACACACCACACACACGAAGGTGAGACAGCGTGAACCCATCCGAGCCGCTCGGCCTGCCCAACGAACGTGTAGTAGACACCCGACCGTC

1. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahujúca úplný aveC ORF S.avermiti1is alebo jeho významnú časť, kde táto molekula neobsahuje ďalší úplný ORF, ktorý je umiestnený za aveC ORF in situ v chromozóme S.avermitilis.

2. Izolovaná polynukleotidová molekula podlá nároku 1 obsahujúca rovnakú nukleotidovú sekvenciu, ako je kódujúca sekvencia na AveC génový produkt S.avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo nukleotidovú sekvenciu rovnakú ako je nukleotidová sekvencia aveC ORF podlá obr. 1 (SEQ ID NO:1), alebo jej významná časť.

3/7

4l7 ιησ> hxLT) σ>Γχ • ·

3. Izolovaná polynukleotidová molekula podlá nároku 2, ktorá ďalej obsahuje nukleotidové sekvencie, ktoré za prirodzeného stavu susedia s aveC génom in situ v S.avermitilis.

4 CD 4 CD 4 Q E- 4 CD 4 mC 4 X E- CJ 4 Em 4 x CJ 4 CD 4 CJ t Em i CD 1 CJ 1 U5 t CJ t E- t U. CD 1 CD t mC 1 Em CJ 1 C 1 I CJ 1 .J z£ 1 CD 1 CD t > CD 4 CD 4 CD « CD CJ 1 CJ 1 E* ¹ CD t I C-J t mC 4 CD 1 Em 1 e- 4 CJ Em 1 Em 4 E* 1 cn mC 4 CD 4 4 * CD 1 CJ 1 CJ 1 qc cd 1 CJ 1 CD 1 > CD 1 CD 1 Em 1 CD 1 CJ 1 » CD i CD CD 1 ·< 1 i cn E- 1 CJ 1 «C i cn 1 CJ 1 1 CJ 1 1 O 1 ä: 1 cn CD 1 CD 1 CD 1 > CJ 1 CD 4 CD 4 ω Em 1 CJ 1 Em 4 i E-· 1 CJ 1 CJ 1 ac cj 1 CJ 4 CD 1 *< CD a Em 1 CJ i UJ CD • CJ 4 1 CD 1 > CD | mC 1 CD i mC CJ 1 CD 1 E* * X C 1 CJ 1 CD 1 CJ 1 l CD i CD 1 CD mC 1 CJ 1 E“ t CO Em t CD 1 CD t o E- a CD 1 Em 1 4 CD 4 CJ 4 CD 4 U3 mC 4 CJ + CJ 4 U3 E- 4 CJ 4 Em 4 Ch «C 4 CJ 4 i CD I CD O 1 CJ i mC • ÍZ CJ 1 CJ 4 e- i U3 CD 4 CD 4 CJ 1 CD t 1 CJ CD 1 CD 6-· 1 CJ 1 CD 1 C E- 4 CJ 1 CJ 1 P£ E· 1 Em 1 CD 4 i CJ I CD 1 CD 1 >> CJ i CD 1 CD 1 > CJ 1 e 1 X Em 1 CD 1 i CD 1 acC 1 Em 1 E-* i cn CJ 4 CD 1 «< i E- mC 1 CD 1 S2 1 CJ i i CD 1 CJ 1 O CD t CJ 1 E-· 1 cn t- 1 CD 1 CD 1 W Em 1 1 CD 1 1 CD 1 Em 1 CJ 1 PS Em 1 CD 1 CJ 4 UJ Em 4 CJ 1 CD 1 > CD 1 CD 1 i Ε-» i X CD 1 CJ 4 CD « S> CJ l CD t CD • D> f CJ 1 E- • • CJ 1 i CD i CD 1 CD CD 1 CJ 1 CD t << CD 4 CD 1 CD f O CJ 1 CJ 1 CD 1 i E-· 1 CD * E— 1 CJ Em 1 CD 4 O 4 Pí M< 1 CJ a CD 1 «C «’C 1 CD 1 4 CD + 5» ·< 4 CD 4 CJ 4- Em 4· CD 4 c.· * P) CD 4 E- 4 E* 4 >- E-* 4 i CD « CJ 1 O CD 4 E- i CJ 1 J O i C a CJ 1 D£ «< 4 Em 1 •C 1 1 £-< 1 CJ 1 1 P£ Em 1 CD 1 1 X CJ t CJ 1 4 x o 1 CJ 1 i CD i Ξ* CD 1 CD 1 CD • t> CJ t CJ 1 u» • 0U Em t CD 1 CD 4 «< CJ 4 l CD 1 CD f CD CD 1 CJ 1 CJ f P. CJ a CD 1 E- 1 Ch E· 1 CJ 1 1 i g-a 1 CD 1 O 1 Pí CJ 1 CD 1 «< t fcM H « CJ 1 CD t :> cj 1 £m 1 í cd 1 CJ 1 CJ 4 e- i cn E- 1 CD I O < -3 Em 4 CD f CD 1 C CJ a » CD 1 1 CD 1 MC Em 1 Em t mC 1 X CD 1 CD a Em 1 P. CD t CD 4 CD a 1 CJ 1 ^4 CD 1 E-m 1 Ph MC 1 ·< t CJ 4 p: cj a CJ 1 CD t CD CJ 1 CJ a l cj 1 CJ i CJ t CJ t Ä mC t CD 1 CD i CD 1 E- 1 CJ f Cm *< 1 4 CD 4 MC 4 e- E- 4 CJ 4 CD 4 ω cd 4 4 CJ 4 a: CD 4 CD 4 CJ 4 l Em 1 CD 1 CJ I UJ Em 4 CD 4 E- 1 X CD 1 CD a CD 1 CD CJ 1 Em t t E-· 1 mC 1 CD 1 Em i P- CJ 1 *c 1 m£ l CC Em 1 CJ f CD 1 «C «< 1 i CD 1 CD 1 ω CD t CD 1 CD 1 CJ 1 CJ 1 CJ 1 ^3 E- t «< t CD t 1 CJ 1 CJ i E-· 1 Ä CD i CD 1 CD 1 < CJ i CD 1 CJ 1 f CD 1 i ε-* t E-· t CD 1 Em • 3= mC 1 CD 1 CD e *C CJ 1 CD 1 CJ t O CD a • CD 1 «C 1 4i CJ 4 CJ t CD 1 P3 CJ 4 CD 1 Em 1 cn E- 4 CJ 4 CD I 1 E-m 1 CD t CD 1 Mtí Mť 1 CD 1 CJ 1 CU O 1 CJ 1 CD 1 > Em t CJ t l CJ 1 E- 1 CD 1 mC i SS CJ 1 CD 1 f- ¹ x CD 1 CJ 4 E- a Pm • i CD i CJ 4 J CJ 4 CD i CD i «< CD t «e 4 CD 1 CD CJ f CJ 4 CD 1 4 E-· + CD CD 4“ MC Em 4 Em CJ 4 ce Em o CD 4 O 4 aC CD 4 CD 4 t CJ 1 CD 4 CD 1 dC i se CD 1 CJ 4 cd • P> fc- 1 CJ 4 E· 4 en Em 1 l 1 CJ t CC CJ 1 CJ 1 CD 1 CD CD t CJ l CJ 4 U) E* 1 CJ 1 CD a 1 zC 1 CJ 1 CD 1 MC Em 1 CD t CJ 1 « CD t O a CJ 1 U) 1 CD 1 i CD 1 -C 1 CJ 1 CJ i U3 O 1 CJ 1 i cn Em t CJ 4 CD 1 Ω CD 4 i g—· » É“» 1 >· CJ 1 CD t CJ 1 04 CJ 1 CJ 1 i x E- 4 CD 1 fr- t i CD 1 CJ 1 CD t -< CJ t CJ 1 CD 1 MC E- 1 CJ 1 e- 1 P- CJ 4 t 1 ^{r 1} 1 CD 1 CJ f CJ t 04 CD 4 O 1 t a—i CD 1 E- 1 CJ t P* CJ 1 i CJ * CD 1 CD CJ 4 CJ 1 CD 1 CD -C 1 CD 1 Em 1 o CD 1 CD 1 CD 4 l CJ 1 Em 1 < 4 Em CD 1 CD 1 1 CD i CJ i CJ 1 PS E- 1 Em 1 4 CJ 4 CD 4 CJ 4 MC 4- cn CJ 4 CJ 4 CD 4 CD CD CD 4 CJ 4 U) CD 4 t CD I CD | CD E- 1 CD 1 CD 1 <C Em 4 CJ 1 E* 1 CJ CJ t ze 1 E- 1 i E-* 1 CJ 1 c 1 l—H MC 1 CD | f ►M CJ a CJ 1 CD 1 a< «< 1 Em 1 1 CJ | «< 1 CJ 1 CJ i O CD 1 CD í E- t cn E- 1 O 4 CJ 1 O E- 1 l CD 1 CD i a CD 1 CD 1 CD 1 CD CD 1 CJ 4 CD 1 :> CD 4 CJ 1 CJ 1 l CJ 1 CJ 4 E- 1 CJ CD 1 CD i Em i X CJ 4 CD 1 Em 1 x f CJ 1 i CD 1 CJ t CJ 1 E- t 3: m< f CD f CD E* 1 CJ 4 CD 1 CD CJ a l «c í CD 4 Mť Em 1 CJ t CJ 1 O CD f CJ f CJ 1 _3 C 1 CJ 1 CJ 1 i CD 1 CD 1 CD 1 S> CD 4 CD 1 CD i CD CJ i CJ 1 mC 4 SS CJ 4 Em 4 l CD 1 CJ 1 O 1 MC * cn CD 1 CD 1 Em i tn CD 1 CD 1 CJ 1 Oa CJ 4 *♦· 4 CD 4 E- 4 CD 4 Em 4 X E- ·*> CD CD 4 CD CJ 4 CD 4 CJ 4 l CJ 1 CD i CD 1 > CJ 1 CJ 1 CJ 1 U3 CJ 1 CJ 1 CD 1 a< CJ 1 a l E-* i CD 1 CJ 1 CD í mC CD 1 *c 1 CJ a P* CJ 1 1 CJ a CL CJ 1 l CD 1 E- 1 X CJ 1 CJ 1 CD 1 CD CJ 1 CD 1 Em 1 en CJ 1 CD 1 E* 1 > CD 1 CJ 1 E— 1 cn Em i CJ 1 CD 1 C Em 1 Em 1 CD i a< t CD 1 1 zť 1 CD 1 £m i E- 1 P- CJ 1 CD 1 CJ t U3 CD 1 CD 1 CJ 1 o o 1 l o t CJ i DC E- 1 CD 4 CJ t 04 MC 4 CD a CD f o CD 4 zC 1 CJ i cn 1 1 O 1 c 1 I-* Em 1 CD 1 MC 1 M CJ 1 CJ a CJ 1 04 CD 1 CJ t ΓΜ 1 zC 1 CD | CD 4 CJ 4 UJ Em f CJ t CJ i P- Em 1 1 CD 1 « E- a i CD 1 «ť f cn Em 1 CD 1 CD 1 > CD 1 CD i CD 1 > C 1 E- 1 ί- 1 a—4 4 E—· 4 CJ -¼ CD 4 S> Em 4 Em 4 ·< 4 cn «< 4 CD 4 CJ 4 O CD 4 Ο 4 i CJ t Em 1 CJ 1 CJ i U3 mC 1 CJ 1 CD i ω CJ 1 CD 1 CD 1 O *C i CD i » CJ 1 e-· 1 u, CJ t CD 1 Em f >* CD 1 CJ 4 CD 1 CJ 1 CJ 4 O i E- 1 1 CD 1 CD 1 CJ 1 Pu CD 1 CD 1 Em 1 CJ CJ 1 CD 1 CJ 1 Pu Em 1 Ľ) i i 1 CD 1 E- 1 e- 4 CD 1 CD CJ 1 CD 1 e- i cn «C 4 CD 1 CD 1 5> CJ l CJ · l CJ 1 CD 1 s> <c 1 CJ 1 CJ 1 P< Em 1 CD 1 CJ 1 O E* 1 CJ 1 CJ 1 Em i 1 CJ 1 CJ 4 e- 1 Em e Em 1 CJ 1 UJ Em 1 Em 1 Em 1 U3 Em t C 1 «C 1 i CD 1 MC t CJ 1 CJ l U3 CD 1 CD 1 CJ 1 UJ << t CD 1 CJ 1 J U l CD i i CD 1 E- 1 >* E- 1 CJ 4 CD 1 CD Em 1 Em 1 Em 1 CD 1 CJ t CJ CJ t 1 C 1 CD 1 CD 1 > Em 1 CD 1 CD l > CD 1 CD 1 CJ 1 0£ CJ 1 C3 1 CD l 4- O 4 O 4 CD 4 Em 4- p- CD 4 CJ 4 CD 4- CD Em 4 CD 4 E* 4 CZ> CJ 4 zC 4 l CJ 1 CD | m£ E-« | CJ 1 Em 1 X CJ 1 CJ 1 CD I > CD 1 CD 1 «C i CJ l i CJ 1 CD 1 CD 1 S> Em 4 CJ 1 1 Em Em 1 CJ 1 Em 1 X Em 4 CJ » £m t I CJ 1 zC 1 Em 1 CJ l UJ CJ 1 CJ 1 CJ 1 aU CJ 1 CJ 1 CJ 1 J CJ 1 Em 1 i «< 1 CJ 1 O -< t Em t E- 1 cn Em 4 CD 1 CJ 4 Ο- CJ 4 CJ 1 CJ 1 CD i i CJ 1 CD 1 CD 1 O Em 1 Em 1 CD 1 > E- 1 CJ I CD 1 «C Em 1 CJ t CD i i E- 1 E* 1 CJ 1 CJ r UJ CD 1 CJ 1 CD » S> Em 4 «< 4 CJ 1 ^3 -C 1 CJ 1 l CJ 1 CJ 1 *-3 CJ 4 CJ 1 CD 1 CD Em I CJ 1 Em 1 Ρ- CD 1 CJ 1 -C 1 Em 1 l E-· 1 o 1 c 1 E- CJ 4 CD 4 mC 1 •-4 E- t CD t CD t CD E* 1 CJ t CJ 1 » CJ 1 CJ 1 Em | CD 1 Em 1 CD t C 1 4-4 << 1 CD 1 a« 1 t-H «C i CJ · 4- CD 4 CD 4 MC CJ 4 CJ ·+ CD 4 S> Em 4- CJ 4 CJ 4 Ο CD 4 Em 4 CJ 4 Em -¼ l CJ 1 CD f < 1 Em MC 1 CD 1 CJ 1 UJ CD 1 CJ 1 CJ f X *< 1 o 1 CJ 1 l «c 1 E- 1 CD 1 CD i O CJ i Em 1 CD 1 CD -c 1 •C 1 CJ 1 3= CJ 1 ·< 1 * CJ 1 CJ 1 UJ CD 1 CJ 1 CD 1 < CJ 1 CJ Em t >- 1 CJ 1 C l CJ I l CJ » E- 1 CD 4 CD Em 1 CJ 1 CD 1 4< Em | CD 1 CD t M Em 1 o 1 zť 1 i CD 1 E-* 4 CD 1 Em l Ch CD 1 CD 1 «< i H4 CD I CD 1 Em 1 k. «C 1 CJ 1 > E-* 1 Em 4 P- CJ 4 CD 1 CD t CD CJ t CJ 1 Em 1 x E* t Em 1 CJ 1 CJ i i MC > CD 1 mC 1 Em Em t CD 1 Em 1 cn Em 1 CD 1 CD 1 CD 1 U 1 Ä 1 i CD 1 E-m 1 Em | CJ 1 UJ CD 1 CD 1 Em 1 u· «C 1 CD 1 Em 1 CJ «C 4 CJ 1 1 CJ 1 CJ 1 U) 1 CD 1 E- 1 X Em 1 CJ 1 CD 1 P3 CD 1 CJ 1 CJ i CD 1 ^-4 •“4 ♦—4 ^4 ^4 ^4 •4 ·“< o C3 O o o e O Cd O O o <o w CSJ m u> \0 r* CO cn O rH r>a

Hindlll

4. Spôsob prípravy rekombinantného produktu génu homologického k AveC, vyznačujúci m, že obsahuje kultiváciu hostiteľskej bunky transformovanej rekombinantným expresným vektorom, kde uvedený re kombinantný expresný vektor obsahuje polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID N0:4 sekvenciu alebo jej významnú časť, kde táto polynukleotidová molekula je v operatívnej väzbe s jedným alebo viac regulačnými elementmi, ktoré kontrolujú expresiu polynukleotidovej molekuly v hostiteľskej bunke, kde táto kultivácia je realizovaná za podmienok umožňujúcich produkciu rekombinantného produktu génu homologického k AveC a získanie AveC génového produktu z bunečnej kultúry.

25. Polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako sekvencia kódujúca AveC génový produkt

S.avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC

209604) alebo nukleotidová sekvencia aveC

ORF

S.avermit i lis, ako je uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO:1) s tou výnimkou, že táto nukleotidová sekvencia ďalej obsahuje jednu alebo dve mutácie, preto bunky

S.avermitilis kmeňa ATCC 53692, v ktorých bola prirodzená aveC alela inaktivovaná a ktoré exprimujú polynukleotidovú molekulu obsahuj úcu mutovanú

109 nukleotidová sekvenciu, produkujú avermektíny v odlišnom pomere a množstve, než sú produkované bunkami S.avermitilis kmeňa ATCC 53692, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu.

26. Polynukleotidovú molekula podľa nároku ovplyvňuje produkciu avermektinov tak, S. avermitilis kmeňa ATCC 53692, v ktorých bola inaktivovaná a ktoré aveC alela polynukleotidovú molekulu podlá nároku

25,

25, že ktorá bunky prirodzená exprimujú produkujú avermektíny v zníženom pomere triedy v porovnaní s bunkami S.avermitilis exprimujú iba prirodzenú alelu.

triede 1

ATCC

53692, ktoré

27. Polynukleotidovú molekula podľa avermektíny triedy 2: triede nároku 26, kde sú cyklohexyl-B2:

cyklohexyl-Bl avermektíny.

28. Polynukleotidovú molekula podľa nároku 27, kde znížený pomer cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl avermektinov je menší než 1,6:1.

29. Polynukleotidovú molekula podľa nároku 28, kde znížený pomer cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl avermektinov je približne 0,94:1.

30. Polynukleotidovú molekula podľa nároku 29, kde mutácia S.avermitilis aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) kóduje aminokyselinová substitúciu vo zvyšku 139 AveC génového produktu z alaninu na treonín.

110

31. Polynukleotidová molekula podľa nároku 28, kde znížený pomer cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl avermektínov je približne 0,88:1.

32. Polynukleotidová molekula podľa nároku 31, kde mutácia S. avermitilis aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) kóduje aminokyselinovú substitúciu vo zvyšku 138 AveC génového produktu zo serínu na treonín.

33. Polynukleotidová molekula podľa nároku 28, kde znížený pomer cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl avermektínov je približne 0,84:1.

34. Polynukleotidová molekula podľa nároku 33, kde mutácia S. avermitilis aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) kóduje prvú aminokyselinovú substitúciu vo zvyšku 138 AveC génového produktu zo serínu na treonín a druhú aminokyselinovú substitúciu vo zvyšku 139 AveC génového produktu z alanínu na treonín.

35. Polynukleotidová molekula podľa nároku 25, kde mutácia S. avermitilis aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) kóduje aminokyselinovú substitúciu vo zvyšku 55 AveC génového produktu zo serínu na fenylalanín.

36. Polynukleotidová molekula podľa nároku 25, kde mutácia S. avermitilis aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) kóduje aminokyselinovú substitúciu vo zvyšku 230 AveC génového produktu z glycínu na aspartat.

Ul

37. Polynukleotidová molekula obsahujúca silný promotor v operatívnej väzbe s S.avermitilis aveC ORF podía obr. 1 (SEQ ID NO:1) .

38. Polynukleotidová molekula podľa nároku 37, kde silný promotor je ermE promotor zo Saccharopolyspora erythraea.

39. Polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt, ktorý bol inaktivovaný inzerciou heterológnej nukleotidovej sekvencie do uvedenej nukleotidovej sekvencie.

40. Polynukleotidová molekula podľa nároku 25, obsahujúca aveC alelu, ktorá bola inaktivovaná deléciou 640bp Pstl/Sphl fragmentu z aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1).

41. Polynukleotidová molekula podľa nároku 25, obsahujúca aveC alelu, ktorá bola inaktivovaná vložením mutácie spôsobujúcej posun čítacieho rámca do alely.

42. Polynukleotidová molekula podľa nároku 25, do ktorej bola vložená mutácie spôsobujúca posun čítacieho rámca pridaním dvoch G nukleotidov po C nukleotidu v nukleotidovej pozícii 471 aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1).

43. Polynukleotidová molekula podľa nároku 25, obsahujúca aveC alelu, ktorá bola inaktivovaná vložením terminačného kodónu v nukleotidovej pozícii, ktorá kóduje aminokyselinu 116 AveC génového produktu S.avermitilis.

112

25, obsahujúca vložením prvej génového mutácie

44. Polynukleotidová molekula aveC alelu, ktorá bola podlá nároku inaktivovaná mutácie v aminokyselinovéj produktu, ktorá mení glycín v pozícii 275 AveC génového na histidín.

pozícii 256

AveC na aspartat a druhej produktu, ktorá mení tyrosin

45. Génový substitučný faktor, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidové sekvencie, ktoré za prirodzeného stavu susedia s aveC ORF in situ v chromozóme

S . avermit i 1 i s.

46. Rekombinantný vektor, vyznačujúci tým, že obsahuje polynukleotidovú molekulu podlá akéhokoľvek z nárokov 25 až 44.

47. Rekombinantný vektor obsahujúci polynukleotidovú molekulu podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že ide o vektor pSE180 (ATCC 209605).

48. Hostiteľská bunka Streptomyces, vyznačujúca tým, že obsahuje rekombinantný vektor podľa nároku 46.

49. Spôsob na identifikáciu mutácií aveC ORF schopných meniť pomer produkovaných avermektínov triedy 2: triede 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

a) stanovenie pomeru avermektínov triedy 2: triede 1 produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis, v ktorých

113 bola prirodzená aveC alela inkativovaná a do ktorých bola vložená a v ktorých je exprimovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný AveC génový produkt;

b) stanovenie pomeru avermektinov triedy 2: triede 1 produkovaných bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis ako v kroku a), ktoré však exprimujú iba aveC alelu majúcu nukleotidovú sekvenciu homologickú k tejto sekvencii; a

c) porovnanie pomeru avermektinov triedy 2: triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku a) s pomerom avermektinov triedy 2: triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku b), kedy pokiaľ je pomer avermektinov triedy 2: triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku a) odlišný od pomeru avermektinov triedy 2: triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku b), tak bola identifikovaná mutácia aveC ORF schopná meniť pomer avermektinov triedy 2: triede 1.

50. Spôsob podľa nároku 49, vyznačujúci sa tým, že pomer avermektinov triedy 2: triede 1 je znížený v dôsledku mutácie.

51. Spôsob na identifikáciu mutácií aveC ORF alebo genetických konštruktov schopných meniť množstvo produkovaných avermektinov, vy z n a č u j ú c i sa tým, že obsahuje:

a) stanovenie avermektinov produkovaných bunkami kmeňa

S.avermitilis, v ktorých bola prirodzená aveC alela inaktivovaná a do ktorých bola vložená a v ktorých je

114 exprimovaná polynukleotidová molekula obsahujúca

b) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný

AveC génový produkt, alebo obsahujúci genetický konštrukt obsahujúci nukleotidovú sekvenciu génový produkt;

stanovenie množstva avermektinov kódujúcu AveC produkovaných bunkami rovnakého kmeňa

S.avermitilis ako v kroku a).

ktoré však exprimujú iba aveC alelu majúcu nukleotidovú sekvenciu ORF podía (SEQ

ID NO:1) alebo nukleotidovú sekvenciu homologickú k tejto sekvencii;

c) porovnanie množstva avermektinov produkovaných bunkami

S.avermitilis z kroku

a) s množstvom avermektinov produkovaných bunkami

S.avermitilis z kroku b), kedy pokiaľ je množstvo avermektinov triedy produkovaných bunkami S.avermitilis z kroku a) odlišné od množstva avermektinov produkovaných bunkami

S . avermitilis z kroku tak bola identifikovaná mutácia aveC ORF schopné meniť množstvo avermektinov.

52 . t v Spôsob podľa nároku 51, v y z n ý m, že množstvo produkovaných a č u j ú c i s a zvýšené avermektinov je dôsledku mutácie. 53 . Spôsob prípravy nových kmeňov S. avermitilis

obsahujúcich bunky, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu a produkujú pozmenený pomer avermektinov triedy 2: triede 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S.avermitilis, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu, vyznaču júci sa tým, že obsahuje transformáciu

115 buniek kmeňa S.avermitilis vektorom, ktorý obsahuje mutovanú aveC alelu kódujúcu génový produkt, ktorý mení pomer avermektinov triedy 2: triede 1 produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis, exprimujúcich mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimuj ú iba prirodzenú aveC alelu, a selekciu transformovaných buniek, ktoré produkujú avermektíny v pozmenenom pomere triedy 2:

triede 1 v porovnaní s pomerom avermektinov triedy 2:

triede 1 produkovaných bunkami kmeňa exprimujúceho iba prirodzenú alelu.

54. Spôsob podlá nároku 53, v y z m, že pomer avermektinov triedy 2:

triede je znížený v dôsledku mutácie.

55. Spôsob prípravy nových kmeňov

S.avermitilis obsahuj úcich bunky, ktoré produkujú pozmenené množstvá avermektinov, tým, že obsahuje transformáciu buniek kmeňa

S.avermitilis vektorom, ktorý obsahuje mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorého expresia vedie ku zmene množstva avermektinov produkovaných bunkami kmeňa S.avermitilis exprimujúcich mutovanú aveC alelu, alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú iba prirodzenú aveC alelu, a selekciu transformovaných buniek, ktoré produkujú avermektíny v pozmenenom množstve v porovnaní s množstvom avermektinov produkovaných bunkami kmeňa exprimujúceho iba prirodzenú alelu.

116

56. Spôsob podlá nároku 55, vyznačujúci tým, že množstvo produkovaných avermektínov je zvýšené v dôsledku mutácie.

57.Spôsob prípravy nových kmeňov S.avermitilis, ktorých bunky obsahujúce inaktivovanú aveC alelu, v y z n a č u júci sa tým, že obsahuje transformáciu buniek kmeňa S.avermitilis vektorom, ktorý inaktivuje aveC alelu, a selekciu transformovaných buniek, v ktorých bola aveC alela inaktivované.

58 . t Spôsob podlá nároku 57, vyznačujúci s a Ý že vektorom je pSE 180 (ATCC 209605). 59 . Kmeň S.avermitilis, vyznačujúci s a t ý m, že obsahuje bunky exprimujúce mutovanú aveC alelu,

čo spôsobuje produkciu avermektínov týmito bunkami v pozmenenom pomere triedy 2:triede 1 v porovnaní s bunkami exprimujúcimi iba prirodzenú aveC alelu.

60 . Kmeň podlá nároku 59, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že pomer avermektínov triedy 2 : triede 1 je znížený v dôsledku mutácie. 61 . Kmeň podlá nároku 60, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že bunky produkujúce cyklohexyl B2 : cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom než 1,6:1. 62 . Kmeň podlá nároku 61, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že bunky produkujúce cyklohexyl B2 : cyklohexyl BI

avermektíny v pomere menšom než 0,94:1.

117

63. Kmeň podľa nároku 61, vyznačujúci s a tým, že bunky produkujúce cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektiny v pomere menšom než 0,88:1.

64. Kmeň podľa nároku 61, vyznačujúci tým, že bunky produkujúce cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektiny v pomere menšom než 0,84:1.

.

Kmeň S . avermitilis , vyznačujúci tým, že obsahuje bunky exprimujúce mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt, čo spôsobuje produkciu avermektínov týmito v porovnaní s bunkami bunkami vo exprimujúcimi vyššom iba prirodzenú množstve aveC alelu

66. Kmeň S.avermitilis, m, že obsahuje v y z n bunky, v ktorých bol aveC gén inaktivovaný.

67. Spôsob výroby sa t ý m, že v y obsahuje kultiváciu avermektínov, buniek čujú

S.avermitilis, kde tieto bunky génový produkt, 2:triede exprimujú mutovanú ktorý mení pomer produkovaných aveC bunkami alelu kódujúcu avermektínov triedy S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa neexprimujúcimi mutovanú alelu a exprimujúcimi iba prirodzenú aveC alelu, v kultivačnom médiu pri podmienkach umožňujúcich alebo indukujúcich

118 produkciu avermektínov týmito bunkami a získanie uvedených avermektínov z kultúry.

68. Spôsob podlá nároku 67, vyznačujúci sa tým, že pomer avermektínov triedy 2:triede 1 je znížený v dôsledku mutácie.

69. Spôsob výroby avermektínov, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje kultiváciu buniek kmeňa

S.avermitilis, kde tieto bunky exprimujú mutovanú aveC alelu genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorý mení množstvo avermektínov produkovaných bunakmi S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa neexprimujúcimi mutovanú alelu či genetický konštrukt a exprimujúcimi iba prirodzenú aveC alelu, v kultivačnom médiu pri podmienkach umožňujúcich alebo indukujúcich produkciu avermektínov týmito bunkami a získanie uvedených avermektínov z kultúry.

70. Spôsob podlá nároku 69, vyznačujúci sa t ý m, že množstvo produkovaných avermektínov je zvýšené v dôsledku expresie mutovanej aveC alely alebo genetického konštruktu.

71. Prípravky obsahujúce avermektíny produkované bunkami kmeňa S.avermiti1is, kde tieto bunky exprimujú mutovanú aveC alelu kódujúcugénový produkt, ktorý znižuje pomer avermektínov triedy 2:triede 1 produkovaných bunkami S.avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa neexprimujúcimi

119 mutovanú alelu a exprimujúcimi iba prirodzenú aveC kde avermektíny sú produkované v zníženom pomere 2:triede 1 v porovnaní s pomerom avermektinov 2:triede 1 produkovaným bunkami rovnakého S.avermitilis neexprimujúcimi mutovanú aveC a exprimujúcimi iba prirodzenú avec alelu.

alelu, triedy triedy kmeňa alelu

120

4. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homologická ku kódujúcej sekvencií na AveC génový produkt S.avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo k nukleotidovej sekvencií aveC ORF podlá obr. 1 (SEQ ID NO:1), alebo jej významnej časti .

5. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homologická k aminokyselinovéj sekvencií kódovanej sekvenciou kódujúcou AveC génový produkt S.avermitilis z plazmidu

104 pSE186 (ATCC 209604), alebo k aminokyselinovej sekvencii podía obr. 1 (SEQ ID NO:2), alebo jej významnej časti.

6. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO:3, alebo jej významnú časť, alebo nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homologická k nukleotidovej sekvencii SEQ ID NO:3.

7. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid, ktorý je homologický k aminokyselinovej sekvencii SEQ ID NO:4.

8. Oligonukleotidová molekula, ktorá hybridizuje na polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo SEQ ID NO:3, alebo na polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k nukleotidovej sekvencii podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1) alebo SEQ ID NO:3, pri podmienkach vysokej prísnosti.

9. Oligonukleotidová molekula podľa nároku 8, ktorá je komplementárna k nukleotidovej sekvencii podľa obr.

(SEQ

ID

NO: 1) alebo

SEQ

ID

NO: 3, alebo polynukleotidovej molekule majúcej nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k nukleotidovej sekvencii podľa obr.

(SEQ ID NO:1) alebo

SEQ ID NO:3.

10. Re kombinantný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny skladajúcej sa z:

105

a) nukleotidovej sekvencie, ktorá je rovnaká ako kódujúca sekvencia na AveC génový produkt

S.avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá je rovnaká ako nukleotidová sekvencia aveC ORF podlá obr. 1 (SEQ ID NO:1), alebo jej významná časť;

b) nukleotidová sekvencia, ktorá je homologická ku kódujúcej sekvencií na AveC génový produkt S.avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo k nukleotidovej sekvencií aveC ORF podľa obr. 1 (SEQ ID NO:1), alebo jej významnej časti; a

c) nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homologická k aminokyselinovej sekvencií kódovanej kódujúcou sekvenciou na AveC génový produkt S.avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo k aminokyselinovej sekvencií podľa obr. 1 (SEQ ID NO:2), alebo jej významnej časti.

11. Rekombinantný vektor podľa nároku 10, vyznačujú c i sa t ý m, že ďalej obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu jeden alebo viac regulačných elementov, kde táto nukleotidová sekvencia kódujúca regulačné elementy je v operatívnej väzbe s nukleotidovou sekvenciou podľa nároku 10.

12. Rekombinantný vektor podľa nároku 11, vyznačujú c i sa t ý m, že obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu selektovateľný marker.

106

13. Rekombinantný vektor podlá nároku 12, vyznačujú c i sa t ý m, že sa jedná o plazmid pSE186 (ATCC 209604) .

14. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že obsahuje rekombinantný vektor podľa nároku 12.

15. Hostiteľská bunka podľa nároku 14, vyznačujú c a sa t ý m, že ňou je Streptomyces avermiti lis.

16. Rekombinantný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny skladajúcej sa z nukleotidovej sekvencie SEQ ID NO:3 alebo jej významnej časti; nukleotidovej sekvencie, ktorá je homologická k nukleotidovej sekvencií SEQ ID NO:3, a nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje polypeptid, ktorý je homologický k aminokyselinovej sekvencií SEQ ID NO:4.

17. Rekombinantný vektor, vyznačujúci t ý m, že ďalej obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu jeden alebo viac regulačných elementov, kde táto nukleotidová sekvencia kódujúca regulačné elementy je v operatívnej väzbe s nukleotidovou sekvenciou podľa nároku 16.

Rekombinantný vektor, tým, že ďalej obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu selektovateľný marker.

107

19. Hostiteľská bunka, vyznačujúca tým, že obsahuje rekombinantný vektor podľa nároku 18.

20. Hostiteľská bunka podľa nároku 19, vyznačujú tým, že ňou je Streptomyces hygroscopicus.

21. Rekombinantne

S.avermitilis nukleotidovou exprimovaný majúci sekvenciou

AveC aminokyselinovú kódujúcou AveC génový sekvenciu produkt kódovanú génový produkt

S . avermitilis aminokyselinovú významné časti, z plazmidu sekvenciu pSE186 (ATCC podľa SEQ ID alebo polypeptid k nemu homologický.

209604) , alebo

NO : 2 , alebo jej

22. Rekombinantne

S.hygroscopicus sekvenciu SEQ exprimovaný génový produkt homologický k AveC majúci aminokyselinovú NO:4, alebo

ID polypeptid k nemu homologický.

23. Spôsob prípravy rekombinantného aveC v y z n a č u génového produktu, t ý m, že obsahuje kultiváciu hostiteľskej bunky rekombinantným rekombinantný expresným expresný vektor vektorom, obsahuj e transformovanej kde uvedený polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu kódovanú kódujúcou sekvenciou na AveC génový produkt S.avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo kódujúcou aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID N0:2 alebo jej významnú časť, kde táto polynukleotidová molekula je v operatívnej väzbe s jedným alebo viac regulačnými elementmi, ktoré kontrolujú

108 expresiu polynukleotidovej molekuly v hostiteľskej bunke, kde táto kultivácia je realizovaná pri podmienkach umožňujúcich produkciu rekombinantného AveC génového produktu a získanie AveC génového produktu z bunečnej kultúry.

6/7