MXPA04007777A - Gen de streptomyces avertmitilis que rige la relacion de avermectinas b2:b1. - Google Patents

Gen de streptomyces avertmitilis que rige la relacion de avermectinas b2:b1.

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Abstract

La presente invencion se refiere a moleculas de polinucleatidos que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un producto genico AveC, moleculas de polinucleotidos que pueden utilizarse para alterar la relacion o cantidad de avermectinas de la clase 2:1 producidas en cultivos de fermentacion de S. avermitilis; la presente invencion se refiere, ademas, a vectores, celulas huesped y cepas mutantes de S. avermitilis en las que el gen aveC ha sido inactivado o mutado con el fin de cambiar la relacion o cantidad de avermectinas de la clase 2:1 producidas.

Description

GEN DE STREPTOMYCES AVERMITILIS QUE RIGE LA RELACION DE AVERMECTINAS B2:B1 1. CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se dirige a composiciones y métodos para la producción eficaz de avermectinas tales como "doramectina", que se utilizan principalmente en el campo de la salud animal. Más particularmente, la presente invención se refiere a moléculas de polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico AveC, que se puede utilizar para modular la relación de avermectinas de la clase 2:1 producidas por cultivos de fermentación de Streptomyces avermitilis. La presente invención se refiere, además, a vectores, células huésped transformadas y a nuevas cepas mutantes de S. avermitilis, en las que el gen AveC ha sido mutado, con el fin de modular la relación de avermectinas de la clase 2:1 producidas. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCION 2.1 Avemectinas Las especies de Streptomyces producen una amplia diversidad de metabolitos secundarios, incluidas las avermectinas, que comprenden una serie de ocho lactonas macrocíclicas de dieciséis miembros relacionadas con una potente actividad antihelmíntica e insecticida. Los ocho compuestos distintos, pero estrechamente relacionados, se denominan A1a, A1 b, A2a, A2b, B1a, B1 b, B2a y B2b. La serie "a" de compuestos se refiere a la avermectina natural en la que el sustituyente en la posición C25 es (S)-sec-butilo y la serie "b" se refiere a los compuestos en los que el sustituyente en la posición C25 es isopropilo. Las designaciones "A" y "B" se refieren a avermectinas en las que el sustituyente en la posición C5 es metoxi e hidroxi, respectivamente. La cifra "1 " se refiere a avermectinas en las que un doble enlace está presente en la posición C22.23, y la cifra "2" se refiere a avermectinas con un hidrógeno en la posición C22 y un hidroxi en la posición C23. Entre las avermectinas relacionadas, se reconoce que el tipo B1 de avermectina tal como doramectina, tiene la actividad antiparasitaria y pesticida más eficaz y, por lo tanto, es la avermectina más deseable en el comercio. Las avermectinas y su producción por fermentación aerobia de cepas de S. avermitilis se describen en las patentes de Estados Unidos n°s 4,310,519 y 4,429,042. Se piensa que la biosíntesis de avermectinas naturales se inicia endógenamente a partir de los análogos de CoA-tioéster de ácido isobutirico y ácido S-(+)-metil-butírico. Una combinación de tanto la mejora de las cepas a través de mutagénesis aleatoria como el uso de ácidos grasos suministrados exógenamente ha conducido a la producción eficaz de análogos de avermectina. Mutantes de S. avermitilis que son deficientes en 2-oxo-ácido-deshidrogenasa de cadena ramificada (mutantes deficientes en bkd) sólo pueden producir avermectinas cuando las fermentaciones se suplementan con ácidos grasos. El rastreo, y el aislamiento de mutantes deficientes en la actividad de deshidrogenasa de cadena ramificada (por ejemplo S. avermitilis, ATCC 53567) se describen en la patente europea (EP) 276103. La fermentación de mutantes de este tipo en presencia de ácidos grasos suministrados exágenamente da como resultado la producción de únicamente las cuatro avermectinas correspondientes al ácido graso empleado. Así, el suplementar las fermentaciones de S. avermitilis (ATCC 53567) con ácido S-(+)-2-metilbutírico da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1 a, A2a, B1 a y B2a; el suplementar las fermentaciones con ácido ¡sobutírico da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1 b, A2b, B1 b y B2b; y el suplementar las fermentaciones con ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las cuatro nuevas ciclopentilavermectinas Al, A2, B1 y B2. Si se suplementan con otros ácidos grasos, se producen nuevas avermectinas. Mediante el rastreo de más de 800 precursores potenciales, se han identificado más de otras 60 nuevas avermectinas. (Véase, por ejemplo, Dutton et al., 1991 , J. Antibiot. 44:357-365; y Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Además, mutantes de S. avermitilis deficientes en la actividad de 5-O-metiltransferasa producen esencialmente sólo las avermectinas análogas a B. Por consiguiente, mutantes de S. avermitilis que carecen de actividad tanto de 2-oxo-ácido-deshidrogenasa de cadena ramificada como de 5-O-metiltransferasa producen solamente las avermectinas B correspondientes al ácido grasó empleado para suplementar la fermentación. Así, el suplementar mutantes dobles de este tipo con ácido S-(+)-2-metil-butírico da como resultado la producción de solamente las avermectinas naturales B1 a y B2a, mientras que la suplementacion con ácido isobutirico o ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las avermectinas naturas B1 b y B2b o las nuevas avermectinas ciclopentilo B1 y B2, respectivamente. La suplementacion de la cepa doble mutante con ácido ciclohexanocarboxilico es un método preferido para producir la nueva avermectina comercialmente importante, ciclohexilavermectina B1 (doramectina). El aislamiento y características de mutantes dobles de este tipo, por ejemplo S. avermitilis (ATCC 53692), se describe en el documento EP 276103. 2.2 Genes implicados en la biosintesis de avermectina En muchos casos, los genes implicados en la producción de metabolitos secundarios y los genes que codifican un antibiótico particular se encuentran formando racimos entre sí sobre el cromosoma. Tal es el caso con el racimo de genes de poliquétido sintasa (PKS) de Streptomyces (véase Hopwood y Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Así, una estrategia para clonar genes en una vía de biosintesis ha sido aislar un gen de resistencia a fármacos y luego someter a ensayo regiones adyacentes del cromosoma para otros genes relacionados con la biosintesis de ese antibiótico particular. Otra estrategia para clonar genes implicados en la biosíntesis de metabolitos importantes ha sido la complementación de mutantes. Por ejemplo, porciones de una genoteca de ADN procedente de un organismo capaz de producir un metabolito particular se introducen en un muíante no productor y los transformantes se rastrean en cuanto a la producción del metabolito. Adicionalmente, la hibridación de una genoteca utilizando sondas derivadas de otras especies de Streptomyces ha sido utilizada para identificar y clonar genes en vías de biosíntesis. Genes implicados en la biosíntesis de avermectina (genes ave), tales como los genes requeridos para la biosíntesis de otros metabolitos secundarios de Streptomyces (por ejemplo PKS) , se encuentran formando racimos sobre el cromosoma. Un cierto número de genes ave ha sido clonado con éxito utilizando vectores para complementar mutantes de S. avermitilís bloqueados en la biosíntesis de avermectina. La clonación de genes de este tipo se describe en la patente de EE.UU. no 5,252,474. Además, Ikeda et al., 1995, J. Antibiot. 48:532-534, describe la localización de una región cromosómica que implica la etapa de deshidratacíón C22,23 (aveC) a un fragmento BamHI de 4.82 Kb de S. avermitilis, así como mutaciones en el gen aveC que dan como resultado la producción de un único productor de componente B2a. Dado que la ivermectina, un potente compuesto antihelmíntico, puede producirse químicamente a partir de avermectina B2a, un sencillo componente productor de este tipo de avermectina B2a se considera particularmente útil para la producción comercial de ivermectina.
La patente de EE.UU. no 6,248,579 expedida a Stutzman-Engwall et al., expedida el 19 de junio de 2001 , describe ciertas mutaciones en el gen aveC de Streptomyces avermitilis que conducen a una reducción en la relación de ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 de aproximadamente 0.75:1. La publicación PCT WO 01/12821 de Pfizer Products Inc., publicada el 22 de febrero de 2001 , describe determinadas mutaciones adicionales en el gen aveC de Spretomyces avermitilis que conducen a una reducción adicional en la relación de ciclohexilo B2:cíclohexilo B1 de hasta 0.40:1 La identificación de mutaciones o combinaciones de mutaciones adicionales en el gen aveC que minimizan adicionalmente la complejidad de la producción de avermectina tales como, por ejemplo, mutaciones que disminuyen adicionalmente a relación B2:B1 de avermectinas, simplificarían la producción y la purificación de avermectinas comercialmente importantes. 3. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona una molécula de polinucleátido que comprende una secuencia de nucleótidos que, por lo demás, es la misma que el alelo aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis o la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) aveC de S. avermitilis según se presenta en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una vanante degenerada de la misma, pero secuencia de nucleótidos que comprende, adicionalmente, mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en los residuos aminoácido correspondientes a las posiciones de aminoácidos de SEQ ID N°:2, de modo que células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis, en las que el alelo aveC de tipo salvaje ha sido inactivado y que expresan la molécula de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una relación de clase 2:1 de avermectinas que está reducida en comparación con la relación producida por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje, en donde, cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , la relación de avermectinas de clase 2:1 es 0.35:1 o menor. En una relación más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohex¡lo B1 es de aproximadamente 0.30:1 o menor. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.25:1 o menor. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L, (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179G; (j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (I) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231 L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G1 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F243S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, P289L; (at) D48E, A61 T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb)D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. La presente invención proporciona, además, una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que, por lo demás, es la misma que el alelo aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis o la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC de S. avermitilis según se presenta en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una variante degenerada de la misma, pero secuencia de nucleótidos que comprende, adicionalmente, mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en los residuos aminoácido correspondientes a las posiciones de aminoácidos de SEQ ID N°:2, de modo que células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis, en las que el alelo aveC de tipo salvaje ha sido inactivado y que expresan una molécula de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una relación de clase 2:1 de avermectinas que está reducida en comparación con la relación producida por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que en su lugar expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje, en donde, cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , la relación de avermectinas de clase 2:1 se reduce a aproximadamente 0.40:1 o menor, y en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D, y (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D. La presente invención proporciona, además, un vector recombinante que comprende una molécula de polinucleótido de la presente invención. La presente invención proporciona, además, una célula huésped que comprende una molécula de polinucleótido o un vector recombinante de la presente invención. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces. En una realización mas preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces avermitilis. La presente invención proporciona, además, un método para preparar una nueva cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (i¡) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos se selecciona de (a) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, un método para preparar una nueva cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (i¡) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde células que comprenden el alelo aveC mutado o una variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.35:1 o menor. En una realización no limitante de la misma, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es aproximadamente 0.30:1 o menor. En una realización no limitante, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (f) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es aproximadamente 0.25:1 o menor. En una realización no limitante, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (w) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización no limitante, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (ao) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, un método para preparar una nueva cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos se selecciona del grupo consistente en (bf) y (bg) listadas anteriormente. En una realización preferida, células de S. avermitilis que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada de este tipo son capaces de producir avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.40:1 o menor. La presente invención proporciona, además, una célula de una especie de Streptomyces que comprende un alelo aveC de S. avermitilis mutado o una variante degenerada del mismo qüe codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas de (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida, la especie de Streptomyces es S. avermitilis. La presente invención proporciona, además, una célula de Streptomyces avermitiles capaz de producir avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en" una relación de 0.35:1 o menor. En una realización no limitante de la misma, la célula comprende un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.30:1 o menor. En una realización no limitante, las células comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (f) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:c¡clohexilo B1 es de aproximadamente 0.25:1 o menor. En una realización no limitante, las células comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (w) a (be) listadas anteriormente.
En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización no limitante, las células comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (ao) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, una célula de una especie de Streptomyces que comprende un alelo aveC de S. avermitilis mutado, o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, seleccionadas del grupo consistente en (bf) y (bg) listadas anteriormente. En una realización preferida, la especie de Streptomyces es S. avermitilis. En una realización más preferida, la célula es una célula de S. avermitilis capaz de producir avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.40:1 o menor. La presente invención proporciona, además, un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar una cepa de células de Streptomyces avermitilis de la presente invención en medios de cultivo bajo condiciones que permitan o induzcan la producción de avermectinas a partir de ellos, y recuperar dichas avermectinas del cultivo. La presente invención proporciona, además, una composición de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 producidas por células de Streptomyces avermitilis, que comprende las avermectinas ciclohexilo B2:c¡clohexilo B1 presentes en un medio de cultivo en el que las células han sido cultivadas, en donde la relación de las avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 presentes en el medio de cultivo es de 0.35:1 o menor, de preferencia aproximadamente 0,30:1 o menor, de modo más preferible, aproximadamente 0.25:1 o menor y, más preferiblemente de aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización particular, la composición de avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 se produce por células de una cepa de S. avermitilis que expresa un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico que da como resultado la reducción de la relación de la clase 2:1 de avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 producidas por las células en comparación con células de la misma cepa de S. avermitilis que no expresan el alelo aveC mutado, sino que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje. En una realización preferida, en los casos en los que la composición sea avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0,35:1 o menor, la composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicionalmente, en los casos en los que la composición sea avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.30:1 o menor, lá composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (f) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicionalmente, en los casos en los que la composición sea avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.25:1 o menor, la composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (w) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicionalmente, en los casos en los que la composición sea avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.20:1 o menor, la composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (ao) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, una composición de avermectinas ciclohexilo B2: ciclohexilo B1 producidas por células de Streptomyces avermitilis, que comprende las avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 presentes en un medio de cultivo en el que las células han sido cultivadas, en donde la relación de las avermectinas ciclohexilo B2: ciclohexilo B1 presentes en el medio de cultivo es de aproximadamente 0.40: 1 o menor, y han sido producidas por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente en (bf) y (bg) listadas anteriormente. 4. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS FIGURA 1 . Secuencia de ADN (SEQ ID N°:1 ) que comprende el ORF de aveC de S. avermitilis, y secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID N°:2) . FIGURA 2. Vector de plásmido pSE186 (ATCC 209604) que comprende el ORF entero del gen aveC de S. avermitilis. FIGURA 3. Vector de reemplazamiento del gen pSE180 (ATCC 209605) que comprende el gen ermE de Sacc. erythraea insertado en el ORF de aveC de S. avermitilis. FIGURA 4. Mapa de restricción BamHI del racimo de genes de poliquétido sintasa de avermectina procedente de S. avermitilis con cinco clones de cósmidos solapantes identificados (es decir pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) . También se indica la relación de pSE1 18 y pSE1 19. FIGURAS 5A-5D. Análisis por HPLC de productos de fermentación producidos por cepas de S. avermitilis. La cuantificacion pico se realizó comparando cantidades convencionales de ciciohexilo B1. El tiempo de retención de ciciohexilo B2 era 7.4-7.7 min; el tiempo de retención de ciciohexilo B1 era 1 1.9-12.3 min. FIG. 5A. La cepa SE180-1 1 de S. avermitilis con un ORF de aveC inactivado. FIG. 5B. La cepa SE180-1 1 de S. avermitilis transformada con pSE186 (ATCC 209604). FIG. 5C. La cepa SE 180-1 1 de S. avermitilis transformada con pSE187. FIG. 5D. La cepa SE180-1 1 de S. avermitilis transformada con pSE188. 5. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la identificación y caracterización de moléculas de polinucleótidos con secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico AveC procedente de Streptomyces avermitilis, la construcción de nuevas cepas de S. avermitilis que pueden utilizarse para rastrear productos génicos AveC mutados en cuanto a su efecto sobre la producción de avermectinas, y el descubrimiento de que determinados productos génicos AveC mutados pueden reducir la relación de avermectinas B2:B1 producidas por S. avermitilis. A título de ejemplo, la invención se describe en las secciones que figuran a continuación para una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis o la secuencia de nucleótidos del ORF de la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) y para moléculas de polinucleótidos con secuencias de nucleótidos mutadas derivadas a partir de las mismas y variantes degeneradas de las mismas. Sin embargo, los principios recogidos en la presente invención se pueden aplicar análogamente a otras moléculas de polinucleótidos, incluidos genes homólogos a aveC procedentes de otras especies de Streptomyces incluidas, por ejemplo, S. hygroscopicus y S. griseochromogenes, entre otras. 5.1. Moléculas de polinucleótidos que codifican el producto qénico AveC de S. avermitilis La presente invención proporciona una molécula de polinucleátido aislada que comprende el ORF de aveC completo de S. avermitilis o una porción sustancial del mismo, molécula de polinucleótido aislada que carece del ORF completo siguiente que está situado más abajo del ORF de aveC in situ en el cromosoma de S. avermitilis. La molécula de polinucleótido aislada de la presente invención comprende, preferiblemente, una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis, o que es la misma que la secuencia de nucleótido del ORF de la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una porción sustancial de la misma. Tal como se utiliza en esta memoria, una "porción sustancial" de una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico AveC de S. avermitilis significa una molécula de polinucleótido aislada que comprende al menos aproximadamente el 70% de la secuencia del ORF de aveC completo mostrada en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) y que codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente. A este respecto, un producto génico AveC "funcionalmente equivalente" se define como un producto génico que, cuando se expresa en la cepa ATCC 53692 de S. avermitilís en la que el alelo aveC nativo ha sido inactivado, da como resultado la producción de esencialmente la misma relación y cantidad de avermectinas según son producidas por la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis la cual, en su lugar, expresa únicamente el alelo aveC funcional de tipo salvaje, nativo para la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis. Además de la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC, la molécula de polinucleótido aislada de la presente invención puede comprender, además, secuencias de nucleótidos que flanquean de modo natural el gen aveC in situ en S. avermitilis, tales como las secuencias de nucleótidos flanqueantes mostradas en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ). La presente invención proporciona, además, una molécula de polinucleótido aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°:1 o una variante degenerada de la misma, según se basa en la degeneración conocida del código genético . Tal como se utiliza en esta memoria, las expresiones "molécula de polinucleótido", "secuencia de polinucleótido", "secuencia codificadora", "marco de lectura abierto" y "ORF", pretenden referirse tanto a moléculas de ADN como de ARN que pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena, y que pueden transcribirse y traducirse (ADN) o traducirse (ARN) en un producto génico aveC o en un polipéptido que es homólogo a un producto génico aveC en un sistema de expresión de célula huésped apropiado cuando se colocan bajo el control de elementos reguladores apropiados. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a secuencias procarióticas, secuencias de ADNc, secuencias de ADN genómíco y secuencias de ADN y ARN químicamente sintetizadas. La secuencia de nucleótidos mostrada en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) comprende cuatro codones = diferentes en las posiciones de pb 42, 174, 177 y 180. Tal como se describe previamente en la patente de EE.UU. n° 6,248,579, se construyeron deleciones múltiples de la región 51 del ORF de aveC (FIGURA 1 ; SEQ ID N°:1 ) para ayudar a definir cuales de estos codones podría actuar en el ORF de aveC como sitios de partida para la expresión de proteínas. La deleción del primer sitio GTG en el pb 42 no eliminó la actividad de AveC. La deleción adicional de la totalidad de los codones GTG, en las posiciones de pb 174, 177 y 180 juntas eliminó la actividad de AveC, indicando que esta región es necesaria para la expresión de proteínas. Así, la presente invención abarca ORFs de aveC de longitud variable. La presente invención proporciona, además, una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitílis, o la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una porción sustancial de la misma. El término "homólogo", cuando se utiliza para aludir a una molécula de polinucleótido que es homologa a una secuencia codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis significa una molécula de polinucleótido con una secuencia de nucleótidos. (a) que codifica el mismo producto génico AveC que la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis, o que codifica el mismo producto génico AveC que la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEQ ID N°: 1 ) , pero que incluye uno o más cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético (es decir, una variante degenerada), o (b) que se híbrida al complemento de una molécula de polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC, o que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2) bajo condiciones moderadamente rigurosas, es decir hibridación al ADN unido a filtro en NaHP0 0.5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,2xSSC/SDS al 0,1 % a 42°C (véase Ausubel et al. (compiladores), 1989, Current Protocols in Molecular Bioloqy, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en la pág. 2.10.3) y que codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente según se define anteriormente. En una realización preferida, la molécula de polinucleátido homologa se híbrida al complemento de la secuencia de nucleótidos del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC o al complemento de la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una porción sustancial de la misma en condiciones altamente rigurosas, es decir hibridación a ADN unido al filtro en NaHP0 0.5 M. SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C y lavado en O.l xSSCISDS al 0.1 % a 68°C (Ausubel et al., 1989, anterior) y codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente según se define anteriormente. La actividad de un producto génico AveC y potenciales equivalentes funcionales del mismo se pueden determinar mediante análisis por HPLC de productos de fermentación, según se describe en los ejemplos que figuran más abajo. Moléculas de polinucleótidos con secuencias de nucleótidos que codifican equivalentes funcionales del producto génico AveC de S. avermitilis pueden incluir genes aveC que se producen en la naturaleza, presentes en otras cepas de S. avermitilis, genes homólogos a aveC presentes en otras especies de Streptomyces y alelos aveC mutados, ya se presenten en la naturaleza o estén tratados por ingeniería. La presente invención proporciona, además, una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es homologa a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC, o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2) o una porción sustancial de la misma. Tal como se utiliza en esta memoria, una "porción sustancial" de la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2) significa un polipéptido que comprende al menos aproximadamente 70% de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2j y que constituye un producto génico AveC funcionalmente equivalente, según se define antes. Tal como se utiliza en esta memoria para referirse a secuencias de aminoácidos que son homologas a la secuencia de aminoácidos de un producto génico AveC procedente de S. avermitilis, el término "homólogo,, se refiere a un polipéptido que, por lo demás, tiene la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2), pero en el que uno o más residuos de aminoácidos han sido sustituidos de forma conservativa con un diferente residuo aminoácido, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente, de' al menos aproximadamente 80% y, lo más preferiblemente, de al menos aproximadamente 90% con el polipéptido codificado por la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC, o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2) según se determina por cualquier algoritmo convencional de identidad de secuencia de aminoácidos, tal como el algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI), y en donde dicha sustitución conservativa resulta en un producto génico funcionalmente equivalente según se define antes. Sustituciones conservativas de aminoácidos son bien conocidas en la técnica. Reglas para efectuar sustituciones de este tipo incluyen las descritas por Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., vol. 5, Sup. 3, entre otros. Más específicamente, sustituciones conservativas de aminoácidos son las que tienen lugar, generalmente, dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en su acidez o polaridad. Aminoácidos genéticamente codificados se dividen generalmente en cuatro grupos: (1 ) de carácter ácido = aspartato, glutamato; (2) de carácter básico = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina también se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Uno o más reemplazamientos dentro de cualquier grupo particular, por ejemplo de una leucina con una isoleucina o valina, o de un aspartato con un glutamato o de una treonina con una serina, o de cualquier otro residuo aminoácido con un residuo aminoácido estructuralmente relacionado, por ejemplo un residuo aminoácido con acidez o polaridad similar, o con similitud en alguna combinación de la misma, tendrán generalmente un efecto insignificante sobre la función del polipéptido. La producción y manipulación de las moléculas de polinucleótido descritas en esta memoria se encuentran dentro de la experiencia en la técnica y pueden llevarse a cabo de acuerdo con técnicas recombinantes descritas, por ejemplo, en Maniatis et al., 1989, Molecular Cloninq. A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols in Molecular Bioloqy , Greene Publishing Associates & wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2 a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (compiladores) , 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; y Erlich (compilador), 1992, PCR Technolo , Oxford'University Press, Nueva York, todas las cuales se incorporan en esta memoria como referencia. Clones de polinucleótidos que codifican productos génicos AveC o productos génicos homólogos a AveC pueden identificarse utilizando cualquier método conocido en la técnica, que incluye pero no se limita a métodos recogidos en la Sección 7 que figura más abajo. Las genotecas de ADN genómico pueden ser rastreadas en cuanto a la presencia de secuencias codificadoras de aveC y homologas a aveC utilizando técnicas tales como los métodos recogidos en Benton y Davis, 1977, Science 196-180, para genotecas de bacteriófagos, y en Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 72:3961 -3965, para genotecas de plásmidos. En estos experimentos de rastreo se pueden utilizar como sondas moléculas de polinucleótidos con secuencias de nucleótidos que se sabe inducen el ORF de aveC según se presenta, por ejemplo, en el plásmido pSE186 (ATCC 209604) o en el plásmido pSE 19 (descrito en la Sección 7 que figura más abajo) . Alternativamente, se pueden sintetizar sondas de oligonucleótidos que corresponden a secuencias de nucleótidos deducidas de secuencias de aminoácidos parciales o completas del producto génico homólogo a AveC purificado. 5.2. Sistemas recombinantes 5.2.1. Vectores de clonación y expresión La presente invención proporciona, además, vectores de clonación y vectores de expresión recombinantes que son útiles para clonar o expresar moléculas de polinucleótidos de la presente invención que comprenden, por ejemplo, el ORF de aveC de S. avermitilis o cualesquiera ORFs homólogos a aveC. En una realización no limitante, la presente invención proporciona el plásmido pSE186 (ATCC 209604) que comprende el ORF completo del gen aveC de S. avermitilis. Toda la descripción que sigue en relación con el ORF de aveC procedente de S. avermitilis, o una molécula de polinucleótido que comprende el ORF de aveC de S. avermitilis o una porción del mismo, o un producto génico AveC de S. avermitilis, también se refiere a alelos aveC mutados según se describe más abajo, a menos que se indique explícitamente o por el contexto. Se han desarrollado una diversidad de diferentes vectores para el uso específico en Streptomyces, incluido el fago, plásmidos con un elevado número de copias, plásmidos con un bajo número de copias y vectores lanzadera de E. coli-Streptomyces, entre otros, y cualesquiera de estos puede utilizarse para poner en práctica la presente invención. También se ha clonado a partir de Streptomyces un cierto número de genes de resistencia a fármacos, y varios de estos genes han sido incorporados en vectores en calidad de marcadores seleccionables. Ejemplos de vectores actuales para uso en Streptomyces se presentan, entre otros lugares, en Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190. Vectores recombinantes de la presente invención, en particular vectores de expresión, se construyen preferiblemente de modo que la secuencia codificadora de la molécula de polinucleótido de la invención esté en asociación operativa con uno o más elementos reguladores, necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora para producir un polipéptido. Tal como sé utiliza en esta memoria, la expresión "elemento regulador" incluye, pero no se limita a secuencias de nucleótidos que codifican promotores, reforzadores, operadores y otros elementos conocidos en la técnica, inducibles y no inducibles, que sirven para impulsar y/o regular la expresión de secuencias codificadoras de polinucleótidos. También, tal como se utiliza en esta memoria, la secuencia codificadora está en "asociación operativa" con uno o más elementos reguladores, en que los elementos reguladores regulan eficazmente y permiten la transcripción de la secuencia codificadora o la traducción de su ARNm, o ambas cosas. Vectores de plásmidos típicos que pueden tratarse por ingeniería para que contengan una molécula de polinucleótido de la presente invención incluyen pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) y el vector lanzadera pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171 :5872-5881 ), entre muchos otros.
Son bien conocidos en la técnica métodos para construir vectores recombinantes que contienen secuencias codificadoras particulares en asociación operativa con elementos reguladores apropiados, y éstos se pueden utilizar para poner en práctica la presente invención. Estos métodos incluyen técnicas recombinantes in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1989, véase antes; Ausubel et al., 1989, véase antes; Sambrook et al., 1989, véase antes; Innis et al., 1995, véase antes; y Erlich, 1992, véase antes. Los elementos reguladores de estos vectores pueden variar en su resistencia y especificidades. Dependiendo del sistema de huésped/vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de un cierto número de elementos de transcripción y traducción adecuados. Ejemplos no limitantes de regiones o promotores reguladores de la transcripción para bacterias incluyen el promotor ß-gal, el promotor T7, el promotor TAC, los promotores A, de la izquierda y de la derecha, promotores trp y lac, promotores de fusión trp-lac y, más específicamente para Streptomyces, los promotores ermE, melC y tipA, etc. En una realización específica, se puede generar un vector de expresión que contenga el O F de aveC o un ORF mutado del mismo, clonado junto a un promotor constitutivo fuerte tal como el promotor ermE procedente de Saccharopolyspora erythraea. Según se describe en la patente de EE.UU. No 6,248,579, un vector que comprende el promotor ermE se transformó en S. avermitilis, y el subsiguiente análisis por HPLC de los productos de fermentación indicó un título incrementado de avermectinas producidas en comparación con la producción por parte de la r isma cepa que, en su lugar, expresa únicamente el alelo aveC de tipo salvaje. Para expresar una proteína de fusión del producto génico AveC pueden utilizarse vectores de expresión de proteínas de fusión. La proteína de fusión purificada puede utilizarse para desarrollar antisueros contra el producto génico AveC, para estudiar las propiedades bioquímicas del producto génico AveC, para tratar por ingeniería proteínas de fusión AveC con diferentes actividades bioquímicas o para ayudar a la identificación o purificación del producto génico AveC expresado. Posibles vectores de expresión de proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a vectores que incorporan secuencias que codifican fusiones de Pgalactosidasa y trpE, fusiones de mal tosa -proteína de unión, fusiones de glutation-S-transferasa y fusiones de polihistidina (regiones vehículo). En una realización alternativa, un producto génico AveC o una porción del mismo se puede fusionar a un producto génico homólogo a AveC o una porción del mismo, derivado de otras especies o cepas de Streptomyces tales como, por ejemplo, S. hygroscopicus o S. griseochromogenes. Vectores híbridos de este tipo se pueden transformar en células de S. avermectilis y someter a ensayo para determinar su efecto, por ejemplo sobre la relación de la avermectina de la clase 2:1 producida. Proteínas de fusión de AveC se pueden tratar por ingeniería de modo que comprendan una región útil para la purificación, por ejemplo, fusiones de AveC-maltosa-proteína de unión pueden purificarse utilizando resina de amilosa; proteínas de fusión de AveC-glutation-S-transferasa se pueden purificar utilizando perlas de glutation-agarosa; y fusiones de AveC-polihistidina se pueden purificar utilizando una resina de níquel divalente. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos contra una proteína, vehículo o péptido para la purificación por cromatografía por afinidad de la proteína de fusión. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos codificadora del epítopo diana de un anticuerpo monoclonal se puede tratar por ingeniería en el vector de expresión en asociación operativa con los elementos reguladores y situar de modo que el epítopo expresado se fusione al polipéptido AveC. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la marca del epítopo FLAG® (International Biotechnologies Inc.), que es un péptido marcador hidrófilo, se puede insertar por técnicas convencionales en el vector de expresión en un punto que corresponde, por ejemplo, al extremo carboxilo del polipéptido AveC. El producto de fusión polipéptido AveC-epítopo FLAG® puede luego detectarse y purificarse por afinidad utilizando anticuerpos anti-FLAG® comercialmente disponibles. El vector de expresión que codifica la proteína de fusión AveC también puede tratarse por ingeniería para que contenga secuencias de polienlazador que codifiquen sitios de escisión de proteasas específicos, de modo que el polipéptido AveC expresado pueda liberarse de la región del vehículo o del participante en la fusión mediante tratamiento con una proteasa específica. Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir secuencias de ADN que codifiquen sitios de escisión de trombina o factor Xa, entre otros.
Una secuencia señal situada más arriba, y en el marco de lectura con el ORF de aveC, puede ser incorporada por ingeniería en el vector de expresión por métodos conocidos para dirigir el tráfico y la secreción del producto génico expresado. Ejemplos no limitantes de secuencias señal incluyen las de factor a, inmunoglobulinas, proteínas de la membrana exterior, penicilinaza, y receptores de células T, entre otras. Para ayudar a la selección de células huésped transformadas o transfectadas con vectores de clonación o expresión de la presente invención, el vector se puede tratar por ingeniería para que comprenda adicionalmente una secuencia codificadora de un producto génico informador u otro marcador seleccionare. Una secuencia codificadora de este tipo está preferiblemente en asociación operativa con las secuencias codificadoras del elemento regulador, según se describe antes. Genes informadores que son útiles en la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen los que codifican la proteína fluorescente verde, luciferaza, xylE y tirosinasa, entre otras. Secuencias de nucleótidos que codifican marcadores seleccionares son bien conocidas en la técnica e incluyen las que codifican productos génicos que confieren resistencia a antibióticos o anti-metabolitos, o que suministran un requisito auxotrófico. Ejemplos de secuencias de este tipo incluyen las que codifican resistencia a eritromicina, tioestreptona o canamicina, entre muchas otras. 5.2.2. Transformación de células hüésped La presente invención proporciona, además, células huésped transformadas que comprenden una molécula de polinucleótido o un vector recombinante de la invención y nuevas cepas o lineas de células derivadas de las mismas. Células huésped útiles en la práctica de la invención son, preferiblemente, células de Streptomyces, a pesar de que también se pueden utilizar otras células procarióticas o células eucarióticas. Células huésped transformadas de este tipo incluyen, típicamente, pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de ADN de bacteriófagos recombinantes, ADN de plásmido o ADN de cósmido, o levaduras transformadas con vectores recombinantes, entre otros. Las moléculas de polinucleótidos de la presente invención pretenden actuar en células de Streptomyces, pero también se pueden transformar en otras células bacterianas eucarióticas, por ejemplo para fines de clonación o de expresión. Típicamente, se puede utilizar una cepa de E. colital como, por ejemplo, la cepa DH5a, disponible de American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, MD, EE.UU. (n° de acceso 31343) y de fuentes comerciales (Stratagene). Células huésped eucarióticas preferidas incluyen células de levadura, a pesar de que también se pueden utilizar eficazmente células de mamíferos o células de insectos. Preferiblemente, el vector de expresión recombinante de la invención se introduce, por ejemplo se transforma o transfecta, en una o más células huésped de un cultivo sustancialmente homogéneo de células. El vector de expresión se introduce generalménte en células huésped de acuerdo con técnicas conocidas tales como, por ejemplo, mediante transformación de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con cloruro de calcio, microinyección, electroporación, transfeccion por contacto con un virus recombinado, transfeccion mediada por liposomas, transfeccion de DEAE-dextrano, transducción, conjugación o bombardeo con microproyectiles. La selección de transformantes se puede efectuar por procesos convencionales tales como seleccionando células que expresan un marcador seleccionare, por ejemplo resistencia a antibióticos, asociado con el vector recombinante, según se describe anteriormente. Una vez que el vector de expresión se ha introducido en la célula huésped, la integración y el mantenimiento de la secuencia codificadora de aveC, ya sea en el cromosoma de la célula huésped o episomalmente se puede confirmar por técnicas convencionales, por ejemplo por análisis de hibridación Southern, análisis de enzimas de restricción, análisis por PCR, incluida PCR de transcriptaza inversa (rt-PCR) o por análisis inmunológico para detectar el producto génico esperado. Células huésped que contienen y/o expresan la secuencia codificadora de aveC recombinante se pueden identificar por cualquiera de al menos cuatro enfoques generales que son bien conocidos en la técnica, que incluyen: (i) hibridación ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN antisentido; (ii) detectar la presencia de funciones de gen "marcador"; (iii) confirmar el nivel de transcripción según se mide por la expresión de transcripciones de ARNm específicas de aveC en la célula huésped; y (¡v) detectar la presencia de un producto de polipéptido maduro según se mide, por ejemplo, por inmunoensayo o por la presencia de la actividad biológica de AveC (por ejemplo la producción de relaciones y cantidades específicas de avermectinas indicativas de la actividad de aveC, por ejemplo en células huésped de S. avermitilis). 5.2.3. Expresión y caracterización de un producto qénico AveC recombinante Una vez que la secuencia codificadora de aveC nativa o mutada ha sido establemente introducida en una célula huésped apropiada, la célula huésped transformada se propaga clonalmente, y las células resultantes se pueden desarrollar en condiciones que conduzcan a la producción máxima del producto génico AveC nativo o mutado. condiciones de este tipo incluyen, típicamente, el crecimiento de células hasta una elevada densidad. En los casos en los que el vector de expresión comprende un promotor inducible, para inducir la expresión se emplean, según sean necesarias, condiciones de inducción apropiadas tales como, por ejemplo, desplazamiento de temperatura, agotamiento de nutrientes, adición de inductores gratuitos (por ejemplo análogos de hidratos de carbono tales como isopropil-P-D-tiogalactopiranósido (IPTG), acumulación de subproductos metabólicos en exceso o similares. En los casos en los que el producto génico AveC expresado queda retenido en el interior de las células huésped, las células se recolectan y lisan y el producto se aisla y purifica a partir del lisado bajo condiciones de extracción conocidas en la técnica para minimizar la degradación de proteínas tales como, por ejemplo, a 4°C, o en presencia de inhibidores de proteasa, o an-ibos. En los casos en los que el producto génico AveC expresado se secreta de las células huésped, el medio nutriente agotado puede ser recogido simplemente y el producto puede aislarse a partir del mismo. El producto génico AveC expresado se puede aislar o purificar sustancialmente a partir de lisados de células o medio de cultivo, según sea apropiado, utilizando métodos convencionales, que incluyen pero no se limitan a cualquier combinación de los siguientes métodos: precipitación con sulfato de amonio, fraccionamiento por tamaño, cromatografía de intercambio de iones, HPLC, centrifugación por densidad y cromatografía de afinidad. En los casos en los que el producto génico AveC expresado exhibe actividad biológica, el aumento de la pureza de la preparación se puede vigilar en cada etapa del proceso de purificación mediante el uso de un análisis apropiado. Independientemente de que el producto génico AveC expresado exhiba o no una actividad biológica, éste se puede detectar según se base, por ejemplo, en el tamaño o la reactividad con un anticuerpo de otro modo específico de AveC o por la presencia de una marca de fusión. Tal como se utiliza en esta memoria, un producto génico AveC está "sustancialmente purificado" en los casos en los que el producto constituye más de aproximadamente 20% en peso de la proteína en una preparación particular. También, tal como se utiliza en esta memoria, un producto génico AveC está "aislado" en los casos en los que el producto constituye al menos aproximadamente 80% en peso de la proteína en una preparación particular. La presente invención proporciona, así, un producto génico AveC de S. avermitilis expresado de manera recombinante, aislado o esencialmente purificado, que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC, o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2) o una porción sustancial de la misma, y versiones mutadas y variantes degeneradas del mismo. La presente invención proporciona, además, un método para preparar un producto génico AveC, que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión recombinante, comprendiendo dicho vector una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico AveC, molécula de polinucleótido que está en asociación operativa con uno o más elementos reguladores que controlan la expresión de la molécula de polinucleátido en la célula huésped, condiciones que conduzcan a la preparación del producto génico AveC recombinante, y recuperar el producto génico AveC del cultivo de células. El producto génico AveC de S. avermitilis expresado de modo recombinante es útil para una diversidad de fines, incluido el rastreo de compuestos que alteran la función del producto génico AveC y que, con ello, modulan la biosíntesis de avermectina, y para desarrollar anticuerpos dirigidos contra el producto génico AveC. Una vez que se ha obtenido un producto génico AveC de suficiente pureza, éste se puede caracterizar por métodos convencionales, que incluyen SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño, análisis de la secuencia de aminoácidos, actividad biológica en la preparación de productos apropiados en la vía de biosíntesis de avermectina, etc. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del producto génico AveC se puede determinar utilizando técnicas convencionales de secuenciación de péptidos. El producto génico AveC se puede caracterizar adicionalmente utilizando análisis de hidrofilia (véase, por ejemplo, Hopp y Woods, 1981 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:3824) o algoritmos de software análogos para identificar regiones hidrófobas e hidrófilas del producto génico AveC. El análisis estructural se puede llevar a cabo para identificar regiones del producto génico AveC que asuman estructuras secundarias específicas. Para representar en mapa y estudiar los sitios de interacción entre el producto génico AveC y su sustrato se pueden utilizar métodos biofísicos tales como cristalografía de rayos X (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 1 1 :7-13), modelación por ordenador (Fletterick y Zoller (compiladores), 1986, en: Current Communications in Molecular Biolo , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y resonancia magnética nuclear (RMN) . La información obtenida de estos estudios se puede utilizar para seleccionar nuevos sitios de mutaciones en el ORF de aveC para ayudar a desarrollar nuevas cepas de S. avermitilis con características de producción de avermectinas más deseables. 5.3. Construcción y uso de mutantes de AveC Un objeto principal de la presente invención consiste en identificar nuevas mutaciones en el alelo aveC de S. avermitilis que den como resultado un cambio y, lo más preferiblemente, una reducción en la relación de avermectinas B2: B1. La presente invención proporciona, así, moléculas de polinucleótidos útiles para producir nuevas cepas de células de S. avermitilis que exhiban un cambio detectable en la producción de avermectina, en comparación con células de la misma cepa pero que, en su lugar, expresen únicamente el alelo aveC de tipo salvaje. En una realización preferida, moléculas de polinucleótidos de este tipo son útiles para producir nuevas cepas de células de S. avermitilis que produzcan avermectinas en una relación de clase 2:1 reducida en comparación con células de la misma cepa que, en su lugar, expresen únicamente el alelo aveC de tipo salvaje. Las células de cepas de este tipo también pueden comprender mutaciones adicionales para producir una cantidad incrementada de avermectinas en comparación con células de la misma cepa que, en su lugar, expresen únicamente un alelo aveC de tipo salvaje sencillo. Mutaciones en el alelo aveC o en la secuencia codificadora incluye cualesquiera mutaciones que introducen una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o que resultan en la truncación del producto génico AveC o cualquier combinación del mismo, y que producen el resultado deseado. Secuencias de alelos aveC mutados de este tipo pretenden incluir cualesquiera variantes degeneradas de los mismos. Por ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del alelo aveC o una variante degenerada del mismo, o la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC, o una variante degenerada del mismo, o la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC de S. avermitilis según se presenta en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una variante degenerada de la misma, pero que comprende, además, mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas en el producto génico AveC. En una realización no limitante, sustituciones de este tipo se producen en una o más posiciones de los aminoácidos del producto génico AveC correspondiente a las posiciones de aminoácidos 25, 28, 35, 36, 38, 40, 41 , 48, 55, 61 , 78, 84, 89, 90, 99, 107, 108, 1 1 1 , 120, 123, 136, 138, 139, 141 , 154, 159, 163, 179, 192, 196, 198, 200, 202, 220, 228, 229, 230, 231 , 234, 238, 239, 250, 252, 266, 275, 278, 289 6 298 de SEQ ID No: 2. Combinaciones preferidas de posiciones de aminoácidos a sustituir comprenden uno o más de los residuos aminoácidos D48, A61 , A89, L136, S138, A139, R163. G179, V196, A198, E238 y P289. Combinaciones específicamente preferidas de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179 y, más específicamente, en D48E y en G179S. Ejemplos específicos de combinaciones de sustituciones de aminoácidos que dan como resultado una reducción en las relaciones ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 están listados en los cuadros A-M más abajo. Los cuadros A-M muestran una lista compilada de combinaciones de sustituciones de aminoácidos codificadas por mutaciones en el alelo aveC según se identifica por una segunda ronda de "redistribución de genes", y sus efectos sobre la relación de la producción de ciclohexilo B2:ciclohexilo B1. Para cada plásmido, en la columna titulada "Mutaciones", el' recuadro superior lista las sustituciones de aminoácidos, y el recuadro inferior lista los cambios de bases de nucleótidos que resultan en esas sustituciones de aminoácidos. Los cambios de bases de nucleótidos entre paréntesis son cambios silenciosos, es decir no resultan en cambios de la secuencia de aminoácidos.
CUADRO A CUADRO B CUADRO C CUADRO D CUADRO E CUADRO F Plásmido Mutaciones [B2] [B1] B2/B1 pSE540 G35S, D48E, A89T, S138T, 42 180 0.23 A139T. G179S, P289L G276A, T317A, G438A, (T497C), T585A, G588A, G708A, C1039T pSE541 D48E, A61 T, A89T, L136P, 36 174 0.20 G179S, P289L (C266T), T317A, G354A, G438A, (T497C), T580C. G708A, C1039T pSE542 D48E, A61 T, A107T, S108G. 50 175 0.29 L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. T317A, G354A, G492A, A495G, (T497C), T580C, G708A, T747G. A887C, C1039T pSE543 D48E, A61 T, A89T, G11 1 V, 17 67 0.25 S138T, A139F, G179S, E238D, P289L T317A, G354A, G438A, G505T, T585A, G588T, C589T. G708A, A887C, C1039T pSE545 D48E, L136P, G179S, R250W 37 134 0.27 G317A, T580C, G708A, C921 T pSE546 D48E, L136P, G179S, E238D 48 178 0.27 G317A, T580C, G708A, A887T pSE547 D48E, A61T, A89T, S138T. 32 142 0.23 A139T, G1 9S, V196A, E238D T317A, G354A, G438A, T585A, G588A, G708A, T760C, A761 C, A887C CUADRO G CUADRO H CUADRO I CUADRO J CUADRO K CUADRO L CUADRO M La presente invención proporciona, así, una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que, por lo demás, es la misma que el alelo aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis o la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC de S. avermitilis según se presenta en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una vanante degenerada del mismo, pero secuencia de nucleótidos que, además, comprende mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en los residuos de aminoácidos correspondientes a las posiciones de los aminoácidos de la SEQ ID NO:2, de modo que células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis en las que el alelo aveC de tipo salvaje ha sido inactivado y que expresan la molécula de polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una relación de clase 2: 1 de avermectinas que está reducida en comparación con la relación producida por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje, en donde, cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , la relación de avermectinas de clase 2;1 es 0.35:1 o menor. En una relación más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2: ciclohexilo B1 es aproximadamente 0.30:1 o menor. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.25:1 o menor. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.20:1 o menor.
En una realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (a): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE538 (véanse los cuadros A-M). En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (b): G40S, D48E, L136P, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE559. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (c): D48E, L136P, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es PSE567. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (d) : D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE570 y PSE572. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (e): D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE571. En una realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (f) : D48E, L136P, G179S, E238D. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE501 y pSE546. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (9) : D48E, A61T, L136P, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE510. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (h): D48E, A61T, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE512. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (i) : D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE519. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (j) : D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE526. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (k) : D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE528.
En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (1 ): D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE530. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (m): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE531. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (n) : D48E, L84P, G1 11V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE534. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (o) : Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE535. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (p) : D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE542. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (q): D48E, L136P, G179S, R250W. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE545. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (r): D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE548. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (s) : D48E, L136P G179S, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE552. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (t) : D48E, F78L, A89T, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE557. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (u) : D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE564 y pSE565. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (v) : D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE568.
En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (w) : D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE543. En una realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (x) : D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE504. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (y) : D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE508. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (z) : D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE511. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (aa) : D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE520. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ab) : D48E, L136P, R163Q, G179S, S231 L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE523. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ac) : D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE527. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ad) : D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE539. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ae) : G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE540. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (af) : D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE547. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ag) : D48E, A89T, G1 11V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE550.
En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ah) : S41 G, D48E, A89T, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE558. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (a¡): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE563. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (aj) : D48E, A89T, L136P, G179S, F234S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE566. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ak) : D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE573 y pSE578. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (al): Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE574. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (am) : D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE575 y pSE576. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (an): D48E, A89T, S138T, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE577. En una realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ao) : D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE502 y pSE524. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ap): D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE503. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (aq) : D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE505. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ar): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE506.
En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (as) : D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE507. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (at) : D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE509. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (au): D48E, A89T, L136P, G179S. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE514 y pSE525. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (av) : D48E, A89T, V120A, L136P, G179S. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE515. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (aw) : D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V19GA, A198G, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE517. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ax) : D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE518. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ay) : D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE529 y pSE554. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (az) : D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE532. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (ba): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE536. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (bb) : D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE537. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (be): D48E, A61T, Á89T, L136P, G179S, P289L. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE541. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (bd) : D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V19GA, E238D, P289L Ejemplos no limitantes de plásmidos que codifican estas sustituciones de aminoácidos son pSE549 y pSE553. En otra realización particular, la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo (be) : D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V19GA, E238D. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica estas sustituciones de aminoácidos es pSE551. La presente invención proporciona, además, una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que, por lo demás, es la misma que el alelo aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis o la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC de S. avermitilis según se presenta en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ) o una variante degenerada de la misma, pero secuencia de nucleótidos que comprende, además, mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en los residuos aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos de SEQ ID N°:2, de modo que células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis, en las que el alelo aveC de tipo salvaje ha sido inactivado y que expresan la molécula de polinucleótido que comprenden la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una relación de clase 2:1 de avermectinas que está reducida en comparación con la relación producida por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje, en donde, cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , la relación de avermectinas de clase 2:1 se reduce a aproximadamente 0.40:1 o menos y en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; y (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D. Ejemplos no limitantes de un plásmido que codifica las sustituciones de aminoácidos del grupo (bf) son pSE556 y pSE569. Un ejemplo no limitante de un plásmido que codifica las sustituciones de aminoácidos del grupo (bg) es pSE561. La presente invención contempla que cualesquiera de las sustituciones de aminoácidos antes mencionadas se puedan conseguir mediante cualquier modificación en la secuencia de nucleótidos del alelo aveC o en una variante degenerada del mismo que dé como resultado sustituciones de este tipo. Por ejemplo, es posible efectuar la mayoría de las sustituciones de aminoácidos descritas en esta memoria cambiando una secuencia de codón nativa o una variante degenerada de la misma por uno cualquiera de varios codones alternativos que codifican la misma sustitución de aminoácidos. Las diversas posibles secuencias que pueden codificar las sustituciones de aminoácidos antes mencionadas resultarán fácilmente evidentes para una persona experta en la técnica a la vista de la presente descripción y de la degeneración conocida del código genético. En una realización no limitante para cada combinación particular reseñada anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se consiguen mediante los cambios no silenciosos de nucleótidos recogidos en los cuadros A-M. Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende la combinación del grupo ... ", y similares, significa que las sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC de acuerdo con la presente invención incluyen al menos sustituciones que se reseñan específicamente, y pueden incluir otras sustituciones de aminoácidos o deleciones de aminoácidos o adiciones de aminoácidos o alguna combinación de las mismas, en donde la expresión del producto génico AveC resultante en la célula de S. avermitilis proporciona una reducción deseable en la relación de avermectinas B2:B1 . Mutaciones en el alelo aveC o en una variante degenerada del mismo se pueden llevar a cabo por cualesquiera de una diversidad de métodos conocidos, incluidos medíante el uso de PCR propensa a errores, o por mutagénesis de cásete. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos se puede emplear para alterar la secuencia del alelo o el ORF de aveC de un modo definido, de manera que, por ejemplo, se introduzcan uno o más sitios de restricción, o un codón de 'terminación, en regiones específicas dentro del alelo o el ORF de aveC. Métodos como los descritos en la patente de EE.UU. 5,605,793, patente de EE.UU. 5,830,721 y patente de EE.UU. 5,837,458, que implican una fragmentación aleatoria, ciclos repetidos de mutagénesis y redistribuciones de nucieótidos, también se pueden utilizar para generar grandes genotecas de polinucleótidos con secuencias de nucieótidos que codifican mutaciones aveC. Pueden ser útiles mutaciones dirigidas a diana, particularmente en los casos en los que sirvan para alterar uno o más residuos aminoácidos conservados en el producto génico AveC. Por ejemplo, una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida del producto génico AveC de S. avermitilis (SEQ ID N°:2) con productos génicos homólogos de AveC procedentes de S. griseochromogenes (SEQ ID N°:5) y S. hyóroscopius (SEQ ID N°:4), según se describe en la patente de EE.UU. No. 6,248,579, indica sitios de significante conservación de residuos aminoácidos entre estas especies. La mutagénesis dirigida a diana que conduce a un cambio en uno o más de estos residuos aminoácidos conservados puede ser eficaz para producir nuevas cepas mutantes que exhiban alteraciones deseables en la producción de avermectinas. También puede ser útil una mutagénesis aleatoria, y ésta se puede llevar a cabo exponiendo células de S. avermitilis a radiación ultravioleta o rayos X, o a mutágenos químicos tales como N-metil-NI'-nitrosoguanidina, metanosulfonato de etilo, ácido nitroso o hiperitas nitrogenadas. Véase, por ejemplo, Ausubel, 1989, antes, para una revisión de las técnicas de mutagénesis.
Una vez que se generan moléculas de polinucleótidos mutadas, éstas se rastrean para determinar si pueden modular la biosíntesis de avermectinas en S. avermitilis. En una realización preferida, una molécula de polinucleótido con una secuencia de nucleótidos mutada se somete a ensayo complementando una cepa de S. avermitilis en la que el gen aveC ha sido inactivado para dar un fondo aveC-negativo (aveC) . En un método no limitante, la molécula de polinucleátido mutada se escinde en un plásmido de expresión en asociación operativa con uno o más elementos reguladores, plásmido que, preferiblemente, también comprende uno o más genes de resistencia a fármacos, para permitir la selección de células transformadas. A continuación, este vector se transforma en células huésped aveC, utilizando técnicas conocidas, y las células transformadas se seleccionan y cultivan en medios de fermentación apropiados bajo condiciones que permitan o induzcan la producción de avermectinas, por ejemplo al incluir subunidades de iniciador apropiadas en el medio y realizar el cultivo en condiciones óptimas para la producían de avermectinas según se conoce en la técnica. A continuación, los productos de fermentación se analizan por HPLC para 'determinar la capacidad de la molécula de polinucleátido mutada de complementar la célula huésped. En la Sección 8.3 que figura más abajo se ejemplifican varios vectores de plásmidos que portan moléculas de polinucleótidos mutadas capaces de reducir la relación B2: B1 de avermectinas, incluidos pSE188, pSE199, pSE231 , pSE239 y pSE290 hasta pSE297. En los cuadros A-M se reseñan otros ejemplos de vectores de plásmidos de este tipo.
Cualesquiera de los métodos antes mencionados de la presente invención se pueden llevar a cabo utilizando medios de cultivo de fermentación, preferiblemente suplementados con ácido ciclohexanocarboxílico, a pesar de que también se pueden utilizar otros precursores de ácidos grasos apropiados, tales como uno cualquiera de los precursores de ácidos grasos listados en el cuadro 1 , o ácido metiltioláctico. Una vez que ha sido identificada una molécula de polinucleótido mutada que modula la producción de avermectinas en una dirección deseable, se puede determinar la localización de la mutación en la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, una molécula de polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC mutado se puede aislar por PCR y someter a análisis de la secuencia de ADN utilizando métodos conocidos. Al comparar la secuencia de ADN del alelo aveC mutando con la del alelo aveC de tipo salvaje, se pueden determinar la o las mutaciones responsables de la alteración en la producción de avermectinas. Por ejemplo, productos génicos AveC de S. avermitilis que comprenden sustituciones sencillas de aminoácidos en cualesquiera de los residuos 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) ó 230 (G230D) , o dobles sustituciones en las posiciones 138 (S138T) y 139 (A139T o A139F) , proporcionaron cambios en la función del producto génico AveC, de modo que se alteró la relación de avermectinas de clase 2:1 producidas (véase la Sección 8 que figura más abajo), en donde las posiciones de los aminoácidos reseñadas corresponden a las presentadas en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:2). Además, las siguientes siete combinaciones de mutaciones han demostrado reducir eficazmente la relación de clase 2:1 de avermectinas: (1 ) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G1 11V/P289L; (7) A139T/K154E/Q298H. La presente invención proporciona cincuenta y nueve (59) combinaciones adicionales de mutaciones que se muestran para reducir la relación de ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 de avermectinas, y éstas se presentan en los cuadros A-M y se reseñan en las reivindicaciones anejas. Tal como se utiliza en esta memoria, las designaciones antes mencionadas, tales como A139T, indican el residuo de aminoácido original mediante designación de una sola letra que, en este ejemplo, es alanina (A), en la posición indicada que, en este ejemplo, es la posición 139 (con referencia a la SEQ ID N°:2) del polipéptido, seguido del residuo aminoácido que reemplaza el residuo original de aminoácido que, en este ejemplo, es treonina (T). Tal como se utiliza en esta memoria, en los casos en los que un residuo aminoácido codificado por un alelo aveC en el cromosoma de S. avermitilis, o en un vector o una molécula de polinculeótido aislada de la presente invención se aluda como "correspondiente al' un residuo aminoácido particular de SEQ ID N°:2, o en los casos en los que a una sustitución de aminoácido se aluda como que se produce en una posición particular "correspondiente a" la de un residuo aminoácido específico numerado de SEQ ID N°:2, esto pretende referirse al residuo aminoácido en la misma localización relativa en el producto génico AveC, la cual el experto en la técnica puede rápidamente determinar mediante referencia a la secuencia de aminoácidos presentada en esta memoria como SEQ ID N°:2. Tal como se utiliza en esta memoria, en los casos en los que mutaciones específicas en el alelo aveC que codifica mutaciones particulares se resehen como cambios de bases en posiciones específicas de nucleótidos en el alelo aveC "correspondiente al' posiciones particulares de nucleótidos como se muestra en SEQ ID N°:1 , o en los casos a los que una posición de nucleótido en el alelo aveC se aluda de otro modo como "correspondiente al, una posición de nucleótido particular en la SEQ ID N°:1 , esto pretende referirse al nucleótido en la misma localización relativa en la secuencia de nucleótidos aveC o en una variante degenerada de la misma, la cual el experto en la técnica puede rápidamente determinar mediante referencia a la secuencia de nucleótidos presentada en esta memoria como SEQ ID N°:1. Tal como se utiliza en esta memoria, para referirse a relaciones de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , el término .aproximadamente" se refiere al valor numérico específicamente establecido más o menos 10% de ese valor establecido. Una molécula de polinucleótido de la presente invención puede .aislarse", lo que significa que: (i) se purifica en la medida que esté sustancialmente exenta de otras moléculas de polinucleótidos con diferentes secuencias de nucleótidos, o (ii) esté presente en un entorno en el que no se produciría por naturaleza, por ejemplo en los casos en los que un alelo aveC procedente de S. avermitilis, o una versión mutada del mismo, esté presente en una célula distinta a una célula de S. avermitilis, o (iii) esté presente en una forma en la que no se presentaría por naturaleza, por ejemplo en forma de un trozo más corto de ADN tal como un fragmento de restricción separado por digestión de un cromosoma bacteriano que comprenda predominantemente la región codificadora de aveC o una versión mutada de la misma, con o sin cualesquiera secuencias reguladoras asociadas de la misma, o como subsiguientemente integrado en un trozo heterólogo de ADN tal como el cromosoma de una célula bacteriana (distinta de una célula de S. avermitilis) o el ADN de un vector tal como un plásmido o fago, o integrado en el cromosoma de S. avermitilis en un lugar distinto del alelo aveC nativo. La presente , invención proporciona, además, un vector recombinante que comprende una molécula de polínucleótido de la presente invención. Un vector recombinante de este tipo se puede utilizar para dirigir a diana cualesquiera de las moléculas de polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos mutados de la presente invención al sitio del alelo aveC del cromosoma de S. avermitilis para insertarlo o reemplazar el ORF de aveC o una parte del mismo, por ejemplo por recombinación homologa. De acuerdo con la presente invención, sin embargo, una molécula de polínucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos mutados de la presente invención proporcionada con ello también puede actuar para modular la biosíntesis de avermectinas cuando se inserta en el cromosoma de S. avermitilis en un sitio distinto del alelo aveC, o cuando se mantiene episomalmente en células de S. avermitílis. Así, la presente invención proporciona, además, vectores que comprenden una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención, vectores que se pueden utilizar para insertar la molécula de polinucleátido en un sitio en el cromosoma de S. avermitílis distinto del gen aveC, o para ser mantenida episomalmente. En una realización no limitante, el vector es un vector de reemplazamiento génico que puede utilizarse para insertar un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo de acuerdo con la presente invención en células de una cepa de S. avermitílis, generando con ello nuevas cepas de S. avermitílis, cuyas células pueden producir avermectínas en una relación de clase 2:1 reducida en comparación con células de la misma cepa que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje. Vectores de reemplazamiento de genes de este tipo se pueden construir utilizando moléculas de polinucleótidos mutadas presentes en vectores de expresión proporcionadas con la. misma, tales como los vectores de expresión ejemplificados en la Sección 8 que figura más abajo. La presente invención proporciona, además, vectores que pueden utilizarse para insertar un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo en células de una cepa de S. avermitílis para generar nuevas cepas de células que producen cantidades alteradas de avermectínas en comparación con células de la misma cepa que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje. En una realización preferida, se incrementa la cantidad de avermectinas producidas por las células. En una realización específica pero no limitante, un vector de este tipo comprende un promotor fuerte como se conoce en la técnica, tal como, por ejemplo, el promotor ermE constitutivo procedente de Saccharopolyspora erythraea, que está situado más arriba de y está en asociación operativa con el ORF de aveC. Vectores de este tipo se pueden construir utilizando el alelo aveC mutado del plásmido pSE189 y de acuerdo con métodos descritos en la patente de EE.UU. n° 6,248,579. La presente invención proporciona vectores de reemplazamiento de genes que son útiles para inactivar el gen aveC en una cepa de tipo salvaje de S. avermitilis. En una realización no limitante, vectores de reemplazamiento de genes de este tipo se pueden construir utilizando la molécula de polinuele6tido mutada presente en el plásmido pSE180 (ATCC 209605) que se ejemplifica en la Sección 8.1 que figura más abajo (FIGURA 3) . La presente invención proporciona, además, vectores de reemplazamiento de genes que comprenden una molécula de polinucleótido que comprende o consiste en secuencias de nucleótidos que flanquean de modo natural el gen aveC in situ en el cromosoma de S. avermitilis, incluidas, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos flanqueantes mostradas en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ), vectores que se pueden utilizar para suprimir el ORF de aveC de S. avermtilis. La presente invención proporciona, además, una célula huésped que comprende una molécula de polinucleótido o un vector recombinante de la presente invención. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica capaz de ser utilizada como un huésped para la molécula de polinucleátido o vector recombinante. En una realización preferida, la célula huésped es una célula bacteriana. En una realización más preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces. En una realización más preferida, la célula huésped es una célula de Streptomyces avermitilis. La presente invención proporciona, además, un método para preparar una nueva cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos se selecciona de (a) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, un método para preparar una nueva cepa de S. avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde las células que comprenden el alelo aveC mutado o una variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , en una relación de 0.35:1 o menor. En una realización no limitante, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.30:1 o menor. En una realización no limitante, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (f) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2.ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.25:1 o menor. En una realización no limitante, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (w) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohex¡lo B1 es de aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización no limitante, el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (ao) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, un método para preparar una nueva cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos se selecciona del grupo consistente en (bf) y (bg). En una realización preferida, células de S. avermitilis que comprenden un alelo aveC mutado de este tipo o una variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.40:1 o menor. Al mutar de esta forma el alelo aveC o al introducir de esta forma el alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo, de acuerdo con las etapas antes reseñadas, se prepara una nueva cepa de S. avermitilis. La presente invención proporciona, además, una célula de una especie de Streptomyces que comprende un alelo aveC mutado o una vanante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida, la especie de Streptomyces es S. avermitilis.
La presente invención proporciona, además, una célula de S. avermitilis capaz de producir avermectinas ciclohexilo B2: ciclohexilo B1 en una relación de 0.35:1 o menor. En una realización no limitante, la célula comprende un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.30:1 o menor. En una realización no limitante, la célula comprende un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (f) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.25:1 o menor. En una realización no limitante, la célula comprende un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (w) a (be) listadas anteriormente. En una realización más preferida, la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es de aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización no limitante, la célula comprende un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (ao) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, una célula de una especie de Streptomyces avermitilis, que comprende un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, seleccionadas del grupo consistente en (bf) y (bg) listadas anteriormente. En una realización preferida, la especie de Streptomyces es S. avermitilis. En una realización más preferida, la célula es una célula de S. avermitilis capaz de producir avermectinas de ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.40:1 o menor. A pesar de que cualquiera de las mutaciones reseñadas puede estar presente en células de la presente invención en un elemento extracromosómico tal como un plásmido, se prefiere que mutaciones de este tipo estén presentes en una secuencia codificadora de aveC integrada en el cromosoma de S. avermitilis y, preferiblemente, pero no necesariamente, en el sitio del alelo aveC nativo. Dichas nuevas cepas de células son útiles en la producción a gran escala de avermectinas comercialmente deseables tal como doramectina. La presente invención proporciona, además, un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar las células de S. avermitilis de la presente invención en medios de cultivo bajo condiciones que permitan o induzcan la producción de avérhriectinas a partir del mismo, y recuperar dichas avermectinas a partir del cultivo. En una realización preferida, las células utilizadas en el procedimiento producen avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.35:1 o menor, más preferiblemente en una relación de aproximadamente 0.30:1 o menor, más preferiblemente en una relación de aproximadamente 0.25:1 o menor y, más preferiblemente, en una relación de aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización preferida, células productoras de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.35:1 o menor comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicional, células productoras de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.30:1 o menor comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (f) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicional, células productoras de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.25:1 o menor comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (w) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicional, células productoras de avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.20:1 o menor comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (ao) a (be) listadas anteriormente. En otra realización, las células producen avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de aproximadamente 0.40:1 o menor y comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (bf) y (bg) listadas anteriormente. El procedimiento de la invención proporciona una eficacia incrementada en la producción de avermectinas comercialmente valiosas tal como doramectina. La presente invención proporciona, además, una composición de avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 producidas por células de Streptomyces avermitilis, que comprende las avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 presentes en un medio de cultivo en el que las células han sido cultivadas, en donde la relación de las avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 presentes en el medio de cultivo es 0.35:1 o menor, de preferencia aproximadamente 0.30:1 d menor, de modo mis preferente aproximadamente 0.25:1 o menor y, con mayor preferencia, de aproximadamente 0.20:1 o menor. En una realización particular la composición de avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 se produce por parte de células de una cepa de S. avermitilis que expresan un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico que resulta en la reducción de la relación de avermectinas de ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 producidas por las células en comparación con las células de la misma cepa de S. avermitilis que no expresan el alelo aveC mutado, sino que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje. En una realización preferida, en los casos en los que la composición es avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 en una relación de 0.35:1 o menor, la composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicional, en los casos en los que la composición es avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.30:1 o menor, la composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que cóhsíste en (f) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicional, en los casos en los que la composición es avermectínas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.25:1 o menor, la composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (w) a (be) listadas anteriormente. En una realización preferida adicional, en los casos en los que la composición es avermectínas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.20:1 , o menor, la composición se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en (ao) a (be) listadas anteriormente. La presente invención proporciona, además, una composición de avermectínas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 producidas por células de Streptomyces avermitilis, que comprende las avermectínas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 presentes en un medio de cultivo en el que las células han sido cultivadas, en donde la relación de las avermectínas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 presentes en el medio de cultivo es de aproximadamente 0.40:1 o menor, y que se produce por células que comprenden un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente en (bf) y (bg) listadas anteriormente. A pesar de que se prefiere que la nueva composición de avermectinas esté presente en un medio de cultivo en el que se hayan cultivado las células, por ejemplo en fluido de cultivo de fermentación parcial o totalmente agotado, la composición de avermectinas puede purificarse, parcial o sustancialmente, de modo alternativo a partir del fluido de cultivo por técnicas bioquímicas de purificación conocidas tales como por precipitación con sulfato de amonio, diálisis, fraccionamiento por tamaño, cromatografía de intercambio de iones, HPLC, etc. Además de preparar nuevas cepas de S. avermítilís que comprenden células que son capaces de producir relaciones reducidas de ciciohexilo B2: cíclohexilo B1 según se describe anteriormente, la presente invención contempla que mutaciones adicionales puedan incorporarse en células de S. avermitilis para mejorar adicionalmente las características de la producción de avermectinas. En una realización no limitante, células de la presente invención pueden comprender, además, modificaciones para aumentar el nivel de producción de avermectinas. En una realización, tales células se pueden preparar (i) mutando el alelo aveC en una célula de S. avermitilis, o (¡i) introduciendo un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo en células de una cepa de S. avermitilis, en donde la expresión del alelo mutado resulta en un aumento de la cantidad de avermectinas producida por células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo aveC mutado en comparación con células de la misma cepa que, en su lugar, expresan únicamente un solo alelo aveC de tipo salvaje, y seleccionando células transformadas que producen avermectinas en una cantidad creciente en comparación con la cantidad de avermectinas producidas por células de la cepa que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC sencillo de tipo salvaje. Por ejemplo, el alelo aveC se puede modificar de modo que comprenda un promotor fuerte, tal como el promotor ermE constitutivo fuerte procedente de Saccharopolyspora erythraea, insertado más arriba y en asociación operativa con el ORF de aveC. En otra realización, una o más mutaciones se pueden introducir en los genes aveR1 y/o aveR2 de S. avermitilis, aumentado con ello el nivel de producción de avermectinas según se describe en la patente de EE.UU. No. 6,197,591 de Stutzman-Engwall et al., expedida el 6 de marzo de 2001. 5.4. Usos de avermectinas Las avermectinas son agentes antiparasitarios muy activos con una particular utilidad como antihelmínticos, ectoparasiticidas, insecticidas y acaricidas. Compuestos de avermectina producidos de acuerdo con los métodos de la presente invención son útiles para cualquiera de estos fines. Por ejemplo, compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son útiles para tratar diversas enfermedades o estados en seres humanos, particularmente en los casos en que esas enfermedades o estados son provocados por infecciones parasitarias, según se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Ikeda y Omura, 1997, Chem. Rev . 97 (7) : 2591-2609. Más particularmente, compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son eficaces para tratar una diversidad de enfermedades o estados causados por endoparásitos, tal como nematodos parasíticos, que pueden infestar seres humanos, animales domésticos, cerdos, ovejas, aves de corral, caballos o ganado. Más específicamente, compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son eficaces contra nematodos que infestan seres humanos, asi como los que infestan diversas especies de animales. Nematodos de este tipo incluyen parásitos gastrointestinales tales como Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria, y parásitos que se encuentran en la sangre u. otros tejidos u órganos tales como los gusanos filariales y los estados intestinales del extracto de Stronqyloides y Trichinella. Los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son también útiles para tratar infecciones ectoparasitarias que incluyen, por ejemplo, infestaciones por artrópodos de mamíferos y aves, provocados por garrapatas, ácaros, piojos, pulgas, moscardas, insectos picadores o larvas dípteras migratorias que pueden afectar al ganado y a los caballos, entre otros. Los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son también útiles como insecticidas contra plagas domésticas tales como, por ejemplo, cucarachas, polillas de la ropa, escarabajos de alfombras y la mosca doméstica, entre otros, así como plagas de insectos de grano almacenado y de plantas agrícolas, plagas que incluyen ácaros araña, áfidos, orugas y ortópteros tales como langostas, entre otros. Animales que pueden ser tratados con los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención incluyen ovejas, ganado, caballos, ciervos, cabras, cerdos, aves, incluidas aves de corral, y perros y gatos. Un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención se administra en una formulación apropiada para el uso pretendido específico, la especie particular de animal huésped que está siendo tratada y el parásito o insecto implicado. Para uso como un parasiticida, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención se puede administrar oralmente en forma de una cápsula, bolo, comprimido o purgante líquido o, alternativamente, se puede administrar como un fármaco de vertido o por inyección, o como un implante. Formulaciones de este tipo se preparan de una manera convencional de acuerdo con prácticas veterinarias convencionales. Así, cápsulas, bolos o comprimidos se pueden preparar mezclando el ingrediente activo con un diluyente o vehículo finamente dividido y adecuado que contiene, adicionalmente, un agente desintegrante y/o ligante tal como almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio, etc. Una formulación de purgante se puede preparar dispersando el ingrediente activo en una solución acuosa junto con un agente dispersante o humectante, etc. Formulaciones inyectables se pueden preparar en forma de una solución estéril que puede contener otras sustancias tales como, por ejemplo, suficientes sales y/o glucosa para isotonizar la solución con la sangre. Formulaciones de este tipo variarán con respecto al peso del compuesto activo dependiendo del paciente o especie de animal huésped a tratar, la gravedad y tipo de infección y el peso corporal del huésped. Generalmente, para la administración por vía oral, será satisfactoria una dosis de compuesto activo de aproximadamente 0.001 a 10 mg por kg de peso corporal del paciente o animal, administrada en forma de una dosis sencilla o en dosis divididas durante un período de 1 a 5 días. Sin embargo, puede haber casos en los que estén indicados intervalos de dosificación mayores o menores, según se determina, por ejemplo, por un médico o veterinario, basados en los síntomas clínicos. Como alternativa, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención se puede administrar en combinación con pienso para animales y, para este fin, se puede preparar un aditivo o premezcla de piensos concentrados para mezclarlo con el pienso normal para animales. Para uso como insecticida y para tratar plagas en agricultura, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención se puede aplicar en forma de una pulverización, polvo, emulsión y similares, de acuerdo con la práctica agrícola convencional. 6. EJEMPLO Fermentación de streptomyces Avermitilis y análisis de avermectinas B2:B1 Cepas que carecen de actividades tanto de 2-oxo-ácido-deshidrogenasa de cadena ramificada como de 5-O-metiltransferasa no producen avermectinas si el medio de fermentación no se suplementa con ácidos grasos. Este ejemplo demuestra que en mutantes de este tipo se puede obtener una amplia gama de relaciones B2:B1 de avermectinas cuando la biosíntesis se inicia en presencia de diferentes ácidos grasos. 6.1 Materiales y métodos Streptomyces avermitilis ATCC 53692 se almacenó a -70°C como un caldo completo preparado en medio de siembra que consistía en: almidón (Nadex, Laing National)-20 g; Pharmamedia (proteína de Trader, Memphis, TN) - 15 g; Ardamine pH (Yeast Products Inc .) -5 g; carbonato de calcio - 1 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con agua del grifo, el pH se ajustó a 7.2 y el medio se sometió en autoclave a 121 °C durante 25 min. Dos mi de una suspensión descongelada de la preparación anterior se utilizó para inocular un matraz que contenía 50 mi del mismo medio. Después de 48 h de incubación a 28°C en un sacudidor rotatorio a 180 rpm, se utilizaron 2 mi del caldo para inocular un matraz que contenía 50 mi de un medio de producción que consistía en: almidón - 80 g; carbonato de calcio 7 g; Pharmamedia - 5 g; dihidrógeno-fosfato de potasio 1 g; sulfato de magnesio - 1 g; ácido glutámico - 0.6 g; sulfato ferroso heptahidrato - 0.01 g; sulfato de zinc - 0.001 g; sulfato de manganeso - 0.001 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con agua del grifo, el pH se ajustó a 7.2 y el medio se sometió en autoclave a 121 °C durante 25 min. Diversos sustratos de ácido carboxílico (véase el cuadro 1 ) se disolvieron en metanol y se añadieron al caldo de fermentación 24 h después de la inoculación para dar una concentración final de 0.2 g/litro. El caldo de fermentación se incubó durante 14 días a 28°C y luego el caldo se centrifugó (2.500 rpm durante 2 min) y el sobrenadante se desechó. El sedimento del micelio se extrajo con acetona (15 mi), luego con diclorometano (30 mi) y la fase orgánica se separo, filtró y luego se evaporó hasta sequedad. El residuo se recogió en metanol (1 mi) y se analizó por HPLC con un cromatógrafo líquido Hewlett-Packard 1090A equipado con un detector de un conjunto de diodos de barrido ajustado a 240 nm.. La columna utilizada era una columna Beckman Ultrasphere C-18, 5 µ??, de 4.6 mm. x 25 cm mantenida a 40°C. Veinticinco µ? de la solución de metanol anterior se inyectaron en la columna. La elución se efectuó con un gradiente lineal de metanol-agua desde 80:20 hasta 95:5 a lo largo de 40 min a 0.85 ml/min. Para calibrar la respuesta del detector se utilizaron dos concentraciones convencionales de ciclohexilo B1 , y se midió el área bajo las curvas para las avermectinas B2 y B1. 6.2 Resultados Los tiempos de retención por HPLC observados para avermectinas B2 y B1 , y las relaciones 2:1 , se muestran en el cuadro 1.
CUADRO 1 Los datos presentados en el cuadro 1 demuestran un intervalo extremadamente amplio de relaciones de producto de avermectinas B2:B1 , indicando una considerable diferencia en los resultados de la conversión por deshidratación de compuestos de la clase 2 en compuestos de la clase 1 , dependiendo de la naturaleza de la unidad iniciadora de cadena lateral de ácido graso suministrada. Esto indica que cambios en las relaciones B2:B1 que resultan de alteraciones en la proteína AveC pueden ser específicos para sustratos particulares. Por consiguiente, el rastreo de mutantes que exhiban cambios en la relación B2:B1 obtenida con un sustrato particular necesita ser realizado en presencia de ese sustrato. Los subsiguientes ejemplos descritos más adelante utilizan ácido ciclohexanocarboxílico como sustrato de rastreo. Sin embargo, este sustrato se utiliza meramente para ejemplificar el potencial, y no pretende limitar la capacidad de aplicación de la presente invención. 7. EJEMPLO Aislamiento del gen aveC Este ejemplo demuestra el aislamiento y la caracterización de una región del cromosoma de Streptomyces avermitilis que codifica el producto génico AveC. Según se demuestra más adelante, se identificó que el gen aveC era capaz de modificar la relación de avermectinas ciclohexilo-B2 a ciclohexilo -B1 (B2:B1 ) producidas. 7.1 Materiales y métodos 7.1.1. Desarrollo de Streptomyces para el aislamiento de ADN Se siguió el siguiente método para desarrollar Streptomyces. Colonias sencillas de S. avermitilis ATCC 31272 (aislado de colonia sencilla n° 2) se aislaron en un medio YPD-6 de resistencia media que contenía: extracto de levadura Difco -5 g; Bacto-peptona Difco - 5 g; dextrosa -2.5 g; MOPS-5 g; Bacto-agar Difco - 15 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con dH20, el pH se ajustó a pH 7.0 y el medio se sometió en autoclave a 121°C durante 25 min.
Los micelios desarrollados en el medio anterior se utilizaron para inocular 10 mi de medio TSB (caldo de soja tríptico Difco - 30 g, en 1 litro de dH20. sometido a autoclave a 121 °C durante 25 min) en un tubo de 25 mm x 150 mm que mantuvo con sacudimiento (300 rpm) a 28°C durante 48-72 h. 7.1.2. Aislamiento de ADN cromosómico procedente de Streptomyces Partes alícuotas (0.25 mi ó 0.5 mi) de micelios desarrollados según se describe anteriormente se colocaron en tubos de microcentrifuga de 1.5 mi, y las células se concentraron por centrifugación a 12,000 x 9 durante 60 s. El material sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron en 0.25 mi de tampón TSE (20 mi de sacarosa 1.5 M, 2.5 mi de Tris-HCI 1 M, pH 8.0, 2.5 mi de EDTA 1 mM, pH 8.0 y 75 mi de dH20) que contenía 2 mg/ml de lisozima. Las muestras se incubaron a 37°C durante 20 min con sacudimiento, se cargaron en un instrumento de aislamiento de ácidos nucleicos automatizado AutoGen 540® (Integrated Separation Systems, Natick, MA) y el ADN genómico se aisló utilizando Cycle 159 (software de equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Alternativamente, 5 mi de micelio se colocaron en un tubo de 17 mm x 100 mm, las células se concentraron por centrifugación a 3,000 rpm durante 5 min y el material sobrenadante se retiró. Las células se resuspendieron en 1 mi de tampón TSE, se concentraron por centrifugación a 3,000 rpm durante 5 min y el material sobrenadante se separó. Las células se resuspendieron en 1 mi de tampón TSE que contenía 2 mg/ml de lisozima, y se incubaron a 37°C con sacudimiento durante 30-60 min. Después de la incubación, se añadieron 0.5 mi de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10%, y las células se incubaron a 37°C hasta que se completó la lisis. El lisado se incubó a GSOC durante 10 min, se enfrió hasta la temperatura ambiente, se escindió en dos tubos Eppendorf de 1.5 mi, se extrajo una vez con 0.5 mi de fenol/cloroformo (50% de fenol previamente equilibrado con Tris 0.5 M, pH 8.0; 50% de cloroformo) . La fase acuosa se separó y se extrajo 2 a 5 veces con cloroformo: alcohol isoamilico (24:1 ) . El ADN se precipitó añadiendo 1/10 volumen de acetato de sodio 3M, pH 4.8, incubando la mezcla en hielo durante 10 min, centrifugando la mezcla a 15,000 rpm, a 5°C durante 10 min y separando el material sobrenadante en un tubo limpio al que se añadió 1 volumen de isopropanol. La mezcla de material sobrenadante más isopropanol se incubó luego en hielo durante 20 min, se centrifugó a 15,000 rpm durante 20 min a 5°C, el material sobrenadante se retiró y el sedimento de ADN se lavó 1 vez con etanol al 70%. Después de que el sedimento estaba seco, el ADN se resuspendió en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). 7.1.3. Aislamiento del ADN del plásmido a partir de Streptomvces Una parte alícuota (1.0 mi) de micelio se colocó en tubos de microcentrífuga de 1.5 mi, y las células se concentraron por centrifugación a 12,000 x 9 durante 60 s. El material sobrenadante se desechó, las células se resuspendieron en 1.0 mi de sacarosa al 10, 3% y se concentraron por centrifugación a 12,000 x g durante 60 s y el material sobrenadante se desechó, A continuación, las células se resuspendieron en 0.25 mi de tampón TSE que contenía 2 mg/ml de lisozima y se incubaron a 37°C durante 20 min con sacudimiento, y se cargaron en un instrumento de aislamiento de ácidos nucleicos automatizado AutoGen 540®. El ADN del plásmido se aisló utilizando Cycle. 106 (software de equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Alternativamente, 1.5 mi de micelio se colocaron en tubos de microcentrífuga de 1.5 mi y las células se concentraron por centrifugación a 12,000 x g durante 60 s. El material sobrenadante se desechó, las células se resuspendieron en 1.0 mi de sacarosa al 10, 3% y se concentraron por centrifugación a 12,000 x 9 durante 60 s, y el material sobrenadante se desechó. Las células se resuspendieron en 0.5 mi de tampón TSE que contenía 2 mg/ml de lisozima, y se incubaron a 37°C durante 15-30 min. Después de la incubación, se añadieron 0.25 mi de SDS alcalino (NaOH 0.3 N, SDS al 2%), y las células se incubaron a 55°C durante 15-30 min o hasta que la solución era transparente. Se añadió acetato de sodio (0.1 mi, 3M, pH 4.8) a la solución de ADN, que luego se incubó en hielo durante 10 min. Las muestras de ADN se centrifugaron a 14,000 rpm. durante 10 min a 5°C. El material sobrenadante se separó a un tubo limpio y se añadieron 0.2 mi de fenolidoroformo (50% de fenol: 50% de cloroformo) y se mezclaron suavemente. La solución de ADN se centrifugó á 14,000 rpm durante 10 min a 5°C y la capa superior se separó a un tubo Eppendorf limpio. Se añadió isopropanol (0.75 mi) y la solución se mezcló suavemente y luego se incubó a la temperatura ambiente durante 20 min. La solución de ADN se centrifugó a 14,000 rpm, durante 15 min a 5°C, el material sobrenadante se separó y el sedimento de ADN se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en tampón TE. 7.1.4.Aislamiento del ADN del plásmido procedente de E. coli Una colonia de E. colitransformada sencilla se inoculó en 5 mi de medio Luria-Bertani (LB) (Triptona Bacto - 10 g, extracto de levadura Bacto - 5 g y NaCI -10 g en 1 litro de dH20, pH 7.0, sometido a autoclave a 121 °C durante 25 min y suplementado con 100 pg/ml de ampicilina) . El cultivo se incubó durante una noche y una parte alícuota de 1 mi se colocó en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi. Las muestras de cultivo se cargaron en el instrumento de aislamiento de ácidos nucleicos automatizado AutoGen 540® y el ADN del plásmido se aisló utilizando el Cycle 3 (software de equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 7.1.5. Preparación y transformación de protoplastos de S. avermitilis Colonias sencillas de S. avermitilis se aislaron en YPD-6 de resistencia media. Los micelios se utilizaron para inocular 10 mi de medio TSB en un tubo de 25 mm x 150 mm que luego se incubó con sacudimiento (300 rpm) a 28°C durante 48 h. Se utilizó un mi de micelio para inocular 50 mi de medio YEME. El medio YEME contiene por litro: extracto de levadura Difco 3 g; Bacto-peptona Difco - 5 g; extracto de malta Difco 3 g; sacarosa - 300 g. Después de someter a autoclave a 121 °C durante 25 min, se anadió lo siguiente: MgCl2.6H20 2.5 M (sometido por separado a autoclave a 121 °C durante 25 min) - 2 mi; y glicina (al 20%) (esterilizada por filtro) 25 mi. Los micelios se desarrollaron a 30°C durante 48-72 h y se recolectaron por centrifugación en un tubo de centrífuga de 50 mi (Falcon) a 3,000 rpm durante 20 min. El material sobrenadante se desechó y los micelios se resuspendieron en tampón P que contiene: sacarosa - 205 g; K2SO4 - 0.25 g; MgC½.6H20 - 2.02 g, H20 - 600 mi; K2P04 (al 0.5%) 10 mi, solución de elementos traza - 20 mi; CaCI2,2H20 (al 3.68%) - 100 mi; y tampón MES (1.0 M, pH 6.5) - 10 mi. (* La solución de elementos traza contiene por litro: ZnCI2 -40 mg; FeCI3. 6H20 2 - 200 mg; CuCI2.2H20 - 10 mg; MnCI2.4H20 - 10 mg; Na2B407.10H20 - 10 mg, (NH4)6M07024.4H20 - 10 mg) . El pH se ajustó a 6.5 y el volumen final se ajustó a 1 litro, y el medio se filtró en caliente a través de un filtro de 0.45 mieras. Los micelios se sedimentaron a 3,000 rpm durante 20 min, el material sobrenadante se desechó y los micelios se -resuspendieron en 20 mi de tampón P que contenía 2 mg/ml de lisozima. Los micelios se incubaron a 35°C durante 15 min con sacudimiento y se examinaron microscópicamente para determinar el grado de la formación de protoplastos. Cuando se completó la formación de protoplastos, éstos se centrifugaron a 8,000 rpm durante 10 min. El material sobrenadante se separó y los protoplalstos se resuspendieron en 10 mi de tampón P. Los protoplastos se centrifugaron a 8,000 rpm durante lo min, el material sobrenadante se retiró, los protoplastos se resuspendieron en 2 mi de tampón P y aproximadamente 1 x 109 protoplastos se distribuyeron en viales criógenos de 2.0 mi (Nalgene). Un vial que contenía 1 x 109 protoplastos se centrifugo a 8,000 rpm durante 10 min, el material sobrenadante se separó y los protoplastos se resuspendieron en 0.1 mi de tampón P. Se añadieron a los protoplastos dos a 5 de ADN transformante, seguido inmediatamente de la adición de 0.5 mi de tampón T de trabajo. La base de tampón T contiene: PEG1000 (Sigma) -25 g, sacarosa - 2.5 g; H20 - 83 mi. El pH se ajustó a 8.8 con NaOH 1 N (esterilizado por filtro) y la base de tampón T se esterilizó por filtro y se almacenó a 4°C. El tampón T de trabajo, preparado el mismo día que se utilizó, era la base de tampón T -8.3 mi; K2P04 (4 mM) - 1.0 mi; CaCI2,2H20 (5 M) - 0.2 mi, y TES (1 M, pH 8) - 0.5 ml. Cada componente del tampón T de trabajo se esterilizó por filtro individualmente. 20 s después de añadir el tampón T a los protoplastos, se añadió también 1.0 ml de tampón P, y los protoplastos se centrifugaron a 8,000 rpm durante 10 min. El material sobrenadante se desechó y los protoplastos se resuspendieron en 0.1 ml de tampón P. A continuación, los protoplastos se extendieron en placas de medio R 14 que contiene: sacarosa - 205 g; K2S04 - 0.25 g; MgCI2.6H20 - 10.12 g; glucosa - 10 g; casaminoácidos Difco - 0.1 g; extracto de levadura Difco 5 g; agar de harina de avena Difco - 3 g; Bacto-agar Difco 22 g; dH20 - 800 mi. La solución se sometió a autoclave a 121 °C durante 25 min. Después de someter en autoclave, se añadieron materiales estériles de lo siguiente: K2P04, (al 0.5%) -10 mi; CaCI2.2H20 (5 M) - 5 mi; L-prolina (al 20%) - 15 mi; tampón MES (1 .0 M, pH 6.5) - 10 mi; solución de elementos traza (la misma que antes) - 2 mi; material de cicloheximida (25 mg/ml) - 40 mi; y NaOH 1 N - 2 mi. Por placa se alicuotaron veinticinco mi de medio RM14, y las placas se secaron durante 24 h antes del uso. Los protoplastos se incubaron en una humedad del 95% a 30°C durante 20-24 h. Para seleccionar transformantes resistentes a tioestreptona, se roció uniformemente sobre las placas de regeneración de RM14 1 mi de tampón de recubrimiento que contenía 125 sg por mi de tioestreptona. El tampón de recubrimiento contiene, por 100 mi: sacarosa 10.3 g; solución de elementos traza (la misma que antes) 0.2 mi; y MES (1 M, pH 6.5) - 1 mi. Los protoplastos se incubaron en una humedad del 95% a 30°C durante 7-14 días hasta que fueron visibles colonias resistentes a tioestreptona (Thior). 7.1 .6.Transformación de protoplastos de Streptomvces lividans En algunos casos, para las transformaciones se utilizó S. lividans TK64 (proporcionado por John Innes Institute, Norwich, Reino Unido). Métodos y composiciones para el desarrollo, la formación de protoplastos y la transformación de S. lividans se describen en Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido, y se efectuaron como se describe allí. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes de S. lividans según se describe en la Sección 7.1.3. anterior. 7.1.7 Análisis de la fermentación de cepas de S. avermitilis Micelios de S. avermitilis desarrollados en YPD-6 de resistencia media durante 4-7 días se inocularon en tubos 25.4 x 92.5 mm que contenían 8 mi de medio preforma y dos perlas de vidrio de 5 mm. El medio preforma contiene: almidón soluble (ya sea almidón finamente hervido o KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/l; Pharmamedia - 15 g/l; Ardamine pH - 5 g/l (Champlain Ind., Clif ton, NJ) ; CaCO, - 2 g/l; 2 x agcr ("agcr" se refiere a ácidos grasos de cadena ramificada) que contienen una concentración final en el medio de 50 ppm de ácido 2-(+/-)-metilbutírico, 60 ppm de ácido isobutírico y 20 ppm de ácido isovalérico. El pH se ajustó a 7.2 y el medio se sometió a autoclave a 121°C durante 25 min. El tubo se sacudió a un ángulo de 17° a 215 rpm. a 29°C durante 3 días. Se utilizó una parte alícuota de 2 mi del cultivo de siembra para inocular un matraz Erlenmeyer de 300 mi que contenía 25 mi de medio de producción que contiene: almidón (ya sea almidón hervido finamente o KOSO) - 60 g/l; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/l; Ardamine pH -10 g/l; K2HPO4 - 2 g/l; MgS04.4H20 2 g/l; FeS04,7H20 - 0.02 g/l; MnCI2 -0.002 g/l, ZnS04.7H20 0.002 g/l; CaC03 - 14 g/l; 2x agcr (como antes); y ácido ciclohexanocarboxílico (CHC) (preparado como una solución al 20% a pH 7.0) - 800 ppm. El pH se ajustó a 6.9 y el medio se sometió a autoclave a 121 °C durante 25 min. (Como se explica antes, se pueden utilizar en su lugar unidades iniciadoras distintas de CHC (véase, por ejemplo, el cuadro 1 )). Después de la inoculación, el matraz se incubó a 29°C durante 12 días con sacudimiento a 200 rpm. Después de la incubación, se retiró una muestra de 2 mi del matraz, se diluyó con 8 mi de metanol, se mezcló y la mezcla se centrifugó a 1 ,250 x g durante 10 min para el desecho del sedimento. El material sobrenadante se sometió a continuación a ensayo por HPLC utilizando una columna ODS Beckman Ultrasphere (25 cm x 4.6 mm de DI) con un caudal de 0.75 ml/min y detección por absorbancia a 240 nm. La fase móvil era 86/8.9/5.1 de metanol/agua/acetonitrilo. 7.1.8. Aislamiento de genes PKS de S. Avermitilis Una genoteca de cósmidos del ADN cromosomal de S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) se preparó e híbrido con una sonda de quetosintasa (KS) preparada a partir de un fragmento del gen poliquétido sintasa (PKS) de Saccharopolyspora erythraea. Una descripción detallada de la preparación de genotecas del cósmido se puede encontrar en Sambrook et al., 1989, véase antes. Una descripción detallada de la preparación de genotecas de ADN cromosomales de Streptomyces se presenta en Hopwood et al. 1985, véase antes. Clones de cósmidos que contienen regiones hibridantes de quetosintasa se identificaron por hibridación a un fragmento Ndel/Eco47lll de 2.7 Kb procedente de pEX26 (gustosamente suministrado por el Dr. P Leadlay, Cambridge, Reino Unido). Aproximadamente 5 ng de pEX26 se digerieron utilizando Ndel y Eco47lll. La mezcla de reacción se cargó sobre un gel de agarosa SeaPlaque GTG al 0.8% (FMC BioProducts, Rockland, ME) . El fragmento Ndel/Eco47lll de 2.7 Kb se escindió del gel después de la electroforesis y el ADN se recuperó del gel utilizando GELase® procedente de Epicentre Technologies utilizando el protocolo Fast. El fragmento Ndel/Eco47lll de 2.7 Kb se marcó con [a"32P]dCTP (desoxicitidina 5'-trifosfato, sal de tetra-(trietilamonio), [alfa _32P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) utilizando el Nick Translation System BRL (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) siguiendo las instrucciones del suministrador. Se efectuó una reacción típica en 0.05 mi de volumen. Después de la adición de 5 µ? de tampón de detención, el ADN marcado se separó de los nucleótidos incorporados utilizando una columna G-25 Sephadex Quick Spin® (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del suministrador. Aproximadamente 1 ,800 clones de cósmidos se rastrearon mediante hibridación de colonias. Se identificaron diez clones que se hibridaban fuertemente a la sonda KS de Sacc. erythraea. ADN de cósmido que contiene colonias de E. coli se desarrolló en medio líquido LB y el ADN del cósmido se aisló de cada cultivo en el instrumento, de aislamiento de ácidos nucleicos automatizado AutoGen 540® utilizando Cycle 3 (software de equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La representación en mapa de las endonucleasas de restricción y el análisis de hibridación por manchas de Southern revelaron que cinco de los clones contenían regiones cromosóm¡cas solapantes. Un mapa de restricción BamHI genómico de S. avermitilis de los cinco cósmidos (es decir pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) se construyó por análisis de cósmidos solapantes e hibridaciones (FIGURA 4). 7.1.9. Identificación de ADN que modula las relaciones de avermectinas B2:B1 e identificación de un ORF de aveC Los siguientes métodos se utilizaron para someter a ensayo fragmentos subclonados derivados del clon de cósmido pSE66 en cuanto a su capacidad para modular las relaciones de avermectinas B2:B1 en mutantes AveC. pSE66 (5 pg) se digerió con Sacl y BamHI. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa SeaPlaqueg GTG al 0.8% (FMC BioProducts), un fragmento Sacl/BamHI de 2.9 Kb se escindió del gel después de electroforesis y el ADN se recuperó del gel utilizando GELase® (Epicentre Technologies) utilizando el protocolo Fast. Aproximadamente 5 pg del vector lanzadera pWHM3 (Vara et al. 1989, J. Bacteriol. 171 :5872-5881 ) se digerió con Sacl y BamHI. Aproximadamente 0.5 pg de la inserción de 2.9 Kb y 0.5 pg de pWHM3 digerido se mezclaron - entre sí y se incubaron durante una noche con 1 unidad de ligasa (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) a 15°C en un volumen total de 20 µ? de acuerdo con las instrucciones del suministrador. Después de la incubación, 5 pl de la mezcla de ligamiento se incubaron a 70°C durante 10 min, se enfriaron hasta la temperatura ambiente y se utilizaron para transformar células DH5a de E, coli competentes (BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se aisló de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción Sacl/BamHI de 2.9 Kb se confirmó mediante análisis de restricción. El plásmido se designó pSE 19. Protoplastos de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis (cepa interna de Pfizer) se preparan y transformaron con pSE119 según se describe en la Sección 7.1.5. anterior. La cepa 1100-SC38 es un mutante que produce significativamente más de la forma de avermectina ciclohexilo-B2 en comparación con la forma de avermectina ciclohexilo-B1 cuando se suplementa con ácido ciclohexanocarboxílico (B2:B1 de aproximadamente 30:1 ). pSE1 19, utilizado para transformar protoplastos de S. avermitilis, se aisló de la cepa GM2163 de E. coli (obtenida del Dr. B. J. Bachmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Universidad de Yale) , la cepa DM1 de E. coli (BRL) o la cepa TK64 de S. lividans. Transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa 1100-SC38 se aislaron y analizaron por análisis de HPLC de productos de fermentación. Transformantes de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis que contenía pSE119 produjeron una relación alterada de avermectinas ciclohexilo-B2:ciclohexilo-B1 de aproximadamente 3.7:1 (cuadro 2). Habiendo establecido que pSE1 19 era capaz de modular las relaciones de avermectinas B2:B1 en un mutante AveC, se secuenció el ADN de la inserción. Aproximadamente 10 pg de pSE1 19 se aislaron utilizando un estuche de aislamiento de ADN de plásmido (Qiagen, Valencia, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante, y se secuenciaron utilizando un secuenciador de ADN automático ABI 373A (Perkin Elmer, Foster City, CA). Los datos de las secuencias se reunieron y editaron utilizando programas de Genetic Computer Group (GCG, Madison, Wl) . La secuencia de ADN y el ORF de aveC se presentan en la FIGURA 1 (SEQ ID N°:1 ). Un nuevo plásmido, designado pSE1 18, se construyó como sigue. Aproximadamente 5 pg de pSE66 se digerieron con Sphl y BamHI. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa SeaPlaques GTG al 0.8% (FMC BioProducts), un fragmento Sphl/BamHI de 2.8 Kb se escindió del gel después de electroforesis y el ADN se recuperó del gel utilizando GELase® (Epicentre Technologies) utilizando el protocolo Fast. Aproximadamente 5 pg del vector lanzadera pWHM3 se digerieron con Sphl y BamHI. Aproximadamente 0.5 pg de la inserción de 2.8 Kb y 0.5 pg de pWHM3 digerido se mezclaron entre sí y se incubaron durante una noche con una unidad de ligasa (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) a 15°C en un volumen total de 20 pl de acuerdo con las instrucciones del suministrador. Después de la incubación, 5 pl de la mezcla de ligamiento se incubaron a 70°C durante 10 min, se enfriaron hasta la temperatura ambiente y se utilizaron para transformar células DH5a de E. coli competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se aisló de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción Sphl/BamHI de 2.8 Kb se confirmó mediante análisis de restricción. El plásmido se designó pSE1 18. El ADN de la inserción en pSE1 18 y pSE1 19 se solapa en aproximadamente 838 nucleótidos (FIGURA 4). Protoplastos de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis se transformaron con pSE118 como antes. Transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa 1100-SC38 se aislaron y analizaron por análisis de HPLC de productos de fermentación. Transformantes de la cepa 1 100-SC38 de S. avermitilis que contenían pSE1 18 no se alteraban en las relaciones de avermectinas ciclohexilo-B2:ciclohexilo-B1 en comparación con la cepa 1 100-SC38 (cuadro 2). 7.1.10 Amplificación por PCR del gen aveC de ADN cromosomal de S. avermitilis Un fragmento de ~ 1.2 Kb, que contenía el ORF de aveC, se aisló del ADN cromosómico de S. avermitilis mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores diseñados sobre la base de la secuencia de nucleótidos aveC obtenida anteriormente. Los cebadores de PCR se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de la derecha era: 5 -TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID N°:6); y el cebador de la izquierda era: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID N°:7). La reacción por PCR se llevó a cabo con polimerasa Deep Vent® (New England Biolabs) en tampón proporcionado por el fabricante y en presencia de 300 µ? de dNTP, glicerol al 10%, 200 pmol de cada cebador, 0,1 g de plantilla y 2.5 unidades de enzima en un volumen final de 100 pl utilizando un ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus. El perfil térmico del primer ciclo era 95°C durante 5 min (etapa de desnaturalización), 60°C durante 2 min (etapa de reanillamiento) y 72°C durante 2 min (etapa de extensión). Los subsiguientes 24 ciclos tenían un perfil térmico similar, excepto que la etapa de desnaturalización se acortó a 45 s y que la etapa de reanillamiento se acortó a 1 min. El producto de PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se detectó una banda sencilla de ADN de ~ 1.2 Kb. Este ADN se purificó a partir del gel y se ligó con 25 ng de vector pCR-Blunt romo linearizado (Invitrogen) en una relación 1 :10 molar de vector a inserción, siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligamiento se utilizó para transformar células E. coli One Shot® competentes (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción de ~ 1.2 Kb se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido se designó pSE179. El ADN de la inserción procedente de pSE179 se aisló mediante digestión con BamHI/Xbal, se separó por electroforesis, se purificó del gel y se ligó con el vector lanzadera pWHM3, que había sido también digerido con BamHI/Xbal, en una concentración total de ADN de 1 pg en una relación 1 :5 molar vector a inserción. La mezcla de ligamiento se utilizó para transformar células DH5a de E. coli competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia de la inserción de ~ 1.2 Kb se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se designó pSE186 (FIGURA 2, ATCC 209604), se transformó en DM1 de E. coli y el ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina. 7.2. Resultados Se identificó que un fragmento Sacl/BamHI de 2.9 Kb de pSE119, cuando se transformaba en la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis, alteraba significativamente la relación de la producción de avermectinas B2:B1. La cepa 1 100-SC38 de S. avermitilis tiene normalmente una relación B2:B1 de aproximadamente 30:1 pero, cuando se transforma con un vector que comprende el fragmento Sacl/BamHI de 2.9 Kb, la relación de avermectinas B2-B1 disminuía en aproximadamente 3.7:1. El análisis post-fermeptación de cultivos transformantes verificó la presencia del ADN transformante. El fragmento de pSE1 19 de 2.9 Kb se secuencio y se identificó un ORF de ~ 0.9 Kb (FIGURA 1 ) (SEQ ID N°:1 ) que abarca un fragmento Pstl/Sphl que había sido previamente mutado en algún otro lugar para proporcionar productos B2 únicamente (Ikeda et al., 1995, véase antes). Una comparación de este ORF, o de su correspondiente polipéptido deducido, frente a bases de datos conocidas (GenEMBL, SWiSS-PROT) no mostró ninguna fuerte homología con secuencias de ADN o de proteínas conocidas.
El cuadro 2 presenta el análisis de fermentación de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis transformada con diversos plásmidos.
CUADRO 2 8. EJEMPLO Construcción de mutantes aveC de S. avermitilis Este ejemplo describe la construcción de varios mutantes AveC de S. avermitilis diferentes utilizando las composiciones y los métodos descritos anteriormente. Una descripción general de técnicas para introducir mutaciones en un gen en Streptomyces se describe por Kieser y Hopwood, 1991 , Meth. Enzym. 204:430-458. Una descripción más detallada se proporciona por Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2):226-233 y por Stutzman-Engwall et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1 ): 144-154. Estas referencias se incorporan en esta memoria como referencia en su totalidad. 8.1. Inactivación del gen aveC de S. avermitilis Mutantes de aveC que contenían genes aveC inactivados se construyeron utilizando varios métodos, según se detalla más abajo. En el primer método, un fragmento Sphl/Pstl de 640 pb interno al gen aveC en pSE119 (plásmido descrito en la Sección 7.1.9., véase antes) se reemplazó por el gen ermE (para la resistencia a eritromicina) procedente de Sacc. erythraea. El gen ermE se aisló a partir de plJ4026 (proporcionado por John Innes Institute, Norwich, Reino Unido; véase también Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368) mediante digestión con enzimas de restricción con Bglll y EcoRI, seguido de electroforesis, y se purificó a partir del gel. Este fragmento de ~ 1.8 Kb se ligó en pGEM7Zf (Promega) que había sido digerido con BamHI y EcoRI y la mezcla de ligamiento se transformó en células DH5a de E. coli competentes, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción de ~ 1.7 Kb se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido se designó pSE27. pSE1 18 (descrito en la Sección 7.1.9., véase antes) se digerió con Sphl y BamHI, el elemento digerido se sometió a electroforesis y la inserción Sphl/BamHI de ~ 2.8 Kb se purificó a partir del gel. pSE119 se digería con Pstl y EcoRI, el elemento digerido se sometió a electroforesis y la inserción Pstl/EcoRI de - 1.5 Kb se purificó a partir del gel. El vector lanzadera pWHM3 se digerió con BamHI y EcoRI. pSE27 se digerió con Pstl y Sphl, el elemento digerido se sometió a electroforesis y la inserción Pstl/Sphl de ~ 1.7 Kb se purificó a partir del gel. Los cuatros fragmentos (es decir - 2.8 Kb, ~ 1.5 Kb, - 7.2 Kb, ~ 1.7 Kb) se ligaron juntos en un ligamiento de 4 maneras. La mezcla de ligamiento se transformó en células DH5a de E. coli competentes siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido se designó pSE180 (FIGURA 3; ATCC 209605). pSE180 se transformó en TK64 de S. lividans y colonias transformadas identificadas por resistencia a tioestreptona y eritromicina. pSE180 se aisló a partir de S. lividans y se utilizó para transformar protoplastos de S. avermitilis. Se identificaron cuatro transformantes de S. avermitilis resistentes a tioestreptona, y los protoplastos se prepararon y se extendieron en placas en condiciones no selectivas sobre medio RM14. Después de haber regenerado los protoplastos, colonias sencillas se rastrearon en cuanto a la presencia de resistencia a eritromicina y la ausencia de resistencia a tioestreptona, indicando una integración cromosómica del gen aveC inactivado y una pérdida del replicón libre. Se identificó un transformante Ermr Thios y se designó cepa SE180-11. El ADN cromosómico total se aisló a partir de la cepa SE180IÍ, se digerió con enzimas de restricción BamHI, Hindlll, Pstl o Sphl, se resolvió por electroforesis -en un gel de agarosa al 0.8%, se transfirió a membranas de nilón y se hibridó a la sonda ermE. Estos análisis demostraron que la integración cromosómica del gen de resistencia ermE y la deleción concomitante del fragmento Pstl/Sphl de 640 pb había ocurrido mediante un suceso de retrocruzamiento doble. El análisis por HPLC de los productos de fermentación de la cepa SE 180-11 mostró que ya no se producían avermectinas normales (FIGURA 5A). En un segundo método para inactivar el gen aveC, el gen ermE de 1.7 Kb se separó del cromosoma de la cepa SE180-11 de S. avermtilis, dejando una delecion de Pstl/Sphl de 640 pb en el gen aveC. Un plásmido de reemplazamiento del gen se construyó como sigue: pSE180 se digerio parcialmente con Xbal y un fragmento de ~ 11.4 Kb se purificó a partir del gel. La banda de - 1 1.4 Kb carece del gen de resistencia ermE de 1.7 Kb. A continuación, el ADN se ligó y se transformó en células DH5a de E. coli. El ADN del plásmido se aisló de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se designó pSE184, se transformó en DM1 de E. coli y el ADN del plásmido se aisló de transformantes resistentes a ampicilina. Este plásmido se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE180- 1 de S. avermitilis. Los protoplastos se prepararon a partir de transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11 y se extendieron en placas en forma de colonias sencillas sobre RM14. Después de haber regenerado los protoplastos, se rastrearon colonias sencillas en cuanto a la ausencia tanto de resistencia a eritromicina como de resistencia a tioestreptona, indicando una integración cromosómica del gen aveC inactivado y una pérdida del replicón libre que contenía el gen ermE. Se identificó un transformante Ermr Thios y se designó SE184-1 -13. El análisis por fermentación de SE184-1 -13 mostró que no se producían avermectinas normales y que SE184-1 -13 tenía el mismo perfil de fermentación que SE180-11 . En un tercer método de inactivar el gen aveC, se introdujo un desplazamiento de marco en el gen aveC cromosómico añadiendo dos Gs después de la C en la posición de nucleótido 471 utilizando PCR y creando con ello un sitio BspE1 . La presencia del sitio BspE1 manipulado era útil para detectar el suceso de reemplazamiento del gen. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir una mutación por desplazamiento del marco en el gen aveC y se suministaron por Genosys Biotechnologies, Inc. El cebador de la derecha era: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID N°-8) y el cebador de la izquierda era: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID N°:9). Las condiciones de PCR eran como se describen en la Sección 7.1.10 anterior. El producto de PCR de 666 pb se digerió con Sphl para dar dos fragmentos de 278 pb y 388 pb, respectivamente. El fragmento de 388 pb se purificó a partir del gel. El plásmido de reemplazamiento del gen se construyó como sigue: el vector lanzadera pWH 3 se digerió con EcoRI y BamHI. pSE1 19 se digerió con BamHI y Sphl, el elemento digerido se sometió a electroforesis y un fragmento de ~ 840 pb se purificó a partir del gel. pSE119 se digerió con EcoRI y Xmnl, el elemento digerido se resolvió por electroforesis y un fragmento de ~ 1.7 Kb se purificó a partir del gel. Los cuatro fragmentos (es decir - 7.2 Kb, - 840 pb, - 1.7 Kb y 388 pb) se ligaron juntos en un ligamiento de 4 maneras. La mezcla de ligamiento se transformó en células DH5a de E. coli competentes. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este plásmido, que se designó pSE185, se transformó en DM1 de E. coli y el ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este plásmido se utilizó para transformar protoplastos de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis. Transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa 1100-SC38 se aislaron y analizaron mediante análisis por HPLC de productos de fermentación. pSE185 no alteraba significativamente las relaciones de avermectinas B2:B1 cuando se transformaba en la cepa 1 100-SC38 de S. avermitilis (cuadro 2). pSE185 se utilizó para transformar protoplastos de S. avermitilis para generar una mutación por desplazamiento de marco en el gen aveC cromosómico. Protoplastos se prepararon a partir de transformantes resistentes a tioestreptona y se extendieron en placas en forma de colonias sencillas sobre RM14. Después de haber regenerado los protoplastos, colonias sencillas se rastrearon en cuanto a la ausencia de resistencia a tioestreptona. El ADN cromosómico procedente de colonias sensibles a tioestreptona se aisló y rastreó mediante PCR en cuanto a la presencia de la mutación por desplazamiento de marco integrada en el cromosoma. Los cebadores de PCR se diseñaron en base a la secuencia de nucleótidos de aveC y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) . El cebador de PCR de la derecha era: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID N°:10) y el cebador de la izquierda era: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID N°: 1 1 ) y las condiciones de PCR eran como se describe en la Sección 7.1.10 anterior. El producto de PCR obtenido era de 543 pb y, cuando se digería con BspE1 , se observaron tres fragmentos de 368 pb, 96 pb y 79 pb, indicando una integración cromosómica del gen aveC inactivado y una pérdida del replicón libre. El análisis por fermentación de mutantes de S. avermitilis que contenían la mutación por desplazamiento de marco en el gen aveC mostraron que ya no se producían avermectinas normales y que estos mutantes tenían el mismo perfil de HPLC de fermentación que las cepas SE180-1 1 y SE184-1-13. Se identificó un transformante Thios y se designó como cepa SE185-5a. Adicionalmente, se produjo una mutación en el gen aveC que cambia la posición del nucleótido 520 de G a A, lo que resulta en el cambio del codón que codifica un triptófano (W) en la posición 116 por un codón de terminación. Una cepa de S. avermitilis con esta mutación no producía avermectinas normales y tenía el mismo perfil, de fermentación que las cepas SE180-1 1 , SE184-1-13 y SE185-5a. Adicionalmente, se produjeron mutaciones en el gen aveC que cambian tanto: (i) la posición del nucleótido 970 de G a A, que cambia el aminoácido en la posición 266 de una glicina (G) a un aspartato (D), y (ii) la posición del nucleótico 996 de T a C, que cambia el aminoácido en la posición 275 de tirosina (Y) a hístidina (H) . Una cepa de S. avermitilis con estas mutaciones (G266D/Y275H) no producía avermectinas normales y tenía el mismo perfil de fermentación que las cepas SE180-11 , SE184-1-13 y SE185-5a. Las cepas mutantes por inactivación aveC de S. Avermitilis SE180-1 1 , SE184-1-13, SE185-5a y otras proporcionadas por la presente, proporcionan herramientas de rastreo para verificar el impacto de otras mutaciones en el gen aveC. pSE186, que contiene una copia de tipo salvaje del gen aveC, se transformó en DM1 de E. coli y el ADN del Plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este ADN de pSE186 se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE180-1 1 de S. avermitilis. Se aislaron transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-1 1 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por análisis de HPLC de productos de fermentación. La presencia del gen aveC funcional en trans era capaz de restaurar la producción normal de avermectinas a la cepa SE180-11 (FIGURA 5B) . 8.2 Análisis de mutaciones en el gen aveC que alteran las relaciones de clase B2:B1 Según se describe anteriormente, la cepa SE180-11 de S. avermitilis, que contiene un gen aveC inactivo, se complementó mediante transformación con un plásmido que contenía un gen aveC funcional (pSE186). La cepa SE180-11 se utilizó también como una cepa huésped para caracterizar otras mutaciones en el gen aveC, según se describe más adelante. ADN cromosómico se aisló de la cepa 1 100-SC38 y se utilizó como una plantilla para la amplificación por PCR del gen aveC. El ORF de 1.2 Kb se aisló mediante amplificación por PCR utilizando cebadores diseñados sobre la base de la secuencia de nucleótidos de aveC. El cebador de la derecha era SEQ ID N°:6 y el cebador de la izquierda era SEQ ID N°:7 (véase la Sección 7.1.10. anterior). La PCR y las condiciones de subclonacion eran como se describen en la Sección 7.1.10. El análisis de la secuencia de ADN del ORF de 1.2 Kb muestra una mutación en el gen aveC que cambia la posición de nt 337 de C a T que cambia el aminoácido en la posición 55 de serina (S) a fenilalanina (F). El gen aveC que contiene la mutación S55F se subclonó en pWHM3 para producir un plásmido que se designó pSE187 y que se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE180-1 de S. avermitilis. Transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-1 1 se aislaron, se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes ThÍor Ermr se analizaron mediante análisis por HPLC de productos de fermentación. La presencia del gen aveC que codifica un cambio en el residuo aminoácido 55 (S55F) era capaz de restaurar la producción normal de avermectinas de la cepa SE180-11 (FIGURA 5C); sin embargo, la relación ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 era aproximadamente 26:1 , en comparación con la cepa SE180-1 1 transformada con pSE186, que tenía una relación de B2:B1 de aproximadamente 1.6:1 (cuadro 3), indicando que la modulación sencilla (S55F) modula la cantidad de ciclohexilo B2 producida con relación a ciclohexilo-B1. Se identificó otra mutación en el gen aveC que cambia la posición de nt 862 de G a A, que cambia el aminoácido en la posición 230 de glicina (G) a aspartato (D) . Una cepa de S. avermitilis que tiene esta mutación (G230D) produce avermectinas en una relación B2:B1 de aproximadamente 30:1. 8.3. Mutaciones que reducen la relación B2:B1 Se construyeron varias mutaciones que reducen la cantidad de ciclohexilo-B2 producida con relación a ciclohexilo-B1 , como sigue. Se identificó una mutación en el gen aveC que cambia la posición del nt 588 de G a A, que cambia el aminoácido en la posición 139 de alanina (A) a treonina (T) . El gen aveC que contiene la mutación A139T se subclonó en pWHM3 para producir un plásmido que se designó pSE188 y que se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-1 1 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron mediante análisis por HPLC de productos de fermentación. La presencia del gen aveC mutado que codifica un cambio en el residuo aminoácido 139 (A139T) era capaz de restaurar la producción de avermectinas a la cepa SE180-1 1 (FIGURA 5D); sin embargo, la relación B2:B1 era aproximadamente 0.94:1 , indicando que esta mutación reduce la cantidad de ciclohexilo-B2 producida con relación a ciclohexilo-B1 . Este resultado era inesperado, debido a que los resultados publicados, así como los resultados de mutaciones descritos anteriormente, han demostrado solamente una inactivación del gen aveC o una producción incrementada de la forma B2 de avermectina con relación a la forma B1 (cuadro 3). Debido a que la mutación A139T alteraba la relación B2:B1 en la dirección B1 más favorable, se construyó una mutación que codificaba una treonina en lugar de una serina en la posición de aminoácido 138. Así, pSE186 se digerió con EcoRI y se clonó en pGEM3Zf (Promega) que había sido digerido con EcoRI. Este plásmido, que se designó pSE186a, se digerió con Apal y Kpnl, los fragmentos de ADN se separaron sobre un gel de agarosa y dos fragmentos de ~ 3.8 Kb y - 0.4 Kb se purificaron a partir del gel. El ADN de la inserción de ~ 1 .2 Kb procedente de pSE186 se utilizó como una plantilla de PCR para introducir un simple cambio de base en la posición del nt 585. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir una mutación en la posición del nt 585 y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR de la derecha era: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID N°:12); y el cebador de PCR de la izquierda era: 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID N°: 13). La reacción por PCR se llevó a cabo utilizando un estuche de PCR genómico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) en tampón proporcionado por el fabricante en presencia de 200 pM de dNTPs, 200 pmol de cada cebador, 50 ng de ADN de plantilla y masa fundida GC 1.0 M y 1 unidad de mezcla de Taq polimerasa Klen en un volumen final de 50 µ?. El perfil térmico del primer ciclo era 94°C durante 1 min; seguido de 25 ciclos de 94°C durante 30 s y 68°C durante 2 min; y 1 ciclo a 68°C durante 3 min. Un producto de PCR de 295 pb se digerió con Apal y Kpnl para liberar un fragmento de 254 pb, que se resolvió por electroforesis y se purificó a partir del gel. Los tres fragmentos (~ 3.8 Kb, ~ 0.4 Kb y 254 pb) se ligaron entre sí en un ligamiento de 3 modos. La mezcla de ligamiento se transformó en células DH5a de E. coli competentes. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se designó pSE198. pSE198 se digerió con EcoRI, se clonó en pWHM3 que había sido digerido con EcoRI, y se transformó en células DH5a de E. coli. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN del plásmido se transformó en DM1 de E. coli, el ADN del plásmido se aisló de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se designó pSE199, se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE180-1 1 de S. avermitilis. Se aislaron transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-1 1 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior ErrrT se analizaron mediante análisis por HPLC de productos de fermentación. La presencia del gen aveC mutado que codifica un cambio en el residuo aminoácido 138 (S138T) era capaz de restaurar la producción normal de avermectina a la cepa SE180-1 1 ; sin embargo, la relación B2:B1 era 0.88:1 , indicando que esta mutación reduce la cantidad de ciclohexilo-B2 producida con relación a ciclohexilo-B1 (cuadro 3). Esta relación B2:B1 es incluso menor que la relación 0.94:1 observada con la mutación A139T producida por la transformación de la cepa SE180-11 con pSE188, según se describe antes. Se construyó otra mutación para introducir una treonina en las posiciones de aminoácidos tanto 138 como 139. El ADN de la inserción de ~ 1.2 Kb procedente de pSE186 se utilizó como una plantilla de PCR. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir mutaciones en las posiciones nt 585 y 588 y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) El cebador de PCR de la derecha era: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID N°: 4); y el cebador de PCR de la izquierda era: 5'-G G AACATC ACG G C ATTCACC-3' (SEQ ID N° :15) . La reacción por PCR se llevó a cabo utilizando las condiciones descritas inmediatamente antes en esta Sección. Un producto de PCR de 449 pb se digerió con Apal y Kpnl para liberar un fragmento de 254 pb, que se resolvió por electroforesis y se purificó a partir del gel. pSE186a se digerió con Apal y Kpnl, los fragmentos de ADN se separaron en un gel de agarosa y a partir del gel se purificaron dos fragmentos de - 3.8 Kb y - 0.4 Kb. Los tres fragmentos (~ 3.8 Kb, ~ 0.4 Kb y 254 pb) se ligaron entre sí en un ligamiento de 3 modos y la mezcla de ligamiento se transformó en células DH5a de E. coli competentes. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se designó pSE230. pSE230 se digerió con EcoRI, se clonó en pWHM3 que había sido digerido con EcoRI, y se transformó en células DH5a de E. coli. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN del plásmido se transformó en DM1 de E. coli, el ADN del plásmido se aisló de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se designó pSE231 , se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE 180-1 1 de S. avermitilis. Se aislaron transformantes resistentes a tioestreptona de SE180-1 1 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron mediante análisis por fermentación. La presencia del gen aveC doble mutado que codifica S138T/A139T era capaz de restaurar la producción normal de avermectinas a la cepa SE180-1 1 ; sin embargo, la relación B2:B1 era 0.84:1 , demostrando que esta mutación reduce además la cantidad de ciclohexilo-B2 producida con relación a ciclohexilo-B1 (cuadro 3), frente a las reducciones proporcionadas por la transformación de la cepa SE180-11 con pSE188 o pSE199, según se describe antes.
Se construyó otra mutación para reducir adicionalmente la cantidad de ciclohexilo-B2 producida con relación a ciclohexílo-B1. Dado que las mutaciones S138T/A139T alteraban las relaciones B2.B1 en la dirección B1 más favorable, se construyó una mutación para introducir una treonina en la posición de aminoácido 138 y una fenilalanina en la posición de aminoácido 139. Como plantilla de PCR se utilizó el ADN de la inserción de - 1.2 Kb procedente de pSE186. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir mutaciones en las posiciones de nt 585 (cambiando una T por A) , 588 (cambiando una G por T) y 589 (cambiando una C por T) y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) . El cebador de PCR de la derecha era: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGCGTT C-3' (SEQ ID N°:16); y el cebador de PCR de la izquierda era: 5'-GGAACATCACCGGCATTCACC-3' (SEQ ID N°:15). La reacción por PCR se llevó a cabo utilizando un estuche de PCR genómico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) en tampón proporcionado por el fabricante en presencia de 200 µ? de dNTPs, 200 pmol de cada cebador, 50 ng de ADN de plantilla, acetato de Mg 1 .1 m y masa fundida GC 1.0 M y 1 unidad de mezcla de Tth ADN polimerasa Klen en un volumen final de 50 µ?. El perfil térmico del primer ciclo era 94°C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de 94°C durante 30 s y 68°C durante 2 min, y 1 ciclo a 68°C durante 3 min. Un producto de PCR de 449 pb se digerió con Apal y Kpnl para liberar un fragmento de 254 pb, que se resolvió por electroforesis y se purificó a partir del gel. Los tres fragmentos (~ 3.8 Kb, ~ 0.4 Kb y 254 pb) se ligaron entre sí en un ligamiento de 3 modos. La mezcla de ligamiento se transformó en células DH5a de E. coli competentes. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se designó pSE238. pSE238 se digerió con EcoRI, se clonó en pWHM3 que había sido digerido con EcoRI, y se transformó en células DH5a de E. coli. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina, y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN del plásmido se transformó en DM1 de E. coli, el ADN del plásmido se aisló de transformantes resistentes a ampicilina y la presencia de la inserción correcta se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se designó pSE239, se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE180-1 1 de S. avermitilis. Se aislaron transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-1 1 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron mediante análisis por HPLC de productos de fermentación. La presencia del gen aveC doble mutado que codifica S138T/A139F era capaz de restaurar la producción normal de avermectina a la cepa SE180-11 ; sin embargo, la relación B2:B1 era 0.75:1 , indicando que esta mutación reduce además la cantidad de ciclohexilo-B2 producida con relación a ciclohexilo-B1 (cuadro 3), frente a las reducciones proporcionadas por la transformación de la cepa SE 80-11 con pSE188, pSE199 o pSE231 , según se describe antes.
CUADRO 3 Se construyeron mutaciones adicionales para reducir adicionalmente la cantidad de ciclohexilo-B2 producida con relación a ciclohexilo-B1 , utilizando la técnica de redistribución de ADN según se describe en Stemmer, 1994, Nature 370:389-391 ; y Stemmer, 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91.10747-10751 ; y según se describe adicionalmente, en las patentes de Estados Unidos n°s 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721 ; y 5.837.458. Plásmídos redistribuidos de ADN que contenían genes aveC mutados se transformaron en células de E. coli dam. dcm competentes. El ADN del plásmido se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y se utilizó para transformar protoplastos de la cepa SE180-1 1 de S. avermitilis. Transformantes resistentes a tioestreptona de la cepa SE180-11 se aislaron y rastrearon en cuanto a la producción de avermectinas con una relación ciclohexilo-B2:ciclohexilo-B1 de 1 :1 o menor. Se determinó la secuencia del ADN del plásmido procedente de transformantes dé SE180-1 1 productores de avermectinas con una relación B2:B1 de 1 :1 o menor. Se identificaron ocho transformantes que producían cantidades reducidas de ciclohexilo-B2 con relación a ciclohexilo-B1. La relación B2:B1 más baja conseguida entre estos transformantes era 0.40:1 (cuadro 4). El ADN del plásmido se aisló a partir de cada uno de los ocho transformantes y se determinó la secuencia de ADN para identificar las mutaciones en el gen aveC. Las mutaciones son como sigue. pSE290 contiene 4 mutaciones en nucleótidos en la posición de nt 317 de T a A, en la posición de nt 353 de C a A, en la posición de nt 438 de G a A y en la posición de nt 1 155 de T a A. El cambio de nucleótidos en la posición de nt 317 cambia el aminoácido en la posición de aminoácido AA 48 de D a E y el cambio de nucleótido en la posición de nt 438 cambia el aminoácido en la posición de AA 89 de A a T. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.42:1 (cuadro 4). pSE291 contiene 4 mutaciones en nucleótidos en la posición de nt 272 de G a A, en la posición de nt 585 de T a A, en la posición de nt 588 de G a A y en la posición de nt 708 de G a A. El cambio de nucleótidos en la posición de nt 585 cambia el aminoácido en la posición de AA 138 de S a T, y el cambio de nucleótido en la posición de nt 558 cambia el aminoácido en la posición AA 139 de A a T y el cambio de nucleótido en la posición de nt 708 cambia el aminoácido en la posición de AA 179 de G a S. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.57:1 (cuadro 4). pSE292 contiene las mismas cuatro mutaciones de nucleótidos que pSE290. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.40:1 (cuadro 4). pSE293 contiene 6 mutaciones en nucleótidos en el nt 24 de A a G, en la posición de nt 286 de A a C, en la posición de nt 497 de T a C, en la posición de nt 554 de C a T, en la posición de nt 580 de T a C y en la posición de nt 886 de A a T. El cambio de nucleótidos en la posición de nt 286 cambia el aminoácido en la posición AA 38 de Q a P, el cambio de nucleótido en la posición de nt 580 cambia el aminoácido en la posición AA 136 de L a P y el cambio de nucleótido en la posición de nt 886 cambia el aminoácido en la posición de AA 238 de E a D. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.68:1 (cuadro 4). pSE294 contiene 6 mutaciones en nucleótidos en el nt 469 de T a C, en la posición de nt 585 de T a A, en la posición de nt de 588 de G a A, en la posición de nt 708 de G a A, en la posición de nt 833 de C a T y en la posición de nt 1184 de G a A. Además, los nts en las posiciones 173, 174 y 175 están suprimidos. El cambio de nucleótidos en la posición de nt 469 cambia el aminoácido en la posición de AA 99 de F a S, el cambio de nucleótido en la posición de nt 585 cambia el aminoácido en la posición de AA 138 de S a T, el cambio de nucleótido en la posición de nt 588 cambia el aminoácido en la posición de AA 139 de A a T y el cambio de nucleótido en la posición de nt 708 cambia el aminoácido de la posición de AA 179 de G a S. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.53:1 (cuadro 4). pSE295 contiene 2 mutaciones en nucleótidos en el nt 588 de G a A, y en el nt 856 de T a C. El cambio de nucleótidos en la posición de nt 588 cambia el aminoácido en la posición de AA 139 de A a T y el cambio de nucleótido en la posición de nt 856 cambia el aminoácido en la posición AA 228 de M a T. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.80:1 (cuadro 4). pSE296 contiene 5 mutaciones en nucleótidos en la posición de nt 155 de T a C, en la posición de nt 505 de G a T, en la posición de nt 1039 de C a T, en la posición de nt 1202 de C a T y en el nt 1210 de T a C. El cambio de nucleótidos en la posición de nt 505 cambia el aminoácido en la posición de AA 1 1 1 de G a V, y el cambio de nucleótido en la posición de nt 1039 cambia el aminoácido en la posición AA 289 de P a L. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.73:1 (cuadro 4). pSE297 contiene 4 mutaciones en nucleótidos en la posición de nt 377 de G a T, en la posición de nt 588 de G a A, en la posición de nt 633 de A a G, y en la posición de nt 1067 de A a T. El cambio de nucleótidos en la posición de nt 588 cambia el aminoácido en la posición AA 139 de A a T, el cambio de nucleótido en la posición de nt 633 cambia el aminoácido en la posición de AA 154 de K a E y el cambio de nucleótido en la posición de nt 1067 cambia el aminoácido en la posición de AA 299 de Q a H. La relación B2:B1 producida por células portadoras de este plásmido era 0.67:1 (cuadro 4).
CUADRO 4 Se llevó a cabo una ronda adicional de redistribución de ADN para reducir adicionalmente la cantidad de avermectina c¡clohexilo-B2 producida con relación a la avermectina ciclohexilo-B1 como sigue.
Redistribución semi-sintética El mejor clon se redistribuyó utilizando el método descrito en la publicación internacional PCT WO 97/20078 por Maxygen Inc. Oligonueleótidos individuales que codifican sustituciones beneficiosas, que corresponden óptimamente a una relación B2:B1 disminuida se añadieron a la reacción de redistribución en un exceso 5 molar frente las cadenas de plantilla aveC. Cada desapareamiento de nucleótido del oligonucleótido estaba flanqueado por 20 nucleótidos de identidad perfecta para asegurar una incorporación adecuada durante la reacción de redistribución. Los oligonueleótidos se adquirieron de Operan Technologies (Alameda, CA).
Desarrollo HTP de S. avermitilis Se tomaron clones independientes de las placas de transformación y se inocularon en 200 µ? de medio R5 (Kieser, T., et al., "Practical Streptomyces Genetics", 2000, Norwich, Reino Unido, John Innes Foundation) en placas de siembra de 96 pocilios profundos y se desarrollaron a 30°C, con sacudimiento. En cada pocilio se dispensó una perla de vidrio para la dispersión de micelios y la agitación del cultivo. Durante este tiempo, los cultivos lograron un desarrollo uniforme y denso. Después de 4-5 días, se dispensaron 20 pl del cultivo en medio de siembra a placas de producción, y el volumen remanente se congeló en calidad de placas maestras a -80°C después de la adición de glicerol hasta la concentración final de 20%. Las placas de producción se incubaron a 30° bajo humedad durante 12-14 días. La esporulación de las cepas se produjo después de 5-8 días de incubación. Las placas de producción se prepararon esencialmente según se describe en la publicación internacional PCT WO 99/41389 de Pfizer Inc., con la excepción de añadir agarosa al 1% para asegurar una superficie sólida.
Extracción y rastreo por ESI-MS/ S Un total de 1 mi de acetato de etilo se añadió en cada pocilio y se incubó con sacudimiento a la temperatura ambiente durante 20 minutos. Aproximadamente 750 µ? de la fase en acetato de etilo se recuperaron, se transfirieron a una placa de 96 pocilios y se depositaron para evaporarse durante la noche. El precipitado se resuspendió en 100 µ? de metanol, NaCI 1 mM, de los cuales 5 µ? de solución se inyectaron en un espectrómetro de masas mediante un automuestreador en un formato de 96 pocilios y se analizaron directamente en la fase de inyección de flujo sin cromatografía líquida ni otra separación. Los compuestos se ionizaron por ionización por electroproyeccíón y dos canales separados se vigilaron sobre dos transiciones en MS/MS. La transición MS/MS para el ion sodiado B1 es de m/z 921 a m/z 777, y para el ion sodiado B2 es de m/z 939 a m/z 795 en modo positivo. Para este rastreo de alto rendimiento se utilizó un espectrómetro de masas Fínnigan TSQ-7000, Micromass Quattro-LC y un automuestreador Twin-Pal Leap Technology. La integración de los cromatogramas B1 y B2 separados para cada localización del pocilio identificaron los impactos. Se identificaron cincuenta y siete (57) nuevas combinaciones de sustituciones de aminoácidos que pueden producir relaciones de avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexilo B1 de 0.35:1 o menor (cuadros A-M). Varias de estas nuevas mutaciones pueden producir mutaciones de avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 de aproximadamente 0.30:1 o menor; varias pueden producir mutaciones de avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 de aproximadamente 0.25:1 o menor y varias pueden producir relaciones de avermectinas ciciohexilo B2: ciciohexilo B1 de aproximadamente 0.20:1 o menor. Se identificaron dos (2) nuevas mutaciones que pueden producir relaciones de avermectinas ciciohexilo B2:ciclohexílo B1 de 0.37 ó 0.38.
Depósito de materiales biológicos Los siguientes plásmidos se depositaron ante la American Type Culture Collection (ATCC) en 12301 Parklawn Drive, Rockville, D, 20852, EE.UU. el 29 de enero de 1998, y se les asignaron los siguientes números de acceso: Plásmido N° de acceso plásmido pSE180 209605 plásmido pSE186 209604 La dirección actual de American Type Culture Collection es 10801 University Blvd, Manassas, VA, 20110, EE.UU. Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas anteriormente se incorporan en esta memoria como referencia en su totalidad. La presente invención no se ha de limitar en su alcance por la realización específica descrita en esta memoria que está destinada como simple ilustración de aspectos individuales de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del alcance de la invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en esta memoria, resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que antecede y de los dibujos que se acompañan. Dichas modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> PFIZER PRODUCTS INC <120> GEN DE STREPTOMYCES AVERMITILIS QUE RIGE LA RELACION DE AVERMECTINAS B2:B1 <130> PC23034A <140> PC23034A <141> 2002-02-12 <160> 16 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1229 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <220> <221> CDS <222> (174) .. (1085) <400> 1 tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60 tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120 aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg 176 Val 1 gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac 224 Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr 5 10 15 gtg ttc age cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg ate gag acg 272 Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu lie Glu Thr 20 25 30 gcg ggc cag ggt cag ggc ggc age aag gat acg ggg act acc gat gtg 320 Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val 35 40 45 gtc tat ecc gtg att tec gtc gtc tgc ate acc gcc gcg gcg gcg tgg 368 Val Tyr Pro Val lie Ser Val Val Cys lie Thr Ala Ala Ala Ala Trp 50 55 60 65 etc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt 416 Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu 70 75 80 ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg age tgg cag age ceg etc atg aac 464 Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met Asn 85 90 95 tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg 512 Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val 100 105 110 ggt tcc tgg ggt ceg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ceg ggt 560 Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro Gly 115 120 125 gcg gag gcg gaa atg ceg ctg gcg teg gee tcc gtc tgc atg teg gct 608 Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala 130 135 140 145 ctg ate gtc acc gtg ctg tgc age aag gca ctg ggg tgg ate aag gee 656 Leu lie Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp lie Lys Ala 150 155 160 cgc cgg ceg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gee gtg ttc ttc 704 Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe Phe 165 170 175 ate ggc ate gtg ctc ggt ctg tcc gag ceg ctg ceg tcc gee tcc ggg 752 lie Gly lie Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly 180 185 190 ate age gta tgg gee aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc 800 lie Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly 195 200 205 gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc 848 Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu Val 210 215 220 225 tgc tgc atg ctg ggc teg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag 896 Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu 230 235 240 teg tgg gtg gaa cgg gga gee tgg cgg ttg ceg caá cgg gca gcg aac 944 Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala Asn 245 250 255 tgg gcg cgt ttc ctc gee gtg gtc ggt ggg gtg aat gee gtg atg ttc 992 Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met Phe 260 265 270 ctc tac acc tgt ttc cat ate ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ceg 1040 Leu Tyr Thr Cys Phe His lie Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln Pro 275 280 285 ccc gac caá ctg ceg gac tcc ttc caá gcg ceg gee gct tac tga 1085 Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145 ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205 acactcctcg gttcagcgat catg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 2 Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu lie Glu 20 25 30 Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp 35 40 45 Val Val Tyr Pro Val lie Ser Val Val Cys lie Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser 130 135 140 Ala Leu lie Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp lie Lys 145 150 155 160 Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe 165 170 175 Phe lie Gly lie Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser 180 185 190 Gly lie Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser 195 200 205 Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu 210 215 220 Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp 225 230 235 240 Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala 245 250 255 Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met 260 265 270 Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His lie Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln 275 280 285 Pro Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <220> <221> CDS <222> (58) (990) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg 57 gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg. tgt gtc ggc gcg ctg gtg 105 Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac age ggc 153 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 tac cgc ate gag aag gcg tec ceg gcc agg ggc ggt ggg gac teg gag 201 Tyr Arg lie Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 cgg ate gcc gat gtg ctg ate ceg ctg ctg tec gtg gtg gga gcg gtg 249 Arg lie Ala Asp Val Leu lie Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 gtc ctc gca gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg 297 Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 acg ttc gac gcg teg ctc ttc ate ggg ctg ctg teg gcc agt tgg cag 345 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe lie Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln 85 90 95 agt ccc ttg atg aac tgg ate aat ceg gtg ctc gcg tea aac gtc aat 393 Ser Pro Leu Met Asn Trp lie Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 gtg ttc gga gcg gtg gcc teg tgg ggg ceg tat gtg ccc ggt tgg cag 441 al Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 ggg gcg ggg gcg cae cag gag gcc gag ctg ceg ctg gcg acc ctg age 489 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 ate tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg 537 lie Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc 585 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu lie 165 170 175 gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg 633 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp lie Ala Glu Pro Leu 180 185 190 gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gca gtg ccc gag ctg 681 Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 acc atc tgg agt ggg cae tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg 729 Thr lie Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 gct teg gcg ctc ttc ggc gcc tet ttg ggg gcc gcg cgc cae ttt cgc 777 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg 825 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 gag ggc ccg agg cea tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 aac atc age atc gcc ctc tac acc ggc gca cae ggc gca cae atc ctg 921 Asn lie Ser lie Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His lie Leu 275 280 285 ttc teg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg taccegatgt 1020 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1 40 gcggccgggg 1150 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 4 Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Al Leu Val 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Arg lie Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 Arg lie Ala Asp Val Leu lie Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe lie Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln 85 90 95 Ser Pro Leu Met Asn Trp lie Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 lie Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 Gly Leu Ala Ala Ala Arg rp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu lie 165 170 175 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp lie Ala Glu Pro Leu 180 185 190 Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 Thr lie Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Asn lie Ser lie Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His lie Leu 275 280 285 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400> 5 Val lie Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gln Val 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp 20 25 30 Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg lie lie Asp 35 40 45 Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe 50 55 60 Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr 130 135 140 Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg 145 150 155 160 Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Phe 165 170 175 Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe lie Ser Phe Ala 180 185 190 Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg 195 200 205 Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 <210> 6 <211> 18 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 tcacgaaacc ggacacac <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag 18 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 9 aactccggtc gactcccctt c 21 <210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 10 gcaaggatac ggggactac <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 11 gaaccgaccg cctgatac 18 210> 12 211> 43 212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 12 gggggc 9c ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg 43 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 13 ggaaccgacc gcctgat 20 <210> 14 <211> 46 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 14 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 15 ggaacatcac ggcattcacc 20 210> 16 211> 46 212> ADN <213> Streptomyces avermitilis <400> 16 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc 46

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1.- Una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que, por lo demás, es la misma que el alelo aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis o la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) aveC de S. avermitilis, según se presenta en SEQ ID N°:1 , o una variante de la misma, que incluye uno o más cambios silenciosos a la secuencia de nucléotidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero secuencia de nucleótidos que comprende, adicionalmente, mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en los residuos aminoácido a las posiciones de aminoácidos de SEQ ID N°:2, de modo que células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis, en las que el alelo aveC de tipo salvaje ha sido inactivado y que expresan la molécula de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una relación de clase 2:1 de avermectinas que está reducida en comparación con la relación producida por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje, en donde, cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , la relación de avermectinas de clase 2:1 es 0.35:1 o menor.
2. - La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la relación de avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 es aproximadamente 0.20:1 o menor.
3. - La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179G; 0) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (I) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G11 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231 L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F243S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb)D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
4.- Una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que, por lo demás, es la misma que el alelo aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia del plásmido pSE186 (ATCC 209604) codificadora del producto génico AveC de S. avermitilis o la secuencia de nucleótidos del ORF de aveC de S. avermitilis, según se presenta en SEQ ID N°:1 , o una variante de la misma, que incluye uno o más cambios silenciosos a la secuencia de nucléotidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero secuencia de nucleótidos que comprende, adicionalmente, mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en los residuos aminoácido correspondientes a las posiciones de aminoácidos de SEQ ID N°:2, de modo que células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis, en las que el alelo aveC de tipo salvaje ha sido inactivado y que expresan una molécula de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una relación de clase 2:1 de avermectinas que está reducida en comparación con la relación producida por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que, en su lugar, expresan únicamente el alelo aveC de tipo salvaje, en donde, cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 , la relación de avermectinas de clase 2:1 se reduce a aproximadamente 0.40:1 o menor, y en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; y (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.
5.- Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 o la reivindicación 4.
6.- Un método para preparar una cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante del mismo, que incluye uno o más cambios silenciosos a la secuencia de nucléotidos de acuerdo con la degeneración del código genético, que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (a) D48E, A61T. A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179G, ) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (I) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G11 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G1 1 1V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G11 1V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231 L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41 G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F243S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G1 11V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb)D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.
7. - Un método para preparar una cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante del mismo, que incluye uno o más cambios silenciosos a la secuencia de nucléotidos de acuerdo con la degeneración del código genético, que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde células que comprenden el alelo aveC mutado o una variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexilo B2:ciclohexilo B1 en una relación de 0.35:1 o menor.
8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179G, (j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (I) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L; (q) D48E, L136P, G179S, R250W; (r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S; (s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G1 1V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231 L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G1 1 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41 G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F243S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G1 11V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb)D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T. A139F, G179S, V196A, E238D.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la relación de avermectinas ciclohexílo B2:ciclohexilo B1 es aproximadamente 0.20:1 o menor.
10. - Un método para preparar una nueva cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, mutación que da como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo aveC mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en donde la combinación de sustituciones de aminoácidos se selecciona del grupo consistente en: (bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; y (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D. 1 1. - Una célula de una especie de Streptomyces que comprende un alelo aveC de S. avermitilis mutado o una variante degenerada del mismo que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179G, (j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L; (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (I) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L; (n) D48E, L84P, G11 1V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L; (o) Y28C, D48E, A61T, A198G, P289L; (t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L; (v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (w) D48E, A61T, A89T, G1 1 1 V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L; (x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141 A, I 159T, R163Q, G179S; (y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D; (z) D48E, A61T, A89T, G1 1 1 V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231 L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G1 1 1 V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41 G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F243S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61 T, A89T, L136P, G179S, V196A, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb)D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (be) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. 12.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque es una célula de Streptomyces avermitilis. 13.- Una célula de una especie de Streptomyces, que comprende un alelo aveC de S. avermitilis mutado o una variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente en: (bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; y (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.
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