CZ304402B6

CZ304402B6 - Polynukleotidová molekula, vektor a hostitelská buňka, mutovaný kmen S. avermitilis a způsob produkce avermektinů

Info

Publication number: CZ304402B6
Application number: CZ2002-296A
Authority: CZ
Inventors: Yan Chen; Claes Gustafsson; Anke Krebber; Jeremy Stephen Minshull; Sun Ai Raillard; Kim Jonelle Stutzman-Engwall
Original assignee: Zoetis P Llc
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2014-04-16
Also published as: US20040009560A1; ATE341632T1; CA2380872C; MA26813A1; US20030232415A1; EA200200056A1; JP3884651B2; US6632673B1; AU778837B2; BR0013119A; US7858340B2; SK1392002A3; HUP0202487A3; CO5290295A1; PA8499501A1; IL147563A0; KR100489856B1; HK1046710B; NO20020664L; DK1200606T3

Abstract

Izolovaná polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako SEQ ID č. 1, nebo její degenerovaná varianta, s výjimkou rozdílu sestávajícího z mutací kódujících alespoň jednu kombinaci substitucí aminokyselin v sekvenci SEQ ID č. 2, zvolenou z D48E/A89T, S138T/A139T/G179S, Q38P/L136P/E238D, F99S/S138T/A139T/G179S, A139T/M228T, G111V/P289L a A139T/K154E/Q298H, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, ve kterých byla aveC alela divokého typu inaktivována, a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1, který je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely. Rekombinantní vektor obsahující tuto polynukleotidovou molekulu a hostitelská buňka, přednostně Streptomyces, zvláště S. avermitilis, obsahující tuto polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor. Způsob přípravy tohoto kmene S. avermitilis příslušnu mutací aveC alely. Způsob produkce avermektinů kultivací buněk tohoto kmene S. avermitilis.

Description

1. Vynález se týká kmene S. avermitilis s mutovanou aveC alelou, schopného produkovat poměr cyklohexyl B2 avermektinů třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinů třídy 1, který je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely. Vynález se také týká způsobu přípravy tohoto kmene a příslušné izolované polynukleotidové molekuly s vhodnou mutací a rekombinantního vektoru obsahujícího tuto polynukleotidovou molekulu. Vynález se také týká způsobu produkce avermektinů kultivací buněk tohoto kmene S. avermitilis.

Dosavadní stav techniky

2.1. Avermektiny

Streptomycety produkují celou řadu sekundárních metabolitů včetně avermektinů, které zahrnují sérii osmi příbuzných šestnáctičlenných makrocyklických laktonů majících silnou antihelmintickou a insekticidální aktivitu. Osm odlišných a blízce příbuzných sloučenin je označováno jako Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a a B2b. Série „a“ sloučenin se týká přirozeného avermektinů, kde substituentem v pozici C25 je (S)-sec-butyl, a „b“ série sloučenin se týká těch sloučenin, kde substituentem v C25 pozici je izopropyl. Označení „A“ a „B“ se týká avermektinů, kde substituent v C5 pozici je methoxy, respektive hydroxy skupina. Číslo „1“ se týká avermektinů, kde dvojná vazba je přítomná v pozici C22,23 a číslo „2“ se týká avermektinů majících vodík v pozici C22 a hydroxy skupinu v pozici C23. Mezi příbuznými avermektiny je typ B1 avermektinu rozeznáván jako avermektin mající nejúčinnější antiparazitickou a pesticidovou aktivitu a je proto komerčně nejvíce žádoucím avermektinem.

Avermektiny a jejich produkce aerobní fermentací kmenů S. avermitilis jsou popsány v patentech US 4 310 519 a US 4 429 042. Biosyntéza přirozených avermektinů je pravděpodobně zahajována endogenně z CoA thioesterových analogů kyseliny izomáselné a kyseliny S-(+)-2-methylmáselné.

Kombinace zlepšení kmene náhodnou mutagenezí i použití exogenně dodaných mastných kyselin vedlo k účinné tvorbě analog avermektinů. Mutanty S. avermitilis s deficiencí s deficiencí dehydrogenázy 2-oxo kyselin (bkd deficientní mutanty) mohou produkovat avermektiny pouze, jsou-li fermentace suplementovány mastnými kyselinami. Vyhledávání a izolace mutant s deficiencí dehydrogenázové aktivity větvených řetězců (například S. avermitilis, ATCC 535567) jsou popsány v patentu EP 276 103. Fermentace takových mutant v přítomnosti exogenně dodaných mastných kyselin vede k produkci pouze čtyř avermektinů odpovídajících použitým mastným kyselinám. Takto dochází suplementací fermentací S. avermitilis (ATCC 53567) S-(+)-2methylmáselnou kyselinou k tvorbě přirozených avermektinů Ala, Alb, Bia aB2a, suplementace fermentací kyselinou izomáselnou vede k tvorbě přirozených avermektinů Alb, A2b, Blba B2b, a suplementace fermentací kyselinou cyklopentankarboxylovou vede k tvorbě čtyř nových cyklopentylavermektinů Al, A2, B1 a B2.

Pokud je provedena suplementace jinými mastnými kyselinami, dochází k tvorbě nových avermektinů. Vyhledáváním více než 800 potenciálních prekurzorů bylo identifikováno více než 60 dalších nových avermektinů (viz například Dutton et al., 1991, J Antibiot 44:357-367, a Banks et al., 1994, Roy Soc Chem 147:16—26). Mutanty S. avermitilis s deficiencí aktivity

5-O-methyltransferázy navíc produkují zásadně pouze B analogové avermektiny. Mutanty S. avermitilis bez aktivity dehydrogenázy větvených 2-oxo kyselin i 5-O-methyltransferázy

-1 CZ 304402 B6 produkují pouze B avermektiny odpovídající mastným kyselinám použitým k suplementaci fermentace. Suplementace takových dvojitých mutant S-(+)-2-methylmáselnou kyselinou vede k tvorbě pouze přirozených avermektinů Bia a B2, zatímco suplementace kyselinou izomáselnou nebo cyklopentankarboxylovou vede k tvorbě přirozených avermektinů Blba B2b, nebo nových cyklopentyl B1 a B2 avermektinů. Suplementace dvojitých zmutovaných kmenů cyklohexankarboxylovou kyselinou je přednostní způsob pro produkci komerčně důležitého nového avermektinů, cyklohexylavermektinu B1 (doramektinu). Izolace a charakteristiky takových dvojitých mutantů, například S. avermitilis (ATCC 53692) jsou popsány v EP 276 103.

2.2. Geny hrající roli v biosyntéze avermektinů

V mnoha případech jsou geny hrající roli v produkci sekundárních metabolitů a geny kódující konkrétní antibiotikum nacházeny v klastrech na chromozómu. Toto je případ například klastů genů Streptomyces pro polyketid syntázu (PKS) (viz Hopwood a Sherman, 1990, Ann Rev Genet 24:37-66). Jednou ze strategií klonování genů v biosyntetické dráze byla izolace genu pro lékovou rezistenci a poté testování přilehlých oblastí chromozómu na další geny mající vztah k biosyntéze takového konkrétního antibiotika. Další ze strategií klonování genů hrajících roli v biosyntéze důležitých metabolitů byla komplementace mutantů. Části DNA knihovny z organismu produkujícího konkrétní metabolit jsou vloženy do neprodukujícího mutovaného kmene a transformované kmeny jsou vyhledávány podle tvorby metabolitů. Navíc byla použita k identifikaci a klonování genů v biosyntetických drahách hybridizace knihovny za použití prób odvozených z kmenů Streptomyces.

Geny hrající roli v biosyntéze avermektinů (ave geny), podobně jako geny vyžadované pro biosyntézu jiných sekundárních metabolitů Streptomyces (například PKS) jsou nacházeny v klastrech na chromozómu. Za použití vektorů ke komplementaci mutantů S. avermitilis s blokádou biosyntézy avermektinů byla úspěšně nakloňována celá řada ave genů. Klonování takových genů je popsáno v patentu US 5 252 474. Ikeda et al. 1995, J Antibiot 48:532-534 navíc popsal lokalizaci chromozomální oblasti obsahující C22,23 dehydratační krok (aveC) na fragmentu S. avermitilis 4,82 Kb BamHI, stejně tak jako mutace v genu aveC, které vedou k produkci jedné komponenty B2a. Protože ivermektin, účinná antihelmintická sloučenina, může být chemicky produkována z avermektinů B2a, je tento kmen produkující jednu komponentu avermektinů B2a považován za obzvlášť užitečný pro komerční tvorbu ivermektinu.

Identifikace mutací aveC genu, které minimalizují komplexnost tvorby avermektinů, jako jsou například mutace, které snižují poměr B2:B1 avermektinů, by mohly zjednodušit produkci a purifikaci komerčně důležitých avermektinů.

Podstata vynálezu

3. Stručný popis vynálezu

Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) je izolovaná polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která je stejnájako SEQ ID č.l, nebo její degenerovaná varianta, s výjimkou rozdílu sestávajícího z mutací kódujících alespoň jednu kombinaci substitucí aminokyselin v sekvenci SEQ ID č. 2, zvolenou z

a) D48E/A89T;

b) S138T/A139T/G179S;

c) Q38P/L136P/E238D;

d) F99S/S138T/A139T/G179S;

-2CZ 304402 B6

e) A139T/M228T;

f) G111V/P289L; a

g) A139T/K154E/Q298H, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, ve kterých byla aveC alela divokého typu inaktivována, a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1, který je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely.

Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména ii) polynukleotidovou molekulu podle provedení i), ve které je poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,8:1 nebo nižší;

iii) polynukleotidovou molekulu podle provedení ii), ve které je poměr tříd 2 : 1 avermektinů 0,68:1 nebo nižší;

iv) polynukleotidovou molekulu podle provedení iii), ve které je poměr tříd 2 : 1 avermektinů 0,53:1 nebo nižší;

v) polynukleotidovou molekulu podle provedení iv), ve které je poměr tříd 2 : 1 avermektinů 0,42:1 nebo nižší;

vi) polynukleotidovou molekulu podle provedení v), ve které je poměr tříd 2 : 1 avermektinů 0,40:1;

vii) polynukleotidovou molekulu podle provedení i), kde mutace v aveC sekvenci kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 317 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 438 SEQ ID č: 1;

viii) polynukleotidovou molekulu podle provedení vii), dále zahrnující záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 353 SEQ ID č.l, a záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1155 SEQ ID č:l;

ix) polynukleotidovou molekulu podle provedení i), kde mutace v aveC sekvenci kódující S138T/A139T/G179S zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č:l, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č: 1;

x) polynukleotidovou molekulu podle provedení ix), dále zahrnující záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 272 SEQ ID č:l;

xi) polynukleotidovou molekulu podle provedení i), kde mutace v aveC sekvenci kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze z A na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 286 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 580 SEQ ID č:l, a záměnu báze zA na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 886 SEQ ID č: 1;

xii) polynukleotidovou molekulu podle provedení xi), dále zahrnující záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 24 SEQ ID č:l, záměnu báze zT na

-3 CZ 304402 B6

C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 497 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 554 SEQ ID č:l;

xiii) polynukleotídovou molekulu podle provedení i), kde mutace v aveC sekvenci kódující F99S/S138T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidových pozicích odpovídajících nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č:l, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l;

xiv) polynukleotídovou molekulu podle provedení xiii), dále zahrnující záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 833 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1184 SEQ ID č:l;

xv) polynukleotídovou molekulu podle provedení i), kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 856 SEQ ID č:l;

xvi) polynukleotídovou molekulu podle provedení i), kde mutace v aveC sekvenci kódující G111V/P289L zahrnují záměnu báze zG na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 505 SEQ ID č:l, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1039 SEQ IDč:l;

xvii) polynukleotídovou molekulu podle provedení xvi), dále zahrnující záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 155 SEQ ID č: 1, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1202 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1210 SEQ ID č:l;

xviii) polynukleotídovou molekulu podle provedení i), kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 633 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1067 SEQ ID č:l; a xix) polynukleotídovou molekulu podle provedení xviii), dále zahrnující záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 377 SEQ ID č: 1.

Dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xx)) je rekombinantní vektor obsahující polynukleotídovou molekulu podle provedení i).

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xxi)) je hostitelská buňka obsahující polynukleotídovou molekulu podle provedení i) nebo rekombinantní vektor podle provedení xx) .

V přednostním provedení xxii) je hostitelskou buňkou podle provedení xxi) buňka Streptomyces.

Jiným aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xxiii)) je způsob přípravy nového kmene S. avermitilis, který zahrnuje mutaci aveC alely v buňkách kmene S. avermitilis vedoucí k substituci v AveC genovém produktu, kterou je alespoň jedna kombinace substitucí aminokyselin v sekvenci SEQ ID č. 2, zvolená z

a) D48E/A89T;

-4CZ 304402 B6

b) S138T/A139T/G179S;

c) Q38P/L136P/E238D;

d) F99S/S138T/A139T/G179S;

e) A139T/M228T;

f) G111V/P289L; a

g) A139T/K154E/Q298H takže buňky kmene 5. avermitilis ATCC 53692, ve kterých byla aveC alela divokého typu inaktivována, a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1, který je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely.

Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména xxiv) způsob podle provedení xxiii), kde poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,8:1 nebo nižší;

xxv) způsob podle provedení xxiii), kde poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,68:1 nebo nižší.

xxvi) způsob podle provedení xxiii), kde poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,53:1 nebo nižší;

xxvii) způsob podle provedení xxiii), kde poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene A avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,42:1 nebo nižší;

xxviii) způsob podle provedení xxiii), kde poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,40:1;

xxix) způsob podle provedení xxiii), kde mutace v aveC sekvenci kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 317 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 438 SEQ ID č:l;

xxx) způsob podle provedení xxix), který dále zahrnuje záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 353 SEQ ID č:l, a záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1155 SEQ ID č:l;

xxxi) způsob podle provedení xxiii), kde mutace aveC sekvenci kódující S138T/A139T/G179S zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l;

xxxii) způsob podle provedení xxxi), který dále zahrnuje záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 272 SEQ ID č: 1;

xxxiii) způsob podle provedení xxiii), kde mutace v aveC sekvenci kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze z A na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 286 SEQ ID č:l, záměnu báze zT na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 580 SEQ

-5CZ 304402 B6

ID č:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 886 SEQ IDč:l;

xxxiv) způsob podle provedení xxxiii), který dále zahrnuje záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 24 SEQ ID č:l, záměnu báze zT na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 497 SEQ ID č:l, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 554 SEQ ID č:l;

xxxv) způsob podle provedení xxiii), kde mutace v aveC sekvenci kódující F99S/S138T/A139T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidových pozicích odpovídajících nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l;

xxxvi) způsob podle provedení xxxv), který dále zahrnuje záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 833 SEQ ID č.l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1184 SEQ ID č: 1;

xxxvii) způsob podle provedení xxiii), kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID δ: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 856 SEQ ID č:l;

xxxviii) způsob podle provedení xxiii), kde mutace v aveC sekvenci kódující G111V/P289L zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 505 SEQ ID č:l, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1039 SEQIDč:l;

ixl) způsob podle provedení xxxviii), který dále zahrnuje záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 155 SEQ ID č: 1, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1202 SEQ ID č:l, a záměnu báze zT na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1210 SEQ ID č: 1;

xl) způsob podle provedení xxiii), kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 633 SEQ ID č:l, a záměnu báze zA na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1067 SEQ IDč:l;

xli) způsob podle provedení xl), který dále zahrnuje záměnu báze zG na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 377 SEQ ID ě: 1;

Dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xl ii)) je buňka Streptomyces avermitilis obsahující mutovanou aveC alelu, která kóduje aveC genový produkt mající v sekvenci SEQ ID č. 2 alespoň jednu kombinaci substitucí aminokyselin zvolenou z

a) D48E/A89T;

b) S138T/A139T/G179S;

c) Q38P/L136P/E238D;

d) F99S/S138T/A139T/G179S;

-6CZ 304402 B6

e) A139T/M228T;

f) Gll 1V/P289L; a

g) A139T/K154E/Q298H takže tyto buňky produkují poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1, kteiý je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely.

Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména xliii) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,8:1 nebo nižší;

xliv) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,68:1 nebo nižší;

xlv) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,53:1 nebo nižší;

xlvi) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,42:1 nebo nižší;

xlvii) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,40:1;

xlviii) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), kde mutace vaveC alele kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 317 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 438 SEQ ID č: 1;

il) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlviii), dále zahrnující záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 353 SEQ ID č:l, a záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1155 SEQ ID č:l;

1) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), kde mutace vaveC alele kódující S138T/A139T/G179S zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l;

li) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení 1), dále zahrnující záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 272 SEQ ID č:l;

Iii) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), kde mutace vaveC alele kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze z A na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 286 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 580 SEQ ID ě:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 886 SEQ ID č:l;

liii) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení Iii), dále zahrnující záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 24 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 497 SEQ ID

-7CZ 304402 B6 č:l, a záměnu báze zC na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 554 SEQ ID č:l;

liv) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), kde mutace v aveC alele kódující F99S/S138T/A139T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidových pozicích odpovídajících nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 469 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l;

lv) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení liv), dále zahrnující záměnu báze zC na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 833 SEQ ID č: 1, a záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1184 SEQ IDč:l;

lvi) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), kde mutace v aveC alele kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 856 SEQ ID č: 1;

lvii) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), kde mutace v aveC alele kódující G111V/P289L zahrnují záměnu báze zG na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 505 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1039 SEQ ID č:l;

lviii) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení lvii), dále zahrnující záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 155 SEQ ID č:l, záměnu báze zC na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1202 SEQ ID č:l, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1210 SEQ ID č:l;

ilx) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení xlii), kde mutace v aveC alele kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 663 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1067 SEQ ID č:l; a lx) buňku Streptomyces avermitilis podle provedení ilx), dále zahrnují záměnu báze zG na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 377 SEQ ID č:l.

Konečně posledním aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu lxi)) je způsob produkce avermektinů, při němž se kultivují buňky podle provedení 42 v kultivačním médiu za podmínek umožňujících indukci produkce avermektinů a potom se avermektiny z kultury oddělí.

V dalším popisu je vynález příležitostně objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.

Předkládaný vynález tedy poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující kompletní aveC ORF S. avermitilis nebo jeho významnou část, přičemž tato izolovaná polynukleotidová molekula postrádá další kompletní ORF, který je lokalizován směrem dolů od veC ORF in šitu na chromozómu S. avermitilis. Izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu obsahuje přednostně nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako pro-8CZ 304402 B6 dukt genu AveC S. avermitilis kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která je stejná jako nukleotidová sekvence aveC ORF z Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její významná část. Předkládaný vynález dále zahrnuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.l, nebo její degenerovanou variantu.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která je homologní s produktem genu AveC S. avermitilis kódujícím sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která je stejná jako nukleotidová sekvence aveC ORF z Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo jako její významná část.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s produktem genu AveC S. avermitilis kódujícím sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo jako aminokyselinová sekvence z Obrázku 1 (SEQ ID č. 2), nebo jako její významná část.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující homologní AveC genový produkt. V přednostní formě vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula nukleotidovou sekvenci kódující homologní AveC produkt genu S. hygroscopicus, přičemž tento homologní genový produkt obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č:4, nebo její významnou část. V přednostní formě vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem vynálezu, a která kóduje homologní AveC produkt, nukleotidovou sekvenci SEQ ID č:3, nebo její významnou část.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní s nukleotidovou sekvencí SEQ IDNO:3.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, který je homologní s homologním AveC produktem genu S. hygroscopicus, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č:4.

Předkládaný vynález dále poskytuje oligonukleotidy, které hybridizují s polynukleotidovou molekulou mající nukleotidovou sekvenci uvedenou na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo SEQ ID č. 3, nebo s polynukleotidovou molekulou mající nukleotidovou sekvenci, která je komplementární s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo SEQ ID č. 3.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní klonovací vektory a expresní vektory, které jsou užitečné pro klonování a expresi polynukleotidu, který je předmětem předkládaného vynálezu, včetně polynukleotidových molekul obsahujících aveC ORT S. avermitilis nebo aveC homologní ORF. V nelimitující formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), který obsahuje celý ORF aveC genu S. avermitilis. Předkládaný vynález dále poskytuje transformované hostitelské buňky obsahující polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor, kteiý je předmětem vynálezu, a nové kmeny, nebo buněčné linie od nich odvozené.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantně exprimovaný AveC genový produkt nebo AveC homologní genový produkt, nebo jejich významnou část. Předkládaný vynález dále poskytuje způsob produkce rekombinantního AveC genového produktu, zahrnující kultivaci transformované hostitelské buňky s rekombinantním expresním vektorem, kde řečený rekombinantní expresní vektor obsahuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt nebo AveC homologní genový produkt, přičemž tato polynukleotidová molekula je v operačním spojení s jedním nebo více regulačními elementy, které kontrolují expresi polynukleotídové molekuly hostitelské buňky, za podmínek napomáhajících produkci rekombinantního AveC genového produktu nebo AveC homologního genového produktu, a zahrnující získání AveC genového produktu nebo AveC homologního genového produktu z buněčné kultury.

-9CZ 304402 B6

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je jinak stejná jako AveC alela S. avermitilis, nebo AveC genový produkt kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo její degenerovanou variantu, nebo nukleotidovou sekvenci aveC ORF S. avermitilis, jak je uvedeno na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její degenerovanou variantu, ale která dále obsahuje jednu nebo více mutací, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, v kterých byla divoká aveC alela inaktivována, a která exprimuje polynukleotidovou molekulu obsahující zmutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují odlišný poměr nebo množství avermektinů, které jsou produkovány buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely. Podle předkládaného vynálezu mohou být takové polynukleotidové molekuly použity k produkci nových kmenů S. avermitilis, které vykazují detekovatelnou změnu v produkci avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné k produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují avermektiny ve sníženém poměru 2:1, ve srovnání se stejným kmenem, který místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V další přednostní formě vynálezu jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují zvýšená množství avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který místo toho exprimuje pouze jednu divokou aveC alelu. V další přednostní formě vynálezu jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, v kterých byl aveC gen inaktivován.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby identifikace mutací aveC ORF S. avermitilis schopných změnit poměr a/nebo množství produkovaných avermektinů. V přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález způsob identifikace mutací aveC ORF schopných změnit poměr třídy 2:1 produkovaných avermektinů, přičemž tento způsob zahrnuje: (a) určení poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidové molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující zmutovaný AveC genový produkt, a tato molekula je exprimována; (b) určení poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis jako v kroku (a), ale přičemž tyto buňky místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely nebo ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo nukleotidovou sekvenci, která je k ORF homologní; a (c) porovnání poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) s poměrem třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b); takže je-li poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) odlišný od poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), poté může být identifikována mutace aveC ORF schopná pozměnit poměr třídy 2:1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je poměr třídy 2:1 avermektinů touto mutací snížen.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsoby identifikace mutací aveC ORF nebo genetických konstruktů obsahujících aveC ORF schopných změnit množství produkovaných avermektinů, přičemž tento způsob zahrnuje: (a) určení množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidové molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující zmutovaný AveC genový produkt, nebo obsahující genetický konstrukt zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt a tato molekula je exprimována; (b) určení množství avermektinů produkovaných stejným kmenem S. avermitilis jako v kroku (a), ale přičemž tento kmen místo toho exprimuje pouze jednu aveC alelu mající nukleotidovou sekvenci jako ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo nukleotidovou sekvenci, která je k ORF homologní; a (c) porovnání množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) s množstvím avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b); takže je-li množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) odlišné od množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), poté může být identifikována mutace aveC ORF nebo genetického konstruktu schopná pozměnit poměr třídy 2:1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je produkované množství avermektinů touto mutací zvýšeno.

- 10CZ 304402 B6

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní vektory, které jsou užitečné pro přípravu nových kmenů S. avermitilis s narušenou produkcí avermektinů. Předkládaný vynález navíc poskytuje vektory, které mohou být použity k cílení jakýchkoli polynukleotidových molekul obsahujících mutované nukleotidové sekvence, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, do místa aveC genu chromozómu S. avermitilis buďto k inzerci nebo k nahrazení aveC alely nebo ORF nebo jejich části pomocí homologní rekombinace. Podle předkládaného vynálezu však může zde poskytnutá polynukleotidová molekula obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, také modulovat biosyntézu avermektinů, je-li inzerována do chromozómu S. avermitilis do místa jiného, než je místo aveC genu, nebo je-li v buňkách S. avermitilis udržována epizomálně. Předkládaný vynález tedy poskytuje také vektory obsahující mutovanou polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, přičemž tyto vektory mohou být použity k inzerci polynukleotidové molekuly do místa v chromozómu S. avermitilis jiného, než je místo aveC genu, nebo která může být v těchto buňkách udržována epizomálně. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genu, které mohou být použity k inzerci mutované aveC alely do chromozómu S. avermitilis za účelem tvorby nových kmenů buněk, které produkují avermektiny ve sníženém poměru třídy 2:1 ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby přípravy nových kmenů S. avermitilis zahrnujících buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, čímž vznikají narušené poměry a/nebo množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy nových kmenů S. avermitilis obsahujících buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, čímž vzniká narušený poměr třídy 2:1 avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, dále zahrnující transformaci buňky kmene S. avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, kteiý narušuje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, které exprimují mutovaný typ aveC alely ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a dále výběr transformovaných buněk, které produkují avermektiny v narušeném poměru třídy 2:1 avermektinů ve srovnání s poměrem třídy 2:1 produkovaným buňkami kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných v buňkách nového kmene.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy nových kmenů S avermitilis zahrnujících buňky, které produkují narušená množství avermektinů, zahrnující transformaci buňky kmene S. avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, jejichž exprese vede k narušenému množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, které exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a dále zahrnující výběr transformovaných buněk, které produkují avermektiny v narušeném množství ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je množství avermektinů produkovaných v buňkách nového kmene zvýšeno.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky obsahují inaktivovanou aveC alelu, obsahující transformaci buněk kmene S. avermitilis, která exprimuje jakoukoli aveC alelu vektorem, který inaktivuje aveC alelu a dále výběr transformovaných buněk, v kterých byla aveC alela inaktivována.

Předkládaný vynález dále poskytuje nové kmeny S. avermitilis, které byly transformovány jakoukoli polynukleotidovou molekulou nebo vektory obsahujícími mutované nukleotidové sekvence, které jsou předmětem předkládaného vynálezu. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahrnující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu na místo nebo navíc k divokému typu aveC alely, kde buňky nového kmene produkují avermektiny

- 11 CZ 304402 B6 v narušeném poměru třídy 2:1 ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostnější formě vynálezu produkuje nový kmen avermektiny v narušeném poměru třídy 2:1 ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. Takové nové kmeny jsou užitečné k produkci komerčně žádoucích avermektinů, jako je například doramektin, ve velkém měřítku.

V další přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis, které exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu na místo nebo navíc k nativní aveC alele, což vede k buněčné produkci narušeného množství avermektinů ve srovnání s množství avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu produkují nové buňky zvýšené množství avermektinů.

V další přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis obsahující buňky, v kterých byl aveC gen inaktivován. Takové kmeny jsou užitečné pro různé spektrum avermektinů, které tyto buňky produkují ve srovnání s divokým kmenem, i pro komplementaci vyhledávacích analýz, jak jsou zde popsané, aby e určilo, zdali cílená nebo náhodná mutageneze aveC genu ovlivňuje produkci avermektinů.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, přičemž tyto buňky exprimují mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který alteruje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely v kultivačním médiu za podmínek, které žních umožňují nebo indukují produkci avermektinů, a získání řečených avermektinů z kultury. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami exprimujících mutaci. Postup poskytuje zvýšenou účinnost produkce komerčně hodnotných avermektinů, jako je například doramektin.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, přičemž tyto buňky exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, které vedou k narušenému množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které neexprimují pouze mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt, ale místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely, v kultivačním médiu za podmínek, které z nich umožňují nebo indukují produkci avermektinů, a přičemž tento způsob zahrnuje dále získání řečených avermektinů z kultury. V přednostní formě vynálezu je zvýšeno množství avermektinů produkovaných buňkami exprimujících mutací nebo genetický konstrukt.

Předkládaný vynález dále poskytuje nové složení avermektinů produkované kmenem S. avermitilis exprimujícím mutovanou aveC alelu, která je předmětem předkládaného vynálezu, kde avermektiny jsou produkovány ve sníženém poměru třídy 2:1 ve srovnání s poměrem 2:1 třídy avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis, které neexprimují mutovanou aveC alelu, ale místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely. Nové složení avermektinů může být přítomno, jak je produkováno ve fermentační kultivační tekutině, nebo z ní může být staženo nebo může být z ní významně purifikováno.

Přehled obrázků na výkresech

4. Následuje stručné vysvětlení obrázků

Obrázek 1. DNA sekvence (SEQ ID č.l) obsahující aveC ORF S. avermitilis a odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID č. 2).

- 12CZ 304402 B6

Obrázek 2. Plazmidový vektor pSE186 (ATCC 209604) obsahující celý ORF aveC genu S avermitilis.

Obrázek 3. Gen nahrazující vektor pSE180 (ATCC 209605) obsahující ermE gen Sace. erythraea inzerovaný do aveC ORF S. avermitilis.

Obrázek 4. BahmHI restrikční mapa klastru genů pro avermektin polyketin syntházu ze

S. avermitilis s identifikovanými pěti přesahujícími kosmidovými klony (tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Uveden je také vztah pSEl 18 a PSE119.

Obrázek 5. HPLC analýza fermentaěních produktů produkovaných kmeny S. avermitilis. Kvantifikace vrcholu byla provedena srovnáním množství standard cyklohexylu Bl. Retenční čas cyklohexylu B2 byl 7,4 až 7,7 minuty, retenční čas cyklohexylu Bl byl 11,9 až 12,3 minuty. Obrázek 5A. Kmen S. avermitilis SE180-11 s inaktivovaným aveC ORF. Obr. 5B. Kmen S. avermitilis SE180-11 transformovaný pomocí pSE187. Obr. 5D. Kmen. S. avermitilis SE180-11 transformovaný pomocí pSE188.

Obrázek 6. Srovnání vyvozených aminokyselinových sekvencí kódovaných aveC ORF S. avermitilis (SEQ ID ě.2), aveC homologním částečným ORF z S. griseochromogenes (SEQ ID č.5), a aveC homologním ORF z S. hygroscopicus (SEQ ID č.4). Valinové reziduum označené tučně je domnělé startovací místo pro bílkovinu. Konzervovaná rezidua jsou uvedena velkými písmeny pro homologii ve všech třech sekvencích a malými písmeny pro homologii ve dvou ze tří sekvencí. Aminokyselinové sekvence mají přibližně 50% identitu sekvencí.

Obrázek 7. Hybridní plazmidový konstrukt obsahující 564 bp BsaAI/Kpnl fragment z S. hygroscopicus aveC homologního genu inzerovaného do BaaAI/Kpnl místa v S. avermitilis aveC ORF. 5. Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká identifikace a charakterizace polynukleotidových molekul majících nukleotidové sekvence, které kódují aveC genový produkt ze Streptomyces avermitilis, konstrukce nových kmenů S. avermitilis, které mohou být použity k vyhledávání mutovaných AveC genových produktů pro jejich efekt na produkci avermektinů, a objevu, že určité mutované AveC genové produkty mohou snižovat poměr B2:B1 avermektinů produkovaných S. avermitilis. Vynález je popsán příkladem v částech uvedených níže jako polynukleotidová molekula mající buďto nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako pro S. avermitilis AveC genový produktkódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo nukleotidovou sekvenci ORF uvedenou na Obrázku 1 (SEQIDč.l), a polynukleotidové molekuly mající z nich odvozené mutované nukleotidové sekvence a jejich degenerované varianty. Principy uvedené v předkládaném vynálezu však mohou být analogicky aplikovány na další polynukleotidové molekuly, včetně aveC homologních genů z jiných druhů Streptomyces, zahrnující mezi jinými například S. hygroscopicus a S. griseochromogenes.

5.1 Polynukleotidové molekuly kódující S. avermitilis AveC genový produkt

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující kompletní aveC ORF S. avermitilis nebo jeho významnou část, přičemž tato izolovaná polynukleotidová molekula postrádá další kompletní ORF, který je lokalizován směrem dolů od ORF in šitu na chromozómu S. avermitilis.

Izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu obsahuje přednostně nukleotidovou sekvenci, která je stejná, jako je S. avermitilis AveC genový produkt kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), neboje stejná jako nukleotidová sekvence ORG z obrázku 1 (SEQ IDě.l), nebo její významná část. Jak je zde použito, „významná část“

-13 CZ 304402 B6 izolované polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci kódující S. avermitilis AveC genový produkt znamená izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující alespoň 70 % kompletní aveC ORF sekvence uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č.l), který kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt. V tomto ohledu je „funkčně ekvivalentní“ AveC genový produkt definován jako genový produkt, který je-li exprimován v kmeni S. avermitilis ATCC 53692, v kterém byla nativní aveC alela inaktivována, vede k produkci významně stejného poměru a množství avermektinů, jako je produkováno kmene S. avermitilis ATCC 53692, který exprimuje pouze divokou, funkční aveC alelu nativní pro kmen S. avermitilis ATCC 53692.

Navíc k nukleotidové sekvence aveC ORF může izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu, dále obsahovat nukleotidové sekvence, které přirozeně hraničí s aveC genem in sítu v S. avermitilis, jako jsou například hraničící nukleotidové sekvence uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č. 1).

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 1, nebo její degenerovanou variantu.

Jak je zde používáno, týkají se termíny „polynukleotidová molekula“, „polynukleotidová sekvence“, „kódující sekvence“, „otevřený čtecí rámec“ a „ORF“, DNA i RNA molekul, které mohou být buďto jednovláknové nebo dvouvláknové, a které mohou být transkribované nebo translatované (DNA), nebo translatované (RNA) do AveC genového produktu, nebo do polypeptidů, který je homologní s AveC genovým produktem nebo s AveC homologním genovým produktem v příslušném expresním systému hostitelské buňky, je-li pod kontrolou příslušných regulačních elementů. Kódující sekvence může zahrnovat, ale není omezena na prokaryotické sekvence, cDNA sekvence, genomické DNA sekvence a chemicky syntetizované DNA a RNA sekvence.

Nukleotidová sekvence uvedená na obrázku 1 (SEQ ID č. 1) zahrnuje čtyři odlišné GTG kodóny v pozicích bp 42, 174, 177 a 180. Jak je uvedeno níže byly konstruovány mnohočetné delece 5'- oblasti aveC ORF (obrázek 1, SEQ ID č. 1), aby se pomohlo definovat, který z těchto kodónů by mohl fungovat v aveC ORF jako startovací místo pro expresi bílkovin. Delece prvního GTG místa v pozici 42 bp neeliminovalo AveC aktivitu. Další delece všech GTG kodónů v pozicích 174, 177 a 180 bp společně eliminovaly AveC aktivitu, což ukazuje, že tato oblast je nezbytná pro expresi bílkovin. Předkládaný vynález tedy zahrnuje aveC ORF o variabilní délce.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která je homologní s S. avermitilis AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATC 209604), nebo s nukleotidovou sekvencí aveC ORF prezentovanou na obrázku 1 (SEQ ID č. 1) nebo s její významnou částí. Termín „homologní“, je-li použit ve vztahu k polynukleotidové molekule, která je homologní s S. avermitilis AveC genový produkt-kódující sekvencí, znamená polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci: a) která kóduje stejný AveC genový produkt jako S. avermitilis genový produkt-kódující sekvence plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která kóduje stejný AveC genový produkt, jako nukleotidová sekvence aveC ORF prezentovaná na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), ale která zahrnuje jednu nebo více němých změn nukleotidové sekvence podle degenerace genetického kódu (tj. degenerační varianta); nebo b) která hybridizuje s komplementárním vláknem polynukleotidové molekuly mající nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci kódovanou AveC genový produktkódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 1 (SEQ ID č. 2), za mírně přísných podmínek, tj. hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5M NaHPO₄, 7% sodném dodecyl sulfátu (SDS), lmM EDTA při teplotě 65 °C, a promytí v 0,2 x SSC/0,1% SDS při teplotě 42 °C (viz Ausubel et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Sv. I, Green Publishing Associates, lne, a John Wiley and Sons, lne, New York, strana 2.10.3), a která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše. V přednostní formě hybridizuje homologní polynukleotidová molekula s komplementárním vláknem AveC genový produkt-kódující sekvence plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo s komplementárním vláknem nukleotidové sekvence aveC

- 14CZ 304402 B6

ORF prezentované na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo s jeho významnou částí za vysoce přísných podmínek tj. hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5M NaHPO₄, 7% SDS, lmM EDTA při teplotě 65 °C, a promytí v 0,1 x SSC/0,1% SDS při teplotě 68 °C (viz Ausubel etal., 1989, výše), která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše.

Aktivita AveC genového produktu a jeho potenciálně funkčních ekvivalentů může být určena HPLC analýzou fermentačních produktů, jak je popsáno v příkladech provedení vynálezu níže. Polynukleotidové molekuly mající nukleotidové sekvence, které kódují funkční ekvivalenty S. avermitilis AveC genového produktu, zahrnují přirozeně se vyskytující se aveC geny přítomné v jiných kmenech S. avermitilis, aveC homologní geny přítomné v jiných druzích Streptomyces, a mutované aveC alely přirozeně se vyskytující nebo připravené genetickým inženýrstvím.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s aminokyselinovou sekvencí kódovanou AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo aminokyselinovou sekvencí z obrázku 1 (SEQ ID č. 2) nebo s její významnou částí. Jak je zde použito, znamená „významná část“ aminokyselinové sekvence z obrázku 1 (SEQ ID č. 2) polypeptid obsahující okolo 70 % aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č. 2), která konstituje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše.

Jak je zde používáno s odkazem na aminokyselinové sekvence, které jsou homologní s aminokyselinovými sekvencemi AveC genového produktu S. avermitilis, týká se termín „homologní“ polypeptidu, který má jinak aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 1 (SEQ ID č. 2), ale v kterém jedno nebo více aminokyselinových reziduí je konzervativně substituováno odlišným aminokyselinovým reziduem, kde řečená aminokyselinová sekvence má alespoň zhruba 70%, přednostněji alespoň zhruba 80%, a nejpřednostněji alespoň zhruba 90% identity aminokyselinové sekvence s polypeptidem kódovaným AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo s aminokyselinovou sekvencí z Obrázku 1 (SEQ ID č. 2), jak je určeno jakýmkoli standardním algoritmem identity aminokyselinových sekvencí, jako je například algoritmus BLASTP (GENBANK, NCBI), a kde taková konzervativní substituce vede ke vzniku funkčně ekvivalentního genového produktu, jak je definováno výše. Konzervativní aminokyselinové substituce jsou dobře známy v oboru. Pravidla pro provádění takových substitucí zahrnují pravidla popsaná mezi jinými Dayhofem MD, 1978, Nat Biomed Res Found, Washington, DC, sv. 5, Sup. 3. Konzervativní aminokyselinové substituce jsou specifičtěji ty substituce, které se obecně uskutečňují v rámci rodiny aminokyselin, které jsou příbuzné aciditou nebo polaritou. Geneticky kódované aminokyseliny jsou obecně rozděleny do čtyř skupin: 1) kyselé = aspartát, glutamát; 2) bazické = lysin, arginin, histidin; 3) nepolární = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan; a 4) polární bez náboje = glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan tyrosin jsou také společně klasifikovány jako aromatické aminokyseliny. Jedna nebo více náhrad v jakékoli konkrétní skupině, například náhrada leucinu za izoleucin nebo valin, nebo aspartátu za glutamát, nebo threoninu za serin, nebo za jakékoli jiné aminokyselinové reziduum se strukturně příbuzným aminokyselinovým reziduem, například aminokyselinové reziduum s podobnou aciditou nebo polaritou, nebo podobných v kombinaci těchto vlastností, budou mít obecně nevýznamný efekt na funkci polypeptidu.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC homologní genový produkt. Jak je zde používáno, je „AveC homologní genový produkt“ definován jako genový produkt mající alespoň zhruba 50% aminokyselinovou sekvenční identitu s AveC genovým produktem S. avermitilis obsahujícím aminokyselinovou sekvenci kódovanou AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obrázku 1 (SEQ ID č. 2), jak je určeno jakýmkoli standardním algoritmem identity aminokyselinových sekvencí, jako je například algoritmus BLASTP (GENBANK, NCBI). V neomezující formě vynálezu je AveC homo- 15CZ 304402 B6 logní genový produkt ze S. hygroscopicus (popsaný v přihlášce EP 02 98 423; depozit FERM BP-1901) a obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.:4 nebo její významnou část. „Významná část“ aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 4 znamená polypeptid obsahující alespoň 70% aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 4, a který konstituuje funkčně ekvivalentní AveC homologní genový produkt. „Funkčně ekvivalentní“ AveC homologní genový produkt je definován jako genový produkt, který je-li exprimován v kmeni S. hygroscopicus FERM BP-1901, v kterém byla nativní aveC homologní alela inaktivována, vede k produkci významně stejného poměru a množství milbemycinů, jako jsou produkovány kmenem S. hygroscopicus FERM BP-1901 exprimujícím místo divokého typu funkční aveC homologní alelu nativní kmen S. hygroscopicus FERM BP-1901. V neomezující formě vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu, a která kóduje S. hygroscopicus AveC homologní genový produkt, nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 3 nebo její významnou část. V tomto ohledu znamená „významná část“ izolované polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 3 nebo její významnou část. V tomto ohledu znamená „významná část“ izolované polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 3 izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující alespoň 70 % nukleotidové sekvence SEQ ID č. 3, která kóduje funkčně ekvivalentní AveC homologní genový produkt, jak je definováno výše.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní s S. hygroscopicus nukleotidovou sekvencí SEQ ID č. 3. Termín „homologní“, je-li použit k odkazu na polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní s S. hygroscopicus AveC homologní genový produkt-kódující sekvenci SEQ ID č. 3, znamená polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci: a) která kóduje stejný genový produkt, jako je nukleotidová sekvence SEQ ID č. 3, ale která obsahuje jednu nebo více němých změn v nukleotidové sekvenci podle degenerace genetického kódu (tj. degenerovaná varianta); nebo b) která hybridizuje s komplementárním vláknem polynukleotidové molekuly mající nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4 za mírně přísných podmínek, tj. hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5M NaHPO₄, 7% SDS, lmM EDTA při teplotě 6 °C, a promytí v 0,2 x SSC/0,1% SDS při teplotě 42 °C (viz Ausubel et al. viz výše), a která kóduje funkčně ekvivalentní AveC homologní genový produkt, jak je definováno výše. V přednostní formě vynálezu hybridizuje homologní polynukleotidová molekula s komplementárním vláknem AveC genový produkt-kódující nukleotidové sekvence SEQ ID č. 3 za vysoce přísných podmínek tj. hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5M NaHPO₄, 7% SDS, lmM EDTA při teplotě 65 °C, a promytí v 0,1 x SSC/0,1% SDS při teplotě 68 °C (viz Ausubel et al., 1989, výše), a kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, který je homologní s S. hygroscopicus AveC homologním genovým produktem. Jak je zde používáno, týká se termín „homologní“ s odkazem na polypeptidy, které jsou homologní s AveC homologním genovým produktem se sekvencí SEQ ID č. 4 ze S. hygroscopicus, polypeptidu, který má jinak aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4, ale v které jedno nebo více aminokyselinových reziduí bylo konzervativně substituováno odlišným aminokyselinovým reziduem, jak je definováno výše, kde řečená aminokyselinová sekvence má alespoň 70%, přednostněji alespoň 80%, nejpřednostněji alespoň 90% aminokyselinovou sekvenční identitu k polypeptidu o sekvenci SEQ ID č. 4, jak je určeno jakýmkoli standardním algoritmem aminokyselinové sekvenční identity, jako je například algoritmus BLASTP (GENBANK, NCBI), kde taková konzervativní substituce vede k funkčně ekvivalentnímu AveC homolognímu genovému produktu, jak je definováno výše.

Předkládaný vynález dále poskytuje oligonukleotidy, které hybridizují s polynukleotidovou molekulou mající nukleotidovou sekvenci uvedenou na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1) nebo SEQ ID č. 3, nebo polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k nukleotidové sekvenci uvedené na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1) nebo SEQ ID č. 3. Takové

- 16CZ 304402 B6 oligonukleotidy mají alespoň 10 nukleotidů, přednostně od zhruba 15 do zhruba 30 nukleotidů, ahybridizují sjednou zvýše uvedených polynukleotidových molekul za vysoce přísných podmínek tj. promytí v 6 x SSC/0,5% pyrofosfátu sodném při teplotě zhruba 37 °C pro oligonukleotidy o zhruba 14 bázích, při teplotě zhruba 48 °C pro oligonukleotidy o zhruba 17 bázích, při teplotě zhruba 55 °C pro oligonukleotidy o zhruba 20 bázích, a při teplotě zhruba 60 °C pro oligonukleotidy o zhruba 23 bázích. V přednostní formě vynálezu jsou oligonukleotidy komplementární k části jedné z výše zmíněných polynukleotidových molekul. Tyto oligonukleotidy jsou užitečné pro celou řadu účelů včetně kódování nebo účinkování jako antisense molekuly pro regulaci genů, nebo jeho primery pro amplifikaci aveC nebo aveC homolog-kódujících polynukleotidových molekul.

Další aveC homologní geny mohou být identifikovány u jiných druhů nebo kmenů Streptomyces za použití polynukleotidových molekul nebo oligonukleotidů uvedených zde ve spojení se známými technikami. Například oligonukleotidová molekula obsahující část S. avermitilis nukleotidové sekvence z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo část S. avermitilis nukleotidové sekvence SEQ ID č. 3 může být detekovatelně označena a použita k vyhledávání genomické knihovny konstruované z DNA odvozené z organismu, který je předmětem zájmu. Přísnost hybridizačních podmínek je zvolena na základě vztahu referenčního organismu, v tomto případě S. avermitilis nebo S. hygroscopicus, k organismu, který je předmětem zájmu. Požadavky na různě přísné podmínky jsou dobře známy osobám zkušeným oboru, a tyto podmínky se liší v závislosti na specifických organismech, z nichž jsou knihovna a označené sekvence odvozeny. Takové oligonukleotidy mají přednostně alespoň zhruba 15 nukleotidů, například se jedná o oligonukleotidy popsané v příkladech provedení vynález níže. Amplifikace homologních genů může být provedena za použití těchto i jiných oligonukleotidů použitím standardních technik, jako je například polymerázová řetězová reakce (PCR), ačkoli mohou být použity i jiné amplifikační techniky známé v oboru.

Klony identifikované jako obsahující aveC homologní nukleotidové sekvence mohou být testovány na schopnost kódovat funkční AveC homologní genový produkt. Pro tento účel mohou být klony podrobeny sekvenční analýze za účelem identifikace vhodného čtecího rámce, stejně tak jako iniciačních a terminačních signálů. Klonované DNA sekvence mohou být alternativně nebo navíc inzerovány do vhodného expresního vektoru, tj. do vektoru, který obsahuje nezbytné elementy pro transkripci a translaci inzerované protein-kódující sekvence. Může být použit jakýkoli z celé řady hostitelských/vektorových systémů, jak je popsáno níže, které zahrnují, ale nejsou omezeny na bakteriální systémy, jako jsou například plazmidové, bakteriofágové nebo kosmidové expresní vektory. Příslušné hostitelské buňky transformované takovými vektory zahrnující potenciální aveC homolog-kódující sekvence mohou být poté analyzovány na aktivitu AveC za použití způsobů, jako je například HPLC analýza fermentačních produktů, jak je popsáno například v části 7 níže.

Produkce a manipulace polynukleotidových molekul zde uvedených jsou známé v oboru a mohou být provedeny podle rekombinantních technik popsaných například vManiatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR strategies, Academie Press, lne., San Diego; a Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, přičemž tyto publikace jsou všechny do vynálezu začleněny jako reference. Polynukleotidové klony kódující AveC genové produkty nebo AveC homologní genové produkty, mohou být identifikovány za pomoci metod známých v oboru, které zahrnují, ale nejsou omezeny na způsoby uvedené v Části 7 níže. Genomické knihovny mohou být vyhledávány na aveC a aveC homologní kódující sekvence za použití technik, jako jsou například metody uvedené v publikaci Benton a Davis, 1977, Science 196:180 pro bakteriofágové knihovny, a v publikaci Grunstein a Hodness, 1975, Proč Nati Acad Sci USA, 72: 3961-3965 pro plazmidové knihovny. Polynukleotidové molekuly mající nukleotidové sekvence, o kterých je známo, že

- 17CZ 304402 B6 zahrnují aveC ORF jako takový, například v plazmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo v plazmidu pSEl 19 (popsáno v části 7 níže), mohou být použity jako próby v těchto vyhledávacích experimentech. Oligonukleotidové próby mohou být syntetizovány alternativně tak, že korespondují s nukleotidovými sekvencemi odvozenými od částečných nebo úplných aminokyselinových sekvencí purifikovaného AveC homologního genového produktu.

5.2 Rekombinantní systémy

5.2.1 Klonovací a expresní vektory

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní klonovací vektory a expresní vektory, které jsou užitečné pro klonování nebo exprimování polynukleotidových molekul, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, například aveC ORF S. avermitilis nebo jakýchkoli aveC homologních ORF. V nelimitující formě poskytuje předkládaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), který obsahuje kompletní ORF aveC gen S. avermitilis.

Všechny z následujících popisů týkajících se aveC ORF z S. avermitilis, nebo polynukleotidové molekuly obsahující aveC ORF z S. avermitilis, nebo jeho část, nebo S. avermitilis AveC genový produkt, se také týkají aveC homolog a AveC homologních genových produktů, ledaže je výslovně nebo z kontextu uvedeno jinak.

Pro specifické použití u Streptomycet byla použita celá řada různých vektorů, zahrnujících mezi jinými vektory fágové, plazmidy s vysokým počtem kopií, plazmidy s nízkým počtem kopií a E.coli-Streptomyces přenosové vektory, a jakýkoli z nich může být použit k provedení předkládaného vynálezu. Ze Streptomycet byla také klonována celá řada genů pro lékovou rezistenci a některé z těchto genů byly začleněny do vektorů jako vektory, které je možno zvolit. Příklady běžných vektorů pro použití v Streptomyces jsou prezentovány mezi jinými místy v publikaci Hutchinson 1980, Applied Biochem Biotech 16:169-190.

Rekombinantní vektory, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, obzvláště expresní vektory, jsou přednostně konstruovány tak, že kódující sekvence polynukleotidové molekuly, která je předmětem vynálezu, je v operačním spojení s jedním nebo více regulačních elementů nezbytných pro transkripci a translaci kódující sekvence za účelem produkce polypeptidu. Jak je zde používáno, termín „regulační element“ zahrnuje, ale není omezen na nukleotidové sekvence, které kódují induktibilní a neinduktibilní promotory, enhancery a další elementy známé v oboru, které slouží k regulaci exprese polynukleotidových kódujících sekvencí. Jak je zde také použito, je kódující sekvence v „operačním spojení“ s jedním nebo více regulačních elementů, kde regulační elementy účinně regulují a umožňují transkripci kódující sekvence nebo translaci jeho mRNA, či obojí.

Typické plazmidové vektory, které mohou být připraveny, aby obsahovaly polynukleotidovou molekulu zahrnují mezi mnoha jinými pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) a transportní vektor pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171:5872-57881).

Způsoby pro konstrukci rekombinantních vektorů obsahujících konkrétní kódující sekvence v operačním spojení s příslušnými regulačními elementy jsou dobře známy v oboru, a tyto způsoby mohou být použity k provedení předkládaného vynálezu. Tyto způsoby zahrnují in vitro rekombinantní techniky, syntetické techniky a in vivo genetickou rekombinací. Viz například techniky popsané v publikaci Maniatis et al., 1989, výše; Ausubel et al., 1989, výše; Sambrook et al., 1989, výše; Innis et al., 1995, výše; Erlich 1992, výše.

Regulační elementy těchto vektorů se mohou lišit ve své síle a ve svých specifitách. V závislosti na použitém hostitelském/vektorovém systému může být použito jakékoli množství vhodných transkripčních a translačních elementů. Neomezující příklady transkripčních regulačních oblastí nebo promotorů pro baktérie zahrnují β-gal promotor, T7 promotor, TAC promotor, λ levý a pra- 18CZ 304402 B6 vý promotor, trp a lac promotory, trp-lac fúzní promotory a specifičtěji pro Streptomyces, promotory ermE, melC a tipA, atd. Ve specifické formě popsané v části 11 níže byl generován expresní vektor, který obsahuje klonovaný aveC ORT přilehle k silnému konstitutivnímu ermE promotoru ze Sacharopolyspora erythreae. Vektor byl transformován do S. avermitilis a následná HPLC analýza fermentačních produktů ukázala zvýšený titr produkovaných avermektinů ve srovnání s produkcí stejného kmene, který ale exprimuje divoký typ aveC alely.

Fúzní proteinové expresní vektory mohou být použity k expresi AveC genový produkt-fúzního proteinu. Purifikovaný fúzní protein může být použit k získání antiséra proti AveC genovému produktu, ke studiu biochemických vlastností AveC genového produktu, k přípravě AveC fúzních proteinů s odlišnými biochemickými aktivitami a k pomoci identifikovat nebo purifikovat exprimovaný AveC genový produkt. Možné expresní vektory pro fúzní protein zahrnují, ale nejsou omezeny na vektory inkorporující sekvence, které kódují β-galaktosidázu atrpE fúze, maltózu vázající proteinové fúze, glutathion-S-transferázové fuze a polyhistidinové fuze (nosičové oblasti). V alternativní formě vynálezu mohou být AveC genový produkt nebo jeho část zfázovány s AveC homologním genovým produktem nebo jeho částí, odvozené od jiných druhů nebo kmene Streptomyces, jako jsou například S. hygroscopicus nebo S. griseochromogenes. V konkrétní formě vynálezu popsané v části 12 níže a zobrazené na obrázku 7 byl zkonstruován chimérický plazmid, který obsahuje 564 bp oblast S. avermitilis aveC ORF. Takové hybridní vektory mohou být transformovány do buněk S. avermitilis a testovány za účelem určení jejich efektu například na poměr třídy 2:1 produkovaných avermektinů.

AveC fúzní proteiny mohou být připraveny, aby obsahovaly oblast užitečnou pro purifikaci. Fúzní AveC-maltózu vázající protein může být například purifikován za použití amylózové pryskyřice; fúzní proteiny AveC-glutathion-S-transferáza mohou být purifikovány za použití glutathion-agarózy; fúzní proteiny AveC-polyhistidin mohou být purifikovány za použití pryskyřice s bivalentním niklem. Pro purifikaci fúzního proteinu afinitní chromatografií mohou být alternativně použity protilátky proti nosičovému proteinu nebo peptidu. Například nukleotidová sekvence kódující cílový epitop monoklonální protilátky může být připravena do expresního vektoru v operačním spojení s regulačními elementy a situována tak, že exprimovaný epitop je zfázován do AveC polypeptidů. Například nukleotidová sekvence kódující FLAG epitop tag (International Biotechnologies lne.), což je hydrofilní markerový peptid, může být inzertována standardními technikami do expresního vektoru v bodě odpovídajícímu například karboxylovému konci AveC polypeptidů. Exprimovaný AveC polypeptid-FLAG™ epitop fuzní produkt může být poté detekován a afinitně purifikován za použití komerčně dostupných anti-FLAG protilátek.

Expresní vektor kódující AveC fúzní protein může být také připraven, aby obsahoval polylinkerové sekvence kódující specifická proteázová štěpící místa tak, že exprimovaný AveC polypeptid může být uvolněn z nosičové oblasti nebo z fuzního partnera pomocí specifické proteázy. Fúzní proteinový vektor může například zahrnovat DNA sekvence kódující mezi jinými štěpící místa pro trombin nebo faktor Xa.

Signální sekvence nahoru od, a ve čtecím rámci aveC ORF může být vpravena do expresního vektoru známými způsoby, aby se usměrnil směr a sekrece exprimovaného genového produktu. Neomezující příklady signálních sekvencí zahrnují mezi jinými sekvence α-faktoru, imunoglobulinů, vnějších membránových proteinů, penicilinázy a T buněčných receptorů.

K pomoci při výběru hostitelských buněk transformovaných nebo transfektovaných klonovacími nebo expresními vektory, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, může být vektor připraven tak, že dále obsahuje kódující sekvenci pro reportérový genový produkt nebo jiný volitelný markér. Taková kódující sekvence je přednostně v operačním spojení se sekvencemi kódujícími regulační element, jak je popsáno výše. Reportérové geny, které jsou užitečné ve vynálezu, jsou dobře známé v oboru a zahrnují geny kódující mezi jinými zelený fluorescenční protein, luciferázu, xylE a tyrosinázu. Nukleotidové sekvence kódující volitelné markéry jsou dobře známé v oboru a zahrnují sekvence, které kódují genové produkty udělující rezistenci vůči antibiotikům

- 19CZ 304402 B6 nebo antimetabolitům, nebo které dodávají auxotrofické požadavky. Příklady takových sekvencí zahrnují sekvence, které kódují rezistenci mezi mnoha jinými k erytromycinu, thiostreptonu nebo kanamycinu.

5.2.2. Transformace hostitelských buněk

Předkládaný vynález dále poskytuje transformované hostitelské buňky obsahující polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor, které jsou předmětem vynálezu, a nové kmeny nebo buněčné linie od nich odvozené. Hostitelské buňky užitečné pro provedení vynálezu jsou přednostně buňky Streptomyces, ačkoli mohou být použity i jiné prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Takové transformované hostitelské buňky typicky zahrnují, ale nejsou omezeny na mikroorganismy, jako jsou například baktérie transformované mezi jinými rekombinantními bakteriofágovými DNA, plazmidovými DNA nebo kosmidovými DNA vektory, nebo kvasinky transformované rekombinantními vektory.

Polynukleotidové molekuly, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, jsou zamýšlené, aby fungovaly u buněk Streptomyces, ale mohou být také transformovány do jiných bakteriálních nebo eukaryotických buněk, například pro klonovací nebo expresní účely. Může být typicky použit kmen E. coli, jako například kmen DH5a, dostupný z Americké sbírky typových kultur (ATCC), Rockville, MD, USA) (přístupové číslo 31343) a z komerčních zdrojů (Stratagene). Přednostní hostitelské buňky zahrnují kvasinkové buňky, ačkoli mohou být účinně použity i savčí buňky nebo buňky hmyzu.

Rekombinantní expresní vektor, který je předmětem vynálezu, je přednostně transformován nebo transfekován do jedné nebo více hostitelských buněk nebo významně homogenní kultury buněk. Expresní vektor je obecně začleněn do hostitelských buněk ve shodě se známými technikami, jako jsou například protoplastová transformace, precipitace kalcium fosfátem, reakce s chloridem vápenatým, mikroinjekce, elektroporace, transfekce kontaktem s rekombinovaným virem, transfekce řízená lipozómem, transfekce s DEAE dextranem, transdukce, konjugace nebo bombardování mikroprojektily. Volba transformovaných buněk může být provedena standardními postupy, jako je například volba buněk exprimujících volitelný markér, například antibiotické rezistence sdružené s rekombinantním vektorem, jak je popsáno výše.

Jakmile je expresní vektor začleněn do hostitelské buňky, může být integrace a udržení aveC kódující sekvence, buďto v chromozómu hostitelské buňky, nebo epizomálně, potvrzena standardními technikami, například Southern hybridizační analýzou, restrikční enzymovou analýzou, PCR analýzou zahrnující PCR s reverzní transkriptázou (rt-PCR), nebo imunologickou analýzou za účelem detekce očekávaného genového produktu. Hostitelské buňky obsahující a/nebo exprimující rekombinantní aveC kódující sekvenci, mohou být identifikovány jakýmkoli z alespoň čtyř obecných přístupů, které jsou dobře známé v oboru, které zahrnují: i) DNA—DNA, DNA— RNA, nebo RNA-antisense RNA hybridizaci; ii) detekci přítomnosti funkčnosti „markerového“ genu; iii) posouzení stupně transkripce měřením exprese aveC-specifických mRNA transkriptů v hostitelské buňce; a iv) detekci přítomnosti zralého polypeptidového produktu například imunoanalýzou nebo přítomností AveC biologické aktivity (jako je například produkce nebo specifické poměry a množství avermektinů ukazující na AveC aktivitu v například S. avermitilis hostitelských buňkách).

5.2.3 Exprese a charakterizace rekombinantního AveC genového produktu

Jakmile byla stabilně vložena do příslušné hostitelské buňky aveC kódující sekvence, je transformovaná hostitelská buňka klonově propagována, a výsledné buňky mohou růst za podmínek napomáhajících maximální produkci aveC genového produktu. Takové podmínky typicky zahrnují rostoucí buňky do vysoké denzity. Kde expresní vektor obsahuje induktibilní promotor, jsou použity příslušné indukční podmínky, jako jsou například teplotní posun, deplece živin, přidání bezdůvodných induktérů (jako jsou například analoga karbohydrátů, jako například izopropyl-β-20CZ 304402 B6

D-thiogalaktopyranosidu (LPTG)), akumulace nadbytku metabolických vedlejších produktů, nebo podobně, jakje požadováno k indukování exprese.

Kde je exprimovaný AveC genový produkt zadržen uvnitř hostitelských buněk, jsou tyto buňky sesbírány a zlyzovány, a produkt je izolován a purifíkován z lyzátu za extrakčních podmínek známých v oboru, aby se minimalizovala degradace bílkovin, jako jsou například teplota 4 °C nebo přítomnost inhibitorů proteáz, nebo obojí. Kde je exprimovaný AveC genový produkt sekretován z hostitelských buněk, může být vyčerpané živné médium jednoduše sebráno a produkt zněj může být izolován.

Exprimovaný AveC genový produkt může být izolován nebo významně purifíkován podle vhodnosti z buněčných lyzátů nebo kultivačního média za použití standardních způsobů zahrnujících, ale neomezujících se na jakoukoli kombinaci z následujících způsobů: precipitace síranem amonným, frakcionace podle velikosti, ionexová chromatografie, HPLC, denzitní centrifugace aafínitní chromatografie. Kde exprimovaný AveC genový produkt vykazuje biologickou aktivitu, může být zvyšující se čistota preparátu monitorována v každém kroku purifíkačního postupu použitím jakékoli vhodné analýzy. Ať už exprimovaný AveC genový produkt vykazuje biologickou aktivitu či nikoli, může být detekován na základě například velikosti, nebo reaktivity s protilátkou jinak specifickou pro AveC, nebo pomocí přítomnosti fúzní značky. Jak je zde používáno, je AveC genový produkt „významně purifíkován“ tam, kde produkt konstituuje více než 20 váhových % bílkoviny v konkrétním preparátu. Jak je zde také používáno, je AveC genový produkt „izolován“, kde tento produkt konstituuje alespoň 80 váhových % bílkoviny v konkrétním preparátu.

Předkládaný vynález tedy poskytuje rekombinantně-exprimovaný izolovaný nebo významně purifíkovaný S. avermitilis AveC genový produkt obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo aminokyselinovou sekvencí z Obrázku 1 (SEQ ID č. 2), nebo její významnou část a její homologa.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantně-exprimovaný izolovaný nebo významně purifíkovaný S.hygroscopicus AveC homologní genový produkt obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4, nebo její významnou část a její homologa.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob produkce AveC genového produktu zahrnující kultivaci hostitelské buňky transformované rekombinantním expresním vektorem, kde řečený vektor zahrnuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt, přičemž tato polynukleotidová molekula je v operačním spojení s jedním nebo více regulačních elementů, které kontrolují expresi polynukleotídové molekuly v hostitelské buňce za podmínek napomáhajících produkci rekombinantního AveC genového produktu a získání AveC genového produktu z buněčné kultury.

Rekombinantně exprimovaný S. avermitilis AveC genový produkt je užitečný pro celou řadu účelů zahrnujících vyhledávání sloučenin, které narušují funkci AveC genového produktu a tím modulují biosyntézu avermektinů, a dále získávání protilátek namířených proti AveC genovému produktu.

Jakmile je AveC genový produkt o dostatečné čistotě získán, může být charakterizován standardními způsoby zahrnujícími SDS-PAGE, chromatografií na základě separace podle velikosti, aminokyselinovou sekvenční analýzu, biologickou aktivitu při produkci příslušných produktů v biosyntetické dráze avermektinů, atd. Aminokyselinová sekvence AveC genového produktu může být například určena za použití standardních sekvenčních technik pro peptidy. AveC genový produkt může být dále charakterizován za použití analýzy hydrofílity (viz například Hopp a Woods, 1981, Proč. Nat.Acad. Sci. USA 78:3824), nebo analogickým softwarovým algoritmem za účelem identifikace hydrofobních a hydrofílních oblastí AveC genového produktu. Strukturální analýza může být provedena za účelem identifikace oblastí AveC genového produktu, které

-21 CZ 304402 B6 jsou zodpovědné za sekundární strukturu. K mapování a studiu míst interakcí mezi AveC genovým produktem a jeho substrátem mohou být použity biofyzikální metody, jako jsou například rentgenová krystalografie (Engstrom, 1974, Biochem Exp Biol 11: 7-13) počítačové modelování (Fletterick a Zoller (eds), 1986, v: Current Communications in Molecular Biology, Cold Springs Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, NY) a nukleární magnetická rezonance (NMR). Informace získané z těchto studií mohou být použity k vybrání nových míst pro mutace v aveC ORF, aby se pomohlo vyvinout nové kmeny S. avermitilis mající více žádoucí charakteristiky produkce avermektinů.

5.3. Konstrukce a použití AveC mutant

Předkládaný vynález poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je jinak stejná jako S. avermitilis aveC alela nebo její degenerační varianta, nebo AveC genový produkt-kódující sekvence plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo její degenerační varianta, nebo nukleotidová sekvence aveC ORF S. avermitilis, jak je prezentováno na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její degenerační varianta, ale které dále obsahují jednu nebo více mutací, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, v kterých byl divoký typ aveC alely inaktivován, a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, nebo její degenerační variantu, produkují odlišný poměr nebo množství avermektinů, které jsou produkovány buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které exprimují pouze divoký typ aveC alely.

Podle předkládaného vynálezu mohou být takové polynukleotidové molekuly použity k produkci nových kmenů S. avermitilis, které vykazují detekovatelnou změnu v produkci avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují avermektiny ve sníženém poměru třídy 2:1 ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V další přednostní formě jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují zvýšená množství avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze jediný divoký typ aveC alely. V další přednostní formě jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, v kterých je aveC gen inaktivován.

Mutace aveC alely nebo kódující sekvence zahrnují jakékoli mutace, které vedou k jedné nebo více delecím, adicím nebo substitucím do AveC genového produktu, nebo které vedou ke vzniku zkráceného AveC genového produktu, nebo kjakékoli jejich kombinaci, a které vedou k požadovanému výsledku. Takové mutované sekvence aveC alely jsou také zamýšleny, aby obsahovaly jejich degenerované varianty. Předkládaný vynález například poskytuje polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci aveC alely nebo její degenerované varianty, nebo AveC genový produkt-kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo její degenerovanou variantu, nebo nukleotidovou sekvenci aveC ORF S. avermitilis, jak je uvedeno na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její degenerovanou variantu, ale které dále obsahují jednu nebo více mutací, které kódují substituci aminokyselinového rezidua odlišným aminokyselinovým reziduem ve zvolených pozicích v AveC genovém produktu. V několika neomezujících formách vynálezu, z nichž několik je uvedeno příkladem níže, mohou být takové substituce provedeny v jakýchkoli aminokyselinových pozicích AveC genového produktu, které korespondují s aminokyselinovými pozicemi 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 nebo 298 sekvence SEQ ID ě. 2, nebo některými jejich kombinacemi.

Mutace aveC kódující sekvence jsou provedeny jakoukoli ze známých metod zahrnujících použití PCR náchylné k chybám, nebo kazetové mutageneze. K narušení sekvence aveC alely nebo ORF definovaným způsobem, například vložením jednoho nebo více restrikčních míst, nebo terminačního kodónu, do specifických oblastí v aveC alele nebo ORF může být například použita mutageneze řízená oligonukleotidem. K tvorbě velkých knihoven polynukleotidů majících nukleotidové sekvence kódujících aveC mutace mohou být také použity metody například popsa-22CZ 304402 B6 né v patentech US 5 605 793, US 5 830 721 a US 5 837 458, které zahrnují náhodnou fragmentaci, opakované cykly mutageneze a nukleotidové přemísťování.

Užitečné mohou být cílené mutace, obzvláště tam, kde slouží k narušení jednoho nebo více konzervovaných aminokyselinových reziduí v AveC genovém produktu. Například srovnání odvozených aminokyselinových sekvencí AveC genových produktů a AveC homologních genových produktů ze S. avermitilis (SEQ ID č. 2), S. griseochromogenes (SEQ ID č. 5) a S. hygroscopicus (SEQ ID č. 4), jak jsou uvedeny na Obrázku 6, ukazuje místa významné konzervace aminokyselinových reziduí mezi těmito druhy. V tvorbě nových mutovaných kmenů, které vykazují požadované alterace produkce avermektinů může být obzvláště účinná cílená mutageneze, která vede ke změně v jednom nebo více těchto konzervovaných aminokyselinových reziduích.

Užitečná může být také náhodná mutageneze, která může být provedena expozicí buněk S. avermitílis ultrafialovému záření nebo rentgenovému záření, nebo chemickým mutagenům, jako jsou například N-methyl-N'-nitrosoguanidin, ethylmethansulfonát, kyselina dusičná nebo dusíkaté yperity. Pro shrnutí technik mutageneze viz například Ausubel, 1989 výše.

Jakmile jsou mutované polynukleotidové sekvence generovány, jsou prohlíženy, aby se určilo, zdali mohou modulovat biosyntézu avermektinů v S. avermitilis. V přednostní formě vynálezu je polynukleotidová molekula mající mutovanou nukleotidovou sekvenci testována komplementací kmene S. avermitilis, v kterých byl aveC gen inaktivován za vzniku aveC negativního (aveC”) pozadí. V neomezujícím způsobuje mutovaná polynukleotidová molekula sestříhaná do expresního plazmidu v operačním spojení s jedním nebo více regulačních elementů, přičemž tento plazmid také přednostně obsahuje jeden nebo více genů pro lékovou rezistenci, které umožňují výběr transformovaných buněk. Tento vektor je poté transformován do aveC hostitelských buněk za pomocí známých technik a transformované buňky jsou vybrány a kultivovány v příslušném fermentačním médiu za podmínek, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů. Fermentační produkty jsou poté analyzovány pomocí HPLC, aby se určila schopnost mutované polynukleotidové molekuly ke komplementací hostitelské buňky. Některé vektory nesoucí mutované polynukleotidové molekuly schopné snížit B2:B1 poměr avermektinů zahrnují pSE 188, pSE 199, pSE231, pSE239 a pSE290 až pSE297, jakje uvedeno příkladem v Části 8,3 níže.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby identifikace mutací S. avermitilis aveC ORF schopných narušit poměr a/nebo množství produkovaných avermektinů. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob identifikace mutací schopných narušit poměr třídy 2:1 produkovaných avermektinů, přičemž tento způsob zahrnuje (a) určení poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt, a tato molekula je exprimována; (b) určení poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis jako v kroku (a), ale přičemž tyto buňky místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely nebo ORF z Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo nukleotidovou sekvenci, která je kORF homologní; a (c) porovnání poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) s poměrem třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b); takže je-li poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) odlišný od poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), poté může být identifikována mutace aveC ORF schopná pozměnit poměr třídy 2:1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je poměr třídy 2:1 avermektinů touto mutací snížen.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob identifikace mutací aveC ORF nebo genetických konstruktů obsahujících aveC ORF schopné změnit množství produkovaných avermektinů, přičemž tento způsob zahrnuje: (a) určení množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC

-23 CZ 304402 B6 genový produkt, nebo obsahující genetický konstrukt zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt a tato molekula je exprimována; (b) určení množství avermektinů produkovaných stejným kmenem S. avermitilis jako v kroku (a), ale přičemž tento kmen místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely nebo homologní nukleotidovou sekvenci; a (c) porovnání množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) s množstvím avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b); takže je-li množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) odlišné od množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), poté může být identifikována mutace aveC ORF nebo genetického konstruktu schopná pozměnit poměr třídy 2:1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je produkované množství avermektinů touto mutací zvýšeno.

Jakýkoli z výše uvedených způsobů k identifikaci mutací může být proveden za použití fermentačního kultivačního média přednostně suplementovaného cyklohexankarboxylovou kyselinou, ačkoli mohou být i jiné vhodné prekurzory mastných kyselin, jako jsou například jakékoli prekurzory mastných kyselin uvedených v Tabulce 1.

Jakmile je identifikována mutovaná polynukleotidová molekula, která moduluje produkci avermektinů žádoucím směrem, může být určeno umístění mutace v nukleotidové sekvenci. Polynukleotidová molekula mající nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt může být například izolována pomocí PCR a podrobena DNA sekvenční analýze za použití známých způsobů. Mutace zodpovědná(é) za alteraci produkce avermektinů může být určena srovnáním DNA sekvence mutované aveC alely se sekvencí divokého typu aveC alely. Ve specifických, avšak neomezujících formách předkládaného vynálezu vedly S. avermitilis AveC genové produkty obsahující buďto jedinou aminokyselinovou substitucí v jakémkoli z reziduí 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T), nebo 230 (G230D), nebo dvě substituce v pozicích 138 (S138T) a 139 (A139T nebo A139F) ke změnám ve funkci AveC genového produktu, takže poměr třídy 2:1 produkovaných avermektinů byl narušen (viz Část 8 níže), kde uvedené aminokyselinové pozice korespondují s pozicemi na Obrázku 1 (SEQ ID č. 2). Navíc bylo prokázáno, že následujících sedm kombinací mutací účinně snižuje poměr třídy 2:1 avermektinů: 1) D48E; 2) S138T/1A39T/G179S; 3) Q38P/L136P/E238D; 4) F99S/S138T/A139T/G179S; 5) A139T/M228T; 6) Gll 1V/P289T. Jak je zde používáno, výše uvedená označení, jako například A139T, ukazují původní aminokyselinové reziduum jednopísmenovým označením, v kterém je v tomto případě alanin (A) v uvedené pozici, která je v tomto případě pozice 139 (týká se SEQ ID č. 2) polypeptidů, a následuje aminokyselinové reziduum, které nahrazuje původní aminokyselinové reziduum, kterým je v tomto případě threonin (T). Z tohoto důvodu jsou polynukleotidové sekvence mající nukleotidové sekvence, které kódují mutované S. avermitilis genové produkty obsahující aminokyselinové substituce nebo delece v jedné nebo více aminokyselinových pozic 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, nebo 298 (viz obrázek 1), nebo jakékoli jejich kombinace, zahrnuty předkládaným vynálezem.

V přednostní formě vynálezu kódují takové mutace aminokyselinové substituce vybrané zjedné nebo více skupin obsahující:

a) aminokyselinové reziduum Q v pozici 38 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P;

b) aminokyselinové reziduum D v pozici 48 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E;

c) aminokyselinové reziduum A v pozici 89 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T;

d) aminokyselinové reziduum F v pozici 99 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S;

-24CZ 304402 B6

e) aminokyselinové reziduum G v pozici 111 nahrazené V nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro V;

f) aminokyselinové reziduum L v pozici 136 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P;

g) aminokyselinové reziduum S v pozici 138 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T;

h) aminokyselinové reziduum A v pozici 139 nahrazené T nebo F nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T nebo F;

i) aminokyselinové reziduum K v pozici 154 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E;

j) aminokyselinové reziduum G v pozici 179 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S;

k) aminokyselinové reziduum M v pozici 228 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T;

l) aminokyselinové reziduum E v pozici 238 nahrazené D nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro D;

m) aminokyselinové reziduum P v pozici 289 nahrazené L nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro L; a

n) aminokyselinové reziduum Q v pozici 298 nahrazené H nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro H;

kde konzervativní aminokyselinové substituce jsou stejné, jako je definováno výše v sekci 5.1

V další přednostní formě vynálezu kódují takové mutace kombinaci aminokyselinových substitucí, kde kombinace substituovaných aminokyselinových reziduí je vybrána ze skupiny obsahující:

a) aminokyselinová rezidua S138aA139;

b) aminokyselinová rezidua D48 a A89;

c) aminokyselinová rezidua S13 8 a A139 a G179;

d) aminokyselinová rezidua Q38, L136 a E238;

e) aminokyselinová rezidua F99, S138, A139 a G179;

f) aminokyselinová rezidua Al39 a M228;

g) aminokyselinová rezidua GI 11 a P289; a

h) aminokyselinová rezidua A139, K154 a Q298.

V další přednostní formě vynálezu jsou specifické kombinace mutací aveC alely užitečné pro efektivní snížení poměru třídy 2:1 avermektinů podle předkládaného vynálezu vybrány z jedné nebo více skupin obsahujících:

-25CZ 304402 B6

a) S138T/A139T

b) S138T/A139F

c) D48E/A89T;

d) S138T/A139T/G179S;

e) Q38P/L136P/E238D;

f) F99S/S138T/A139T/G179S;

g) A139T/M228T;

h) G111V/P289L; a

i) A139T/K154E/Q298H.

Předkládaný vynález dále poskytuje preparáty pro přípravu nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky obsahují mutovanou aveC alelu, která vede k narušení produkce avermektinů. Předkládaný vynález například poskytuje rekombinantní vektory, které mohou být použity k zacílení jakékoli polynukleotidové molekuly obsahující mutované nukleotidové sekvence, které jsou předmětem předkládaného vynálezu na místo aveC genu chromozómu S. avermitilis buďto k inzerci, nebo k nahrazení aveC ORF nebo jeho části pomocí homologní rekombinace. Podle předkládaného vynálezu však může polynukleotidová molekula obsahující zde poskytnutou mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, také modulovat biosyntézu avermektinů, je-li inzerována do chromozómu v místě jiném než je aveC gen, nebo je-li udržována epizomálně v buňkách S. avermitilis. Předkládaný vynález tedy také poskytuje vektory obsahující polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, přičemž tyto vektory mohou být použity k inzerci polynukleotidové molekuly na místo v chromozómu S. avermitilis jiné než je aveC gen, nebo mohou být udržovány epizomálně.

V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genů, které mohou být použity k inzerci mutované aveC alely nebo její degenerované varianty do buněk kmene S. avermitilis, čímž dochází k tvorbě nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky produkují avermektiny v narušeném poměru třídy 2:1 ve srovnání s buňkami stejného kmene, který místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě je poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami snížen. Takové vektory nahrazující geny mohou být konstruovány za použití mutovaných polynukleotidových molekul přítomných ve zde poskytnutých expresních vektorech, jako jsou například pSE188, pSE199 a pSE231, přičemž tyto expresní vektory jsou uvedeny příkladem v Části 8 níže.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory, které mohou být použity k inzerci mutované aveC alely nebo její degenerované varianty do buněk kmene S. avermitilis k tvorbě nových kmenů buněk, které produkují avermektiny v narušeném množství ve srovnání s buňkami stejného kmene, který místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě je množství avermektinů produkovaných buňkami zvýšeno. Ve specifické, avšak neomezující formě vynálezu zahrnuje takový vektor silný promotor, jak je známý v oboru, jako je například silný konstitutivní ermE promotor z Sacharopolysora erythraea, který je situován ve směru nahoru od a v operačním spojení saveC alelou. Takovým vektorem může být pSE189, popsaný v příkladu provedení vynálezu 11 níže, nebo může být konstruován za použití mutované aveC alely plazmidu pSEl 89.

-26CZ 304402 B6

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genů, které jsou užitečné pro inaktivaci aveC genu u divokého typu kmene S. avermitilis. V neomezující formě vynálezu mohou být takové vektory nahrazující gen zkonstruovaný za použití mutované polynukleotidové molekuly přítomné vplazmidu pSE180 (ATCC 209605), která je uvedena příkladem v části 8.1 níže (obrázek 3). V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genů, které zahrnují polynukleotidovou molekulu obsahující nebo skládající se z nukleotidových sekvencí, které přirozeně hraničí s aveC genem in šitu v chromozómu

S. avermitilis, a zahrnují například hraničící nukleotidové sekvence uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), přičemž tyto vektory mohou být použity k deleci S. avermitilis aveC ORF.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro přípravu nových kmenů S. avermitilis zahrnujících buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, a které produkují porušený poměr a/nebo množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S. avermitilis zahrnujících buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, a které produkují porušený poměr třídy 2:1 avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, dále zahrnující transformaci buněk kmene S. avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, který narušuje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a vybrání transformovaných buněk, které produkují narušený poměr třídy 2:1 ve srovnání s poměrem třídy 2:1 produkovaným buňkami kmene, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostnější formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nového kmene S. avermitilis zahrnující transformaci buněk kmene S. avermitilis vektorem schopným vytvořit mutaci v aveC alele takových buněk, kde mutace aveC alely vede k substituci v kódovaném AveC genovém produktu různého aminokyselinového rezidua v jedné nebo více aminokyselinových pozicích odpovídajících aminokyselinovým reziduím 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, nebo 298 v sekvenci SEQ ID č. 2, takže buňky kmene S. avermitilis, v kterých byla aveC alela mutována, produkují poměr třídy 2:1, který je odlišný od poměru produkovaného buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2:1 avermektinů.

Jak je zde používáno, tam, kde aminokyselinové reziduum kódované aveC alelou v chromozómu S. avermitilis, nebo ve vektoru či izolované polynukleotidové molekule, která je předmětem předkládaného vynálezu, je označováno jako „odpovídající“ konkrétnímu aminokyselinovému reziduu v sekvenci SEQ ID č. 2, nebo kde aminokyselinová substituce je označována jako vyskytující se v konkrétní pozici „odpovídající“ specifickému očíslovanému aminokyselinovému reziduu v sekvenci SEQ ID č. 2, týká se aminokyselinové reziduum stejného relativního umístění v AveC genovém produktu, který osoba znalá oboru může rychle určit pomocí odkazu na aminokyselinovou sekvenci prezentovanou zde jako SEQ ID c. 2.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro přípravu nových kmenů, kde specifické mutace v aveC alele kódující konkrétní mutace jsou uváděny jako základní změny ve specifických nukleotidových pozicích v aveC alele „odpovídající“ konkrétním nukleotidovým pozicím, jak je uvedeno v sekvenci SEQ ID č. 1. Jak je uvedeno výše, s ohledem na odpovídající aminokyselinové pozice, kde nukleotidová pozice v aveC alele je uváděna jako „odpovídající“ konkrétní nukleotidové pozici v sekvenci SEQ ID č. 1, týká se nukleotid stejného relativního umístění v aveC nukleotidové sekvenci, kterou může osoba znalá oboru rychle určit pomocí odkazu na nukleotidovou sekvenci prezentovanou zde jako sekvence SEQ ID č. 1.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S. avermitilis zahrnujících buňky, které produkují porušená množství avermektinů, zahrnující transformaci buňky kmene S. avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, jejíž exprese vede k narušení množství avermektinů

-27CZ 304402 B6 produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a vybrání transformovaných buněk, které produkují avermektiny v narušeném množství ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaných buňkami kmene, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je zvýšeno množství avermektinů produkovaných transformovanými buňkami.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky obsahují inaktivovanou aveC alelu, zahrnující transformaci buněk kmene S. avermitilis, které exprimují jakoukoli aveC alelu vektorem, který inaktivuje aveC alelu, a vybrání transformovaných buněk, v kterých byla aveC alela inaktivována. V přednostnější, avšak neomezující formě vynálezu jsou buňky kmene S. avermitilis transformovány vektorem nahrazujícím gen, který nese aveC alelu, která byla inaktivována mutací nebo náhradou části aveC alely heterologní genovou sekvencí, a jsou vybrány transformované buňky, v kterých byla jinak nativní aveC alela nahrazena inaktivovanou aveC alelou. Inaktivace aveC alely může být určena HPLC analýzou fermentaěních produktů, jak je popsáno níže. Ve specifické, avšak neomezující formě vynálezu popsané v části 8.1 níže byla aveC alela inaktivována inzercí ermE genu ze Sacharopolyspora erythraea do aveC ORF.

Předkládaný vynález dále poskytuje nové kmeny S. avermitilis zahrnující buňky, které byly transformovány jakýmikoli polynukleotidovými molekulami nebo vektory, které jsou předmětem předkládaného vynálezu. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahrnující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, nebo její degenerovanou variantu na místo nebo navíc k divokému typu aveC alely, kde buňky nového kmene produkují avermektiny v narušeném poměru třídy 2:1 ve srovnání s poměrem třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je snížen narušený poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaný novými buňkami. Takové nové kmeny jsou užitečné pro produkci komerčně žádoucích avermektinů, jako je například doramektin, ve velkém měřítku. V přednostnější formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahrnující jakoukoli z výše uvedených mutací nebo kombinací mutací v aveC alele v nukleotidových pozicích odpovídajících pozicím prezentovaných výše, nebo které jinak kódují jakoukoli z výše uvedených aminokyselinových substitucí AveC genového produktu. Ačkoli takové mutace mohou být přítomny v takových buňkách na extrachromozomální části, jako je například plazmid, je preferováno, že takové mutace jsou přítomny v aveC alele lokalizované na chromozómu S. avermitilis. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález kmen Streptomyces avermitilis zahrnující buňky mající mutaci v aveC alele, která kóduje AveC genový produkt mající substituci vjedné nebo více aminokyselinových pozicích odpovídajících aminokyselinovým reziduím 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, nebo 298 v sekvenci SEQ ID ě. 2, kde buňky produkují poměr třídy 2:1 avermektinů, který je odlišný od poměru produkovaného buňkami stejného kmene S. avermitilis, který exprimuje divoký typ aveC alely.

Primárním cílem vyhledávacích analýz zde popsaných je identifikovat mutované alely aveC genu, jejichž exprese je v buňkách S. avermitilis narušena a konkrétněji dochází ke snížení poměru třídy 2:1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je poměr B2:B1 avermektinů produkovaných buňkami nového kmene S. avermitilis, který je předmětem předkládaného vynálezu, a který exprimuje mutovanou aveC alelu nebo její degenerovanou variantu, a který je předmětem předkládaného vynálezu, zhruba 1,6:1 nebo méně. V přednostnější formě vynálezu je poměr 0,84:1 nebo méně. V přednostnější formě vynálezu je poměr 0,80:1 nebo méně. V přednostnější formě vynálezu je poměr 0,75:1 nebo méně. V přednostnější formě vynálezu je poměr 0,73:1 nebo méně. V přednostnější formě vynálezu je poměr 0,68:1 nebo méně. V ještě přednostnější formě vynálezu je poměr 0,67:1 nebo méně. V přednostnější formě vynálezu je poměr 0,57:1 nebo méně. V ještě přednostnější formě vynálezu je poměr 0,53:1 nebo méně. V ještě přednostnější formě vynálezu je poměr 0,42:1 nebo méně. V ještě přednostnější formě vynálezu je poměr 0,40:1 nebo méně.

-28CZ 304402 B6

V specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 1,6:1 V odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,94:1. V další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,88:1. V další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,84:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,75:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,73:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,68:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,67:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,57:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,53:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,42:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,40:1.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahrnující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, nebo její degenerovanou variantu, nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu nebo její degenerovanou variantu na místo nebo navíc k divokému typu alely, kde buňky nového kmene produkují narušená množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu produkuje nový kmen zvýšená množství avermektinů. V neomezující formě vynálezu zahrnuje genetický konstrukt silný promotor, jako je například silný konstitutivní promotor ermE ze Sacharopolyspora erythraea ve směru nahoru a v operačním spojení s aveC ORF.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahrnující buňky, v kterých byl aveC gen inaktivován. Takové kmeny jsou užitečné pro rozličné spektrum avermektinů, které produkují ve srovnání s divokým typem kmene i pro komplementaci vyhledávacích analýz, jak je zde popsáno, aby se určilo, zdali cílená nebo náhodná mutageneze aveC genu ovlivňuje produkci avermektinů. Ve specifické formě vynálezu popsané níže byly hostitelské buňky S. avermitilis geneticky upraveny, aby obsahovaly inaktivovaný aveC gen. Například kmen SE180-11 popsaný v příkladech níže byl generován za použití plazmidu pSE180 nahrazujícího gen (ATCC 209605) (obrázek 3), který byl konstruován, aby inaktivoval S. avermitilis aveC gen inzercí genu ermE rezistence do aveC kódující oblasti.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantně exprimované mutované S. avermitilis AveC genové produkty kódované jakoukoli zvýše uvedených polynukleotidových molekul, které jsou předmětem vynálezu a způsoby jejich přípravy.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, přičemž tyto buňky exprimují mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který narušuje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, v kultivačním médiu za podmínek, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů z těchto buněk. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2:1

-29CZ 304402 B6 avermektinů produkovaných v kultuře buňkami exprimujícími mutovanou aveC alelu. Tento způsob poskytuje zvýšenou účinnost v produkci komerčně cenných avermektinů, jako je například doramektin.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, přičemž tyto buňky exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, která vede k produkci narušeného množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene, které neexprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt, ale místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely, v kultivačním médiu za podmínek, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů z těchto buněk, a získání řečených avermektinů z kultury. V přednostní formě vynálezu je zvýšeno množství avermektinů produkovaných v kultuře buňkami exprimujícími mutovanou aveC alelu, degenerovanou variantu nebo genetický konstrukt.

Předkládaný vynález dále poskytuje nový preparát avermektinů produkovaných kmenem S. avermitilis exprimujícím mutovanou aveC alelu nebo její degenerovanou variantu, která kóduje genový produkt, který snižuje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu nebo její degenerovanou variantu ve srovnání s buňkami stejného kmene, které místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely, kde avermektiny v novém preparátu jsou produkovány ve sníženém poměru třídy 2:1 ve srovnání s poměrem třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis, které místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely. Nový avermektinový preparát může být přítomen, jak je produkován ve vyčerpané fermentační kultivační tekutině, nebo z ní může být stažen. Nový avermektinový preparát může být částečně nebo významně purifikován z kultivační tekutiny pomocí známých biochemických technik purifikace, jako jsou například precipitace síranem amonným dialýza, frakcionace podle velikosti, ionexová chromatografie, HPLC, atd.

5.4 Použití avermektinů

Avermektiny jsou vysoce aktivní antiparazitámí látky mající obzvláštní využití jako antihelmintika, ektoparaziticidy, insekticidy a akaricidy. Avermektinové sloučeniny produkované podle způsobů předkládaného vynálezu jsou užitečné pro jakýkoli z těchto účelů. Avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou užitečné například k léčbě různých onemocnění či stavů člověka, obzvláště těch, které jsou způsobené parazitickými infekcemi, jak je známo v oboru. Viz například Ikeda a Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609. Konkrétněji avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou účinně v léčbě celé řady onemocnění nebo stavů způsobených endoparazity, jako jsou například parazitická nemátoda, která mohou infikovat člověka, domácí zvířata, prasata, ovce, drůbež, koně nebo dobytek.

Specifičtěji avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou účinné proti nematodům, která infikují člověka, stejně tak jako nematoda, která infikují různé druhy živočichů. Taková nematoda zahrnují gastrointestinální parazity, jako jsou například Ancylostoma, Necatotor, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria a parazité, které jsou nacházeni v krvi jiných tkání a orgánů, jako jsou například filariální červi a střevní formy Strongyloides a Trichinella.

Avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou také účinné v léčbě ektoparazitických infekcí zahrnujících například infestaci savců a ptáků arthropody, způsobené klíšťaty, roztoči, všemi, blechami, masařkami, bodavým hmyzem nebo migrujícími larvami dvoukřídlého hmyzu, které mohou napadnout mezi jinými dobytek a koně.

Avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou také užitečné jako insekticidy proti domácím škůdcům, jako jsou například mezi jinými švábi, moli, kobercoví

-30CZ 304402 B6 brouci a domácí mouchy, stejně tak jako hmyz napadající uskladněné zrní a zemědělské rostliny, přičemž tyto škůdci zahrnují mezi jinými roztoče, mšice, housenky a hmyz zrodu Orthoptera, jako jsou například kobylky.

Zvířata, která mohou být léčena avermektinovými sloučeninami produkovanými podle vynálezu, zahrnují ovce, dobytek, jeleny, kozy, prasata, ptáky včetně drůbeže a psi a kočky.

Avermektinová sloučenina produkovaná podle předkládaného vynálezu je podávána v preparátu vhodném pro specifické zamýšlené použití, konkrétní druh hostitelského zvířete, které má být léčeno a parazita či hmyzu, který je infekčním agens. Pro použití jako paraziticidum může být avermektinová sloučenina produkovaná podle předkládaného vynálezu podávána ve formě kapsle, bolu, tablety nebo tekutého léku, nebo může být alternativně podána jako forma polévací, injekční nebo jako implantát. Takové formy jsou připraveny konvenčním způsobem ve shodě se standardní veterinární praxí. Kapsle, bolusy nebo tablety mohou být tedy připraveny smíšením aktivní složky s vhodnou přesně rozdělenou ředicí látkou nebo s nosičem, dále obsahujícím dezintegrační látku a/nebo vazebnou látku, jako jsou například škrob, laktóza, talek, magnézium stearát, atd. Namáčecí preparáty mohou být připraveny disperzní aktivní složky ve vodném roztoku spolu s například dispergující nebo zvlhčující látkou. Injekční preparáty mohou být připraveny ve formě sterilního roztoku, kteiý může obsahovat další substance, jako jsou například dostatečné soli a/nebo glukóza, aby mohl být připraven roztok izotonický s krví.

Takové preparáty se liší vahou aktivní sloučeniny v závislosti na pacientovi, druhu hostitelského zvířete, které má být léčeno, závažnosti a typu infekce a tělesné váhy hostitele. Obecně je pro perorální podání dostatečná dávka aktivní sloučeniny od zhruba 0,001 do 10 mg na kg tělesné váhy pacienta nebo zvířete podané jako jedna dávka nebo rozděleně po dobu od 1 do 5 dnů. Mohou však nastat případy, kde je indikováno vyšší nebo nižší dávkovači rozmezí, jak je určeno například lékařem nebo veterinářem podle klinických příznaků.

Jako alternativa může být avermektinová sloučenina produkována podle předkládaného vynálezu podána v kombinaci s krmivém pro zvířata a pro tento účel může připraveno koncentrované krmivové aditivum nebo premix pro smíšení s normálním krmivém pro zvířata.

Pro použití jako insekticidům a pro léčbu zemědělských škůdců může být avermektinová sloučenina produkovaná podle předkládaného vynálezu podaná jako sprej, prášek, emulze a podobně ve shodě se standardní zemědělskou praxí.

Příklady provedení vynálezu

6. Fermentace Streptomyces avermitilis a analýza B2:B1 avermektinů

Kmeny postrádající aktivitu dehydrogenázy větvených 2-oxo kyselin i 5-O-methyltransferázy neprodukují žádné avermektiny, pokud fermentační médium není suplementováno mastnými kyselinami. Tento příklad demonstruje, že u takových mutant může být získáno široké spektrum poměrů B2:B1 avermektinů, je-li fermentace zahájena v přítomnosti různých mastných kyselin.

6.1 Materiál a metodika

Buňky Streptomyces avermitilis ATCC 53692 byly skladovány při teplotě -70 °C jako plný bujón připravený v očkovacím médiu složeném z: škrobu (Nadex, Laing National) - 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g; Ardamin pH (Yeast Products lne.) - 5 g; uhličitanu vápenatého - 1 g. Finální objem byl upraven na 1 litr tekoucí vodou, pH bylo upraveno na 7,2 a médium bylo autoklávováno při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.

-31 CZ 304402 B6

K inokulaci nádoby obsahující stejné médium byly použity dva ml rozmražené suspenze výše uvedeného preparátu. Po 48 hodinách inkubace při teplotě 28 °C na rotační třepačce při rychlosti 180 rpm, byly použity 2 ml bujónu k inokulaci nádoby obsahující 50 ml produkčního média obsahujícího: škrob - 80 g; uhličitan vápenatý - 7 g; Pharmamedia - 5 g; hydrogen fosfát draselný - lg; síran hořečnatý - 1 g; kyselina glutamová - 0,6 g; heptahydrát síranu železnatého - 0,01 g; síran zinečnatý - 0,001 g; síran manganatý - 0,001 g. Finální objem byl upraven do 1 litru tekoucí vodou, pH bylo upraveno na 7,2 a médium bylo autoklávováno při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.

Rozličné substráty karboxylové kyseliny (viz Tabulka 1) byly rozpuštěny v methanolu a přidány do fermentačního bujónu 24 hodin po inokulaci za vzniku finální koncentrace 0,2 g/litr. Fermentační bujón byl inkubován 14 dnů při teplotě 28 °C, poté byl bujón zcentrifugován (2500 rpm, po dobu 2 minut) a supematant byl odstraněn. Mycéliová peleta byla extrahována acetonem (15 ml), poté dichlormethanem (30 ml) a organická fáze byla separována, zfiltrována a poté odpařena do sucha. Reziduum bylo extrahováno do methanolu (1 ml) a analyzováno pomocí HPLC pomocí kapalinového chromatografu Hewlett-Packard 1090A vybaveném skenovacím diode-array detektorem při 240 nm. Byla použita kolona Beckman Ultrasphere C-18, 5 μπι, 4,6 mm x 25 cm, teplota kolony byla udržována na 40 °C. Na kolonu bylo injikováno 25 μΐ nebo výše uvedeného methanolického roztoku. Eluce byla provedena lineárním gradientem methanol-voda z poměru 80:20 do 95:5 po dobu 40 minut při průtoku 0,85 ml/minutu. Ke kalibraci odpovědi detektoru byly použity dvě standardní koncentrace cyklohexylu B1 a byla měřena plocha pod křivkami B2 a B1 avermektinů.

6.2 Výsledky

HPLC retenční časy pozorované pro B2 a B1 avermektiny a poměry 2.1 jsou uvedeny v Tabulce 1

Tabulka 1

	HPLC retenční čas ( min)	Poměr
Substrát	B2	B1	B2:B1
4 - Tetrahydropyrankarboxylová kyselina	8,1	14,5	0,25
Kyselina izomáselná	10,8	18,9	0,5
Kyselina 3-furoová	7,6	14,6	0,62
Kyselina S-(+)-2-metylmáselná	12,8	21, 6	1,0
Kyselina cyklohexankarboxylová	16,9	26,0	1,6
Kyselina 3-thiofenkarboxylová	8,8	16,0	1,8
Kyselina cyklopentankarboxylová	14,2	23,0	2,0
Kyselina 3 - trifluoromethylmáselná	10,9	18,8	3,9
Kyselina 2-methylpentanová	14,5	24,9	, 2
Kyselina cykloheptankarboxylová	18,6	29,0	15,0

Data prezentovaná v Tabulce 1 demonstrují extrémně široké rozmezí poměrů B2:B1 avermektinových produktů, což ukazuje na významný rozdíl ve výsledcích dehydratační konverze třídy 2 sloučenin na třídu 1 sloučenin, v závislosti na charakteru postranního řetězce mastné kyseliny dodávané jako iniciační sloučenina. To ukazuje, že změny v poměrech B2:B1, které jsou výsledkem alterací AveC proteinu, mohou být specifické konkrétním substrátům. Následné vyhledávání mutant vykazujících změny vpoměruB2:Bl získané s konkrétním substrátem musí být prováděno v přítomnosti tohoto substrátu. Následné příklady popsané níže používají kyselinu cyklohexankarboxylovou jako substrát pro vyhledávání mutant. Tento substrát je však používán

-32CZ 304402 B6 čistě jako příklad potenciálu a není zamýšlen jako omezující použitelnost předkládaného vynálezu.

7. Izolace aveC genu

Tento příklad popisuje izolaci a charakterizaci oblasti chromozómu Streptomyces avermitilis, který kóduje AveC genový produkt. Jak je demonstrováno níže, byl aveC gen identifikován jako schopný modifikovat poměr produkovaných cyklohexyl B2 avermektinů na cyklohexyl B1 avermektiny (B2:B1).

7.1. Materiál a metodika

7.1.1. Růst Streptomyces pro izolaci DNA

Pro růst Streptomyces byla použita následující metoda. Jednotlivé kolonie S. avermitilis ATCC 31272 (izolát jednotlivé kolonie č. 2) byly izolovány na poloviční půdě YPD-6 obsahující: Difco kvasničný extrakt - 5 g; Difco Bactopepton - 5 g; dextróza - 2,5 g; MOPS - 5 g; Difco Bacto agar - 5 g. Finální objem byl upraven na 1 litr pomocí dH₂O, pH bylo upraveno na 7,0 a médium bylo autoklávováno při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.

Mycélia vykultivovaná na výše uvedeném médiu byla použita k inokulaci 10 ml TSB média (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, v 1 litru dH₂O, autoklávováno při teplotě 121 °C po dobu 25 minut) ve zkumavce o rozměrech 25 x 150 mm, která byla protřepávána (300 rpm) při teplotě 28 °C po dobu 48 až 72 hodin.

7.1.2. Chromozomální DNA izolace ze Streptomyces

Alikvóty (0,25 ml nebo 0,5 ml) mycélia vykultivovaného, jak bylo popsáno výše, byly umístěny v l,5ml mikrocentrifugačních zkumavkách a buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 12 000 g po dobu 60 sekund. Supematant byl odstraněn a buňky byly resuspendovány v 0,25 ml TSE pufru (20 ml 1,5M sacharózy, 2,5ml 1M Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 ml 1M EDTA, pH 8,0 a 75 ml dH₂O) obsahujícím 2 mg/ml lysozomu. Vzorky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 20 minut při protřepávání, vloženy do automatizovaného zařízení na izolaci nukleových kyselin AutoGen 540™ (Integrated Separation systems, Natick, MA) a genomická DNA byla izolována za použití Cycle 159 (software zařízení) podle instrukcí výrobce.

Alternativně bylo 5 ml mycélia umístěno do zkumavky o rozměrech 17 x 100 mm, buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 3000 rpm po dobu 5 minut a supematant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 1 ml TSE pufru, zakoncentrovány centrifugací při 3000 rpm po dobu 5 minut a supematant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 1 ml TSE pufru obsahujícím 2 mg/ml lysozyma inkubovány při teplotě 37 °C při protřepávání po dobu 30 až 60 minut. Po inkubaci bylo přidáno 0,5 ml 10% dodecylsulfátu sodného (SDS) a buňky byly inkubovány při teplotě 37 °C až do dokončení lýzy. Lyzát byl inkubován při teplotě 65 °C po dobu 10 minut, ochlazen na pokojovou teplotu, rozdělen do dvou ependorfek a extrahován lx 0,5 ml fenol/chloroformem (50% fenol předem ekvilibrovaný 0,5M Trisem, pH 8,0; 50% chloroform). Vodná fáze byla odstraněna a extrahována 2 až 5 x směsí chloroform:izoamylalkohol (24:1). DNA byla precipitována přidáním 1/10 objemu 3M octanu sodného, pH 4,8, inkubací směsi na ledu 10 minut, centrifugací směsi při 15000 rpm při teplotě 5 °C po dobu 10 minut, a vyjmutím supernatantu do čisté zkumavky, do které byl přidán 1 objem izopropanolu. Supematant plus směs izopropanolu byla poté inkubována na ledu po dobu 20 minut při 5 °C, supematant byl odstraněn a DNA peleta byla promyta lx 70% ethanolem. Po vysušení pelety byla DNA resuspendována v TE pufru (ÍOmM Tris, lmM EDTA, pH 8,0).

-33 CZ 304402 B6

7.1.3. Izolace plazmidové DNA ze Streptomyces

Alikvóta (1,0 ml) mycélia byla umístěna do l,5ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund. Supematant byl odstraněn, buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharózy a zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund a supematant byl odstraněn. Buňky byly poté resuspendovány v 0,25 ml TSE pufru obsahující 2 mg/ml lysozymu a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 20 minut při protřepávání a naneseny do automatizovaného zařízení pro izolaci nukleových kyselin AutoGen 540™. Plazmidová DNA byla izolována za použití softwaru Cycle 106 podle instrukcí výrobce.

Alternativně bylo 1,5 ml mycélia umístěno do l,5ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund. Supematant byl odstraněn, buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharózy a zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund a supematant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 0,5 ml TSE pufru obsahující 2 mg/ml lysozymu a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 15 až 30 minut. Po inkubaci bylo přidáno 0,25 ml alkalického SS (0,3 N NaOH, 2% SDS) a buňky byly inkubovány při teplotě 55 °C po dobu 15 až 30 minut, až byl roztok čistý. K roztoku DNA byl přidán octan sodný (0,1 ml, 3M, pH 4,8) a roztok byl poté inkubován na ledu po dobu 10 minut. Vzorky DNA byly centrifugovány při 14000 rpm po dobu 10 minut při teplotě 5 °C. Supematant byl vyjmut do čisté zkumavky a bylo přidáno 0,2 ml směsi fenokchloroform (50% fenol:50% chloroform) a směs byla jemně promíchávána. Roztok DNA byl centrifugován při 14000 rpm po dobu 10 minut při teplotě 5 °C a vrchní vrstva byla vyjmuta do čisté ependorfky. Byl přidán izopropanol (0,75 ml) a roztok byl jemně promícháván a poté inkubován při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Roztok DNA byl centrifugován při 14000 rpm po dobu 15 minut při teplotě 5 °C, supematant byl odstraněn a DNA peleta byla promyta 70% ethanolem, vysušena a resuspendována v TE pufru.

7.1.4. Izolace plazmidová DNA z E. coli

Jediná transformovaná kolonie E. coli byla inokulována do 5ml Luria-Bertani (LB) média (Bacto-Trypton - 10 g, Bacto-kvasničný extrakt - 5 g a NaCl - 10 g v 1 litru dH₂O, pH 7,0, autoklávováno při 121 °C po dobu 25 minut a suplementováno 100 pg/ml ampicilinu). Kultura byla inkubována přes noc a lml alikvóty byly umístěny do l,5ml mikrocentrifugační zkumavky. Vzorky kultury byly naneseny na automatizované zařízení pro izolaci nukleových kyselin AutoGen 540 a plazmidová DNA byla izolována za použití softwaru Cycle 106 podle instrukcí výrobce.

7.1.5. Příprava a transformace protoplastů S. avermitilis

Jednotlivé kolonie S. avermitilis byly izolovány na 1/2 médiu YPD—6. Mycélia byla použita k inokulaci 10 ml média TSB ve zkumavce o rozměrech 25 x 150 mm, které bylo poté inkubováno při protřepávání (300 rpm) při teplotě 28 °C po dobu 48 hodin. Jeden ml mycélia byl použit k inokulaci 50 ml YEME média. YEME médium obsahuje najeden litr: Difco kvasničný extrakt - 3 g; Difco Bacto-pepton - 5 g; Difco Mat Extract - 3 g; sacharóza - 300 g. Po autoklávování při teplotě 121 °C po dobu 25 minut byly přidány následující substance: 2,5MMgCl₂. 6 H₂O (separátně autoklávované při teplotě 11 °C po dobu 25 minut) - 2 ml; a glycin (20%) (sterilizace filtrem) - 25 ml.

Mycélia byla kultivována při teplotě 30 °C po dobu 48 až 62 hodin a sbírány centrifugací v 50ml centrifugační zkumavce (Falcon) při 3000 rpm po dobu 20 minut. Supematant byl odstraněn a mycélia byla resuspendována v P pufru, který obsahuje: sacharózu - 205 g; K₂SO₄ - 0,25 g; MgCl₂.6 H₂O - 2,02 g; H₂O - 600 ml; K_2PO4 (0,55) - 10 ml; roztok stopových prvků* - 20 ml; CaCl₂.2H₂O (3,68%) - 100 ml; a MES pufr (l,0M, pH 6,5 - 10 ml. (* Roztok stopových prvků obsahuje najeden litr: ZnCl₂ - 40 mg; FeCl₃ . 6H₂O - 200 mg; CuCl₂ . 2H₂O - 10 mg; MnCl₂ . 4H₂O - 10 mg; Na₂B₄O₇ . 10H₂O - 10 mg; (NH4)₆ Mo₇O₂₄.4H₂O - 10 mg). PH bylo upraveno

- 34 CZ 304402 B6 na 6,5, finální objem byl upraven na 1 litr a médium bylo horké zfiltrováno přes 0,45 mikronový filtr.

Mycélia byla zpeletována při 3000 rpm po dobu 20 minut, supematant byl odstraněn a mycélia byla resuspendována v 20 ml P pufru obsahujícím 2 mg/ml lysozymu. Mycélia byla inkubována při teplotě 35 °C po dobu 16 minut při protřepávání a kontrolována mikroskopicky, aby se určil rozsah tvorby protoplastů. Když byla tvorba protoplastů dokončena, byly protoplasty centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut. Supematant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 10 ml P pufru. Protoplasty byly centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut, supernatant byl odstraněn, protoplasty byly resuspendovány ve 2 ml P pufru a přibližně 1 x 10⁹ protoplastů bylo distribuováno do 2,0ml kryogenních vialek (Nalgene).

Vialka obsahující 1 x 10⁹ protoplastů byla centrifugována při 8000 rpm po dobu 10 minut, supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 0,1 ml P pufru. K protoplastům bylo přidáno 2 až 5 pg transformující DNA okamžitě následované přidáním 0,5 ml pracovního T pufru. Základ T pufru obsahoval: PEG-1000 (Sigma) -25 g; sacharózu-2,5 g; H₂O-83 ml. pH bylo upraveno na 8,8 pomocí 1N NaOH (sterilizace filtrací) a základ T pufru byl sterilizován filtrací a uskladněn při 4 °C. Pracovní T pufr připravený ve stejný den, kdy byl připraven, se skládal ze základu T pufru-8,3 ml; K₂PO4 (4mM) -1,0 ml; CaCl₂.2H₂O (5M) -0,2 ml; a TS (1M, pH 8) 0,5 ml. Každá složka pracovního T pufru byla individuálně sterilizována filtrací.

Během 20 sekund přidávání T pufru k protoplastům byl také přidán 1,0 ml P pufru a protoplasty byly centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut. Supematant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 0,1 ml P pufru. Protoplasty byly poté umístěny do RM14 média, které obsahuje: sacharózu-205 g; K₂O₄-0,25 g; MgCl₂.6H₂O-10,12 g; extrakt-5 g; Difco Casamino kyseliny-0,1 g; Difco kvasničný extrakt-5 g; Difco Oatmeal Agar-3g; Difco Bacto Agar-22 g; dH₂0-800 ml. Roztok byl zautoklávován při teplotě 121 °C po dobu 25 minut. Po autoklávování byly přidány sterilní zásobní roztoky: K₂PO₄ (0,5%)-10 ml; CaCl₂. 2 H₂O (5mM); L-prolin (20%)-15 ml; MES pufr (l,0M, pH 6,5)-10 ml; roztok stopových prvků (stejný jako je uvedeno výše)-2 ml; cykloheximidový zásobní roztok (25 mg/ml-40 ml; a 1N NaOH-2 ml. Dvacet pět ml média RM14 bylo alikvótně naneseno na destičku a destičky byly vysoušeny 24 hodin před použitím.

Protoplasty byly inkubovány v 95% vlhkosti při teplotě 30 °C po dobu 20 až 24 hodin. Pro výběr transformantů rezistentních na thiostrepton byl rovnoměrně rozptýlen 1 ml překryvného pufru obsahujícího 125 pg thiostreptonu na 1 ml na regenerační destičky RM14. Překryvný pufr obsahoval na 100 ml: sacharózu-10,3 g; roztok stopových prvků (stejný jako je uvedeno výše)-0,2 ml; a MES (1M, pH 6,5)-1 ml. Protoplasty byly inkubovány v 95% vlhkosti při teplotě 30 °C po dobu 7 až 14 dnů do té doby, než se staly kolonie rezistentní na thiostrepton (Thio^r) viditelné.

7.1.6. Transformace protoplastů Streptomyces lividans

V některých případech byla použita k transformacím S. lividans TK64 (poskytnutá John Innes Institute, Norwich, Spojené království). Způsoby a složení k růstu, tvorbě protoplastů a transformaci S. lividans jsou popsány v publikaci Hopowood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Spojené království, a provedené podle postupů zde popsaných. Plazmidová DNA byla izolována ze S. lividans, jak je popsáno v Části 7.1.3. výše.

7.1.7. Fermentační analýza kmenů S. avermitilis

Mycélia S. avermitilis kultivovaná na 1/2 YPD-6 po dobu 4 až 7 dnů byla inokulována do 1x6 palcových zkumavek obsahujících 8 ml přeformovaného média a dvě 5 mm skleněné kuličky. Přeformované médium obsahovalo: rozpustný škrob (buďto málo povařený škrob neboli KOSO,

-35 CZ 304402 B6

Japan Com Starch Co., Nagoya) - 20 g/1; Pharmamedia-15 g/1; Ardamin pH-5 g/1 (Champlain Ind. Clifton, NJ); CaCO₃-2 g/1; 2xbcfa („bcfa“ znamená mastné kyseliny s větveným řetězcem) obsahující finální koncentraci v médiu 50 ppm 2-(+/-)-methylmáselné kyseliny, 60 ppm izomáselné kyseliny a 20 ppm kyseliny izovalerové. pH bylo upraveno na 7,2 a médium bylo zautoklávováno při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.

Zkumavka byla protřepávána v úhlu 17° při 215 rpm při teplotě 29 °C po dobu 3 dnů. K inokulaci 300ml Erlenmeyerovy nádoby obsahující 25 ml produkčního média obsahujícího: škrob (buďto málo povařený škrob neboli KOSO) - 160 g/1; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/1; Ardamin pH-10 g/1; K₂HPO₄-2 g/1; MgSO₄.4H₂O-2 g/1; FeS0₄.7H₂0-0,02 g/1; MnCl₂-0,002 g/1; ZnS0₄.7H₂0-0,002 g/1; CaCo₃-14 g/1; 2xbcfa (jako výše); acyklohexankarboxylovou kyselinu (CHC) vytvořenou jako 20% roztok při pH 7,0) - 800 ppm byla použita 2ml alikvóta inokulační kultury. pH bylo upraveno na 6,9 a médium bylo zautoklávováno při teplotě 121 °C po dobu 25 minut.

Po inokulaci byla nádoba inkubována při teplotě 29 °C po dobu 12 dnů s protřepáváním při 200 rpm. Po inkubaci byly 2 ml vzorku odebrány z nádoby, naředěny 8 ml methanolu, smíšeny a směs byla centrifugována při 1250 g po dobu 10 minut, aby došlo k peletizaci zbytků. Supernatant byl poté analyzován pomocí HPLC za použití kolony Beckman Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm vnitřní průměr) s průtokem 0,75 ml/min a s detekcí pomocí absorbance při 240 nm. Mobilní fáze byla 86/8,9/5,1 methanol/voda/acetonitril.

7.1.8. Izolace genů S. avermitilis

Kosmidová knihovna S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) chromozomální DNA byla připravena a hybridizována s ketosyntházovou próbou připravenou z fragmentu genu pro polyketid syntházu (PKS) ze Saccharopolyspora erythraea. Detailní popis přípravy kosmidových knihoven může být nalezen v publikaci Sambrook et al., 1989, výše. Detailní popis přípravy chromozomálních DNA knihoven Streptomyces je uveden v publikaci Hopwood et al., 1985, výše. Kosmidové klony obsahující ketosyntházu hybridizující oblasti byly identifikovány hybridizací s 2,7 kB Nde/Eco47III fragmentem zpEX26 (laskavě poskytnutým dr. P. Leadlay, Cambridge, Spojené království). Přibližně 5 ng pEX26 bylo natráveno pomocí Ndel a Eco47III. Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel SeaPlaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME) Po elektroforéze byl vyříznut z gelu 2,7 kB Ndel/Eco47III fragment a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ od Epicentre Technologies za použití Fst Protocol. 2,7 kB Ndel/Eco47IH fragment byl označen [a-³²]dCTP (deoxycytidin-5'-trifosfát, tetra(triethylamonium) sůl, [α-³²Ρ]-) (NENDupont, Boston, MA) za použití systému BRL Nick Translation Systém (BRL Life Technologies, lne., Gaithersburg, MD), podle instrukcí dodavatele. Typická reakce byla provedena v objemu 0,05 ml. Po přidání 5 μΐ zastavovacího pufru byla označená DNA oddělena od neinkorporovaných nukleotidů za použití G—25 Sephadex Quick Spin kolon (Boehringer Mannheim) podle instrukcí dodavatele.

Přibližně 1800 kosmidových klonů bylo prohlíženo hybridizací kolonií. Deset klonů bylo identifikováno jako silně hybridizujících s Sace. erythraea KS próbou. Kolonie E. coli obsahující kosmidovou DNA byly kultivovány v LB tekutém médiu a kosmidová DNA byla izolována z každé kultury v automatizovaném zařízení na izolaci nukleových kyselin AutoGen 540™ za použití programu Cycle 3 (software zařízení) podle instrukcí výrobce. Mapování restrikční endonukleázou a analýzy Southern blot odhalily, že pět z klonů obsahovalo překrývající se chromozomální oblasti. Genomická BamHI restrikční mapa S. avermitilis pěti kosmidů (tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) byla zkonstruována analýzou překrývajících se kosmidů a hybridizací (obrázek 4).

-36CZ 304402 B6

7.1.9. Identifikace DNA, která moduluje poměry Avermektinů B2:B1 a identifikace aveC ORF

K testování subklonovaných fragmentů odvozených od pSE66 kosmidového klonu byly použity u AveC mutant následující metody na zjištění schopnosti modulace poměrů avermektinů B2:B1. PSE66 (5 pg) byl natráven pomocí Sací a BamHI. Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel SeaPlaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME), po elektroforéze byl vyříznut z gelu 2,9 kB SacI/BamHI fragment a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ (Epicentre Technologies) za použití Fast Protocol. Přibližně 5 pg transportního vektoru pWHM3 (Vara etal., 1989, J Bacteriol 171:5872-5881) bylo natráveno pomocí Sací a BamHI. Okolo 0,5 pg

2,9 kB inzertu a 0,5 pg natráveného pWHM3 bylo spolu smíšeno a inkubováno přes noc s 1 jednotkou ligázy (New England Biolabs, lne, Beverly, MA) při teplotě 15 °C v celkovém objemu 20 pl podle instrukcí dodavatele. Po inkubaci bylo 5 pg ligační směsi inkubováno při teplotě 70 °C po dobu 10 minut, směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a použita k transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk (BRL) podle instrukcí dodavatele. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost 2,9 kB Sac/BamHI inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSEl 19.

Protoplasty kmene S. avermitilis 1100-SC38 (kmen od společnosti Pfizer) byly připraveny a transformovány pomocí pSE119, jak je popsáno v Části 7.1.5 výše. Kmen 1100-SC38 je mutant, který produkuje významně více cyklohexyl-B2 formy avermektinů ve srovnání s cyklohexyl-Bl formou avermektinů, je-li suplementován cyklohexankarboxylovou kyselinou (B2:B1 je zhruba 30:1). PSEl 19 použitý k transformaci protoplastů S. avermitilis byl izolován buďto z kmene E. coli GM2163 (získaný od dr. BJ Bachmanna, správce, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), kmene E. coli DMI (BRL), nebo z kmene S. lividans TK64. Thíostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Transformanty kmene S. avermitilis 1100-SC38 obsahující pSE119 vedly k narušenému poměru cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů, který byl zhruba 3,7:1 (tabulka 2).

Po zjištění, že pSEl 19 je schopný modulovat poměry B2:B1 avermektinů u AveC mutant byla sekvenována inzerovaná DNA. Přibližně 10 pg pSEl 19 bylo izolováno za pomoci izolačního kitu na plazmidovou DNA (Qiagen, Valencia, CA) podle instrukcí výrobce, a sekvenováno za použití automatizovaného sekvenačního zařízení ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Sekvenační údaje byly seřazeny a editovány za použití programů Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI). DNA sekvence a aveC ORF jsou prezentovány na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1).

Nový plazmid, označený jako pSE118, byl zkonstruován následujícím způsobem. Přibližně 5 pg pSE66 bylo natráveno pomocí Sphl a BamHI. Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel SeaPlaque GTG (FMC BioProducts), po elektroforéze byl vyříznut z gelu 2,8 kB SphI/BamHI fragment a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ (Epicentre Technologies) za použití Fast Protocol. Přibližně 5 pg transportního vektoru pWHM3 bylo natráveno pomocí Sphl a BamHI. Okolo 0,5 pg 2,8 Kb inzertu a 0,5 pg natráveného pWHM3 bylo spolu smíšeno a inkubováno přes noc s 1 jednotkou ligázy (New England Biolabs) při teplotě 15 °C v celkovém objemu 20 pl podle instrukcí dodavatele. Po inkubaci bylo 5 pl ligační směsi inkubováno při teplotě 70 °C po dobu 10 minut, směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a použita k transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk (BRL) podle instrukcí dodavatele. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost 2,8 kB Sph/BamHI inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE118. Inzerovaná DNA v pSEl 18 a pSEl 19 se překrývaly přibližně 838 nukleotidy (obrázek 4).

Protoplasty kmene S. avermitilis 11OO-SC38 byly transformovány pomocí pSE118, jak je uvedeno výše. Thíostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Transformanty kmene S. avermitilis 1100—

-37CZ 304402 B6

SC38 obsahující pSE118 vedly k narušení poměrů cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů ve srovnání s kmenem 1100-SC38 (tabulka 2).

7.1.10. PCR amplifikace aveC genu z chromozomální DNA S. avermitilis

Zhruba 1,2 Kb fragment obsahující aveC ORF byl izolován z chromozomální DNA pomocí PCR amplifikace za použití primerů označených na základě aveC nukleotidové sekvence získané výše. PCR primery byly dodané společností Genosys Biotechnologies lne. (Texas). Pravostranný primer byl: 5-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID č:6) a levostranný primer byl: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID č:7). PCR reakce byla provedena polymerázou Deep Vent™ (New England Biolabs) v pufru poskytnutém výrobcem a v přítomnosti 300μΜ dNTP, 10% glycerolu, 200 pmol každého primeru, 0,1 pg templátu a 2,5 jednotek enzymu ve finálním objemu 100 μΐ za použití termocykléru Perkin-Elmer Cetus. Termální profil prvního cyklu byl 95 °C po dobu 5 minut (denaturační krok), 60 °C po dobu 2 minut (chladicí krok) a 72 °C po dobu 2 minut (rozšiřovací krok). Následných 24 cyklů mělo stejný termální profil s výjimkou toho, že denaturační krok byl zkrácen na 45 sekund a chladicí krok byl zkrácen na 1 minutu.

PCR produkt byl podroben elektroforéze na 1% agarózovém gelu a byl detekován jeden DNA proužek o velikosti 1,2 Kb. Tato DNA byla purifikována z gelu a ligována s 25 ng linearizovaného, hrubého pCR-Blunt vektoru (Invitrogen) v 1:10 molámím vektor/inzert poměru podle instrukcí výrobce. Ligační směs byla použita k transformaci One Shot Competent E. coli buněk (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu o velikosti zhruba 1,2 Kb byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE179.

DNA inzertu z pSE179 byla izolována natrávením pomocí BamHI/Xbal, separována elektroforézou, purifikována z gelu a ligována s transportním vektorem pWHM3, který byl natráven pomocí BamHI/Xbal v celkové koncentraci DNA 1 pg v 1:5 molámím vektor/inzert poměru Ligační směs byla použita k transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk (BRL) podle instrukcí dodavatele. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost zhruba 1,2 kB inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE186 (obrázek 2, ATCC 209604), byl transformován do E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů.

7.2. Výsledky

2,9 kB SacI/BamHI zpSE119 byl identifikován tak, že po transformaci do kmene S. avermitilis 1100-SC38 významně narušil poměr B2:B1 avermektinové produkce. Kmen S. avermitilis 1100—SC38 má normální poměr B2:B1 zhruba 30:1, ale je-li transformován vektorem obsahujícím 2,9 Kb SacI/BamHI fragment, poměr B2:B1 avermektinů se snížil na zhruba 3,7:1. Postfermentační analýza kultur transformantů potvrdila přítomnost transformující DNA.

2,9 Kb pSE119 fragment byl sekvenován a byl identifikován zhruba 0,9 Kb ORF (obrázek 1) SEQ ID č:l), který zahrnuje Pst/Sphl fragment, který byl předtím jinde mutován, aby produkoval pouze B2 produkty (Ikeda et al., 1995, výše). Srovnání tohoto ORF, nebo jeho odpovídajícího odvozeného polypeptidu proti známým databázím (GenEMBL, SWIS-PROT) neprokázal silnou homologii se známou DNA nebo proteinovou sekvencí.

Tabulka 2 uvádí fermentační analýzu kmene S. avermitilis 1100-SC38 transformované různými plazmidy.

- 38 CZ 304402 B6

Tabulka 2

Kmen S. avermitilis	Počet	testovaných	Průměrný poměr
(transformující plazmid	transformantů	B2:B1
1100-SC38 ( žádný)	9	30,66
1100-SC38 (pWHM3)	21	31,3
1100-SC38 (pSE119)	12	3,7
1100-SC38 (pSE118)	12	30,4
1100-SC38 (pSE185)	14	27, 9

8. Příklad: Konstrukce mutant AveC S. avermitilis

Tento příklad popisuje konstrukci několika různých mutant AveC S. avermitilis za použití preparátů a metod zde popsaných. Obecný popis technik pro zavedení mutací do genu Streptomyces je popsán Kieserem a Hopwoodem, 1991, Meth Enzym 204:430—458. Detailnější popis je poskytnut Anzaiem et al 1988, J Antibiot XLI(2):226-233 a Stutzman-Engwallem et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1):144-154. Tyto reference jsou tímto začleněny v celém svém rozsahu.

8.1 Inaktivace genu aveC S. avermitilis

AveC mutanty obsahující inaktivované aveC geny byly zkonstruovány za použití několika metod, jakje detailně uvedeno níže.

V první metodě byl 640 bp Sph/Pstl fragment z aveC genu v pSEl 19 (plazmid popsaný v Části

7.1.9 výše) nahrazen genem ermE (pro rezistenci na erythromycin) ze Sace. Eiyhraea. Gen ermE byl izolován z pIJ4026 (poskytnutý ústavem John Innes Institute, Norwich, Spojené království, viz také Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368) natrávením restrikčním enzymem pomocí Bgl/II a EcoRI s následnou elektroforézou a poté byl z gelu purifikován. Tento zhruba 1,7 Kb fragment byl ligován do pGEM72f (Promega), který byl natráven pomocí BamHI a EcoRI a ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost zhruba 1,7 Kb inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE27.

PSEl 18 (popsaný v Části 7.1.9. výše) byl natráven pomocí Sphl a BamHI, natrávený produkt byl podroben elektroforéze a zhruba 2,8 Kb Sphl/BamHI inzert byl purifikován z gelu. PSEl 19 byl natráven pomocí Pstl a EcoRI, natrávený produkt byl podroben elektroforéze a zhruba 1,5 Kb Pstl/EcoRI inzert byl purifikován z gelu. Transportní vektor pWHM3 byl natráven pomocí BamHI a EcoRI. PSE27 byl natráven pomocí Pstl a Sphl, natrávený produkt byl podroben elektroforéze a zhruba 1,7 Kb Pstl/Sphl inzert byl purifikován z gelu. Všechny čtyři fragmenty (tj. zhruba 2,8 Kb, zhruba 1,5 Kb, zhruba 7,2 Kb, zhruba 1,7 Kb) byly spolu ligovány v čtyřcestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE180 (obrázek 3; ATCC 209605).

PSEl80 byl transformován do S. lividans TK64 a transformované kolonie byly identifikovány pomocí rezistence k thiostreptonu a erytromycinu. PSEl80 byl izolován ze S. lividans a použit k transformaci protoplastů S. avermitilis. Byly identifikovány čtyři transformanty rezistentní na thiostrepton a protoplasty byly připraveny a umístěny za neselektivních podmínek do RM14 média. Po regeneraci protoplastů byly jednotlivé kolonie prohlíženy na přítomnost rezistence k eiytromycinu a nepřítomnost rezistence na thiostrepton, což ukazuje na chromozomální integra-39CZ 304402 B6 ci ínaktivovaného aveC genu a ztrátu volného replikonu. Jeden Erm^r Thio^s transformant byl identifikován a označen jako kmen SE180-11, natráven restrikčními enzymy BamHI, HindlII, Pstl, nebo Sphl, podroben elektroforéze na 0,8% agarózovém gelu, přenesen na nylonové membrány a hybridizován s ermE próbou. Tyto analýzy prokázaly, že chromozomální integrace genu ermE rezistence a konkomitantní delece 640 bp Pstl/Sphl fragmentu se vyskytla v důsledku dvojitého crossoveru. HPLC analýza fermentačních produktů kmene SE180-11 prokázala, že normální avermektiny již nebyly produkovány (obrázek 5 A).

V druhé metodě inaktivace aveC genu byl 1,7 Kb erm gen odstraněn z chromozómu kmene S. avermitilis SE180-11 zanechávajíce 640 bp Pstl/Sphl deleci v aveC genu. Plazmid pro náhradu genu byl zkonstruován následujícím způsobem: pSE180 byl částečně natráven pomocí Xbal a zhruba 11,4 Kb fragment byl purifikován z gelu. Proužek o velikosti zhruba 11,4 Kb postrádá 1,7 Kb gen pro ermE rezistenci. DNA byla poté ligována a transformována do E. coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE184, byl transformován do E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů. Tento plazmid byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Protoplasty byly připraveny z transformantů kmene SE180-11 rezistentních na thiostrepton a byly umístěny jako jednotlivé kolonie do RM14. Po zregenerování protoplastů byly jednotlivé kolonie prohlíženy na nepřítomnost rezistence na erythromycin i thiostrepton, což ukazuje na chromozomální integraci ínaktivovaného aveC genu a ztrátu volného replikonu obsahujícího ermE gen. Jeden Erm^s Thio^s transformant byl identifikován a označen jako SE1841-13. Fermentační analýza SE184-1-13 prokázala, že normální avermektiny již nebyly produkovány, aže SE184-1-13 měl stejný fermentační profil jako SE180-11.

V třetím způsobu inaktivace aveC genu byl do chromozomálního aveC genu začleněn posun rámce přidáním dvou bází G po C v nt pozici 471 za použití PCR, čímž došlo k vytvoření místa BspEl. Přítomnost vytvořeného místa BspEl byla užitečná pro detekci náhrady genu. PCR produkty byly navrženy tak, aby došlo k začlenění frameshift mutace do aveC genu a tyto primery byly dodávány společností Genosys Biotechnologies, lne. Pravostranný primer měl sekvenci: 5GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID č:8) a levostranný primer měl sekvenci: 5'AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3 (SEQ ID č:9). Podmínky PCR byly stejné, jako je popsáno v části 7.1.10. výše. 666 bp PCR produkt byl natráven pomocí Sphl za vzniku dvou fragmentů o velikosti 278 bp a 388. Fragment o velikosti 388 bp byl purifikován z gelu.

Plazmid pro náhradu genu byl zkonstruován následujícím způsobem transportní vektor pWHM3 byl natráven pomocí EcoRi a BamHI. pSE119 byl natráven pomocí BamHI a Sphl, natrávená směs byla podrobena elektroforéze a zhruba 840 bp fragment byl purifikován z gelu. PSE119 byl natráven pomocí EcoRI a XmnI, natrávená směs byla podrobena elektroforéze a fragment o velikosti zhruba 1,7 Kb byl purifikován z gelu. Všechny čtyři fragmenty (tj. zhruba 7,2 Kb, zhruba 840 bp, zhruba 1,7 Kb a zhruba 388 bp) byly spolu lisovány v čtyřcestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a DNA analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE185, byl transformován do E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů. Tento plazmid byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis 1100-S38. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. PSE 185 nenarušoval významně poměry B2:B1 avermektinů po transformaci do kmene S. avermitilis 1100-SC38 (tabulka 2).

PSE 185 byl použit k transformaci protoplastů S. avermitilis pro tvorbu frameshift mutace v chromozomálním aveC genu. Protoplasty byly připraveny z thiostrepton rezistentních transformantů a umístěny jako jednotlivé kolonie do RM14. Po regeneraci protoplastů byly jednotlivé protoplasty prohlíženy na rezistenci k thiostreptonu. Z thiostrepton senzitivních kolonií byla izolována chromozomální DNA, která byla prohlížena pomocí PCR na frameshift: mutace integrované do

-40 CZ 304402 B6 chromozómu. PCR primery byly navrženy na základě avC nukleotidové sekvence a byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. (Texas). Pravostranný primer měl sekvenci: 5'GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID č:10) a levostranný primer měl sekvenci: 5'GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID č:l 1). Podmínky PCR byly stejné, jako je popsáno v Části 7.1.10. výše. Získaný PCR produkt měl 543 bp, po natrávení pomocí Bsp byly pozorovány tři fragmenty o velikosti 368 bp, 96 bp a 79 bp, což ukazuje na chromozomální integraci inaktivovaného aveC genu a ztrátu volného replikonu.

Fermentační analýza mutant S. avermitilis obsahujících frameshift mutaci v aveC genu prokázala, že normální avermektiny již nebyly produkovány, a že tyto mutanty měly stejný fermentační HPLC profil jako kmeny SEI 80—11 a SE184-1-13. Jeden Thio^s transformant byl identifikován a označen jako kmen SE185-5a.

Navíc došlo k tvorbě mutace v aveC genu, která mění nt pozici 520 z G na A, která vede k záměně kodónu kódujícího tryptofan (W) v pozici 116 za terminační kodón. Kmen S. avermitilis s touto mutací neprodukoval normální avermektiny a měl stejný fermentační profil jako kmeny SE 180-11, SE 184-1-13 a SEI85-5a.

Navíc došlo k tvorbě mutací v aveC genu, které mění: (i) nt pozici 970 z G na A, což mění aminokyselinu v pozici 266 z glycinu (G) na aspartát (D), a (ii) nt pozici 996 z T na C, což mění aminokyselinu v pozici 275 z tyrosinu (Y) na histidin (H). Kmen S. avermitilis s těmito mutacemi (G256D/Y275H) neprodukoval normální avermektiny a měl stejný fermentační profil jako kmeny SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5a.

Mutované kmeny S. avermitilis SE180-11, SE184—1—13, SE185-5a a další zde poskytnuté s inaktivací aveC, poskytují vyhledávací nástroj k posouzení dopadu jiných mutací aveC genu. PSEl86, který obsahuje divokou kopii aveC genu, byl transformován do E. coli DMI aplazmidová DNA byla izolována zampicilin rezistentních transformantů. Tato pSE186 DNA byla použita k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SEI80-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SEI 80-11 byly izolovány a byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu, a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost funkčního aveC genu in trans byla schopna restaurovat normální produkci avermektinů v kmeni SEI80-11 (obrázek 5B).

8.2. Analýza mutací v aveC genu, které narušují poměry tříd B2:B1.

Jak je popsáno výše, byl kmen S. avermitilis SEI 80-11 obsahující neaktivní aveC gen komplementován transformací splazmidem obsahujícím funkční aveC gen (pSE186). Kmen SE180-11 byl také využit jako hostitelský kmen k charakterizací dalších mutací aveC genu, jak je popsáno níže.

Chromozomální DNA byla izolována z kmene 1100-SC38 a použita jako templát pro PCR amplifikaci aveC genu. ORF o velikosti 1,2 Kb byl izolován PCR amplifikaci za použití primerů navržených na základě aveC nukleotidové sekvence. Pravostranný primer měl sekvenci SEQ ID č:6 a levostranný primer měl sekvenci SEQ ID č:7 (viz Část 7.1.10 výše). Podmínky PCR a subklonování byly stejné, jako je popsáno v části 7.1.10. Analýza DNA sekvence ORF o velikosti 1,2 Kb prokázala mutaci v aveC genu, která mění nt pozici 337 zC na T, což mění aminokyselinu v pozici 55 ze šeřinu (S) na fenylalanin (F). AveC gen obsahující mutaci S55F byl subklonován do pWHM3 za vzniku plazmidu, který byl označen jako pSE187, a který byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SEI80-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SEI80-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost aveC genu kódujícího záměnu v aminokyselinovém reziduu 55 (S55F) byla schopna restaurovat u kmene SEI80-11 normální produkci avemektinů (obr. 5C); avšak cyklohexyl B2: cyklohexyl Bl poměr byl zhruba 26:1 ve srovnání s kmenem SE 180-11 transformovaném

-41 CZ 304402 B6 pomocí pSE186, který měl poměr B2:B1 zhruba 1,6:1 (tabulka 3), což ukazuje, že jediná mutace (S55F) moduluje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-B 1.

Další mutace v aveC genu byla identifikována, že mění nt pozici 862 z G na A, což vede k záměně aminokyseliny v pozici 230 z glycinu (G) na aspartát (D), Kmen S. avermitilis mající tuto mutaci (G230D) produkuje avermektiny v poměru B2:B1 zhruba 30:1.

8.3. Mutace, které redukují B2:B1 poměr

Některé mutace byly konstruovány, že snižují množství cyklohexyl-B2 vzhledem k cyklohexylB1 následujícím způsobem.

Mutace v aveC byla identifikována, že mění nt pozici 588 z G na A, což vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 z alaninu (A) na threonin (T). aveC gen obsahující A139T mutaci byl subklonován do pWEIM3 za vzniku plazmidu, který byl označen pSE188, a který byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE 180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE 180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio^r Erm^rtransformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího záměnu v aminokyselinovém reziduu 139 (A139T) byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů (obr. 5D); avšak B2:B1 poměr byl zhruba 0,94:1, což ukazuje, že tato mutace snižuje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-B 1. Tento výsledek byl neočekávaný, protože publikované výsledky, stejně tak jako výsledky mutací popsaných výše, pouze demonstrovaly buďto inaktivaci aveC genu nebo zvýšenou produkci B2 formy avermektinů ve vztahu k B1 formě (tabulka 3).

Protože A139T mutace narušila poměr B2:B1 v prospěšnějším B1 směru, byla zkonstruována mutace, která kódovala threonin místo šeřinu v aminokyselinové pozici 138. PSE186 byl tedy natráven pomocí EcoRI a klonován do pGEMSZf (Promega), který byl natráven pomocí EcoRI. Plazmid, který byl označen jako pSE186a, byl natráven pomocí Apal a KpnI, DNA fragmenty byly separovány na agarózovém gelu a dva fragmenty o velikosti zhruba 3,8 a 0,4 Kb byly purifikovány z gelu. DNA inzert o velikosti zhruba 1,2 Kb zpSE186 byl použit jako PCR templát k založení záměny jediné báze v nt pozici 585. Byly navrženy PCR primery k založení mutace v nt pozici 585, které byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. (Texas). Pravostranný primer měl sekvenci: 5-GGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID č:12); a levostranný primer měl sekvenci: 5'-GGAACCGACCGCCGCCTGATACA-3' (SEQ ID č:13). PCR reakce byla provedena za použití genomického PCR kitu Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) v pufru poskytnutém výrobcem, v přítomnosti 200μΜ dNTP, 200 pmol každého primeru, 50 ng templátové DNA, l,0M GC-Melt a 1 jednotky KlenTaq Polymerase mix ve finálním objemu 50μ1. Termální profil prvního cyklu byl 94 °C po dobu 1 minuty, následovaný 25 cykly při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund a 68 °C po dobu 2 minut, a 1 cyklem při teplotě 68 °C po dobu 3 minut. PCR produkt o velikosti 295 bp byl natráven pomocí Apal a KpnI, aby došlo k uvolnění 254 bp fragmentu, který byl podroben elektroforéze a purifikován z gelu. Všechny 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) byly spolu ligovány v trojcestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE198.

PSE 198 byl natráven pomocí EcoRI, klonován do pWHM3, který byl natráven pomocí EcoRI a transformován do E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA. Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE190, byl použit k transformaci proto-42 CZ 304402 B6 plastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Tho^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentaěních produktů. Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího záměnu v aminokyselinovém reziduu 138 (S138T) byla schopna restaurovat u kmene SE180—11 normální produkci avermektinů; avšak B2:B1 poměr byl zhruba 0,88:1, což ukazuje, že tato mutace snižuje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl (tabulka 3). Tento poměr B2:B1 je dokonce nižší než poměr 0,94:1 pozorovaný u mutace A139T produkované transformací kmene SE 180—11 pomocí pSE188, jak je popsáno výše.

Další mutace byla zkonstruována za účelem začlenění threnoninu do aminokyselinových pozic 138 i 139. DNA inzert o velikosti zhruba 1,2 Kb zpSE186 byl použit jako PCR templát. Byly navrženy PCR primery k založení mutací v nt pozicích 585 a 588, které byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. (Texas). Pravostranný primer měl sekvenci: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID č:14); a levostranný primer měl sekvenci: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID č:15). PCR reakce byla provedena za použití podmínek popsaných výše v této Části. PCR produkt o velikosti 449 bp byl natráven pomocí Apal a KpnI, aby došlo k uvolnění 254 bp fragmentu, který byl podroben elektroforéze a purifíkován z gelu. PSE 186a byl natráven pomocí Apal a KpnI, DNA fragmenty byly separovány na agarózovém gelu a dva fragmenty o velikosti zhruba 3,8 Kb a 0,4 Kb byly purifikovány z gelu. Všechny 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) byly spolu ligovány v trojcestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE230.

PSE230 byl natráven pomocí EcoRI, nakloňován do pWHM3, který byl natráven pomocí EcoRI a transformován do E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA. Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE231, byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k eiytromycinu a Thio^r Emí transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentaěních produktů. Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího S138T/A139T byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů; avšak B2:B1 poměr byl zhruba 0,84:1, což ukazuje, že tato mutace dále snižuje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-B 1 (tabulka 3) ve srovnání se snížením dosaženým transformací kmene SE180-11 pomocí pSE188 nebo pSE199, jak je popsáno výše.

Další mutace byla zkonstruována za účelem dalšího snížení množství produkované cyklohexyl B2 k cyklohexyl Bl. Protože S138T/A139T mutace narušila poměr B2:B1 v prospěšnějším Bl směru, byla zkonstruována mutace za účelem začlenění threoninu v aminokyselinové pozici 138 a fenylalaninu v aminokyselinové pozici 139. DNA inzert o velikosti zhruba 1,2 Kb zpSE186 byl použit jako PCR templát. Byly navrženy PCR primery k založení mutací v nt pozici 585 (záměna T za A), 588 (záměna G za T) a 589 (záměna C za T), které byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. (Texas). Pravostranný primer měl sekvenci: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEQ ID č:25); a levostranný primer měl sekvenci: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID č: 15). PCR reakce byla provedena za použití genomického PCR kitu Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) v pufru poskytnutém výrobcem, v přítomností 200 μΜ dNTP, 200 pmol každého primeru, 50 ng templátové DNA, l,0M GC-Melt a 1 jednotky Tth DNA Polymerace ve finálním objemu 50 μΐ. Termální profil prvního cyklu při 94 °C po dobu 1 minuty, následovaný 25 cykly při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund a 68 °C po dobu 2 minut, a 1 cyklem při teplotě 68 °C po dobu 3 minut. PCR produkt o velikosti 449 bp byl natráven pomocí Apal a KpnI, aby došlo k uvolnění 254 bp fragmentu, který byl podroben elektroforéze a purifíkován z gelu. Všechny 3 fragmenty

-43 CZ 304402 B6 (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) byly spolu ligovány v trojcestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE238.

PSE238 byl natráven pomocí EcoRI, nakloňován do pWHM3, který byl natráven pomocí EcoRI a transformován do E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA. Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE239, byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE 180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio^rErm^rtransformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost dvojitě mutovaného aveC genu kódujícího S138T/A139F byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů; avšak B2:B1 poměr byl zhruba 0,75:1, což ukazuje, že tato mutace dále snižuje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl (tabulka 3) ve srovnání se snížením dosaženým transformací kmene SE180-11 pomocí pSE188, pSE199, nebo pSE231, jak je popsáno výše.

Tabulka 3

Kmen S. avermitilis (transformující plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní c B2	Relativní c B1	Průměrný poměr B2 :B1
SE18Q-11 (žádný)	30	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	25	222	140	1,59
SE180-11 (pSE187)	12	283	11	25,3
SE180-11 (pSE188)	24	193	205	0,94
SE180-11 (pSE199)	18	155	171	0,88
SE180-11 (pSE231)	5	259	309	0,84
SE180-11 (pSE239)	20	184	242	0,75

Další mutace byly zkonstruovány za účelem dalšího snížení množství produkovaného cyklohexyl B2 k cyklohexyl B1 za použití techniky DNA přesouvání, jak je popsáno v publikaci Stemmer, 1994, Nátuře 370:389-391; a Stemmer, 1994, Proč Nati Acad Sci USA 91:10747-10751, a dále v patentech US 5 605 793, US 5 811 238, US 5 830 721 a US 5 837 458.

DNA přesouvací plazmidy obsahující mutované aveC geny byly transformovány do kompetentních dam dcm E.coli buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a použita k transformaci protoplastů kmene SE 180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE 180-11 byly izolovány a analyzovány na produkci avermektinů s poměrem cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl 1:1 nebo méně. Byla určena DNA sekvence plazmidové DNA z SE180-11 transformantů produkujících avermektiny s poměrem B2:B1 1:1 nebo méně.

Bylo identifikováno osm transformantů produkujících snížená množství cykIohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl. Nejnižší poměr B2:B1 dosažený mezi těmito transformanty byl 0,4:1 (tabulka 4). Plazmidová DNA byla izolována z každého z osmi transformantů a byla určena DNA sekvence za účelem identifikace mutací v aveC genu. Mutace jsou následující.

PSE290 obsahuje 4 nukleotidové mutace v nt pozici 317 z T na A, v nt pozici 353 z C na A, v nt pozici 438 z G na A a v nt pozici 1155 z T na A. Nukleotidová záměna v nt pozici 317 vede k záměně aminokyseliny v pozici 48 z D na E a nukleotidová záměna vnt pozici 438 vede

-44 CZ 304402 B6 k záměně aminokyseliny v pozici 89 z A na T. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,42:1 (tabulka 4).

PSE291 obsahuje 4 nukleotidové mutace v nt pozici 272 z G na A, v nt pozici 585 z T na A, v nt pozici 588 zG na A a vnt pozici 708 zG na A. Nukleotidová záměna vnt pozici 585 vede k záměně aminokyseliny v pozici 138 zS na T, nukleotidová záměna vnt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 z A na T a nukleotidová záměna vnt pozici 708 vede k záměně aminokyseliny v pozici 179 z G na S. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,57:1 (tabulka 4).

PSE292 obsahuje stejné 4 nukleotidové mutace jako pSE290. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,40:1 (tabulka 4).

PSE293 obsahuje 6 nukleotidových mutací v nt pozici 24 z A na G, v nt pozici 286 z A na C, v nt pozici 497 z T na C, v nt pozici 554 z C na T, v nt pozici 580 z T na C a v nt pozici 886 z A na T. Nukleotidová záměna v nt pozici 286 vede k záměně aminokyseliny v pozici 38 z Q na P, nukleotidová záměna vnt pozici 580 vede k záměně aminokyseliny v pozici 136 zL na P a nukleotidová záměna v nt pozici 886 vede k záměně aminokyseliny v pozici 238 z E na D. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,68:1 (tabulka 4).

PSE294 obsahuje 6 nukleotidových mutací v nt pozici 469 z T na C, v nt pozici 585 z T na A, v nt pozici 588 z G na A, v nt pozici 708 z G na A, v nt pozici 833 z C na T a v nt pozici 1184 z G na A. Navíc jsou nukleotidy v pozicích 173, 174 a 175 deletovány. Nukleotidová záměna v nt pozici 469 vede k záměně aminokyseliny v pozici 99 z F na S, nukleotidová záměna v nt pozici 585 vede k záměně aminokyseliny v pozici 138 z S na T, nukleotidová záměna v nt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 z A na T a nukleotidová záměna v nt pozici 708 vede k záměně aminokyseliny v pozici 179 z G na S. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,53:1 (tabulka 4).

PSE295 obsahuje 2 nukleotidové mutace v nt pozici 588 z G na A, v nt pozici 856 z T na C. Nukleotidová záměna vnt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 z A na T a nukleotidová záměna v nt pozici 856 vede k záměně aminokyseliny v pozici 228 z M na T. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,80:1 (tabulka 4).

PSE296 obsahuje 5 nukleotidových mutací v nt pozici 155 z T na C, v nt pozici 505 z G na T, v nt pozici 1039 z C na T, v nt pozici 1202 z C na T a v nt pozici 1210 z T na C. Nukleotidová záměna v nt pozici 505 vede k záměně aminokyseliny v pozici 111 z G na V a nukleotidová záměna vnt pozici 1039 vede k záměně aminokyseliny v pozici 289 zP na L. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,73:1 (tabulka 4).

PSE297 obsahuje 4 nukleotidové mutace v nt pozici 377 z G na T, v nt pozici 588 z G na A, v nt pozici 633 z A na G a vnt pozici 1067 zA na T. Nukleotidová záměna vnt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 zA na T, nukleotidová záměna vnt pozici 633 vede k záměně aminokyseliny v pozici 154 z K na E, nukleotidová záměna v nt pozici 1067 vede k záměně aminokyseliny v pozici 298 z Q na H. Poměr B2:B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,67:1 (tabulka 4).

-45 CZ 304402 B6

Tabulka 4

Kmen S. avermitilis (transformuj ící plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní c B2	Relativní c B1	Průměrný poměr B2:B1
SE180-11 ( žádný)	4	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	4	0	0	0
SE180-11 (pSE290)	4	87	208	0,42
SE180-11 (pSE291)	4	106	185	0,57
SE180-11 (pSE292)	4	91	231	0,40
SE180-11 (pSE293)	4	123	180	0,68
SE180-11 (pSE294)	4	68	129	0,53
3E180-11 (pSE295)	4	217	271	0,80
SE180-11 (pSE296)	1	135	186	0,73
SE180-11 (pSE297)	1	148	221	0,67

9. Konstrukce 5' delečních mutant

Jak je vysvětleno v části 5.1 výše, obsahuje nukleotidová sekvence S. avermitilis uvedená na obrázku 1 (SEQ ID č:l) čtyři různé GTG kodóny vbp pozicích 42, 174, 177 a 180, které jsou potenciálními startovacími místy. Tato část popisuje konstrukci mnohočetných delecí 5' oblasti aveC ORF (obrázek 1; SEQ ID č:l), aby se definovalo, který z těchto kodónů může účinkovat jako startovací místo v aveC ORF pro expresi proteinu.

Fragmenty aveC genu různě deletované na 5' konci byly izolovány z chromozomální DNA

S. avermitilis pomocí PCR amplifikace. PCR primery byly navrženy na základě aveC DNA sekvence a byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. Pravostranné primery měly sekvenci: 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID č:16), (D1F1): 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID č:17) (D1F2); 5-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID č:18) (D1F3); a 5-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID č:19) (D2F2). Levostranné primery měly sekvenci: 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID č:20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID č:21); a 5-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID č:22). PCR reakce byla provedena, jak je popsáno v části 8,3 výše.

PCR produkty byly separovány elektroforeticky na 1% agarózovém gelu a byly detekovány jednotlivé DNA bandy o velikosti buďto zhruba 1,0 Kb nebo 1,1 Kb. PCR produkty byly purifikovány z gelu a ligovány s 25 ng linearizovaného pCR2.1 vektoru (Invitrogen) v 1:10 molámím vektor/inzert poměru podle instrukcí výrobce. Ligační směsi byly použity k transformaci One Shot™ kompetentních E. coli buněk (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA. Tyto plazmidy byly označeny jako pSE190 (získán s primerem D1F1), pSE191 (získán sprimerem D1F2), pSE192 (získán s příměrem D1F3) apSE193 (získán s příměrem D2F2).

DNA inzerty byly natráveny pomocí BamHI/Xbal, separovány elektroforeticky na 1% agarózovém gelu, a odděleně ligovány s transportním vektorem pWHM3, který byl natráven pomocí BamHI/Xbal v celkové DNA koncentraci 1 pg v 1:5 molámím vektor/inzert poměru. Ligační směsi byly použity k transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tyto plazmidy, které byly označeny jako pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) a pSE197 (D2F2) byly každý odděleně transformovány do kmene E. coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tato DNA byla použita k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu, a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány

-46CZ 304402 B6

HPLC analýzou fermentačních produktů za účelem určení, která GTG místa byla nezbytná pro aveC expresi. Výsledky ukazují, že GTG kodón v pozici 42 může být eliminován bez ovlivnění aveC exprese, protože pSE194, pSE195 a pSE196, z nichž každý postrádá GTG místo v pozici 42, ale každý obsahuje tři GTG místa v pozicích 174, 177 a 180, byly všechny schopny restaurovat normální produkci avermektinů po transformaci do SE 180-11. Normální produkce avermektinů nebyla restaurována transformací kmene SE180-11 pomocí pSE197, který postrádá všechny čtyři GTG místa (tabulka 5).

Tabulka 5

Kmen S. avermitilis (transformuj icí plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní c B2	Relativní c B1	Průměrný poměr B2:B1
ΞΕ180-11 (žádný)	S	0	0	0
SB180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	6	241	152	1,58
SE180-11 (pSB194)	6	35	15	2,43
SE180-11 (pSE195)	6	74	38	1,97
SE180-11 (pSE196)	6	328	208	1,58
SE180-11 (pSE197)	6	0	0	0

10. Klonování aveC homologů ze S. hygroscopicus a S. griseochromogenes

Předkládaný vynález umožňuje identifikovat a klonovat aveC homologní geny z jiných avermektin nebo milbemycin produkujících druhů Streptomyces. Například byla hybridizována s 1,2 Kb aveC próbou ze S. avermitilis kosmidová knihovna genomické DNA ze S. hygroscopicus (FERM BP-1901), jak je popsáno výše. Bylo identifikováno několik kosmidových klonů, které silně hybridizují. Chromozomální DNA byla izolována z těchto kosmidů a byl identifikován 4,9 Kb KpnI fragment, který hybridizoval s aveC próbou. Tato DNA byla sekvenována a byl identifikován ORF (SEQ ID č:3) mající významnou homologii s aveC ORF S. avermitilis. Aminokyselinová sekvence (SEQ ID č:4) odvozená z aveC homologního ORF S. hygroscopicus je uvedená na obrázku 6.

Navíc byla hybridizována s 1,2 Kb aveC próbou ze S. avermitilis kosmidová knihovna genomické DNA ze S. griseochromogenes, jak je popsáno výše. Bylo identifikováno několik kosmidových klonů, které silně hybridizují. Chromozomální DNA byla izolována z těchto kosmidů a byl identifikován 5,4 Kb Pstl fragment, který hybridizoval s aveC próbou. Tato DNA byla sekvenována a byl identifikován avec homologní částečný ORF mající významnou homologii s aveC ORF S. avermitilis. Odvozená částečná aminokyselinová sekvence (SEQ ID č:5) je uvedená na obrázku 6.

DNA a aminokyselinová sekvenční analýza aveC homologů ze S. hygroscopicus a S. griseochromogenes ukazují, že tyto oblasti sdílejí významnou homologii (zhruba 50% sekvenční identita na aminokyselinové úrovni), jak vůči sobě tak i s genovými produkty aveC ORF S. avermitilis a AveC (obrázek 6).

11. Konstrukce plazmidu s aveC genem za ermE promotorem

1,2 Kb aveC ORF z pSE186 byl subklonován v pSE34, což je transportní vektor pWHM3 mající 300 bp ermE promotor inzerovaný jako KpnI/BamHI fragment v KpnI/BamHI místě pWHM3 (viz Ward et al., 1986, Mol Gen Genet 203:468—478). PSE 186 byl natráven pomocí BamHI a HindlII, natrávená směs byla podrobena elektroforéze a 1,2 Kb fragment byl izolován z agarózového gelu a ligován s pSE34, který byl natráven pomocí BamHI a HindlII. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována zampicilin rezistentních transformantů a přítomnost 1,2 Kb inzertu byla

-47CZ 304402 B6 potvrzena restrikční analýzou. Tento plazmid, který byl označen jako pSE189 byl transformován do kmene E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována zampicilin rezistentních transformantů. Protoplasty kmene S. avermitilis 1100-SC38 byly transformovány pomocí pSE189. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů.

Transformanty kmene 1100-SC38 obsahující pSE189 měly narušené poměry produkovaných avermektin cyklohexyl-B2:avermektin-Bl (zhruba 3:1) ve srovnání s kmenem 1100-SC38 (zhruba 34:1) a celková produkce avermektinů se zvýšila přibližně 2,4 krát ve srovnání s kmenem 1100-SC38 transformovaným pomocí pSEl 19 (tabulka 6).

PSE189 byla také transformována do protoplastů divokého typu kmene S. avermitilis. Thiostrepton rezistentní transformanty byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Celkové avermektiny produkované divokým typem S. avermitilis transformovaným pomocí pSE189 se zvýšily přibližně 2,2 krát ve srovnání s divokým kmenem S. avermitilis transformovaným pomocí pSEl 19 (tabulka 6).

Tabulka 6

Kmen s. avermitilis (transformující plazmid.)	n testovaných transformantů	Relativní B2	Relativní B1	Relativní celkové avermektiny	Průměrný poměr B2 :B1
1100-SC38	6	155	4,8	176	33,9
1100-SC38 (pSE119)	9	239	50, 3	357	4,7
1100-SC38 (pSE189)	16	546	166	849	3,3
Divoký typ	6	59	42	113	1,41
Divoký typ (pSE119)	6	248	151	481	1,64
Divoký typ (pSE189)	5	545	345	1, 071	1,58

12. Chimérický plazmid obsahující sekvence z aveC ORF S. avermitilis i aveC homologa S. hygroscopicus

Hybridní plazmid označený jako pSE35O byl zkonstruován, aby obsahoval 564 bp část aveC homolog S. hygroscopicus nahrazující 564 homologní část aveC ORF S. avermitilis (obrázek 7) následujícím způsobem. PSE350 byl zkonstruován za použití BsaAl restrikčního místa, které je konzervováno v obou sekvencích (aveC pozice 225) a KpnI restrikčním místě, které je přítomno v aveC genu S. avermitilis (aveC pozice 810). KpnI místo bylo začleněno do DNA S. hygroscopicus pomocí PCR za použití pravostranného primerů 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID č:23) a levostranného primerů 5'-GAATCTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID č:24) (dodané společností Genosys Biotechnologies) za použití PCR podmínek popsaných v Části 7.1.10 výše. PCR produkt byl natráven pomocí BsaAl a KpnI, fragmenty byly separovány na l%agarózovém gelu a 564 bp BsaAI/Kpnl fragment byl izolován z gelu. pSE179 (popsaný v Části 7.1.10 výše) byl natráven pomocí KpnI a HindlII, fragmenty byly separovány elektroforeticky na 1% agarózovém gelu a fragment o velikosti zhruba 4,5 Kb byl izolován z gelu. pSE179 byl natráven pomocí HindlII a BsaAl, fragmenty byly separovány elektroforeticky na 1% agarózovém gelu a BsaAI/HindlII fragment o velikosti zhruba 0,2 Kb byl izolován z gelu HindlII/Kpnl fragment o velikosti zhruba 4,5 Kb, BsaAI/HindlII fragment o velikosti zhruba 0,2 Kb a BsaAI/Kpnl fragment o velikosti zhruba 564 bp ze S. hygroscopicus byly spolu ligovány v trojcestné ligaci a ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost

-48CZ 304402 B6 správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou za použití KpnI a Aval. Plazmid byl natráven pomocí HindlII a Xbal, aby došlo k uvolnění inzertu o velikosti 1,2 Kb, který byl poté ligován s pWHM3, který byl natráven pomocí HindlII a Xbal. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou za použití HindlII a Aval. Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA. Plazmid byl označen jako pSE350 a použit k transformaci protoplastů kmene SE 180-11 S. avermitilis. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu, a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Výsledky ukazují, že transformanty obsahující S. avermitilis/S. hygroscopicus hybridní plazmid mají průměrný B2:B1 poměr zhruba 109:1 (Tabulka 7).

Tabulka 7

Kmen S. avermitilis (transformuj ící plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní c B2	Relativní c B1	Průměrný poměr B2:B1
SEl80-11 ( žádný)	8	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	8	0	0	0
SE180-11 (pSE350)	16	233	2	109

Uložení biologického materiálu

Následující biologický materiál byl uložen v Americké sbírce typových kultur (ATCC), Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 29. ledna 1998 a byla mu přiřazeny následující přístupová čísla:

Plazmid_Přístupové číslo

Plazmid pSE 180 209605

Plazmid pSE 186 209604

Všechny patenty, patentové přihlášky a publikace výše citované jsou tímto začleněny jako reference v celé své šíři.

Předkládaný vynález není omezen rozsahem specifických forem vynálezu zde popsaných, které jsou zamýšleny jako jednotlivé ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu a funkčně ekvivalentní metody a komponenty jsou v rozsahu vynálezu. Různé modifikace vynálezu, navíc ktěm, které byly uvedeny a popsány, budou skutečně zjevné osobám znalým oboru z předchozího popisu a doprovodných obrázků. Takové modifikace jsou považovány za patřící do rozsahu přiložených patentových nároků.

Claims

1. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako SEQ ID č.l, nebo její degenerovaná varianta, s výjimkou rozdílu sestávajícího z mutací kódujících alespoň jednu kombinaci substitucí aminokyselin v sekvenci SEQ ID č. 2, zvolenou z

a) D48E/A89T;

-49CZ 304402 B6

b) S138T/A139T/G179S;

c) Q38P/L136P/E238D;

d) F99S/S138T/A139T/G179S;

e) A139T/M228T;

f) GI 11V/P289L; a

g) A139T/K154E/Q298H, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, ve kterých byla aveC alela divokého typu inaktivována, a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují poměr cyklohexyl B2 avermektinů třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinů třídy 1, který je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely.

2. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde poměr cyklohexyl B2 avermektinů třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinů třídy 1 je 0,8:1 nebo nižší.

3. Polynukleotidová molekula podle nároku 2, kde poměr tříd 2:1 avermektinů je 0,68:1 nebo nižší.

4. Polynukleotidová molekula podle nároku 3, kde poměr tříd 2:1 avermektinů je 0,53:1 nebo nižší.

5. Polynukleotidová molekula podle nároku 4, kde poměr tříd 2:1 avermektinů je 0,42:1 nebo nižší.

6. Polynukleotidová molekula podle nároku 5, kde poměr tříd 2:1 avermektinů je 0,40:1.

7. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde mutace v aveC sekvenci kódující D48E/A89T zahrnuji záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 317 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 438 SEQ ID č:l.

8. Polynukleotidová molekula podle nároku 7 dále zahrnující záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 353 SEQ ID č.l, a záměnu báze zT na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1155 SEQ ID č:l.

9. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde mutace v aveC sekvenci kódující S138T/A139T/G179S zahrnují záměnu báze zT na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č:l, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l.

10. Polynukleotidová molekula podle nároku 9 dále zahrnující záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 272 SEQ ID č: 1.

11. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde mutace v aveC sekvenci kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze z A na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 286 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové

-50CZ 304402 B6 pozici 580 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 886 SEQ ID č:l.

12. Polynukleotidová molekula podle nároku 11 dále zahrnující záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 24 SEQ ID č:l, záměnu báze zT na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 497 SEQ ID č:l, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 554 SEQ ID č:l.

13. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde mutace v aveC sekvenci kódující F99S/S138T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidových pozicích odpovídajících nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č:l, záměnu báze zT na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l.

14. Polynukleotidová molekula podle nároku 13 dále zahrnující záměnu báze zC na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 833 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1184 SEQ ID č: 1.

15. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 856 SEQ ID č:l.

16. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde mutace v aveC sekvenci kódující G11IV/P289L zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 505 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1039 SEQ ID č.l.

17. Polynukleotidová molekula podle nároku 16 dále zahrnující záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 155 SEQ ID č:l, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1202 SEQ ID č:l, a záměnu báze zTna C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1210 SEQ ID č:l.

18. Polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 633 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1067 SEQ ID č:l.

19. Polynukleotidová molekula podle nároku 18 dále zahrnující záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 377 SEQ ID č:l.

20. Rekombinantní vektor obsahující polynukleotidovou molekulu podle nároku 1.

21. Hostitelská buňka obsahující polynukleotidovou molekulu podle nároku 1 nebo rekombinantní vektor podle nároku 20.

22. Hostitelská buňka podle nároku 21, kterou je buňka Streptomyces.

23. Způsob přípravy nového kmene S. avermitilis, vyznačující se tím, že zahrnuje mutaci aveC alely v buňkách kmene S. avermitilis vedoucí k substituci v AveC genovém produktu, kterou je alespoň jedna kombinace substitucí aminokyselin v sekvenci SEQ ID č. 2, zvolená z

-51 CZ 304402 B6

a) D48E/A89T;

b) S138T/A139T/G179S;

c) Q38P/L136P/E238D;

d) F99S/S138T/A139T/G179S;

e) A139T/M228T;

f) G111V/P289L; a

g) A139T/K154E/Q298H takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, ve kterých byla aveC alela divokého typu inaktivována, a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1, který je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene & avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,8:1 nebo nižší.

25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene 5. avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,68:1 nebo nižší.

26. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,53:1 nebo nižší.

27. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene & avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,42:1 nebo nižší.

28. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím,že poměr tříd 2 : 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, ve kterém byla aveC alela mutována, je 0,40:1.

29. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že mutace vaveC sekvenci kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 317 SEQ ID č:l, a záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 438 SEQ ID č:l.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že dále zahrnuje záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 353 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1155 SEQ ID č:l.

31. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že mutace aveC sekvenci kódující S138T/A139T/G179S zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l.

-52CZ 304402 B6

32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že dále zahrnuje záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 272 SEQ ID č:l.

33. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že mutace v aveC sekvenci kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze zA na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 286 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 580 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 886 SEQ ID č: 1.

34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že dále zahrnuje záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 24 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 497 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 554 SEQ ID č:l.

35. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že mutace v aveC sekvenci kódující F99S/S138T/A139T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidových pozicích odpovídajících nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č:l, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l.

36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že dále zahrnuje záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 833 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1184 SEQ ID č: 1.

37. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že mutace v aveC sekvenci kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 856 SEQ ID č: 1.

38. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že mutace v aveC sekvenci kódující G11 1V/P289L zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 505 SEQ ID č:l, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1039 SEQ ID č:l.

39. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že dále zahrnuje záměnu báze zT na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 155 SEQ ID č:l, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1202 SEQ ID č:l, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1210 SEQ ID č:l.

40. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že mutace v aveC sekvenci kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 633 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 1067 SEQ ID č:l.

41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že dále zahrnuje záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nukleotidové pozici 377 SEQ ID č:l.

42. Buňka Streptomyces avermitilis obsahující mutovanou aveC alelu, která kóduje aveC genový produkt mající v sekvenci SEQ ID ě. 2 alespoň jednu kombinaci substitucí aminokyselin zvolenou z

a) D48E/A89T;

-53 CZ 304402 B6

b) S138T/A139T/G179S;

c) Q38P/L136P/E238D;

d) F99S/S138T/A139T/G179S;

e) A139T/M228T;

f) G111V/P289L; a

g) A139T/K154E/Q298H takže tyto buňky produkují poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1, který je nižší než poměr produkovaný buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které namísto toho exprimují jen divoký typ aveC alely.

43. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,8:1 nebo nižší.

44. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,68:1 nebo nižší.

45. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,53:1 nebo nižší.

46. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,42:1 nebo nižší.

47. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, produkující poměr cyklohexyl B2 avermektinu třídy 2 k cyklohexyl B1 avermektinu třídy 1 0,40:1.

48. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, kde mutace v aveC alele kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 317 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 438 SEQ ID č: 1.

49. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 48 dále zahrnující záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 353 SEQ ID č:l, a záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1155 SEQ ID č: 1.

50. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, kde mutace v aveC alele kódující S138T/A139T/G179S zahrnují záměnu báze zT na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č:l, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l.

51. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 50, dále zahrnující záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 272 SEQ ID č:l.

52. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, kde mutace v aveC alele kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze zA na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 286 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 580 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 886 SEQ ID č:l.

-54CZ 304402 B6

53. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 52, dále zahrnující záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 24 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 497 SEQ ID č:l, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 554 SEQ IDč:l.

54. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, kde mutace v aveC alele kódující F99S/S138T/A139T/G179S zahrnují delecí 3 párů bází v nukleotidových pozicích odpovídajících nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č:l, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 708 SEQ ID č:l.

55. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 54 dále zahrnující záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 833 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1184 SEQ ID ě: l.

56. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, kde mutace v aveC alele kódující A139T7M228T zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 856 SEQ ID č:l.

57. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, kde mutace v aveC alele kódující G11IV/P289L zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 505 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1039 SEQ ID č:l.

58. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 57 dále zahrnující záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 155 SEQ ID č:l, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1202 SEQ ID č:l, a záměnu báze zT na C v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1210 SEQIDč:l.

59. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 42, kde mutace v aveC alele kódující A139T7K154E/Q298H zahrnují záměnu báze zG na A v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 588 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 663 SEQ ID ě:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 1067 SEQ ID č:l.

60. Buňka Streptomyces avermitilis podle nároku 59 dále zahrnující záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici aveC alely odpovídající nukleotidové pozici 377 SEQ ID č:l.

61. Způsob produkce avermektinů, vyznačující se tím, že se kultivují buňky podle nároku 42 v kultivačním médiu za podmínek umožňujících indukci produkce avermektinů a potom se avermektiny z kultury oddělí.