KR100489856B1 - Ｂ2:ｂ1 아베르멕틴의 비율을 제어하는 스트렙토마이세스아베르미틸리스 유전자 - Google Patents

Ｂ2:ｂ1 아베르멕틴의 비율을 제어하는 스트렙토마이세스아베르미틸리스 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 발효 배양에서 생산된 유형 2:1 아베르멕틴의 비율 또는 양을 변화되는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 벡터, 숙주 세포, 및 aveC 유전자가 불활성화되거나, 또는 생산되는 유형 2:1 아베르멕틴의 비율 또는 양을 변화하기 위해 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이 균주에 관한 것이다.

Description

Ｂ2:Ｂ1 아베르멕틴의 비율을 제어하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유전자{STREPTOMYCES AVERMITILIS GENE DIRECTING THE RATIO OF B2:B1 AVERMECTINS}
본 발명은 아베르멕틴을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 주로 동물 위생 분야에 관련한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 발효 배양으로 생산된 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 조절하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 분자, 및 이 폴리뉴클레오타이드 분자를 스크리닝(screening)하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벡터, 형질전환된 숙주 세포, 및 aveC 유전자가 돌연변이되어 생산되는 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 조절하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 돌연변이주에 관한 것이다.
1. 아베르멕틴
스트렙토마이세스 종은 효능 있는 구충제 및 살충제 활성을 갖는 관련 16원의 거대 환상 락톤의 8종의 시리즈를 포함하는 아베르멕틴을 포함하여, 매우 다양한 2차 대사 산물을 생산한다. 8종의 구별되지만 밀접한 관련 화합물들은 Ala, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a 및 B2b로서 언급된다. "a" 시리즈의 화합물은 C25 위치에서의 치환기가 (S)-2차-부틸인 천연 아베르멕틴을 나타내고, "b" 시리즈의 화합물은 C25 위치에서의 치환기가 이소프로필인 천연 아베르멕틴을 나타낸다. 표시 "A" 및 "B"는 C5 위치에서의 치환기가 각각 메톡시 및 하이드록시인 에베르멕틴을 나타낸다. 숫자 "1"은 이중 결합이 C22 및 C23 위치에 존재하는 아베르멕틴을 나타내고, 숫자 "2"는 C22 위치에서 수소, 및 C23 위치에서 하이드록시를 갖는 아베르멕틴을 나타낸다. 상기 관련 아베르멕틴 중에서, B1 유형의 아베르멕틴은 가장 효과적인 구충제 및 해충제 활성을 갖는 것으로 알려져 있으므로, 상업적으로 가장 바람직한 아베르멕틴이다.
아베르멕틴, 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 호기성 발효에 의한 그의 생산은 미국 특허 제 4,310,519 호 및 제 4,429,042 호에 기재되어 있다. 천연 아베르멕틴의 생합성은 이소부티르산 및 S-(+)-2-메틸부티르산의 CoA 티오에스테르 유사체로부터 내인성으로 개시되는 것으로 사료된다.
무작위 돌연변이 유발을 통한 균주 개량 및 외인성으로 공급된 지방산의 사용을 조합함으로써, 아베르멕틴 유사체를 효과적으로 생산하였다. 분지쇄 2-옥소산 데하이드로게나제가 결핍된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이주(bkd 결핍 돌연변이주)는 발효물이 지방산으로 보충될 때 아베르멕틴만을 생산할 수 있다. 분지쇄 데하이드로게나제 활성이 결핍된 돌연변이주(예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스, ATCC 53567)의 스크리닝 및 단리는 유럽 특허 제 EP 246103 호에 기재되어 있다. 외인성으로 공급된 지방산의 존재하에 상기 돌연변이주를 발효한 결과, 적용된 지방산에 상응하는 4종의 아베르멕틴만을 생산한다. 그러므로, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(ATCC 53567)를 S-(+)-2-메틸부티르산으로 발효를 보충한 결과, 천연 아베르멕틴 A1a, A2a, B1a 및 B2a를 생산하고; 이소부티르산으로 발효를 보충한 결과, 천연 아베르멕틴 A1b, A2b, B1b 및 B2b를 생산하며; 사이클로펜탄카복실산으로 발효를 보충한 결과, 4개의 신규한 사이클로펜틸아베르멕틴 A1, A2, B1 및 B2를 생산한다.
기타 지방산으로 보충할 경우, 신규한 아베르멕틴이 생산된다. 800종의 잠재적인 전구체에 걸쳐 스크리닝함으로써, 60종 이상의 다른 신규한 아베르멕틴을 확인하였다(예를 들어, 문헌[Dutton et al., J. Antibiot., 44, 357-365, 1991] 및 [Banks et al., Roy. Soc. Chem., 147, 16-26, 1994] 참조). 또한, 5-O-메틸트랜스퍼라제 활성이 결핍된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이주는 본질적으로 B 유사체 아베르멕틴만을 생산한다. 따라서, 분지쇄 2-옥소산 데하이드로게나제 및 5-O-메틸트랜스퍼라제 활성이 둘 다 결핍된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 돌연변이주는 발효를 보충하기 위해 적용된 지방산에 상응하는 B 아베르멕틴만을 생산한다. 그러므로, 이중 돌연변이주를 S-(+)-2-메틸부티르산으로 보충한 결과, 천연 아베르멕틴 B1a 및 B2a만을 생산하는 반면에; 이소부티르산 또는 사이클로펜탄카복실산으로 보충한 결과, 천연 아베르멕틴 B1b 및 B2b 또는 신규한 사이클로펜틸 B1 및 B2 아베르멕틴을 각각 생산한다. 이중 돌연변이주 균주에 대한 사이클로헥산 카복실산의 보충은 상업적으로 중요한 신규한 아베르멕틴인 사이클로헥실아베르멕틴 B1(도라멕틴)을 생산하기 위한 바람직한 방법이다. 상기 이중 돌연변이주(예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(ATCC 53692))의 단리 및 특성은 유럽 특허 제 EP 276103 호에 기재되어 있다.
2. 아베르멕틴 생합성에 연관된 유전자
많은 경우에 있어, 2차 대사 산물의 생산에 연관된 유전자, 및 특정 항생 물질을 암호화하는 유전자는 염색체 상에 함께 다발로 발견되었다. 이는, 예를 들어 스트렙토마이세스 폴리케티드 합성효소 유전자군(PKS)에 기인한다(문헌[Hopwood and Sherman, Ann. Rev. Genet., 24, 37-66, 1990] 참조). 그러므로, 생합성 경로에서 유전자를 클로닝(cloning)하기 위한 하나의 방법은 약물내성 유전자를 단리하여, 특정 항생 물질의 생합성과 관련된 다른 유전자에 대한 염색체의 인접 영역을 시험하는 것이었다. 중요한 대사 산물의 생합성에 관련된 유전자를 클로닝하기 위한 또 다른 방법은 돌연변이주의 보충이었다. 예를 들어, 특정 대사 산물을 생산할 수 있는 유기체로부터의 DNA 총합체(library) 일부는 비-생산성 돌연변이주에 도입하여, 대사 산물을 생산하는 형질전환주가 스크리닝된다. 또한, 다른 스트렙토마이세스 종으로부터 유래한 탐침을 사용한 총합체의 혼성화는 생합성 경로에서 유전자를 확인하고 클로닝하는데 사용되었다.
다른 스트렙토마이세스 2차 대사 산물의 생합성에 필요한 유전자와 같이, 아베르멕틴 생합성에 연관된 유전자(aveC 유전자)는 염색체 상에서 다발로 발견되었다. 수많은 ave 유전자는 아베르멕틴 생합성에서 차단된 상보적인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 돌연변이주를 보충하는 벡터를 사용하여 성공적으로 클로닝되었다. 상기 유전자의 클로닝은 미국 특허 제 5,252,474 호에 기재되어 있다. 또한, 문헌[Ikeda et al., J. Antibiot., 48, 532-534, 1995]에는 단일 성분 B2a 생산자를 생산하는 aveC 유전자에서의 돌연변이 뿐만 아니라 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(aveC)의 4.82Kb BamHI 단편에 대한 C22 및 C23 탈수반응 단계를 포함하는 염색체 영역의 위치결정이 기재되어 있다. 효능 있는 구충제 화합물인 이베르멕틴은 아베르멕틴 B2a로부터 화학적으로 제조될 수 있기 때문에, 상기 아베르멕틴 B2a의 단일 성분 생산자는 이베르멕틴을 상업적으로 생산하는데 특히 유용한 것으로 고려된다.
예를 들어, 아베르멕틴의 B2:B1 비율을 감소하는 돌연변이주와 같은 아베르멕틴 생산의 복잡성을 최소화하는 aveC 유전자의 돌연변이주를 확인함으로써, 상업적으로 중요한 아베르멕틴의 생산 및 정제가 단순화될 것이다.
발명의 요약
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 완전한 aveC ORF(개방-판독 틀) 또는 그의 실질적인 일부를 포함하며, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의 aveC ORF 원래 위치에서 하류에 위치되어 있는 다음의 완전한 ORF가 결핍된 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 바람직하게는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일하거나, 또는 도 1에 존재하는 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그의 실질적인 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명은 서열 번호: 1 또는 그의 축퇴성 변이체의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일하거나, 또는 도 1에 존재하는 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그의 실질적인 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 도 1의 아미노산 서열(서열 번호: 2) 또는 그의 실질적인 일부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(S. hygroscopicus)로부터의 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이 상동 유전자 산물은 서열 번호: 4의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 일부를 포함한다. 바람직한 양태로, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 실질적인 일부를 포함한다.
본 발명은 서열 번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본 발명은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 상동 유전자 산물과 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본 발명은 도 1(서열 번호: 1) 또는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자에 혼성화되거나, 또는 도 1(서열 번호: 1) 또는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 추가로 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF 또는 aveC 상동 ORF를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하거나 발현하는데 유용한 재조합 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 추가로 제공한다. 제한되지 않는 양태로, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC 유전자의 전체 ORF를 포함하는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포, 및 그로부터 유래한 신규한 균주 또는 세포주를 추가로 제공한다.
본 발명은 실질적으로 정제되거나 단리된, 재조합으로 발현된 AveC 유전자 산물 또는 AveC 상동 유전자 산물, 또는 실질적인 일부 뿐만 아니라 이들의 동족체를 추가로 제공한다. 본 발명은 재조합 AveC 유전자 산물 또는 AveC 상동 유전자 산물을 생산하는데 도움이 되는 조건하에, AveC 유전자 산물 또는 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지며 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 요소와 효과적으로 관련하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 갖는 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 이 세포 배양으로부터 AveC 유전자 산물 또는 AveC 상동 유전자 산물을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 AveC 유전자 산물을 생산하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC 대립 유전자, 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 그의 축퇴성 변이체, 또는 도 1에 존재하는 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그의 축퇴성 변이체와 동일하지만, 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함함으로써, 야생형 aveC 대립 유전자를 불활성화하여, 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포가 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포에 의해 생산된 것과 상이한 아베르멕틴의 비율 또는 양을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본 발명에 따라서, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의균주와 비교하여 아베르멕틴 생산에서 탐지할 수 있는 변화를 나타내는 신규한 동일한 균주를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직한 양태로, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주와 비교하여 감소된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 신규한 동일한 균주를 생산하는데 유용하다. 추가의 바람직한 양태로, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 단일 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주와 비교하여 증가된 수준의 아베르멕틴을 생산하는 신규한 동일한 균주를 생산하는데 유용하다. 추가의 바람직한 양태로, 상기 뉴클레오타이드 분자는 aveC 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 생산하는데 유용하다.
본 발명은 생산되는 아베르멕틴의 비율 및/또는 양을 변화시킬 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF의 돌연변이를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로, 본 발명은 (a) 고유의 aveC 대립 유전자가 불활성화되어, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 도입되어 발현되는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 측정하는 단계; (b) 도 1의 ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 것을 제외하고는 단계 (a)에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율과 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 비교함으로써, 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율이 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율과 상이한 경우, 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시킬 수 있는 aveC ORF의 돌연변이를 확인하는 단계를 포함하는, 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시킬 수 있는 aveC ORF의 돌연변이를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 양태로서, 아베르멕틴의 유형 2:1 비율은 돌연변이에 의해 감소된다.
추가의 바람직한 양태로서, 본 발명은 (a) 고유의 aveC 대립 유전자가 불활성화되어, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 구성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 도입되어 발현되는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; (b) 도 1의 ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단일 aveC 대립 유전자만을 발현하는 것을 제외하고는 단계 (a)에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양과 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양을 비교함으로써, 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양이 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양과 상이한 경우, 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는 aveC ORF 또는 유전자 구성의 돌연변이를 확인하는 단계를 포함하는, 생산되는 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는 aveC ORF 또는 이러한 aveC ORF를 포함하는 유전자 구성의 돌연변이를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 양태로서, 아베르멕틴의 양은 돌연변이에 의해 증가된다.
본 발명은 변화된 아베르멕틴 생산을 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하는데 유용한 재조합 벡터를 추가로 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상동 재조합에 의해 ORF 또는 그의 일부를 갖는 aveC 대립 유전자에 삽입하거나 이를 대치하기 위해 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의 aveC 유전자 부위에 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자를 표적으로 하는데 사용될 수 있는 벡터를 제공한다. 그러나, 본 발명에 따라서, 본원에 제공된 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 또한 aveC 유전자 이외의 부위에서 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체로 삽입되거나, 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 에피솜(episome) 내에서 유지될 때 아베르멕틴 생합성을 조절하기 위해 작용할 수도 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하며, aveC 유전자 이외의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의 부위에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 삽입하거나 에피솜 내로 유지되는데 사용될 수 있는 벡터를 제공한다. 바람직한 양태로서, 본 발명은 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체로 삽입함으로써, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 감소된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 세포의 신규한 균주를 생성하는데 사용될 수 있는 유전자 대치 벡터를 제공한다.
본 발명은 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하고, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주의 세포와 비교하여 변화된 아베르멕틴의 비율 및/또는 양을 생산하는 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 추가로 포함한다. 바람직한 양태로, 본 발명은 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하고, 변화된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 생산하는 세포를 포함하며, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 대립 유전자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 지닌 벡터를 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환하는 단계; 및 야생형 aveC 대립 유전자를 발현하는 상기 균주의 세포에 의해 생산되는 유형 2:1 비율과 비교하여 변화된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로, 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율은 신규한 균주의 세포에서 감소된다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 변화된 양의 결과를 야기하는, 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 aveC 대립 유전자를 포함하는 유전자 구성을 갖는 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환하는 단계; 및 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양과 비교하여 변화된 양의 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 변화된 아베르멕틴의 양을 생산하는 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로, 생산되는 아베르멕틴의 양은 신규한 균주의 세포에서 증가된다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 aveC 대립 유전자를 불활성화하는 벡터로 임의의 aveC 대립 유전자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환하는 단계; 및 aveC 대립 유전자가 불활성화된 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 불활성화된 aveC 대립 유전자를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 벡터로 형질전환된 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 야생형 aveC 대립 유전자 대신에, 또는 그 외에 또 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 세포를 포함하며, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 변화된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제공한다. 더욱 바람직한 양태로, 신규한 균주의 세포는 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 감소된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산한다. 상기 신규한 균주는 도라멕틴과 같은 상업적으로 바람직한 아베르멕틴을 대규모로 생산하는데 유용하다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 고유의 aveC 대립 유전자 대신에, 또는 그 외에 또 돌연변이된 aveC 대립 유전자, 또는 aveC 대립 유전자를 포함하는 유전자 구성을 발현한 결과, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양과 비교하여 변화된 아베르멕틴의 양을 생산하는 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제공한다. 바람직한 양태로, 상기 신규한 세포는 증가된 아베르멕틴의 양을 생산한다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 aveC 유전자가 불활성화된 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제공한다. 이러한 균주는 야생형 균주와 비교하여 이들이 생산하는 상이한 아베르멕틴의 스펙트럼, 및 aveC 유전자의 표적 또는 무작위 돌연변이 유발이 아베르멕틴 생산에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 본원에 개시된 보충 스크리닝 분석 둘 모두에 유용하다.
본 발명은 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하지 않고 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배지에서 배양하는 단계; 및 이 배양액으로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴을 생산하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 돌연변이를 발현하는 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율은 감소된다. 이러한 방법은 도라멕틴과 같은 상업적으로 값비싼 아베르멕틴을 생산하는데 증가된 효율을 제공한다.
본 발명은 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하지 않고 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산되는 변화된 아베르멕틴의 양을 생산하는 결과를 야기하는 aveC 대립 유전자를 포함하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배지에서 배양하는 단계; 및 이 배양액으로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴을 생산하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 돌연변이 또는 유전자 구성을 발현하는 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 양은 증가된다.
본 발명은 본 발명의 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주에 의해 생산되며, 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하지 않고 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율과 비교하여 감소된 유형 2:1 비율로 생산된 신규한 아베르멕틴의 조성물을 추가로 제공한다. 상기 신규한 아베르멕틴 조성물은 발효 배양액에서 생산될 때 존재할 수 있거나, 그로부터 수확될 수 있고, 그로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제될 수 있다.
도 1은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC ORF를 포함하는 DNA 서열(서열 번호: 1), 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호: 2)을 도시한다.
도 2는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC 유전자의 전체 ORF를 포함하는 플라스미드 벡터 pSE186(ATCC 209604)을 도시한다.
도 3은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF에 삽입된 사카로폴리스포라 에리트래아(Saccharopolyspora erythraea)의 ermE 유전자를 포함하는 유전자 대치 벡터 pSE180(ATCC 209605)을 도시한다.
도 4는 확인된 5개의 중첩되는 코스미드 클론(즉, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68 및 pSE69)과 함께 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 유래한 아베르멕틴 폴리케티드 합성효소 유전자군의 BamHI 제한 지도를 도시한다. 또한, pSE118 및 pSE119의 관계도 도시된다.
도 5a 내지 5d는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주에 의해 생산된 발효 산물의 HPLC 분석을 도시한다. 피크 정량은 사이클로헥실 B1의 표준량과 비교함으로써 수행되었다. 사이클로헥실 B2의 체류 시간은 7.4 내지 7.7분이었고, 사이클로헥실 B1의 체류 시간은 11.9 내지 12.3분이었다. 도 5a는 불활성화된 aveC ORF를 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 도시한다. 도 5b는 pSE186(ATCC 209604)으로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 도시한다. 도 5c는 pSE187로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 도시한다. 도 5d는 pSE188로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 도시한다.
도 6은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF(서열 번호: 2), 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스(Streptomyces griseochromogenes)의 aveC 상동 부분 ORF(서열 번호: 5) 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 aveC 상동 ORF(서열 번호: 4)에 의해서 암호화된 추론된 아미노산 서열의 비교를 도시한다. 굵은 글씨체의 발린 잔기는 단백질에 대한 추정되는 개시 부위이다. 보존 잔기는 3개의 모든 서열에서 상동성인 경우 대문자, 및 3개의 서열 중에서 2개에서 상동성인 경우 소문자로 나타냈다. 상기 아미노산 서열은 약 50% 서열 동일성을 포함한다.
도 7은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC ORF의 BsaAI/KpnI 부위에 삽입된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 aveC 상동 유전자로부터의 564bp(base pair; 염기 쌍)의 BsaAI/kpnI 단편을 포함하는 혼성 플라스미드 구성을 도시한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자의 확인 및 특성, 아베르멕틴 생산에 대한 이들의 영향에 대해 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주의 구성, 및 특정 돌연변이된 AveC 유전자 산물이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에 의해 생산되는 B2:B1 아베르멕틴의 비율을 감소할 수 있는 발견에 관한 것이다. 한 예로써, 본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열 또는 도 1의 ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자, 및 그로부터 유래한 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열 및 그의 축퇴성 변이체를 갖는 뉴클레오타이드 분자에 대하여 하기 단락에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명에서 설명되는 원리는, 예를 들어 그 가운데서도 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 및 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스를 포함하는 다른 스트렙토마이세스 종으로부터 유래한 aveC 상동 유전자를 포함하는, 다른 폴리 뉴클레오타이드 분자에 유사하게 적용될 수 있다.
5.1. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 완전한 aveC ORF 또는 그의 실질적인 일부를 포함하며, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의 aveC ORF 원래 위치에서 하류에 위치되어 있는 다음의 완전한 ORF가 결핍된 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 바람직하게는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일하거나, 또는 도 1의 ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그의 실질적인 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 원에 사용된 바와 같이, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자의 "실질적인 일부"란 도 1에 도시된 완전한 aveC ORF 서열(서열 번호: 1)의 약 70% 이상을 포함하며, 기능적으로 등가의 AveC 유전자 산물을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 여기에 있어서, "기능적으로 등가의" AveC 유전자 산물이란 고유의 aveC 대립 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692에서 발현될 때 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692에 대한 고유의 야생형 기능성 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692에 의해 생산된 실질적으로 동일한 아베르멕틴의 비율 및 양을 생산하는 결과를 야기하는 유전자 산물로서 정의된다.
aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열 이외에, 본 발명의 단리된 뉴클레오타이드 분자는 도 1에 도시된 인접 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)과 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC 유전자 원래 위치에서 자연적으로 인접한 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 서열 번호: 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 축퇴성 변이체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드 분자", "폴리뉴클레오타이드 서열", "암호화 서열", "개방-판독 틀(open-reading frame)" 및 "ORF"는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며 AveC 유전자 산물, 또는 하기 기재된 바와 같이 AveC 상동 유전자 산물로, 또는 적절한 조절 요소의 제어하에 배치된 적절한 숙주 세포 발현 시스템에서 AveC 유전자 산물 또는 AveC 상동 유전자 산물과 동일한 펩타이드로 전사되어 번역되거나(DNA), 또는 번역될(RNA) 수 있는 DNA와 RNA 분자 모두를 의미한다. 암호화 서열은 원핵 생물의 서열, cDNA 서열, 게놈 DNA 서열, 및 화학적으로 합성된 DNA 및 RNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
도 1에 도시된 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)은 42번, 174번, 177번 및 180번 bp 위치에서 4개의 상이한 GTG 코돈을 포함한다. 하기 단락 9에 기재된 바와 같이, aveC ORF(도 1; 서열 번호: 1)의 5′영역의 다중 결손은 이들 코돈 중에서 어떤 코돈이 단백질 발현을 위한 개시 부위로서 aveC ORF에서 작용할 수 있는지를 규명하는데 도움이 되도록 구성되어 있다. 42번 bp에서 첫 번째 GTG의 결손은 AveC 활성을 제거하지 않았다. 174번, 177번 및 180번 bp 위치에서 함께 모든 GTG 코돈의 추가적인 결손은 AveC 활성을 제거하므로 단백질 발현에 필요한 영역임을 나타낸다. 그러므로, 본 발명은 다양한 길이의 aveC ORF를 포함한다.
본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일하거나, 또는 도 1에 존재하는 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그의 실질적인 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자를 나타내는데 사용될 때, 용어 "동일한"은
(a) 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일한 AveC 유전자 산물을 암호화하거나, 또는 도 1에 존재하는 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)과 동일한 AveC 유전자 산물을 암호화하지만, 유전자 코드의 축퇴(즉, 축퇴성 변이체)에 따른 뉴클레오타이드 서열에 대한 하나 이상의 침묵 변화를 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(b) 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 암호화하거나, 또는 다소 엄격한 조건(즉, 0.5M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 및 1mM EDTA 중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화되고, 42℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS중에 세척([Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, p.2.10.3, 1989, Green Publishing Associates, Inc., John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조))하에 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열 번호: 2)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자의 상보적 서열에 혼성화되고, 상기 정의된 바와 같은 기능적으로 등가의 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 바람직한 양태로, 상기 상동 폴리뉴클레오타이드 분자는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 뉴클레오타이드 서열의 상보적 서열, 또는 매우 엄격한 조건(즉, 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA 중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화되고, 68℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS중에 세척(아우수벨(Ausubel) 등의 상기 문헌 참조)하에 도 1에 존재하는 aveC ORF의 뉴클레오타이드(서열 번호: 1) 또는 실질적인 그의 일부의 상보적 서열에 혼성화되고, 상기 정의된 바와 같이 기능적으로 등가의 AveC 유전자 산물을 암호화한다.
AveC 유전자 산물 및 그의 잠재적인 기능성 등가물의 활성은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 발효 산물의 HPLC 분석을 통하여 측정될 수 있다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물의 기능성 등가물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 다른 균주에 존재하는 자연적으로 발생하는 aveC 유전자, 다른 스트렙토마이세스 종에 존재하는 aveC 상동 유전자, 및 자연적으로 발생하거나유전공학적으로 제조된 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 포함한다.
본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 도 1의 아미노산 서열(서열 번호: 2) 또는 그의 실질적인 일부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 도 1의 아미노산 서열(서열 번호: 2)의 "실질적인 일부"란 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열 번호: 2)의 약 70% 이상을 포함하며, 상기 정의된 바와 같이 기능적으로 등가의 AveC 유전자 산물을 구성하는 폴리펩타이드를 의미한다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 AveC 유전자 산물의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 나타내기 위해 본원에 사용될 때, 용어 "동일한"은 도 1의 아미노산 서열(서열 번호: 2)을 갖지만, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 보존적으로 치환되며, 이때 상기 아미노산 서열이 BLASTP 알고리즘(젠방크(GENBANK)제 NCBI)과 같은 모든 표준 아미노산 서열 확인 알고리즘에 의해 측정될 때 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 도 1의 아미노산 서열(서열 번호: 2)에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대하여 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 나타내며, 상기 정의된 바와 같이 보존적으로 치환한 결과, 기능적으로 등가의 유전자 산물을 야기한다. 보존성 아미노산 치환은 당해 분야에서 잘 공지되어 있다. 상기 치환을 하기 위한 규정은 그 중에서도 특히 문헌[Dayhof, M. D., Nat. Biomed. Res. Found., Vol.5, Sup.3, 1978, Washington, D. C.]에 기재되어 있는 것을 포함한다. 더욱 구체적으로, 보존성 아미노산 치환은 산도 또는 극성에 관련된 아미노산 계열 내에서 일반적으로 발생한다. 유전학적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 (1) 산성: 아스파르트산염 및 글루탐산염; (2) 염기성: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; (3) 비극성: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판; 및 (4) 비전하 극성: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 타이로신의 4개의 군으로 나누어진다. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 또한 방향족 아미노산으로서 함께 분류된다. 임의의 특정 군내에서 하나 이상의 치환, 예를 들어 류신과 이소류신 또는 발린의 치환, 아스파르트산염과 글루탐산염의 치환, 트레오닌과 세린의 치환, 또는 임의의 다른 아미노산 잔기와 구조적으로 관련된 아미노산 잔기, 예를 들어 유사한 산도 또는 극성, 또는 이들의 일부 조합에서 유사성을 갖는 아미노산 잔기의 치환은 폴리펩타이드의 기능에 무의미한 영향을 미칠 것이다.
본 발명은 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "AveC 상동 유전자 산물"이란 BLASTP 알고리즘(젠방크제 NCBI)과 같은 모든 표준 아미노산 서열 확인 알고리즘에 의해 측정될 때 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열 번호: 2)을 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 AveC 유전자 산물에 대하여 약 50% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 유전자 산물로서 정의된다. 제한되지 않는 양태로, AveC 상동 유전자 산물은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(유럽 특허 제 EP 0298423 호에 기재; FERM BP-1901로 기탁)로부터 유래하고, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 일부을 포함한다. 서열 번호: 4의 아미노산 서열의 "실질적인 일부"는 서열 번호: 4의 아미노산 서열의 약 70% 이상을 포함하며, 기능적으로 등가의 AveC 상동 유전자 산물을 구성하는 폴리펩타이드를 의미한다. "기능적으로 등가의" AveC 상동 유전자 산물은 본래의 aveC 상동 대립 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 FERM BP-1901에서 발현될 때 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 FERM BP-1901에 대한 고유의 야생형 기능성 aveC 상동 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 FERM BP-1901에 의해 생산된 것과 동일한 밀베마이신의 비율 및 양을 실질적으로 생산하는 유전자 산물로서 정의된다. 제한되지 않는 양태로, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 실질적인 일부를 포함한다. 여기에 있어서, 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자의 "실질적인 일부"란 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열의 약 70% 이상을 포함하고, 바로 앞서 정의된 기능적으로 등가의 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다.
본 발명은 서열 번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 서열 번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 상동 유전자 산물-암호화 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 언급하기 위해 사용될 때, 용어 "동일한"은
(a) 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 유전자 산물을 암호화하지만, 유전자 코드의 축퇴(즉, 축퇴성 변이체)에 따른 뉴클레오타이드 서열에 대한 하나 이상의 침묵 변화를 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
(b) 다소 엄격한 조건(즉, 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA 중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화되고, 42℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS중에 세척(아우수벨 등의 상기 문헌 참조))하에 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자의 상보적 서열에 혼성화되고, 상기 정의된 바와 같이 기능적으로 등가의 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 바람직한 양태로, 상기 상동 폴리뉴클레오타이드 분자는 매우 엄격한 조건(즉, 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA 중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화되고, 68℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS중에 세척(아우수벨 등의 상기 문헌 참조)하에 서열 번호: 3의 AveC 상동 유전자 산물-암호화 뉴클레오타이드 서열의 상보적 서열에 혼성화되고, 상기 정의된 바와 같이 기능적으로 등가의 AveC 상동 유전자 산물을 암호화한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 상동 유전자 산물과 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 추가로 제공한다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스로부터 유래한 서열 번호: 4의 AveC 상동 유전자 산물과 동일한 폴리펩타이드를 언급하기 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "동일한"은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖지만, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 보존적으로 치환되며, 상기 정의된 바와 같이 상기 아미노산 서열이 BLASTP 알고리즘(젠방크제 NCBI)과 같은 모든 표준 아미노산 서열 확인 알고리즘에 의해 측정될 때 서열 번호: 4의 폴리펩타이드에 대하여 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 나타내며, 상기 정의된 바와 같이, 보존적으로 치환한 결과 기능적으로 등가의 AveC 상동 유전자 산물을 야기한다.
본 발명은 도 1(서열 번호: 1) 또는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 도 1(서열 번호: 1) 또는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 이 올리고뉴클레오타이드는 길이가 약 10 뉴클레오타이드 이상, 바람직하게는 약 15 내지 약 30이며, 매우 엄격한 조건(즉, 6xSSC/0.5% 나트륨 피로포스페이트중에서 약 14-염기 올리고는 약 37℃에서, 약 17-염기 올리고는 약 48℃에서, 약 20-염기 올리고는 약 55℃에서 세척)하에 상기 폴리뉴클레오타이드 중의 하나에 혼성화된다. 바람직한 양태로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자중 하나의 일부와 상보적이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 유전자 조절에서 유용한 안티센스(antisense) 분자를 암호화하거나 안티센스 분자로서 작용하거나, 또는 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 증폭에서 프라이머(primer)로서 작용함을 포함하여, 다양한 목적에 유용하다.
추가적인 aveC 상동 유전자는 공지된 기술과 함께 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 스트렙토마이세스의 다른 종 또는 균주에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 도 1의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)의 일부, 또는 서열 번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 뉴클레오타이드 서열의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 분자는 검지될 수 있도록 표지되어 관심 유기체로부터 유래된 DNA로 구성된 게놈 총합체를 스크리닝하는데 사용된다. 혼성화 조건의 엄격성은 기준 유기체, 예를 들어 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스와 관심 유기체의 관계에 기초하여 선택된다. 다양한 엄격 조건에 대한 요구성은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 이러한 조건은 총합체 및 표지된 서열이 유래된 특정 유기체에 따라 예상대로 다양할 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 길이가 약 15 뉴클레오타이드 이상인 것이 바람직하고, 예를 들어 하기 실시예에서 기재된 것을 포함한다. 상동 유전자의 증폭은 당해 분야에 알려진 다른 증폭 기술, 예를 들어 리가제(ligase) 연쇄 반응이 또한 사용될 수 있지만, 중합효소 연쇄 반응(PCR; polymerase chain reaction)과 같은 표준 기술을 적용함으로써 상기 및 다른 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행될 수 있다.
aveC 상동 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 확인된 클론은 기능성 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 이를 위해, 상기 클론은 개시 및 종결 신호 뿐만 아니라 적합한 판독 틀을 확인하기 위해 서열 분석에 필요할 수 있다. 다르게 또는 추가적으로, 상기 클론된 DNA 서열은 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함하는 벡터에 삽입될 수 있다. 임의의 다양한 숙주/벡터 시스템은 하기 기재된 바와 같이, 플라스미드, 박테리오파지 또는 코스미드 발현 벡터와 같은 박테리아 시스템에 사용될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이어서, 잠재적인 aveC 상동 유전자 암호화 서열을 포함하는 상기 벡터로 형질전환된 적합한 숙주 세포는, 예를 들어 하기 단락 7에 기재된 바와 같이 발효 산물의 HPLC 분석과 같은 방법을 사용하여 AveC-형 활성에 대해 분석될 수 있다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자의 생산 및 조작은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY], 문헌[Ausubel, et al., Current Protocols In Molecular Biology, 1989, Greene Publishing Associations & Wiley Interscience, NY], 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY], 문헌[Innis, et al.(eds), PCR Strategies, 1995, Academic Press, Inc., San Diego] 및 문헌[Erlich(ed), PCR Technology, 1992, Oxford University Press, New York]에 기재된 재조합 기술에 따라 수행될 수 있으며, 모두 본원에 참조로 인용된다. AveC 유전자 산물 또는 AveC 상동 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 클론은 하기 단락 7에 기재된 방법을 포함하여 당해 분야에 임의의 공지된 기술을 사용하여 확인될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 게놈 DNA 총합체는 박테리오파지 총합체에 대하여 문헌[Benton and Davis, Science, 196, 180, 1977], 및 플라스미드 총합체에 대하여 문헌[Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961-3965, 1975]에 기재된 방법과 같은 기술을 사용하여 aveC 유전자 및 aveC 상동 유전자-암호화 서열에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 pSE186(ATCC 209604) 또는 플라스미드 pSE119(하기 단락 7에 기재됨)에 나타난 바와 같은 aveC ORF를 포함하는 것으로 알려진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 스크리닝 실험에서 탐침으로 사용될 수 있다. 다르게는, 정제된 AveC 상동 유전자 산물의 일부 또는 완전한 아미노산 서열로부터 추론된 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 탐침이 합성될 수 있다.
5.2. 재조합 시스템
5.2.1. 클로닝 및 발현 벡터
본 발명은, 예를 들어 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF 또는 aveC 상동 ORF를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 클로닝하거나 발현하는데 유용한 재조합 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 추가로 제공한다. 제한되지 않는 양태로, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC 유전자의 완전한 ORF를 포함하는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)을 제공한다.
또한, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 유래한 aveC ORF, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 유래한 aveC ORF 또는 그의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물에 관계하는 하기 명세서의 모두는 명백히 문맥에 따라 지정되지 않는 한 aveC 동족체 및 AveC 상동 유전자 산물을 나타낸다.
다양한 상이한 벡터는 그 중에서도 파지, 높은 카피 수의 플라스미드, 낮은 카피 수의 플라스미드 및 에스케리키아 콜라이(E. coli)-스트렙토마이세스 셔틀 벡터를 포함하여, 스트렙토마이세스에서 특이적인 사용을 위해 개발되었고, 이들 모두는 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 또한, 수많은 약물내성 유전자는 스트렙토마이세스로부터 클로닝되었고, 몇 가지 상기 유전자는 선택가능한 표지로서 벡터중에 혼입되었다. 스트렙토마이세스에서 사용을 위한 통상적인 벡터의 예는 그 중에서도 문헌[Hutchinson, Applied Biochem. Biotech., 16, 169-190, 1980]에 기재되어 있다.
본 발명의 재조합 벡터, 특히 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자에 대한 암호화 서열이 폴리펩타이드를 생산하는 암호화 서열을 전사 및 복사하는데 필요한 하나 이상의 조절 요소와 효과적으로 관련되도록 구성되는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 폴리뉴클레오타이드 암호화 서열의 발현을 유도하고/하거나 조절하는데 도움이 되는 유도성 및 비유도성 촉진자(promoter), 증강자(enhancer), 작동 유전자(operator) 및 당해 분야에서 공지된 다른 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 암호화 서열은 조절 요소가 암호화 서열의 전사 또는 그의 mRNA의 복사, 또는 둘 모두를 위해 효과적으로 조절되고 허용되는 하나 이상의 조절 요소와 "효과적으로 관련된다".
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하도록유전공학적으로 제조될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터로는 그 중에서도 pCR-블런트(Blunt), pCR2.1(인비트로겐(Invitrogen)), pGEM3Zf(프로메가(Promega)) 및 셔틀 벡터 pWHM3(문헌[Vara et al., J. Bact., 171, 5872-5881, 1989] 참조)이 포함된다.
적합한 조절 요소와 효과적으로 관련된 특정 암호화 서열을 포함하는 재조합 벡터를 구성하기 위한 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 이들은 본 발명을 시시하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, 이 기술은 마니아티스(Maniatis) 등의 상기 문헌, 아우수벨 등의 상기 문헌, 이니스(Innis) 등의 상기 문헌, 및 얼리치(Erlich) 등의 상기 문헌에 기재되어 있다.
상기 벡터의 조절 요소는 이들의 강도 및 특이성에서 다양할 수 있다. 사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 임의의 수많은 적합한 전사 및 번역 요소도 사용될 수 있다. 박테리아에 대한 전사 조절 영역 및 촉진자의 제한되지 않은 예로는 β-gal 촉진자, T7 촉진자, TAC 촉진자, λ좌 및 우 촉진자, trp 및 lac 촉진자, trp-lac 융합 촉진자, 및 더욱 구체적으로 스트렙토마이세스에 대하여 촉진자 ermE, melC, tipA 등이 포함된다. 하기 단락 11에 기재되어 있는 특이적인 양태로, 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한 강한 항구성 ermE 촉진자에 인접하게 클론화된 aveC ORF를 포함하는 발현 벡터가 생성되었다. 이 벡터는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 내로 형질전환되고, 이어서 발효 산물의 HPLC 분석은 야생형 aveC 대립 유전자를 발현하는 동일한 균주에 의한 생산과 비교하여 생산되는 아베르멕틴의 증가된 역가를 나타냈다.
융합 단백질 발현 벡터는 AveC 유전자 산물-융합 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 상기 정제된 융합 단백질은 AveC 유전자 산물에 대한 항혈청을 증가하기 위해, AveC 유전자 산물의 생화학적 특성을 연구하기 위해, 다양한 생화학적 활성을 갖는 AveC 융합 단백질을 제조하기 위해, 또는 발현된 AveC 유전자 산물의 확인 또는 정제를 보조하기 위해 사용될 수 있다. 가능한 융합 단백질 발현 벡터는 β-갈락토시다제 및 trpE 융합물, 말토스-결합 단백질 융합물, 글루타치온-S-트랜스페라제 융합물 및 폴리히스티딘 융합물(운반 영역)을 함호화하는 서열을 삽입하는 벡터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 양태로, AveC 유전자 산물 또는 그의 일부는, 예를 들어 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 또는 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스와 같은 스트렙토마이세스의 또 다른 종 또는 균주에서 유래된 AveC 상동 유전자 산물 또는 그의 일부에 융합될 수 있다. 하기 단락 12에 기재되고 도 7에 기술된 특별한 양태에 있어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC ORF의 상동 564bp 영역을 대치하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 aveC 상동 ORF의 564bp 영역을 포함하는 키메라 플라스미드가 구성되어 있다. 이러한 혼성 벡터는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스를 형질전환하여, 예를 들어 생산되는 유형 2:1 아베르멕틴의 비율에 대한 이들의 영향을 측정하는데 시험될 수 있다.
AveC 융합 단백질은 정제에 유용한 영역을 포함하도록유전공학적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, AveC-말토스-결합 단백질 융합물은 아밀로스 수지를 사용하여 정제될 수 있고; AveC-글루타치온-S-트렌스페라제 융합 단백질은 글루타치온-아가로스 비드(bead)를 사용하여 정제될 수 있으며; AveC-폴리히스티딘 융합물은 2가의 니켈 수지를 사용하여 정제될 수 있다. 또한, 운반 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 항체는 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 클론 항체의 표적 항원 결정기(epitope)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 조절 요소와 효과적으로 관련하는 발현 벡터로유전공학적으로 제조되어, 발현된 항원 결정기가 AveC 폴리펩타이드에 융합되도록 위치될 수 있다. 예를 들어, 친수성 표지 펩타이드인 플라그(FLAG, 상표명) 항원 결정기 태그(tag)(인터내셔널 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(International biotechnologies Inc.))를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 AveC 폴리펩타이드의 카복실 말단에 상응하는 지점에서 발현 벡터에 표준 기술에 의해 삽입될 수 있다. 이어서, 상기 발현된 AveC 폴리펩타이드-플라그 항원 결정기 융합 산물은 시판중인 항-플라그 항체를 사용하여 검출되어 친화성-정제될 수 있다.
또한, 상기 AveC 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 발현된 AveC 폴리펩타이드가 특이적인 단백질 분해 효소로 처리됨으로써 운반 영역 또는 융합 파트너로부터 방출될 수 있도록 특이적인 단백질 분해 효소 절단 부위를 암호화하는 폴리링커(polylinker) 서열을 포함하도록유전공학적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질 벡터는 그 중에서도 트롬빈 또는 인자 Xa 절단 부위를 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
aveC ORF로부터 상류에 위치하고 그와 함께 판독 틀 내에 있는 신호 서열은 발현된 유전자 산물의 거래 및 분비 작용을 지배하기 위해 공지된 방법에 의해 발현 벡터에유전공학적으로 제조될 수 있다. 제한되지 않는 신호 서열의 예로는 그 중에서도 α-인자, 면역글로불린, 외부 막 단백질, 페니실리나제 및 T-세포 수용체로부터 유래한 것들이 포함된다.
본 발명의 클로닝 또는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질 감염된 숙주 세포의 선택을 보조하기 위해, 상기 벡터는 리포터(reporter) 유전자 산물 또는 다른 선택가능한 표지에 대한 암호화 서열을 추가로 포함하도록유전공학적으로 제조될 수 있다. 상기 암호화 서열은 바람직하게는 상기 기재된 바와 같이 조절 요소 암호화 서열과 효과적으로 관련되어 있다. 본 발명에 유용한 리포터 유전자는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 그 중에서도 녹색 형광 단백질, 루시페라제, xylE 및 타이로시나제를 암호화하는 것들을 포함한다. 선택가능한 표시를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 항생 물질 또는 항-대사 산물에 대한 내성을 주는 유전자 산물을 암호화하거나, 또는 영양 요구성 요구물을 공급하는 것들을 포함한다. 이러한 서열의 예는 그 중에서도 에리트로마이신, 티오스트렙톤 또는 카나마이신에 대한 내성을 암호화하는 것을 포함한다.
5.2.2 숙주 세포의 형질전환
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포, 및 그로부터 유래한 신규한 균주 또는 세포주를 추가로 제공한다. 본 발명의 실시에 유용한 숙주 세포는 다른 원핵 세포 또는 진핵 세포가 또한 사용될 수 있지만, 스트렙토마이세스 세포가 바람직하다. 상기 형질전환된 숙주 세포는 그 중에서도 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 박테리아, 또는 재조합 벡터로 형질전환된 효모와 같은 미생물을 전형적으로 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자는 스트렙토마이세스 세포에서 작용하지만, 예를 들어 클로닝 또는 발현 목적을 위해 다른 박테리아 또는 진핵 세포로 또한 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC; 미국 종균 보존소; 미국 메릴랜드주 록빌 소재)로부터 구입할 수 있거나(수탁 번호 31343), 시판중(스트라타젠(Stratragene))인 DH5α균주와 같은 에스케리키아 콜라이 균주가 전형적으로 사용될 수 있다. 바람직한 진핵 숙주 세포로는 포유동물 세포 또는 곤충 세포가 또한 효과적으로 사용될 수 있지만, 효모 세포가 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 실질적으로 동일한 세포 배양의 하나 이상의 숙주 세포 내로 형질전환되거나 형질 감염되는 것이 바람직하다. 상기 발현 벡터는 공지의 기술, 예를 들어 원형질체 형질전환, 인산화칼슘 침전, 염화칼슘 처리, 현미 주사, 전기 천공법, 재조합 바이러스 접촉에 의한 형질 감염, 리포좀-매개된 형질 감염, DEAE-덱스트란 형질 감염, 형질 도입, 접합, 또는 미세 발사 충격법에 따라서 숙주 세포로 도입되는 것이 일반적이다. 형질전환체의 선택은 상기 기재된 바와 같이 재조합 벡터와 관련된 선택가능한 표지, 예를 들어 항생 물질 내성을 발현하는 세포를 선택함으로써, 표준 절차에 따라 수행될 수 있다.
발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 경우, 숙주 세포 염색체 또는 에피좀 내에서의 aveC 암호화 서열의 삽입 및 유지는 표준 기술, 예를 들어 서던(Southern) 혼성화 분석, 제한 효소 분석, 역 전사 효소 PCR(rt-PCR)을 포함하는 PCR 분석에 의하거나, 또는 기대되는 유전자 산물을 검지하기 위한 면역학적 분석에 의해 확인될 수 있다. 재조합 aveC 암호화 서열을 포함하고/하거나 발현하는 숙주 세포는 (i) DNA-DNA, DNA-RNA 또는 RNA-안티센스 RNA 혼성화 방법; (ii) "표지" 유전자 작용의 존재를 검지하는 방법; (iii) 숙주 세포 내에서 aveC-특이성 mRNA 사본의 발현에 의해 측정된 전사 수준을 평가하는 방법; (iv) 면역학적 분석, 또는 AveC 생물학적 활성(예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 숙주 세포에서 AveC 활성의 나타내는 아베르멕틴의 비율 및 양의 생산)의 존재에 의해 측정되는 바와 같이 성숙 폴리펩타이드 산물의 존재를 검지하는 방법을 포함하는, 당해 분야에 잘 알려진 4개 이상의 일반적인 접근법에 의해 확인될 수 있다.
5.2.3. 재조합 AveC 유전자 산물의 발현 및 특성
aveC 암호화 서열이 적절한 숙주 세포 내로 안정하게 도입될 경우, 형질전환된 숙주 세포는 복제되어 증식하고, 생성된 세포는 AveC 유전자 산물의 최대 생산에 도움이 되는 조건하에 생육할 수 있다. 이러한 조건에 의해, 세포가 전형적으로 고밀도로 성장함을 포함한다. 발현 벡터가 유도성 촉진자를 포함하는 경우, 온도 변화, 영양원의 고갈, 무상 유도 물질(예를 들어, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 같은 탄수화물의 유사 물질)의 첨가, 과잉 대사 부산물의 축적 등과 같은 적절한 유도 조건은 발현을 유도하는데 필요에 따라 적용된다.
발현된 AveC 유전자 산물이 숙주 세포 내부에서 유지될 경우, 이 세포를 수확하여, 용해하고, 단백질 분해를 최소화하기 위한 당해 분야에 알려진 추출 조건, 예를 들어 4℃에서 또는 단백질 분해 효소 저해제의 존재하에, 또는 이들 두 조건하에 용해물로부터 상기 산물을 단리하여 정제한다. 발현된 AveC 유전자 산물이 숙주 세포로부터 분비될 경우, 고갈된 영양원 배지를 간단히 수거하여, 그로부터 상기 산물을 단리할 수 있다.
상기 발현된 AveC 유전자 산물은, 경우에 따라, 황산암모늄 침전, 크기 분획, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 밀도 원심 분리 및 친화성 크로마토그래피와 같은 방법의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 표준 방법을 사용하여 세포 용해물 또는 배양액으로부터 단리되거나 실질적으로 정제될 수 있다. 발현된 AveC 유전자 산물이 생물학적 활성을 나타낼 경우, 제조물의 순도 증가는 적절한 분석을 사용하여 정제 절차의 각 단계에서 모니터링(monitoring)될 수 있다. 발현된 AveC 유전자 산물이 생물학적 활성을 나타내는지 여부는, 예를 들어 크기, 또는 AveC에 대하여 특이적인 항체와의 반응성에 기초하여 또는 융합 태그의 존재에 의해 검지될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 제조물에서 단백질 약 20 중량% 이상으로 구성된 AveC 유전자 산물이 "실질적으로 정제된다". 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 제조물에서 단백질 약 80 중량% 이상으로 구성된 AveC 유전자 산물이 "단리된다".
그러므로, 본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 도 1의 아미노산 서열(서열 번호: 2) 또는 그의 실질적인 일부, 및 그의 동족체을 포함하는 재조합으로 발현된, 단리되거나 실질적으로 정제된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 제공한다.
본 발명은 서열 번호: 4의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 일부, 및 그의 동족체를 포함하는 재조합으로 발현된, 단리되거나 실질적으로 정제된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 상동 유전자 산물을 추가로 제공한다.
본 발명은 재조합 AveC 유전자 산물을 생산하는데 도움이 되는 조건하에 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지며 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 요소와 효과적으로 관련하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 이 세포 배양으로부터 AveC 유전자 산물을 회수하는 단계를 포함하는, AveC 유전자 산물을 생산하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
재조합으로 발현된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물은 AveC 유전자 산물의 기능을 변화함으로써 아베르멕틴 생합성을 조절하는 화합물을 스크리닝하며, AveC 유전자 산물에 대한 항체를 증가함을 포함하여, 다양한 목적에 유용하다.
충분한 순도의 AveC 유전자 산물이 수득된 경우, SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, 아미노산 서열 분석, 아베르멕틴 생합성 경로에서 적합한 산물을 생산하는 생물학적 활성 등을 포함하는 표준 방법에 의해 특징지어 질 수 있다. 예를 들어, AveC 유전자 산물의 아미노산 서열은 표준 펩타이드 서열화 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 AveC 유전자 산물은 친수성 분석(예를 들어, 문헌[Hopp and Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824, 1981] 참조), 또는 유사한 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 AveC 유전자 산물의 소수성 및 친수성 영역을 확인하기 위해 추가로 특징지어질 수 있다. 구조 분석이 특이적인 2차 구조로 추정되는 AveC 유전자 산물의 영역을 확인하기 위해 수행될 수 있다. X선 결정학(문헌[Engstrom, Biochem. Expl Biol., 11, 7-13, 1974] 참조), 컴퓨터 모델링(문헌[Fletterick and Zoller(eds), Current Communications in Molecular Biology, 1973, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] 참조), 및 핵자기 공명(NMR)과 같은 생물 물리학적 방법은 AveC 유전자 산물과 그의 기질 사이의 상호 작용 부위를 지도화하고 연구하는데 사용될 수 있다. 이러한 연구로부터 수득된 정보는 더욱 바람직한 아베르멕틴 생산 특성을 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 개발하는데 도움이 되는 aveC ORF에서 돌연변이를 위한 신규한 부위를 선택하는데 사용될 수 있다.
5.3. AveC 돌연변이주의 구성 및 용도
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC 대립 유전자 또는 그의 축퇴성 변이체, 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 그의 축퇴성 변이체, 또는 도 1에 존재하는 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그의 축퇴성 변이체와 동일하지만, 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함함으로써, 야생형 aveC 대립 유전자가 불활성화되어, 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 축퇴성 변이체를 포함하는 뉴클레오타이드 분자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포가 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포에 의해 생산된 것과 상이한 아베르멕틴의 비율 또는 양을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
본 발명에 따라서, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주와 비교하여 아베르멕틴 생산에서 탐지할 수 있는 변화를 나타내는 신규한 동일한 균주를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직한 양태로, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주와 비교하여 감소된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 신규한 동일한 균주를 생산하는데 유용하다. 추가의 바람직한 양태로, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 단일 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주와 비교하여 증가된 수준의 아베르멕틴을 생산하는 신규한 동일한 균주를 생산하는데 유용하다. 추가의 바람직한 양태로, 상기 뉴클레오타이드 분자는 aveC 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 생산하는데 유용하다.
aveC 대립 유전자 또는 암호화 서열에 대한 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 결손, 추가 또는 치환을 AveC 유전자 산물로 도입하거나, 또는 AveC 유전자 산물의 절단 또는 그의 임의의 조합의 결과를 야기하여, 원하는 결과를 생산하는 임의의 돌연변이를 포함한다. 또한, 상기 돌연변이된 aveC 대립 유전자 서열은 그의 축퇴성 변이체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 aveC 대립 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 축퇴성 변이체, 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 그의 축퇴성 변이체, 또는 도 1에 존재하는 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그의 축퇴성 변이체를 포함하지만, AveC 유전자 산물의 선택된 위치에서 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로의 치환을 암호화하는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 하기에 예시된 여러 가지 제한되지 않는 양태로, 상기 치환은 서열 번호: 2의 38번, 48번, 55번, 89번, 99번, 111번, 136번, 138번, 139번, 154번, 179번, 228번, 230번, 238번, 266번, 275번, 289번 또는 298번 아미노산 위치, 또는 그의 일부 조합에 상응하는 AveC 유전자 산물의 임의의 아미노산 위치에서 수행될 수 있다.
aveC 암호화 서열에 대한 돌연변이는 오류-빈발(error-prone) PCR의 사용 또는 카세트 돌연변이 발생을 포함하여, 다양한 임의의 공지된 방법에 의해서 수행된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드-지향성 돌연변이 발생은, 예를 들어 하나 이상의 제한 부위, 또는 종결 코돈을 aveC 대립 유전자 또는 ORF 내의 특이 영역으로 도입하는 규정된 방법으로 aveC 대립 유전자 또는 ORF의 서열을 변화시키는데 적용될 수 있다. 또한, 무작위 단편화, 돌연변이 발생의 반복 주기 및 뉴클레오타이드 셔플링(shuffling)을 포함하는 미국 특허 제 5,605,793 호, 미국 특허 제 5,830,721 호 및 제 5,837,458 호에 기재된 것과 같은 방법은 aveC 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 거대한 총합체를 생성하는데 사용될 수 있다.
표적 돌연변이는, 특히 AveC 유전자 산물에서 하나 이상의 보존된 아미노산 잔기를 변화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 6에 존재하는 바와 같이 AveC 유전자 산물의 추론된 아미노산 서열과 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(서열 번호: 2), 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스(서열 번호: 5) 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(서열 번호: 4)로부터 유래한 AveC 상동 유전자 산물을 비교함으로써, 이들 종 사이에 아미노산 잔기의 중요한 보존 부위를 나타낼 수 있다. 하나 이상의 보존된 아미노산 잔기의 변화를 야기하는 표적 돌연변이는, 특히 아베르멕틴 생산에서 바람직한 변화를 나타내는 신규한 돌연변이주 균주를 생산하는데 효과적일 수 있다.
또한, 무작위 돌연변이 발생도 유용할 수 있으며, 자외선 조사 또는 X선, 또는 화학적 돌연변이 유발요인(예를 들어, N-메틸-N'-니트로소구아니딘, 에틸 메탄 설포네이트, 아질산 또는 질소 머스타드)에 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 세포를 노출함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 돌연변이 발생 기술의 검토에 대한 아우수벨의 상기 문헌 참조).
돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 분자가 생성될 경우, 이들은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 아베르멕틴 생합성을 조절할 수 있는지를 측정하기 위해 스크리닝된다. 바람직한 양태로, 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 aveC 유전자가 불활성화되어 aveC 음성(aveC -) 배경을 제공하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 보충함으로써 시험된다. 제한되지 않는 양태로, 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 분자는 하나 이상의 조절 요소와 효과적으로 관련하며, 바람직하게는 형질전환된 세포를 선택하기 위해 하나 이상의 약물내성 유전자를 포함하는 발현 플라스미드에 접합된다. 이어서, 이러한 벡터는 공지된 기술을 사용하여 aveC - 숙주 세포 내로 형질전환되고, 형질전환된 세포는 선택되어 아베르멕틴 생산을 허용하거나 유도하는 조건하에 적절한 발효 배지에서 배양된다. 다음으로, 발효 산물을 HPLC에 의해 분석하여 숙주 세포를 보충하는 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 분자의 능력을 측정한다. pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 및 pSE290 내지 pSE297을 포함하여, 아베르멕틴의 B2:B1 비율을 감소할 수 있는 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 분자를 갖는 일부 벡터는 하기 단락 8.3에 예시되어 있다.
본 발명은 생산되는 아베르멕틴의 비율 및/또는 양을 변화시킬 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF의 돌연변이를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로, 본 발명은 (a) 고유의 aveC 대립 유전자가 불활성화되어, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 도입되어 발현되는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 측정하는 단계; (b) 도 1의 ORF 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1) 또는 그와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 야생형 aveC 대립 유전자 또는 aveC 대립 유전자만을 발현하는 것을 제외하고는 단계 (a)에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율과 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 비교함으로써, 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율이 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율과 상이한 경우, 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시킬 수 있는 aveC ORF의 돌연변이를 확인하는 단계를 포함하는, 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시킬 수 있는 aveC ORF의 돌연변이를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로서, 아베르멕틴의 유형 2:1 비율은 돌연변이에 의해 감소된다.
추가의 바람직한 양태로서, 본 발명은 (a) 고유의 aveC 대립 유전자가 불활성화되어, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 구성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 도입되어 발현되는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; (b) 야생형 aveC 대립 유전자 또는 그와 동일한 뉴클레오타이드 서열만을 발현하는 것을 제외하고는 단계 (a)에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양과 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양을 비교함으로써, 단계 (a)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양이 단계 (b)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양과 상이한 경우, 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는 aveC ORF 또는 유전자 구성의 돌연변이를 확인하는 단계를 포함하는, 생산되는 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는 aveC ORF를 포함하는 aveC ORF 또는 유전자 구성의 돌연변이를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로서, 아베르멕틴의 양은 돌연변이에 의해 증가된다.
상기 돌연변이를 확인하기 위한 임의의 방법은 표 1에 도시된 지방산 전구체중 임의의 하나와 같은 다른 적절한 지방산 전구체가 또한 사용될 수 있지만, 바람직하게는 사이클로헥산 카복실산으로 보충된 발효 배지를 사용하여 수행된다.
바람직한 방향으로 아베르멕틴 생산을 조절하는 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 분자가 확인될 경우, 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변이의 위치는 측정될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 PCR에 의해 단리되어, 공지의 방법을 사용하여 DNA 서열 분석을 할 수 있다. 상기 돌연변이된 aveC 대립 유전자의 DNA 서열을 야생형 aveC 대립 유전자와 비교함으로써, 아베르멕틴 생산의 변화에 대하여 책임이 있는 돌연변이(들)를 측정할 수 있다. 본 발명의 특이적인 제한되지 않는 양태로서, 55번(S55F), 138번(S138T), 139번(A139T) 또는 230번(G230D)의 임의의 잔기에서 단일 아미노산 잔기 치환, 또는 138번(S138T) 및 139번(A139T 또는 A139F)의 위치에서 이중 치환을 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물은 생산되는 유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 변화되도록 AveC 유전자 산물 기능에서의 변화를 야기하며(하기 단락 8 참조), 이때 기술된 아미노산 위치는 도 1에 존재하는 것(서열 번호: 2)과 상응한다. 또한, (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; 및 (7) A139T/K154E/Q298H의 돌연변이의 7가지 조합은 각각 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 효과적으로 감소하는 것으로 나타났다. 본원에 사용된 바와 같이, A139T와 같은 상기 명명은 단일 문자 명명으로 원 아미노산 잔기를 나타내며, 상기 예에서는 알라닌(A)이고, 지정된 위치에서 이 예에서는 폴리펩타이드의 139번 위치(서열 번호: 2로 언급)이며, 원 아미노산 잔기를 대치하는 아미노산 잔기가 따르며, 상기 예에서는 트레오닌(T)이다. 따라서, 38번, 48번, 55번, 89번, 99번, 111번, 136번, 138번, 139번, 154번, 179번, 228번, 230번, 238번, 266번, 275번, 289번 또는 298번의 하나 이상의 아미노산 위치(도 1 참조), 또는 그의 임의의 조합에서 아미노산 치환 또는 결손을 포함하는 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 본 발명에 의해 포함된다.
바람직한 양태로, 상기 돌연변이는
(a) P, 또는 P에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 38번 위치에서의 아미노산 잔기 Q;
(b) E, 또는 E에 대하여 보존성 치환체체인 아미노산에 의해 대치된 48번 위치에서의 아미노산 잔기 D;
(c) T, 또는 T에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 89번 위치에서의 아미노산 잔기 A;
(d) S, 또는 S에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 99번 위치에서의 아미노산 잔기 F;
(e) V, 또는 V에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 111번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
(f) P, 또는 P에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 136번 위치에서의 아미노산 잔기 L;
(g) T, 또는 T에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 138번 위치에서의 아미노산 잔기 S;
(h) T 또는 F, 또는 T 또는 F에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 139번 위치에서의 아미노산 잔기 A;
(i) E, 또는 E에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 154번 위치에서의 아미노산 잔기 K;
(j) S, 또는 S에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 179번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
(k) T, 또는 T에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 228번 위치에서의 아미노산 잔기 M;
(l) D, 또는 D에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 238번 위치에서의 아미노산 잔기 E;
(m) L, 또는 L에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 289번 위치에서의 아미노산 잔기 P; 및
(n) H, 또는 H에 대하여 보존성 치환체인 아미노산에 의해 대치된 298번 위치에서의 아미노산 잔기 Q로 구성된 하나 이상의 군에서 선택된 아미노산 치환체를 암호화하며, 이때 보존성 아미노산 치환체는 단락 5.1에서 상기 정의된 바와 같다.
추가의 바람직한 양태로, 상기 돌연변이는 아미노산 치환체의 조합물을 암호화하며, 치환된 아미노산 잔기의 조합은 (a) 아미노산 잔기 S138 및 A139; (b) 아미노산 잔기 D48 및 A89; (c) 아미노산 잔기 S138, A139 및 G179; (d) 아미노산 잔기 Q38, L136 및 E238; (e) 아미노산 잔기 F99, S138, A139 및 G179; (f) 아미노산 잔기 A139 및 M228; (g) 아미노산 잔기 G111 및 P289; 및 (h) 아미노산 잔기 A139, K154 및 Q298로 구성된 군에서 선택된다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명에 따른 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 효과적으로 감소하는데 유용한 aveC 대립 유전자에서 돌연변이의 특정 조합은 (a) S138T/A139T; (b) S138T/A139F; (c) D48E/A89T; (d) S138T/A139T/G179S; (e) Q38P/L136P/E238D; (f) F99S/S138T/A139T/G179S; (g) A139T/M228T; (h) G111V/P289L; 및 (i) A139T/K154E/Q298H로 구성된 하나 이상의 군에서 선택된다.
본 발명은 아베르멕틴 생산의 변화를 야기하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 조성물을 추가로 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상동 재조합에 의해 aveC ORF 또는 그의 일부로 삽입하거나 이를 대치하기 위해 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의 aveC 유전자의 부위에 대해 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자를 표적으로 하는데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제공한다. 그러나, 본 발명에 따라서, 또한 본원에 제공된 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 aveC 유전자 이외의 부위에서 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체로 삽입되거나, 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 에피좀 내에서 유지될 때도 아베르멕틴 생합성을 조절하도록 작용한다. 그러므로, 본 발명은 또한 aveC 유전자 이외의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의 부위에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 삽입하는데 사용되거나, 또는 에피좀 내에서 유지될 수 있는, 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
바람직한 양태로, 본 발명은 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 그의 축퇴성 변이체를 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포로 삽입함으로써, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 변화된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포의 신규한 균주를 생산하는데 사용될 수 있는 유전자 대치 벡터를 제공한다. 바람직한 양태로, 상기 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율은 감소된다. 상기 유전자 대치 벡터는, 하기 단락 8에 예시된, 예를 들어 pSE188, pSE199 및 pSE231과 같은 본원에 제공된 발현 벡터에 존재하는 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 분자를 사용하여 구성될 수 있다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 그의 축퇴성 변이체를 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포로 삽입하여, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 변화된 아베르멕틴의 양을 생산하는 세포의 신규한 균주를 생산하는데 사용될 수 있는 벡터를 제공한다. 바람직한 양태로, 상기 세포에 의해 생산되는 아베르멕티의 양은 증가된다. 특이적이지만 제한되지 않은 양태로, 상기 벡터는 aveC 대립 유전자로부터 상류에 위치되고, 그와 효과적으로 관련된, 예를 들어 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한 강한 항구성 ermE 촉진자와 같은 당해 분야에 공지된 강한 촉진자를 추가로 포함한다. 상기 벡터는 하기 실시예 6에 기재되어 있는 플라스미드 pSE189이거나, 또는 플라스미드 pSE489의 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 사용하여 구성될 수 있다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 야생형 균주의 aveC 유전자를 불활성화하는데 유용한 유전자 대치 벡터를 제공한다. 제한되지 않는 양태로, 상기 유전자 대치 벡터는 하기 단락 8.1에 예시된 플라스미드 pSE180(ATCC 209605)(도 3)에 존재하는 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드 분자를 사용하여 구성될 수 있다. 본 발명은, 예를 들어 도 1에 도시된 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)과 인접한 것을 포함하여, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체에서 aveC 유전자 원래 위치에서 자연적으로 인접한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC ORF를 결손하는데 사용될 수 있는 유전자 대치 벡터를 추가로 제공한다.
본 발명은 돌연변이된 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주의 세포와 비교하여 aveC 대립 유전자를 발현하고, 아베르멕틴의 변화된 비율 및/또는 양을 생산하는 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 본 발명은 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 지닌 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환하는 단계; 및 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 균주의 세포에 의해 생산된 유형 2:1 비율과 비교하여 변화된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하고, 변화된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 생산하는 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 더욱 바람직한 양태로, 본 발명은 상기 세포의 aveC 대립 유전자로 돌연변이를 도입할 수 있는 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환하며, aveC 대립 유전자에 대한 돌연변이 결과, 서열 번호: 2의 38번, 48번, 55번, 89번, 99번, 111번, 136번, 138번, 139번, 154번, 179번, 228번, 230번, 238번, 266번, 275번, 289번 또는 298번 아미노산 잔기에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 잔기의 암호화된 AveC 유전자 산물에서 치환을 야기함으로써, aveC 대립 유전자가 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포가 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 세포에 의해 생산된 비율과 상이한 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 생산함을 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로, 아베르멕틴의 변화된 유형 2:1 비율은 감소된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체, 또는 본 발명의 벡터 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자에서의 aveC 대립 유전자에 의해 암호화된 아미노산 잔기가 서열 번호: 2의 특정 아미노산 잔기에 "상응하는" 것으로 언급되거나, 또는 아미노산 치환이 서열 번호: 2의 특정 번호화된 아미노산 잔기에 "상응하는" 특정 위치에서 발생하는 것으로 언급되며, 이는 숙련자가 서열 번호: 2로서 본원에 존재하는 아미노산 서열에 대하여 참조로 신속히 측정할 수 있는 AveC 유전자 산물에서 동일한 상대 위치에서의 아미노산 잔기를 언급한다.
본 발명은 특정 돌연변이를 암호화하는 aveC 대립 유전자에서의 특이적 돌연변이가 서열 번호: 1에 도시된 바와 같은 특정 뉴클레오타이드 위치에 "상응하는" aveC 대립 유전자의 특이적인 뉴클레오타이드 위치에서 염기 변화로서 기술되는 신규한 균주를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. aveC 대립 유전자에서의 뉴클레오타이드 위치는 서열 번호: 1에서의 특정 뉴클레오타이드 위치에 "상응하는 "것으로 언급되는, 상응하는 아미노산 위치에 관해서 상기한 바와 같이, 이는 숙련자가 서열 번호: 1로서 본원에 존재하는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 참조로 신속히 측정할 수 있는 aveC 뉴클레오타이드 서열의 동일한 상대 위치에서의 뉴클레오타이드를 언급한다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 단일 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴 양의 변화를 야기하는, 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 aveC 대립 유전자를 포함하는 유전자 구성을 갖는 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환하는 단계; 및 단일 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 양과 비교하여 변화된 양의 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 변화된 아베르멕틴의 양을 생산하는 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 양태로, 형질전환된 세포에서 생산되는 아베르멕틴의 양은 증가된다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 임의의 aveC 대립 유전자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 aveC 대립 유전자를 불활성화하는 벡터로 형질전환하는 단계; 및 aveC 대립 유전자가 불활성화된 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 불활성화된 aveC 대립 유전자를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하지만 제한되지 않는 양태로, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포는 돌연변이에 의해서, 또는 이종 유전자 서열로 aveC 대립 유전자의 일부의 대치에 의해서 불활성화된 aveC 대립 유전자를 갖는 유전자 대치 벡터로 형질전환되고, 본래 aveC 대립 유전자가 불활성화된 aveC 대립 유전자로 대치된 형질전환된 세포가 선택된다. aveC 대립 유전자의 불활성화는 하기 기재된 바와 같이, 발효 산물을 HPLC 분석함으로써 측정될 수 있다. 하기 단락 8.1에 기재된 특이적이지만 제한되지 않는 양태로서, aveC 대립 유전자는 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한 ermE 유전자를 aveC ORF로 삽입함으로써 불활성화된다.
본 발명은 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 벡터로 형질전환된 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 본 발명은 야생형 aveC 대립 유전자 대신에 또는 그 외에 또 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 그의 축퇴성 변이체를 발현하는 세포를 포함하며, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율과 비교하여 변화된 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제공한다. 바람직한 양태로, 신규한 세포에 의해 생산되는 변화된 유형 2:1 비율은 감소된다. 상기 신규한 균주는 도라멕틴과 같은 상업적으로 바람직한 아베르멕틴의 대규모 생산에 유용하다. 더욱 바람직한 양태로, 본 발명은 상기 본원에 존재하는 것에 상응하는 뉴클레오타이드 위치에서 aveC 대립 유전자에서의 임의의 상기 돌연변이 또는 돌연변이의 조합을 포함하거나, 또는 AveC 유전자 산물에서 임의의 상기 아미노산 치환체를 암호화하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 세포를 제공한다. 상기 돌연변이가 플라스미드와 같은 염색체외 요소 상에서 상기 세포에 존재할 수 있지만, 상기 돌연변이가 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체 상에 위치하는 aveC 대립 유전자에 존재하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태로, 본 발명은 서열 번호: 2의 38번, 48번, 55번, 89번, 99번, 111번, 136번, 138번, 139번, 154번, 179번, 228번, 230번, 238번, 266번, 275번, 289번 또는 298번 아미노산 잔기에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환체를 갖는 AveC 유전자 산물을 암호화하는 aveC 대립 유전자의 돌연변이를 가지며, 야생형 aveC 대립 유전자를 발현하는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 비율과 상이한 아베르멕틴 유형 2:1 비율을 생산하는 세포를 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다.
본원에 기재된 스크리닝 분석의 주요한 목적은 발현이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산되는 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 변화하고, 더욱 특히 감소하는 aveC 유전자의 돌연변이된 대립 유전자를 확인하는 것이다. 바람직한 양태로, 본 발명의 돌연변이된 aveC 대립 유전자, 또는 그의 축퇴성 변이체를 발현하는 본 발명의 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 B2:B1 아베르멕틴의 비율은 약 1.6:1 이하이다. 더욱 바람직한 양태로, 이 비율은 약 1:1 이하이다. 더욱 바람직한 양태로, 이 비율은 약 0.84:1 이하이다. 더욱 바람직한 양태로, 상기 비율은 약 0.80:1 이하이다. 더욱 바람직한 양태로, 이 비율은 약 0.75:1 이하이다. 더욱 바람직한 양태로, 이 비율은 약 0.73:1 이하이다. 더욱 바람직한 양태로, 상기 비율은 약 0.68:1 이하이다. 훨씬 더욱 바람직한 양태로, 상기 비율은 약 0.67:1 이하이다. 더욱 바람직한 양태로, 이 비율은 약 0.57:1 이하이다. 훨씬 더욱 바람직한 양태로, 상기 비율은 약 0.53:1 이하이다. 훨씬 더욱 바람직한 양태로, 상기 비율은 약 0.42:1 이하이다. 훨씬 더욱 바람직한 양태로, 상기 비율은 0.40:1 이하이다.
하기 기재된 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 1.6:1 미만의 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.94:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 추가의 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.88:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.84:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.75:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.73:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.68:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.67:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.57:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.53:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.42:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기재된 훨씬 더욱 다른 특이적인 양태로, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.40:1 비율로 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴을 생산한다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 야생형 aveC 대립 유전자 대신에 또는 그 외에 또 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 그의 축퇴성 변이체, 또는 aveC 대립 유전자 또는 그의 축퇴성 변이체를 포함하는 유전자 구성을 발현하며, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포와 비교하여 변화된 아베르멕틴의 양을 생산하는 세포를 포함하는, 신규한 동일한 균주를 제공한다. 바람직한 양태로, 상기 신규한 균주는 증가되는 아베르멕틴의 양을 생산한다. 제한되지 않는 양태로, 상기 유전자의 구성은 aveC ORF로부터 상류에 위치하고, 그와 효과적으로 관련하는 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한 강한 항구성 ermE 촉진자와 같은 강한 촉진자를 추가로 포함한다.
추가의 바람직한 양태로, 본 발명은 aveC 유전자가 불활성화된 세포를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제공한다. 이러한 균주는 야생형 균주와 비교하여 이들이 생산하는 상이한 아베르멕틴의 스펙트럼, 및 aveC 유전자의 표적 또는 무작위 돌연변이 유발이 아베르멕틴 생산에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 본원에 개시된 보충 스크리닝 분석 둘 모두에 유용하다. 하기 기재된 특이적인 양태로, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 숙주 세포는 불활성화된 aveC 유전자를 포함하도록 유전공학적으로 제조되었다. 예를 들어, 하기 실시예에 기재되어 있는 균주 SE180-11은 ermE 저항성 유전자를 aveC 암호화 영역에 삽입함으로써 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC 유전자를 불활성화하도록 구성된 유전자 대치 플라스미드 pSE180(ATCC209605)(도 3)을 사용하여 생산되었다.
본 발명은 본 발명의 임의의 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된 재조합으로 발현된 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물, 및 이를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배지에서 배양하는 단계; 및 이 배양액으로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴을 생산하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 돌연변이된 aveC 대립 유전자를 발현하는 세포에 의해 배양액에서 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율은 감소된다. 상기 방법은 도라멕틴과 같은 상업적으로 값비싼 아베르멕틴을 생산하는데 증가된 효율을 제공한다.
본 발명은 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하지 않고 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산되는 변화된 아베르멕틴의 양을 생산하는 결과를 야기하는 aveC 대립 유전자를 포함하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 유전자 구성을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배지에서 배양하는 단계; 및 이 배양액으로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴을 생산하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 양태로, 돌연변이된 aveC 대립 유전자, 축퇴성 변이체 또는 유전자 구성을 발현하는 세포에 의해 배양액에서 생산되는 아베르멕틴의 양은 증가된다.
본 발명은 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포와 비교하여 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 축퇴성 변이체를 발현하는 동일한 균주의 세포에 의해 생산되는 아베르멕틴의 유형 2:1 비율을 감소하는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된 aveC 대립 유전자 또는 그의 축퇴성 변이체를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주에 의해 생산되며, 야생형 aveC 대립 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주의 세포에 의해 생산된 아베르멕틴의 유형 2:1 비율과 비교하여, 감소된 유형 2:1 비율로 생산된 아베르멕틴의 신규한 조성물을 추가로 제공한다. 이러한 신규한 아베르멕틴 조성물은 고갈된 발효 배양액에서 생산될 때 존재할 수 있거나, 그로부터 수확될 수 있다. 상기 신규한 아베르멕틴 조성물은 공지된 생화학적인 정제 기술, 예를 들어 황산암모늄 침전, 투석, 크기 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC 등에 의해 배양액으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제될 수 있다.
5.4. 아베르멕틴의 용도
아베르멕틴은 구충제, 체외기생충제, 살충제 및 진드기 살충제로서의 특정 용도를 갖는 높은 활성 구충제이다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 임의의 상기 목적에 유용하다. 예를 들어, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 인간의 다양한 질환 또는 증상, 특히 당해 분야에서 알려진 바와 같이 기생충 감염에 의해 야기된 질환 또는 증상을 치료하는데 유용하다(예를 들어, 문헌[Ikeda and Omura, Chem. Rev., 97(7), 2591-2609, 1997] 참조). 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 인간, 가축, 돼지, 양, 가금, 말 또는 소를 감염시킬 수 있는 선충과 같은 내부 기생충에 의해 야기된 다양한 질환 또는 증상을 치료하는데 효과적이다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 다양한 종의 동물을 감염시키는 선충 뿐만 아니라 인간을 감염시키는 선충에 대하여 효과적이다. 상기 선충에는 안실로스토마(Ancylostoma), 네카토(Necator), 회충(Ascaris), 스트롱질로이디즈(Strongyloides), 트리키넬라(Trichinella), 모두충(Capillaria), 편충(Trichuris), 요충(Enterobius), 디로필라리아(Dirofilaria)와 같은 위장관내 기생충, 및 혈액 또는 다른 조직이나 기관에서 발견되는 기생충, 예를 들어 사상충 벌레, 및 스트롱질로이디즈 및 트리키넬라의 추출 내장 상태가 포함된다.
또한, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 체외기생충 감염, 예를 들어 그 중에서도 소 및 말에 영향을 줄 수 있는 참진드기, 좀진드기, 이, 벼룩, 검정파리, 무는 곤충, 또는 유주성 쌍시류의 유충에 의해 발생하는, 포유동물 및 조류의 절지동물 만연을 치료하는데 유용하다.
또한, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은, 예를 들어 그 중에서도 바퀴벌레, 옷좀나방, 카페트 딱정벌레 및 집파리와 같은 집의 해충 뿐만 아니라, 그 중에서도 거미 진드기, 진딧물, 모충 및 직시류 곤충(예를 들어, 메뚜기)을 포함하는 저장된 곡물 및 농작물의 곤충 해충에 대해서도 살충제로서 유용하다.
본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물로 치료될 수 있는 동물에는 양, 소, 말, 사슴, 염소, 돼지, 가금을 비롯한 조류, 개 및 고양이가 포함된다.
본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 의도된 특정 용도, 치료할 숙주 동물의 특정한 종, 치료할 기생충 또는 곤충의 종류에 따라 적절한 제형으로 투여된다. 구충제로서 사용하기 위해, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 캡슐, 환약, 정제 또는 액체 물약의 형태로 경구적으로 투여되거나, 또는 쏟아 부어 피부에 바르거나, 주사하거나 또는 이식편으로서 투여될 수 있다. 이러한 제형은 표준 수의학 실시에 따라서 통상적인 방법으로 제조된다. 따라서, 캡슐, 환약 또는 정제는 활성 성분을 붕해제 및/또는 결합제(예를 들어, 전분, 락토스, 활석, 스테아르산 마그네슘 등)를 추가로 포함하는 적절하게 미분된 희석제 또는 담체와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 용액 제형은 활성 성분을 분산제 또는 습윤제 등과 함께 수용액 중에 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 주사가능한 제형은 혈액과 등장인 용액을 제조하는 충분한 염 및/또는 글루코스 등과 같은 기타 물질을 포함할 수 있는 멸균 용액의 형태로 제조할 수 있다.
상기 제형은 환자 또는 치료할 숙주 동물의 종, 감염의 심각성 및 유형, 및 숙주의 체중에 따라 활성 성분의 중량과 관련하여 다양할 것이다. 일반적으로 경구 투여를 위해서는 환자 또는 동물 체중 1kg당 약 0.001 내지 10㎎의 활성 성분의 투여량으로 1일 내지 5일 동안 1회로 또는 분할하여 투여하는 것이 만족스러운 결과를 나타낼 것이다. 그러나, 임상적인 증상에 기초하여, 예를 들어 의사 또는 수의사 등에 의해 결정된 바와 같이, 그보다 더 많거나 더 적은 투여량 범위를 나타내는 물질일 수 있다.
또 다르게는, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 동물 사료와 혼합하여 투여될 수 있으며, 이를 위해 농축된 사료 첨가물 또는 예비 혼합물(premix)를 일반적인 동물 사료와 혼합하기 위해 제조할 수 있다.
살충제로서, 및 농작물의 해충을 처리할 목적으로 사용하기 위해, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 표준 농업학적 실시에 따라서 분무액, 분진, 유화액 등으로 적용될 수 있다.
실시예 1
스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 발효 및 B2:B1 아베르멕틴 분석
분지쇄 2-옥소산 데하이드로게나제 및 5-O-메틸트랜스퍼라제 활성이 모두 결손된 균주는 발효 배지에 지방산을 보충하지 않을 경우 아베르멕틴을 생산하지 않는다. 상기 실시예는 이러한 돌연변이주에서 다양한 지방산의 존재하에 생합성을 개시하였을 때 광범위한 아베르멕틴의 B2:B1 비율로 수득될 수 있음을 나타낸다.
6.1. 물질 및 방법
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 53692를 전분(나덱스, 레잉 내셔널(Nadex, Laing National)) 20g; 파마메디아(Pharmamedia)(미국 테네시주 멤피스 소재의 트레이더스 프로테인(Trader's Protein)) 15g, 아르다민(Ardamine) pH(이스트 프로덕츠 인코포레이티드(Yeast Products Inc.)) 5g, 및 탄산칼슘 1g으로 구성된 종 배지에서 제조된 전체 배양액으로서 -70℃에서 저장하였다. 최종 부피를 수돗물로 1ℓ로 조정하고, pH를 7.2로 조정한 후, 배지를 25분동안 121℃에서 오토클레이브(autoclave)하였다.
상기 제조물을 해동시킨 현탁액 2㎖를 사용하여 50㎖의 동일 배지가 포함된 플라스크에 접종하였다. 회전식 진탕기에서 180 rpm으로 28℃에서 48시간 동안 배양한 후에, 배양액 2㎖를 사용하여 전분 80g, 탄산칼슘 7g, 파마메디아 5g, 인산수소이칼륨 1g, 황산마그네슘 1g, 글루탐산 0.6g, 황산철(II) 7수화물 0.01g, 황산아연 0.001g, 및 황산망간 0.001g으로 구성된 생산용 배지 50㎖를 포함하는 플라스크에 접종하였다. 최종 부피를 수돗물로 1ℓ로 조정하고, pH를 7.2로 조정한 후, 배지를 25분동안 121℃에서 오토클레이브하였다.
다양한 카복실산 기질(하기 표 1을 참조)을 메탄올 중에 용해하고, 접종 24시간 후에 발효 배양액에 0.2 g/ℓ의 최종 농도로 첨가하였다. 발효 배양액을 28℃에서 14일동안 배양한 후에, 이 배양액을 원심 분리하고(2,500 rpm에서 2분간) 상청액을 버렸다. 균체 펠렛(pellet)을 아세톤(15㎖) 및 이어서 디클로메탄(30㎖)으로 추출하고, 유기 상을 분리하고 여과한 후, 증발하여 건조시켰다. 잔류물을 메탄올(1㎖) 중에 용해하고, 240nm로 설정된 스캐닝 다이오드-어레이(scanning diode-array) 검출기가 장착된 휴렛-패커드(Hewlett-Packard) 1090A 액체 크로마토그래피를 갖는 HPLC로 분석하였다. 사용된 칼럼은 40℃로 유지된 벡크만 울트라스피어(Beckman Ultrasphere) C-18, 5㎛, 4.6㎜ ×25㎝ 칼럼이었다. 상기 메탄올 용액 25㎕를 칼럼에 주입하였다. 0.85 ㎖/분의 유속으로 40분에 걸쳐 80:20에서 95:5까지 메탄올-물의 직선 구배로 용출하였다. 사이클로헥실 B1의 2가지 표준 농도를 사용하여 검출기 반응을 보정하였고, B2 및 B1 아베르멕틴 곡선 아래의 면적을 측정하였다.
6.2. 결과
B2 및 B1 아베르멕틴에 대해서 관찰된 HPLC 체류 시간, 및 이들 아베르멕틴 2:1의 비율은 하기 표 1에 나타나 있다.
HPLC 체류 시간(분) 비율
기질 B2 B1 B2:B1
4-테트라하이드로피란 카복실산 8.1 14.5 0.25
이소부티르산 10.8 18.9 0.5
3-푸르산 7.6 14.6 0.62
S-(+)-2-메틸부티르산 12.8 21.6 1.0
사이클로헥산 카복실산 16.9 26.0 1.6
3-티오펜 카복실산 8.8 16.0 1.8
사이클로펜탄 카복실산 14.2 23.0 2.0
3-트리플루오로메틸부티르산 10.9 18.8 3.9
2-메틸펜탄산 14.5 24.9 4.2
사이클로헵탄 카복실산 18.6 29.0 15.0
표 1에 존재하는 데이타는 B2:B1 아베르멕틴 산물 비율이 매우 광범위함을 나타내는데, 이는 유형 2의 화합물의 유형 1의 화합물로의 탈수적 전환 결과가 제공된 지방산 측쇄 개시제 단위의 성질에 따라 상당히 차이가 있음을 나타낸다. 이는 AveC 단백질의 변형에 기인한 B2:B1 비율의 변화가 특정 기질에 특이적일 수 있음을 의미한다. 결과적으로, 특정 기질로 수득된 B2:B1 비율의 변화를 나타내는 돌연변이주에 대한 스크리닝은 상기 기질의 존재하에 행해질 필요가 있다. 하기 기재된 이후의 실시예에서는 스크리닝 기질로서 사이클로헥산 카복실산을 사용한다. 그러나, 상기 기질을 단순히 가능성을 예시하기 위해 사용할 뿐이지 본 발명의 응용성을 제한하지는 않는다.
실시예 2
aveC 유전자의 단리
이 실시예에서는 AveC 유전자 산물을 암호화하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체 영역의 단리 및 특징을 기술한다. 하기에 기술한 바와 같이, aveC 유전자는 생산되는 아베르멕틴의 사이클로헥실-B2:사이클로헥실-B1(B2:B1)의 비율을 변화시킬 수 있음이 확인되었다.
7.1. 물질 및 방법
7.1.1. DNA 단리를 위한 스트렙토마이세스의 배양
하기 방법은 스트렙토마이세스를 배양하기 위해 수반되었다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 31272의 단일 콜로니(단일 콜로니 단리물 #2)를 디프코(Difco) 효모 추출물 5g, 디프코 박토(Bacto)-펩톤 5g, 덱스트로스 2.5g, MOPS 5g 및 디프코 박토-아가 15g을 포함하는 1/2 농도 YPD-6에서 단리하였다. 최종 부피를 증류수로 1ℓ로 조정하고, pH를 7.0으로 조정한 후, 배지를 25분동안 121℃에서 오토클레이브하였다.
상기 배지에서 생육시킨 균체를 사용하여 48 내지 72시간동안 28℃에서 진탕하면서(300 rpm) 유지된 25㎜ ×150㎜의 튜브(tube) 내의 TSB 배지(121℃에서 25분동안 오토클레이브한 1ℓ의 증류수 중의 디프코 트립신 분해된 대두 배양물 30g) 10㎖에 접종하였다.
7.1.2. 스트렙토마이세스로부터 염색체 DNA 단리
상기 기재된 바와 같이 생육시킨 균체의 분취량(0.25㎖ 또는 0.5㎖)을 1.5㎖의 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고, 세포를 12,000 ×g에서 60초동안 원심 분리하여 농축하였다. 상청액을 버리고, 세포를 2 ㎎/㎖의 라이소자임을 포함하는 0.25㎖의 TSE 완충액(1.5M 수크로스 20㎖, 1M Tris-HCl 2.5㎖, pH 8.0, 1M EDTA 2.5㎖, pH 8.0 및 증류수 75㎖) 중에 재현탁하였다. 샘플을 진탕하면서 20분동안 37℃에서 배양한 후, 오토젠 540(AutoGen 540, 등록상표) 자동화 핵산 단리 장치(미국 매사츄세츠주 내틱 소재의 인테그레이티드 세퍼레이션 시스템즈(Integrated Separation Systems))에 충진하여 게놈 DNA를 제조 회사의 지시에 따라 사이클(Cycle) 159(장치 소프트웨어)를 사용하여 단리하였다.
또는, 5㎖의 균체를 17㎜ ×100㎜의 튜브에 넣고, 세포를 3,000 rpm에서 5분동안 원심 분리하여 농축한 후, 상청액을 제거하였다. 세포를 1㎖의 TSE 완충액에 재현탁하고, 3,000 rpm에서 5분동안 원심 분리하여 농축한 후, 상청액을 제거하였다. 세포를 2 ㎎/㎖의 라이소자임을 포함하는 TSE 완충액 1㎖에 재현탁하고, 30 내지 60분간 진탕하면서 37℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 후에, 10% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 0.5㎖를 첨가하고 세포가 완전히 용해될 때까지 37℃에서 항온 처리하였다. 용해물을 65℃에서 10분동안 항온 처리하고, 실온으로 냉각한 후, 2개의 1.5㎖ 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 나누어 넣고, 0.5㎖의 페놀/클로로포름(0.5M Tris, pH 8.0으로 미리 평형시킨 50% 페놀; 50% 클로로포름)으로 1회 추출하였다. 수성 상을 제거하고 클로로포름:이소아밀 알콜(24:1)로 2 내지 5회 추출하였다. 상기 DNA를 3M 아세트산나트륨(pH 4.8)을 1/10 부피로 첨가하여 침전하고, 혼합물을 얼음상에서 10분동안 항온 처리한 후, 15,000 rpm으로 5℃에서 10분동안 원심 분리하고 상청액을 제거하여 비워진 튜브에 1 부피의 이소프로판올을 첨가하였다. 이어서, 상청액과 이소프로판올 혼합물을 20분동안 얼음상에서 항온 처리하고, 15,000 rpm으로 5℃에서 20분동안 원심 분리한 후, 상청액을 제거하고 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 1회 세척하였다. 이 펠렛을 건조시킨 후에, DNA를 TE 완충액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)에 재현탁하였다.
7.1.3. 스트렙토마이세스로부터 플라스미드 DNA의 단리
균체의 분취량(1.0㎖)을 1.5㎖ 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 세포를 12,000 ×g에서 60초동안 원심 분리하여 농축하였다. 상청액을 버리고, 세포를 10.3% 수크로스 1.0㎖에 재현탁한 후, 12,000 ×g에서 60초동안 원심 분리하여 농축하고 상청액을 버렸다. 그 다음, 세포를 2 ㎎/㎖의 라이소자임을 포함하는 TSE 완충액 0.25㎖에 재현탁하고, 진탕하면서 37℃에서 20분동안 항온 처리한 후, 오토젠 540 자동화 핵산 분리 장치에 충진하였다. 플라스미드 DNA를 제조 회사의 지시에 따라 사이클 106(장치 소프트웨어)을 사용하여 단리하였다.
또 다르게는, 균체 1.5㎖를 1.5㎖ 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고, 세포를 12,000 ×g에서 60초동안 원심 분리하여 농축하였다. 상청액을 버리고, 세포를 10.3% 수크로스 1.0㎖에 재현탁한 후, 12,000 ×g에서 60초동안 원심 분리하여 농축하고 상청액을 버렸다. 세포를 2 ㎎/㎖의 라이소자임을 포함하는 TSE 완충액 0.5㎖에 재현탁하고, 37℃에서 15 내지 30분동안 항온 처리하였다. 항온 처리가 끝난 후에, 알칼리 SDS(0.3N NaOH, 2% SDS) 0.25㎖를 첨가하고, 세포를 55℃에서 15 내지 30분동안 또는 용액이 맑아질 때까지 항온 처리하였다. 아세트산나트륨(0.1㎖, 3M, pH 4.8)을 상기 DNA 용액에 첨가한 후, 10분동안 얼음상에서 항온 처리하였다. 상기 DNA 샘플을 14,000 prm으로 5℃에서 10분동안 원심 분리하였다. 상청액을 제거하여 비워진 튜브에 0.2㎖의 페놀:클로로포름(50% 페놀; 50% 클로로포름)을 첨가하고 서서히 혼합하였다. DNA 용액을 14,000 rpm으로 5℃에서 10분동안 원심 분리하고, 상층을 제거하여 에펜도르프 튜브를 비웠다. 이소프로판올(0.75㎖)을 첨가하고, 용액을 서서히 혼합한 후 실온에서 20분동안 항온 처리하였다. 상기 DNA 용액을 14,000 rpm으로 5℃에서 15분동안 원심 분리한 후, 상청액을 제거하고 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 후에, TE 완충액에 재현탁하였다.
7.1.4. 에스케리키아 콜라이로부터 플라스미드 DNA의 단리
형질전환된 에스케리키아 콜라이 단일 콜로니를 5㎖의 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지(1ℓ의 증류수 중의 박토-트립톤 10g, 박토-효모 추출물 5g 및 NaCl 10g을 121℃에서 25분동안 오토클레이브하고, 100 ㎍/㎖의 암피실린으로 보충함)에 접종하였다. 배양물을 밤새 배양하고, 1㎖의 분취량을 1.5㎖ 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣었다. 배양 샘플을 오토젠 540 자동화 핵산 분리 장치에 충진하고, 플라스미드 DNA를 제조 회사의 지시에 따라 사이클 3(장치 소프트웨어)을 사용하여 단리하였다.
7.1.5. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 원형질체의 제조 및 형질전환
스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 단일 콜로니를 1/2 농도 YPD-6에서 단리하였다. 상기 균체를 사용하여 25㎜ ×150㎜의 튜브 내의 TSB 배지 10㎖에 접종한 후, 진탕하면서(300 rpm) 28℃에서 48시간 동안 배양하였다. 1㎖의 균체를 사용하여 50㎖의 YEME 배지에 접종하였다. YEME 배지는 1ℓ당 디프코 효모 추출물 3g, 디프코 박토-펩톤 5g, 디프코 맥아 추출물 3g, 수크로스 300g을 포함한다. 121℃에서 25분동안 오토클레이브한 후에, 2.5M MgCl2·6H2O(별도로 121℃에서 25분동안 오토클레이브하였다) 2㎖ 및 글리신(20%)(필터-멸균됨) 25㎖를 첨가하였다.
상기 균체를 30℃에서 48 내지 72시간 동안 생육하여, 50㎖ 원심 분리기 튜브(팔콘(Falcon))에서 3,000 rpm으로 20분동안 원심 분리하여 수확하였다. 상청액을 버리고, 수크로스 205g, K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, H2O 600㎖, K2PO4(0.5%) 10㎖, 미량 원소 용액(미량 원소 용액은 1ℓ당 ZnCl2 40㎎, FeCl3·6H2O 200㎎, CuCl2·2H2O 10㎎, MnCl2·4H2O 10㎎, Na2B4 O7·10H2O 10㎎, (NH4)6Mo7O24·4H 2O 10㎎을 포함한다) 20㎖, CaCl2·2H2O(3.68%) 100㎖, 및 MES 완충액(1.0M, pH 6.5) 10㎖를 포함하는 P 완충액 중에 상기 균체를 재현탁하였다. pH를 6.5로 조정하고, 최종 부피를 1ℓ로 조정한 후, 배지를 0.45 ㎛ 필터를 통해 고온에서 여과하였다.
상기 균체를 3,000 rpm에서 20분동안 펠렛화하고, 상청액을 버린 후, 이 균체를 2 ㎎/㎖의 라이소자임을 포함하는 P 완충액 20㎖ 중에 재현탁하였다. 이 균체를 진탕하면서 15분동안 35℃에서 항온 처리하고, 현미경으로 관찰하여 원형질체가 형성된 정도를 측정하였다. 원형질체 형성이 완료될 경우, 이 원형질체를 8,000 rpm에서 10분동안 원심 분리하였다. 상청액을 제거하고 원형질체를 10㎖의 P 완충액 중에 재현탁하였다. 원형질체를 8,000 rpm에서 10분동안 원심 분리하고, 상청액을 제거한 후, 2㎖의 P 완충액에 재현탁하여 약 1 ×109개의 원형질체를 2.0㎖의 극저온용 바이알(vial)에 분배하였다.
1 ×109개의 원형질체를 포함하는 바이알을 8,000 rpm에서 10분동안 원심 분리하고, 상청액을 버린 후, 원형질체를 0.1㎖의 P 완충액에 재현탁하였다. 형질전환할 DNA 2 내지 5㎍을 상기 원형질체에 첨가한 후에, 곧바로 0.5㎖의 반응 T 완충액을 첨가하였다. T 완충액 기본 용액은 PEG-1000(시그마(Sigma)) 25g, 수크로스 2.5g 및 H2O 83㎖를 포함한다. pH를 1N NaOH(필터-멸균됨)로 8.8로 조정하고, T 완충액 기본 용액을 필터-멸균한 후, 4℃에서 저장하였다. 반응 T 완충액은 동일자로 제조하여 사용하며, T 완충액 기본 용액 8.3㎖, 4mM K2PO4 1.0㎖, 5M CaCl2 ·2H2O 0.2㎖ 및 1M TES(pH 8) 0.5㎖를 포함한다. 반응 T 완충액의 각 성분은 별도로 필터-멸균되었다.
원형질체에 T 완충액을 첨가하고 20초 이내에, P 완충액 1.0㎖를 또한 첨가한 후, 원형질체를 8,000 rpm에서 10분동안 원심 분리하였다. 상청액을 버리고, 원형질체를 P 완충액 0.1㎖에 재현탁하였다. 그 다음, 원형질체를 수크로스 205g, K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 10.12g, 글루코스 10g, 디프코 카스아미노산 0.1g, 디프코-효모 추출물 5g, 디프코-오트밀 아가 3g, 디프코-박토 아가 22g, 및 증류수 800㎖를 포함하는 RM14 배지 상에 도말하였다. 이 용액을 121℃에서 25분동안 오토클레이브하였다. 오토클레이브한 후에, 0.5% K2PO4 10㎖, 5M CaCl2·2H 2O 5㎖, 20% L-프롤린 15㎖, 1.0M MES 완충액(pH 6.5) 10㎖, 미량 원소 용액(상기한 바와 동일) 2㎖, 사이클로헥스이미드 스톡(stock)(25 ㎎/㎖) 40㎖ 및 1N NaOH 2㎖의 멸균 스톡을 첨가하였다. 플레이트(plate) 당 25㎖의 RM14 배지를 나누고, 이 플레이트를 사용하기 전에 24시간 동안 건조시켰다.
원형질체를 95% 습도 및 30℃에서 20 내지 24시간동안 배양하였다. 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 선택하기 위해, 125 ㎍/㎖의 티오스트렙톤을 포함하는 오버레이(overlay) 완충액 1㎖를 RM14 재생 플레이트 상에 균일하게 도포하였다. 오버fp이 완충액은 100㎖ 당 수크로스 10.3g, 미량 원소 용액(상기한 바와 동일) 0.2㎖ 및 1M MES(pH 6.5) 1㎖를 포함한다. 상기 원형질체를 티오스트렙톤 저항성(Thio, 등록상표) 콜로니가 발견될 때까지 7 내지 14일 동안 95% 습도 및 30℃에서 배양하였다.
7.1.6. 스트렙토마이세스 리비단스( Streptomyces lividans ) 원형질체의 형질전환
스트렙토마이세스 리비단스 TK64(영국 노르위치 소재의 존 인즈 인스티튜트(John Innes Institute)에서 제공)를 일부 경우에서 형질전환을 위해 사용하였다. 스트렙토마이세스 리비단스의 배양, 원형질체화 및 형질전환을 위한 방법 및 조성물은 문헌[Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985]에 기재되어 있으며, 상기 문헌에 기재된 바와 같이 실행하였다. 플라스미드 DNA는 상기 실시예 7.1.3.에 기재된 바와 같이 스트렙토마이세스 리비단스 형질전환체로부터 단리하였다.
7.1.7. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 발효 분석
1/2 농도의 YPD-6 상에서 4 내지 7일동안 생육시킨 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균체를 미리 제조된 배지 8㎖ 및 2개의 5㎜ 유리 비드를 포함하는 1 ×6인치의 튜브에 접종하였다. 미리 제조된 배지에는 가용성 전분(약하게 비등된 전분, 또는 KOSO(일본 나고야 소재의 재팬 콘 스타치 캄파니(Japan Corn Starch Co.))) 20 g/ℓ; 파마메디아 15 g/ℓ; 아르다민 pH(미국 뉴저지주 클리프톤 소재의 참플레인 인더스트리(Champlain Ind.)) 5 g/ℓ; CaCO3 2 g/ℓ; 및 2(+/-)-메틸부티르산 50 ppm, 이소부티르산 60 ppm 및 이소발레르산 20 ppm의 배지에서 최종 농도를 포함하는 2x bcfa("bcfa"란 분지쇄 지방산을 지칭한다)를 포함한다. pH를 7.2로 조정하고 배지를 121℃에서 25분동안 오토클레이브하였다.
튜브를 각도 17°로 하여 215 rpm으로 29℃에서 3일동안 진탕하였다. 종 배양액 2㎖ 분취량을 사용하여 전분(약하게 비등된 전분 또는 KOSO) 160 g/ℓ, 누트리소이(Nutrisoy)(미국 일리노이주 데카투르 소재의 아쳐 다이엘즈 미들랜드(Archer Daniels Midland)) 10 g/ℓ, 아르다민 pH 10 g/ℓ, K2HPO4 2 g/ℓ, MgSO4·4H2O 2 g/ℓ, FeSO4·7H2O 0.02 g/ℓ, MnCl2 0.002 g/ℓ, ZnSO4·7H2O 0.002 g/ℓ, CaCO3 14 g/ℓ, 2x bcfa(상기 정의한 바와 동일) 및 사이클로헥산 카복실산(CHC)(pH 7.0에서 20% 용액으로 제조) 800 ppm을 포함하는 생산용 배지 25㎖를 포함하는 300㎖ 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에 접종하였다. pH를 6.9로 조정하고, 배지를 121℃에서 25분동안 오토클레이브하였다.
접종한 후에, 플라스크를 200 rpm으로 진탕하면서 29℃에서 12일동안 배양하였다. 배양한 후에, 2㎖의 샘플을 플라스크로부터 회수하고, 8㎖의 메탄올로 희석하고 혼합한 후에, 이 혼합물을 1,250 ×g에서 10분동안 원심 분리하여 나머지 부분을 펠렛화하였다. 그 다음, 상청액을 벡크만 울트라스피어 ODS 칼럼(25㎝ ×4.6㎜ 내경)을 사용하여, 0.75 ㎖/분의 유속으로 HPLC 분석을 하여, 240nm에서 흡광도 측정하였다. 이동 상은 86/8.9/5.1의 메탄올/물/아세토니트릴이었다.
7.1.8. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 PKS 유전자의 단리
스트렙토마이세스 아베르미틸리스(ATCC 31272, SC-2) 염색체 DNA의 코스미드 총합체를 제조하고, 사카로폴리스포라 에리트래아 폴리케티드 합성 효소(PKS) 유전자의 단편으로부터 제조된 케토신타제(KS) 탐침과 혼성화하였다. 코스미드 총합체의 제조 방법에 대한 상세한 설명은 삼부룩(Sambrook) 등의 상기 문헌에서 발견될 수 있다. 스트렙토마이세스의 염색체 DNA 총합체의 제조 방법에 대한 상세한 설명은 홉우드(Hopwood) 등의 상기 문헌에 제시되어 있다. 케토신타제-혼성화 영역을 포함하는 코스미드 클론은 pEX26(영국 캠브리지의 닥터 피. 리들레이(P. Leadlay)에 친절하게 제공)으로부터의 2.7Kb NdeI/Eco47III 단편에 혼성화됨으로써 확인되었다. 약 5ng의 pEX26을 NdeI 및 Eco47III로 분해하였다. 반응 혼합물을 0.8% 시플라크(SeaPlaque) GTG 아가로스 겔(미국 메인주 로클랜드 소재의 FMC 바이오프로덕츠(BioProducts))상에 충진하였다. 전기 영동 후에 2.7Kb의 NdeI/Eco47III 단편을 상기 겔로부터 절제해내고, 패스트(Fast) 프로토콜을 사용하는 에피센터 테크놀로지스(Epicentre Technologies)로부터 구입한 겔라제(GELase, 상표)를 사용하여 상기 겔로부터 DNA를 회수하였다. 2.7Kb NdeI/Eco47III 단편을 BRL 닉 트랜슬레이션 시스템(Nick Translation System)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 비알엘 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(BRL Life Technologies, Inc.))을 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 [α-32P]dCTP(데옥시사이티딘 5'-트리포스페이트, 테트라(트리에틸암모늄) 염, [α-32P]-)(미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 NEN-듀퐁(Dupont))로 표지 되었다. 전형적인 반응은 0.05㎖의 부피로 수행된다. 5㎕의 종결 완충액을 첨가한 후에, 표지된 DNA를 G-25 세파덱스 퀵 스핀(Sephadex Quick Spin, 상표) 칼럼(베링거 만하임(Boehringer Mannheim))을 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 혼입되지 않은 뉴클레오타이드로부터 분리하였다.
약 1,800개의 코스미드 클론을 콜로니 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 사카로폴리스포라 에리트래아 KS 탐침에 강하게 혼성화되는 10개의 클론을 확인하였다. 코스미드 DNA를 포함하는 에스케리키아 콜라이 콜로니를 LB 액체 배지에서 생육하고, 각 배양물로부터 코스미드 DNA를 오토젠 540 자동화 핵산 단리 장치에서 제조 회사의 지시에 따라 사이클 3(장치 소프트웨어)을 사용하여 단리하였다. 제한 엔도뉴클레아제 지도 및 서던 블롯 혼성화 분석을 행한 결과, 5개의 클론이 중첩된 염색체 영역을 포함함을 알 수 있었다. 5개의 코스미드(즉, pSE65, pSE66, pSE67, PSE68 및 pSE69)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 게놈 BamHI 제한 지도는 코스미드의 중첩 분석 및 혼성화 분석으로 구성하였다(도 4).
7.1.9. 아베르멕틴 B2:B1의 비율을 조절하는 DNA의 확인 및 aveC ORF의 확인
하기 방법을 사용하여 pSE66 코스미드 클론으로부터 유래한 서브클로닝(subcloning)된 단편이 AveC 돌연변이주에서 아베르멕틴 B2:B1의 비율을 조절하는 능력을 시험하였다. pSE66(5㎍)을 SacI 및 BamHI로 분해하였다. 이 반응 혼합물을 0.8% 시플라크 GTG 아가로스 겔(FMC 바이오프로덕츠)상에 충진하고, 전기 영동 후에 2.9Kb의 SacI/BamHI 단편을 상기 겔로부터 절제해낸 후, 패스트 프로토콜을 사용하는 겔라제(에피센터 테크놀로지스)를 사용하여 상기 겔로부터 DNA를 회수하였다. 약 5㎍의 셔틀 벡터 pWHM3(문헌[Vara et al., J. Bacteriol., 171, 5872-5881, 1989] 참조)을 SacI 및 BamHI로 분해하였다. 2.9Kb의 삽입물 약 0.5㎍ 및 분해된 pWHM3 0.5㎍을 함께 혼합하고, 총 20㎕의 부피로 1 유니트(unit)의 리가제(미국 매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.))를 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 15℃에서 밤새 항온 처리하였다. 항온 처리한 후에, 연결 혼합물 5㎕를 70℃에서 10분동안 항온 처리하고, 실온으로 냉각한 후, 이를 사용하여 콤피텐트(competent) 에스케리키아 콜라이 DH5α세포(BRL)를 제조 회사의 지시에 따라 형질전환하는데 사용하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 2.9Kb SacI/BamHI 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 pSE119라고 명명하였다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38(화이자(Pfizer) 사내 균주)의 원형질체를 제조하고, 상기 단락 7.1.5.에 기재된 바와 같이 pSE119로 형질전환하였다. 균주 1100-SC38은 사이클로헥산 카복실산으로 보충될 경우 아베르멕틴 사이클로헥실 B1 형태와 비교하여 아베르멕틴 사이클로헥실 B2 형태를 더 많이 생산하는 돌연변이주이다(B2:B1의 비율 약 30:1). 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 원형질체를 형질전환하기 위해 사용된 pSE119는 에스케리키아 콜라이 균주 GM2163(미국 예일(Yale) 대학 에스케리키아 콜라이 제네틱 스톡 센터(Genetic Stock Center) 소장인 닥터 비. 제이. 바흐만(B.J. Bachmann)으로부터 수득), 에스케리키아 콜라이 균주 DM1(BRL) 또는 스트렙토마이세스 리비단스 균주 TK64로부터 단리하였다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC 분석에 의해 분석하였다. pSE119를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 형질전환체는 약 3.7:1의 아베르멕틴 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 변화된 비율을 생산하였다(하기 표 2 참조).
pSE119가 AveC 돌연변이주에서 아베르멕틴 B2:B1 비율을 조절할 수 있음이 입증됨에 따라, 삽입된 DNA의 서열을 분석하였다. 약 10㎍의 pSE119를 플라스미드 DNA 단리 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아진(Qiagen))를 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 단리하고, ABI 373A 자동화 DNA 서열 분석기(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 서열을 분석하였다. 서열 데이타를 조합하고, 제네틱 컴퓨터 그룹(Genetic Computer Group) 프로그램(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 GCG)을 사용하여 편집하였다. DNA 서열 및 aveC ORF를 도 1(서열 번호: 1)에 도시하였다.
pSE118이라고 명명한 새로운 플라스미드를 하기와 같이 구성하였다. 약 5㎍의 pSE66을 SphI 및 BamHI로 분해하였다. 이 반응 혼합물을 0.8% 시플라크 GTG 아가로스 겔(FMC 바이오프로덕츠) 상에 충진하고, 전기 영동 후에 2.8Kb의 SphI/BamHI 단편을 상기 겔로부터 절제해낸 후, 패스트 프로토콜을 사용한 겔라제(에피센터 테크놀로지스)를 사용하여 상기 겔로부터 DNA를 회수하였다. 약 5㎍의 셔틀 벡터 pWHM3을 SphI 및 BamHI로 분해하였다. 2.8Kb 삽입물 약 0.5㎍ 및 분해된 pWHM3 0.5㎍을 함께 혼합하고, 총 20㎕의 부피로 1 유니트의 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 15℃에서 밤새 항온 처리하였다. 항온 처리한 후에, 연결 혼합물 5㎕를 70℃에서 10분동안 항온 처리하고, 실온으로 냉각한 후, 콤피덴트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포를 제조 회사의 지시에 따라 형질전환하는데 사용하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 2.8Kb SphI/BamHI 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 pSE118라고 명명하였다. pSE118 및 pSE119의 삽입 DNA는 약 838개의 뉴클레오타이드로 중첩되었다(도 4 참조).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 원형질체를 상기한 바와 같이 pSE118로 형질전환하였다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC 분석에 의해 분석하였다. pSE118을 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 형질전환체는 균주 1100-SC38과 비교하여 아베르멕틴 사이클로헥실 B2:아베르멕틴 사이클로헥실 B1의 비율을 변화하지 않았다(하기 표 2 참조).
7.1.10. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체 DNA로부터 aveC 유전자의 PCR 증폭
aveC ORF를 포함하는 약 1.2Kb 단편을 상기에서 수득된 aveC 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체 DNA로부터 단리하였다. PCR 프라이머는 미국 텍사스 소재의 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies, Inc.)에서 구입하였다. 우측 방향 프라이머는 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3'(서열 번호: 6)이고, 좌측 방향 프라이머는 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3'(서열 번호: 7)이었다. 상기 PCR 반응은 제조 회사에서 제공된 완충액 내에서 딥 벤트(Deep Vent, 상표) 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여, 최종 부피 100㎕로 300μM dNTP, 10% 글리세롤, 각 프라이머 200 pmol, 주형 0.1 ㎍ 및 2.5 유니트의 효소의 존재하에 퍼킨-엘머 세투스 써멀 사이클러(Cetus thermal cycler)를 사용하여 수행하였다. 제 1 주기의 열 프로파일은 5분동안 95℃(변성 단계), 2분동안 60℃(어닐링(annealing) 단계) 및 2분동안 72℃(연신 단계)이었다. 이후의 24 주기는 변성 단계를 45초로 단축하고 어닐링 단계를 1분으로 단축한 이외에는 유사한 열 프로파일을 가졌다.
PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기 영동하고, 약 1.2Kb의 단일 DNA 밴드를 검출하였다. 상기 DNA를 겔로부터 정제하고, 25ng의 선형화된 블런트 pCR-블런트 벡터(인비트로겐)에 제조 회사의 지시에 따라 1:10의 벡터:삽입물의 몰비로 연결하였다. 상기 연결 혼합물을 사용하여, 원 샷(One Shot, 상표) 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 세포(인비트로겐)를 제조 회사의 지시에 따라 형질전환하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 약 1.2Kb의 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 pSE179라고 명명하였다.
pSE179로부터 유래한 삽입 DNA를 BamHI/XbaI으로 분해하여 단리하고, 전기 영동하여 분리한 후, 겔로부터 정제하고, 총 1㎍의 DNA 농도에서, 또한 BamHI/XbaI로 분해된 셔틀 벡터 pWHM3와 1:5의 벡터:삽입물의 몰비로 연결하였다. 이 연결 혼합물을 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포를 형질전환하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 약 1.2Kb의 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE186(도 2, ATCC 209604)으로 명명된 상기 플라스미드로 에스케리키아 콜라이 DM1을 형질전환하여, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다.
7.2. 결과
pSE119로부터 유래한 2.9Kb의 SacI/BamHI 단편은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38을 형질전환하였을 때 B2:B1 아베르멕틴 생산의 비율을 상당히 변화하였음이 확인되었다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38은 통상적으로 약 30:1의 B2:B1 비율을 갖지만, 2.9Kb의 SacI/BamH1 단편을 포함하는 벡터로 형질전환될 경우에 약 3.7:1로 감소된 B2:B1 아베르멕틴의 비율을 갖는다. 형질전환된 배양액을 발효 후 분석한 결과 형질전환하는 DNA의 존재가 확인되었다.
2.9Kb의 pSE119 단편의 서열을 분석하고, 약 0.9Kb의 ORF(도 1, 서열 번호: 1)를 확인하였는데, 상기 ORF는 단지 B2 산물만을 생산하도록 다른 위치에서 미리 돌연변이된 PstI/SphI 단편을 포함한다(이케다 등의 상기 문헌 참조). 상기 ORF 또는 그의 상응하는 추론된 폴리펩타이드를 공지된 데이터 베이스(GenEMBL, SWISS-PROT)에 대해서 비교한 결과, 공지된 DNA 또는 단백질 서열과의 강한 상동성을 나타내지 않았다.
하기 표 2는 다양한 플라스미드로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 발효 분석 결과를 나타낸다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주(형질전환성 플라스미드) 시험한형질전환체의 수 B2:B1의 평균 비율
1100-SC38(없음) 9 30.66
1100-SC38(pWHM3) 21 31.3
1100-SC38(pSE119) 12 3.7
1100-SC38(pSE118) 12 30.4
1100-SC38(pSE185) 14 27.9
실시예 3
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 돌연변이주의 구성
이 실시예는 상기 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 여러 가지 다양한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 돌연변이주의 구성을 기술한다. 스트렙토마이세스의 유전자에 돌연변이를 도입하기 위한 기술에 대한 일반적인 설명은 문헌[Kieser and Hopwood, Meth. Enzym., 204, 430-458, 1991]에 기재되어 있다. 더욱 상세한 설명은 문헌[Anzai et al., J. Antibiot., XLI(2), 226-233, 1988] 및 문헌[Stutzman-Engwall et al., J. Bacteriol., 174(1), 144-154, 1992]에 기재되어 있다. 상기 참고 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
8.1. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC 유전자의 불활성화
불활성화된 aveC 유전자를 포함하는 AveC 돌연변이주를 하기에 기술한 바와 같이 몇 가지 방법을 사용하여 구성하였다.
첫 번째 방법으로, pSE119(상기 단락 7.1.9.에서 기재된 플라스미드)의 aveC 유전자 내부의 640bp SphI/PstI 단편을 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한 ermE 유전자(에리트로마이신 저항성)로 대치하였다. ermE 유전자는 pIJ4026(영국 노르위치 소재의 존 인즈 인스티튜트에서 제공; 또한 문헌[Bibb et al., Gene, 41, 357-368, 1985] 참조)으로부터 BglII 및 EcoRI로 제한 효소로 분해한 후, 전기 영동하고, 겔로부터 정제하여 단리하였다. 이 약 1.7Kb 단편을 BamHI 및 EcoRI으로 분해된 pGEM7Zf(프로메가)에 연결하고, 이 연결 혼합물은 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포로 제조 회사의 지시에 따라 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 약 1.7Kb 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 pSE27이라고 명명하였다.
pSE118(상기 단락 7.1.9.에서 기재)을 SphI 및 BamHI으로 분해하고, 분해물을 전기 영동한 후, 약 2.8Kb의 SphI/BamHI 삽입물을 겔로부터 정제하였다. pSE119를 PstI 및 EcoRI로 분해하고, 분해물을 전기 영동한 후, 약 1.5Kb의 PstI/EcoRI 삽입물을 겔로부터 정제하였다. 셔틀 벡터 pWHM3을 BamHI 및 EcoRI로 분해하였다. pSE27을 PstI 및 SphI으로 분해하고, 분해물을 전기 영동한 후, 약 1.7Kb의 PstI/SphI 삽입물을 겔로부터 정제하였다. 4개의 모든 단편들(즉, 약 2.8Kb, 약 1.5Kb, 약 7.2Kb, 약 1.7Kb)을 모두 함께 4 방향 연결로 연결하였다. 상기 연결 혼합물은 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포로 제조 회사의 지시에 따라 형질전환되었다. 상기 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE180(도 3, ATCC 209605)이라고 명명하였다.
pSE180으로 스트렙토마이세스 리비단스 TK64를 형질전환하고, 형질전환된 콜로니를 티오스트렙톤 및 에리트로마이신에 대한 저항성에 의해 확인하였다. pSE180을 스트렙토마이세스 리비단스로부터 단리하고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 원형질체를 형질전환하는데 사용하였다. 4개의 티오스트렙톤 저항성 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 형질전환체를 확인하고, 원형질체를 제조한 후, RM14 배지 상에서 비-선택적인 조건하에 도말하였다. 원형질체를 재생한 후에, 에리트로마이신 저항성이 존재하고 티오스트렙톤 저항성이 존재하지 않는 단일 콜로니를 스크리닝하였는데, 이는 불활성화된 aveC 유전자가 염색체에 삽입되고 유리 레플리콘(replicon)이 손실되었음을 의미한다. 1개의 Ermr Thios 형질전환체를 확인하고 균주 SE180-11이라고 명명하였다. 전체 염색체 DNA를 균주 SE180-11로부터 단리하고, BamHI, HindIII, PstI 또는 SphI의 제한 효소로 분해한 후, 0.8% 아가로스 겔상에서 전기 영동하여 분리하고, 나일론 멤브레인으로 옮겨 ermE 탐침에 혼성화하였다. 상기 분석 결과는 ermE 저항성 유전자의 염색체 삽입 및 640bp의 PstI/SphI 단편의 동시 결손이 이중 교차 사건으로 발생함을 나타내었다. 균주 SE180-11의 발효 산물을 HPLC로 분석한 결과, 정상적인 아베르멕틴은 더 이상 생산되지 않음을 나타냈다(도 5a).
aveC 유전자를 불활성화하기 위한 두 번째 방법으로, 1.7Kb의 ermE 유전자를 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 염색체로부터 제거하여, aveC 유전자에서 640bp의 PstI/SphI 단편이 결손되도록 하였다. 유전자 대치 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다: pSE180을 XbaI로 부분 분해하고, 약 11.4Kb의 단편을 겔로부터 정제하였다. 약 11.4Kb 밴드에서 1.7Kb의 ermE 저항성 유전자가 결핍되었다. 이어서, DNA를 연결하고, 에스케리키아 콜라이 DH5α세포를 형질전환하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE184로 명명된 상기 플라스미드로 에스케리키아 콜라이 DM1을 형질전환하고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. 상기 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 형질전환하였다. 원형질체를 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체로부터 제조하고, RM14 상에 단일 콜로니로 도말하였다. 원형질체를 재생한 후에, 에리트로마이신 저항성 및 티오스트렙톤 저항성이 모두 존재하지 않는 단일 콜로니를 스크리닝하였는데, 이는 불활성화된 aveC 유전자가 염색체에 삽입되고 ermE 유전자를 포함하는 유리 레플리콘이 손실되었음을 의미한다. 1개의 Erms Thios 형질전환체를 확인하고 SE184-1-13이라고 명명하였다. SE184-1-13을 발효 분석한 결과, SE184-1-13은 정상적인 아베르멕틴을 생산하지 않으며, SE180-11과 동일한 발효 프로파일을 가짐을 확인하였다.
aveC 유전자를 불활성화하는 세 번째 방법으로, PCR을 사용하여 염색체 aveC 유전자의 471번 뉴클레오타이드 위치에서 C 이하에 2개의 G를 첨가함으로써 틀 이동(frameshift)을 도입하여 BspE1 부위를 제조하였다. 유전공학적으로 제조된 BspE1 부위의 존재는 유전자 대치 사건을 검지하는데 유용하였다. aveC 유전자에 틀 이동 돌연변이를 도입하는 PCR 프라이머를 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드로부터 구입하였다. 우측 방향 프라이머는 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3'(서열 번호: 8)이고, 좌측 방향 프라이머는 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3'(서열 번호: 9)이었다. PCR 조건은 상기 단락 7.1.10.에 기재된 바와 같았다. 666bp의 PCR 산물을 SphI으로 분해하여 각각 278bp 및 388bp의 2가지 단편을 수득하였다. 388bp 단편을 겔로부터 정제하였다.
유전자 대치 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다: 셔틀 벡터 pWHM3을 EcoRI 및 BamHI으로 분해하였다. pSE119를 BamHI 및 SphI으로 분해하고, 분해물을 전기 영동한 후, 약 840bp의 단편을 겔로부터 정제하였다. pSE119를 EcoRI 및 XmnI로 분해하고, 분해물을 전기 영동에 의해 분리한 후, 약 1.7Kb의 단편을 겔로부터 정제하였다. 4개의 모든 단편들(즉, 약 7.2Kb, 약 840bp, 약 1.7Kb 및 388bp)을 모두 함께 4방향 연결로 연결하였다. 이 연결 혼합물로 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포를 형질전환하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 확인하였다. pSE185라고 명명된 상기 플라스미드로 에스케리키아 콜라이 DM1을 형질전환하고 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. 상기 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC 분석에 의해 분석하였다. pSE185는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38을 형질전환하였을 때, B2:B1 아베르멕틴 비율을 거의 변화하지 않았다(표 2 참조).
pSE185를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 원형질체를 형질전환하여 염색체 aveC 유전자에 틀 이동 돌연변이를 도입하였다. 원형질체는 티오스트렙톤 저항성 형질전환체로부터 제조하고, RM14 상에 단일 콜로니로 도말하였다. 원형질체를 재생한 후에, 티오스트렙톤 저항성이 존재하지 않는 단일 콜로니를 스크리닝하였다. 티오스트렙톤 민감성 콜로니로부터 염색체 DNA를 단리하고, 염색체로 삽입된 틀 이동 돌연변이의 존재를 PCR로 스크리닝하였다. PCR 프라이머를 aveC 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(미국 텍사스 소재)에서 구입하였다. 우측 방향 PCR 프라이머는 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3'(서열 번호: 10)이고, 좌측 방향 PCR 프라이머는 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3'(서열 번호: 11)이며, PCR 조건은 상기 단락 7.1.10.에 기재된 바와 같았다. 수득된 PCR 산물은 543bp이었고, BspE1로 분해하였을 때 368bp, 96bp 및 79bp의 3가지 단편이 관찰되었는데, 이는 불활성화된 aveC 유전자가 염색체에 삽입되었으며 유리 레플리콘이 손실되었음을 나타낸다.
aveC 유전자의 틀 이동 돌연변이를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 돌연변이주를 발효하여 분석한 결과, 이들 돌연변이주는 정상적인 아베르멕틴을 더 이상 생산하지 않으며, 균주 SE180-11 및 SE 184-1-13과 동일한 발효 HPLC 프로파일을 가짐이 확인되었다. 1개의 Thios 형질전환체가 확인되었고, 이를 균주 SE185-5a라고 명명하였다.
또한, 116번 위치에서 트립토판(W)을 암호화하는 코돈을 종결 코돈으로 변화시키는 결과를 야기하는, 520번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로 변하는 aveC 유전자에서의 돌연변이주가 제조되었다. 이와 같이 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주는 정상적인 아베르멕틴을 생산하지 않으며, 균주 SE180-11, SE184-1-13 및 SE185-5a와 동일한 발효 프로파일을 가지고 있었다.
또한, (i) 256번 위치에서의 아미노산을 글리신(G)으로부터 아스파테이트(D)로 변화시키는, 970번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로 변화하고; (ii) 275번 위치에서의 아미노산을 타이로신(Y)으로부터 히스티딘(H)으로 변화시키는, 996번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로 변화시키는 aveC 유전자에서의 돌연변이주가 제조되었다. 이와 같이 돌연변이된(G256D/Y275H) 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주는 정상적인 아베르멕틴을 생산하지 않으며, 균주 SE180-11, SE184-1-13 및 SE185-5a와 동일한 발효 프로파일을 가지고 있었다.
본원에 제공된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC 불활성화 돌연변이 균주 SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a 및 기타 균주는 aveC 유전자의 다른 돌연변이의 영향을 평가하기 위한 스크리닝 도구를 제공한다. aveC 유전자의 야생형 카피를 포함하는 pSE186은 에스케리키아 콜라이 DM1을 형질전환하고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. 이 pSE186 DNA를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC 분석에 의해 Thior Ermr 형질전환체를 분석하였다. 트랜스(in trans) 기능성 aveC 유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산하도록 회복할 수 있었다(도 5b 참조).
8.2. 유형 B2:B1 비율을 변화시키는 aveC 유전자에서의 돌연변이의 분석
상기 기재된 바와 같이, 불활성 aveC 유전자를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11은 기능성 aveC 유전자를 포함하는 플라스미드(pSE186)로 형질전환함으로써 보충될 수 있다. 또한, 균주 SE180-11은 하기 기재된 바와 같이 aveC 유전자의 다른 돌연변이에 특성을 부여하기 위해 숙주 균주로서 사용되었다.
염색체 DNA를 균주 1100-SC38로부터 단리하고, aveC 유전자의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 1.2Kb의 ORF를 aveC 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 고안된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하여 단리하였다. 우측 방향 프라이머는 서열 번호: 6이고, 좌측 방향 프라이머는 서열 번호: 7이었다(상기 단락 7.1.10 참조). PCR 및 서브클로닝 조건은 상기 단락 7.1.10에 기재되어 있다. 1.2Kb ORF의 DNA 서열을 분석한 결과, 55번 위치에서의 아미노산을 세린(S)으로부터 페닐알라닌(F)으로 변화시키는, 337번 뉴클레티드 위치에서 C로부터 T로 변화시키는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 일어났음을 발견하였다. S55F 돌연변이를 포함하는 aveC 유전자를 pWHM3에 서브클로닝하여 pSE187이라고 명명된 플라스미드를 제조하고, 이를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC로 분석함으로써 Thior Ermr 형질전환체를 분석하였다. 아미노산 잔기 55번에서의 변화(S55F)를 암호화하는 aveC 유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산하도록 회복시킬 수 있지만(도 5C); 약 1.6:1의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비율을 갖는 pSE186으로 형질전환된 균주 SE180-11과 비교하여, B2:B1의 비율이 약 26:1이었으므로, 이로부터 상기 단일 돌연변이(S55F)가 사이클로헥실 B1에 비하여 생산되는 사이클로헥실 B2의 양을 조절함을 알 수 있다.
230번 위치에서의 아미노산을 글리신(G)으로부터 아스파테이트(D)로 변화시키는, 862번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로 변화시키는 aveC 유전자에서의 또 다른 돌연변이가 확인되었다. 이러한 돌연변이(G230D)를 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주는 약 30:1의 B2:B1의 비율로 아베르멕틴을 생산한다.
8.3. B2:B1 비율을 감소하는 돌연변이
사이클로헥실 B1에 비해 생산되는 사이클로헥실 B2의 양을 감소하는 몇 가지 돌연변이를 하기와 같이 구성하였다.
139번 위치에서의 아미노산을 알라닌(A)으로부터 트레오닌(T)으로 변화시키는, 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로 변화시키는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 확인되었다. A139T 돌연변이를 포함하는 aveC 유전자를 pWHM3으로 서브클로닝하여 pSE188이라고 명명된 플라스미드를 제조하고, 이를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC 분석함으로써 Thior Ermr 형질전환체를 분석하였다. 139번 아미노산 잔기에서의 변화(A139T)를 암호화하는 돌연변이된 aveC 유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산하도록 회복할 수 있지만(도 5d); B2:B1의 비율은 약 0.94:1로, 이는 상기 돌연변이로 인해 사이클로헥실 B1에 비하여 생산되는 사이클로헥실 B2의 양이 감소하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 기재된 돌연변이의 결과 뿐만 아니라 공개된 결과가 단지 aveC 유전자의 불활성화나 B1 형태에 비해서 아베르멕틴의 B2 형태의 증가된 생산만을 나타내는 것으로 보아 예측하지 못하였다(하기 표 3 참조).
A139T 돌연변이는 B2:B1의 비율을 더욱 바람직한 B1이 더 많이 생산되는 방향으로 변화하기 때문에, 138번 아미노산 위치에서 세린 대신 트레오닌을 암호화하기 위해 돌연변이를 구성하였다. 따라서, pSE186은 EcoRI으로 분해되어, EcoRI로 분해된 pGEM3Zf(프로메가)로 클로닝되었다. pSE186a로 명명된 이 플라스미드를 ApaI 및 KpnI으로 분해하고, DNA 단편을 아가로스 겔상에서 분리한 후, 약 3.8Kb 및 약 0.4Kb의 2개의 단편을 겔로부터 정제하였다. pSE186으로부터 약 1.2Kb의 삽입물 DNA를 PCR 주형으로 사용하여 585번 뉴클레오타이드 위치에서 단일 염기 변화를 도입하였다. 585번 뉴클레오타이드 위치에서 돌연변이를 도입하기 위해 PCR 프라이머를 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(텍사스)에서 구입하였다. 우측 방향 PCR 프라이머는 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3'(서열 번호: 12)이고, 좌측 방향 PCR 프라이머는 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3'(서열 번호: 13)이었다. PCR 반응은 제조회사에서 제공된 완충액 중의 어드밴티지(Advantage) GC 게놈 PCR 키트(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크 래버러토리즈(Clonetech Laboratories))를 사용하여, 200μM dNTP, 200 pmol의 각 프라이머, 50ng의 주형 DNA, 1.0M GC-용융체 및 1 유니트의 클렌태크 폴리머라제 믹스(KlenTaq Polymerase Mix)의 존재하에 최종 부피 50㎕에서 수행하였다. 제 1 주기의 열 프로파일은 1분동안 94℃이었고, 이어서 30초동안 94℃ 및 2분동안 68℃에서 25회 주기를 수행한 후, 3분동안 68℃에서 1회 주기를 수행하였다. 295bp의 PCR 산물은 ApaI 및 KpnI로 분해되어 254bp 단편을 방출하고, 이를 전기 영동으로 분리한 후, 겔로부터 정제하였다. 3개의 모든 단편(약 3.8Kb, 약 0.4Kb 및 254bp)을 3방향 연결로 함께 연결하였다. 이 연결 혼합물은 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE198이라고 명명하였다.
pSE198은 EcoRI로 분해되고, EcoRI로 분해된 pWHM3으로 클로닝된 후, 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 이 플라스미드 DNA는 에스케리키아 콜라이 DM1 내로 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE199라고 명명된 상기 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC로 분석함으로써 Thior Ermr 형질전환체를 분석하였다. 138번 아미노산 잔기에서의 변화(S138T)를 암호화하는 돌연변이된 aveC 유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산하도록 회복할 수 있지만; B2:B1의 비율이 약 0.88:1로, 이는 상기 돌연변이로 인해 사이클로헥실 B1에 비해 생산되는 사이클로헥실 B2의 양이 감소하였음을 나타낸다(하기 표 3 참조). 상기 B2:B1 비율은 심지어 상기 기재된 바와 같이 pSE188로 형질전환된 균주 SE180-11에서 생산된 A139T 돌연변이에 의해 관찰된 0.94:1의 비율보다 더 낮았다.
138번 및 139번 아미노산 위치 둘 모두에 트레오닌을 도입하기 위해 또 다른 돌연변이를 구성하였다. pSE186으로부터 수득한 약 1.2Kb의 삽입물 DNA를 PCR 주형으로 사용하였다. 585번 및 588번 뉴클레오타이드 위치에서 돌연변이를 도입하기 위해 PCR 프라이머를 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(텍사스)에서 구입하였다. 우측 방향 PCR 프라이머는 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3'(서열 번호: 14)이었고, 좌측 방향 PCR 프라이머는 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3'(서열 번호: 15)이었다. PCR 반응은 이 단락에서 앞서 기재된 조건을 사용하여 수행되었다. 449bp의 PCR 산물은 ApaI 및 KpnI로 분해되어 254bp 단편을 방출하고, 이를 전기 영동으로 분리한 후, 겔로부터 정제하였다. pSE186a는 ApaI 및 KpnI로 분해되고, DNA 단편을 아가로스 겔상에서 분리한 후, 약 3.8Kb 및 약 0.4Kb의 2개의 단편들을 겔로부터 정제하였다. 3개의 모든 단편(약 3.8Kb, 약 0.4Kb 및 254bp)을 3방향 연결로 함께 연결하고, 이 연결 혼합물은 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 pSE230이라고 명명하였다.
pSE230은 EcoRI로 분해되고, EcoRI로 분해된 pWHM3으로 클로닝된 후, 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드 DNA로 에스케리키아 콜라이 DM1 내로 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE231이라고 명명된 상기 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효에 의해 Thior Ermr 형질전환체를 분석하였다. S138T/A139T를 암호화하는 이중 돌연변이된 aveC 유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산하도록 회복할 수 있지만, B2:B1 비율은 약 0.84:1로, 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같이 pSE188 또는 pSE199로 형질전환된 균주 SE180-11에 의해 제공된 감소에 대하여, 사이클로헥실 B1에 비해서 생산되는 사이클로헥실 B2의 양을 추가로 감소한다는 사실을 알 수 있다(하기 표 3 참조).
사이클로헥실 B1에 비해서 사이클로헥실 B2의 양을 추가로 감소하기 위해 또 다른 돌연변이를 추가로 구성하였다. S138T/A139T 돌연변이는 B2:B1 비율을 더욱 바람직한 B1이 더 많이 생산되는 방향으로 변화하기 때문에, 138번 아미노산 위치에 트레오닌을 및 139번 아미노산 위치에서 페닐알라닌을 도입하기 위해 돌연변이를 구성하였다. pSE186으로부터 수득한 약 1.2Kb의 삽입물 DNA를 PCR 주형으로 사용하였다. 585번 뉴클레오타이드 위치(T로부터 A로의 변화), 588번 뉴클레오타이드 위치(G로부터 T로의 변화), 및 589번 뉴클레오타이드 위치(C로부터 T로의 변화)에서 돌연변이를 도입하기 위해 PCR 프라이머를 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(텍사스)에서 구입하였다. 우측 방향 PCR 프라이머는 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3'(서열 번호: 25)이었고, 좌측 방향 PCR 프라이머는 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3'(서열 번호: 15)이었다. PCR 반응은 제조회사에서 제공된 완충액 중의 어드밴티지 GC 게놈 PCR 키트(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크 래버러토리즈)를 사용하여, 200μM dNTP, 200 pmol의 각 프라이머, 50ng의 주형 DNA, 1.1mM Mg 아세테이트, 1.0M GC-용융체 및 1 유니트의 Tth DNA 폴리머라제의 존재하에 최종 부피 50㎕에서 수행하였다. 제 1 주기의 열 프로파일은 1분동안 94℃이었고, 이어서 30초동안 94℃ 및 2분동안 68℃에서 25회 주기를 수행한 후, 3분동안 68℃에서 1회 주기를 수행하였다. 449bp의 PCR 산물은 ApaI 및 KpnI로 분해되어 254bp 단편을 방출하고, 이를 전기 영동으로 분리한 후, 겔로부터 정제하였다. 3개의 모든 단편(약 3.8Kb, 약 0.4Kb 및 254bp)을 3방향 연결로 함께 연결하였다. 이 연결 혼합물은 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 pSE238이라고 명명하였다.
pSE238은 EcoRI으로 분해되고, EcoRI로 분해된 pWHM3으로 클로닝된 후, 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드 DNA는 에스케리키아 콜라이 DM1 내로 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE239로 명명된 상기 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC 분석함으로써 Thior Ermr 형질전환체를 분석하였다. S138T/A139F를 암호화하는 이중 돌연변이된 aveC 유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산하도록 회복할 수 있지만; B2:B1 비율은 약 0.75:1로, 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같이 pSE188, pSE199 또는 pSE231로 형질전환된 균주 SE180-11에 의해 제공된 감소에 대하여, 사이클로헥실 B1에 비해서 생산되는 사이클로헥실 B2의 양을 감소한다는 사실을 알 수 있다(하기 표 3 참조).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주(형질전환 플라스미드) 시험한형질전환체의 수 상대적인 B2의 농도 상대적인 B1의 농도 B2:B1의 평균 비율
SE180-11(없음) 30 0 0 0
SE180-11(pWHM3) 30 0 0 0
SE180-11(pSE186) 26 222 140 1.59
SE180-11(pSE187) 12 283 11 26.3
SE180-11(pSE188) 24 193 206 0.94
SE180-11(pSE199) 18 155 171 0.88
SE180-11(pSE231) 6 259 309 0.84
SE180-11(pSE239) 20 184 242 0.75
문헌[Stemmer, Nature, 370, 389-391, 1994] 및 문헌[Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10747-10751, 1994]에 기재된 바와 같은 DNA 셔플링 기술을 사용하여 사이클로헥실 B1에 비해서 생산되는 사이클로헥실 B2의 양을 추가로 감소하기 위해 추가의 돌연변이를 구성하였고, 미국 특허 제 5,605,793 호, 제 5,811,238 호, 제 5,830,721 호 및 제 5,837,458 호에 추가로 기재되어 있다.
돌연변이된 aveC 유전자를 포함하는 DNA 셔플링된 플라스미드는 콤피텐트 담 디씨엠(dam dcm) 에스케리키아 콜라이 세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 이를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 1:1 이하의 사이클로헥실 B2: 사이클로헥실 B1 비율을 갖는 아베르멕틴의 생산하기 위해 스크리닝하였다. 1:1 이하의 B2:B1 비율을 갖는 아베르멕틴을 생산하는 SE180-11 형질전환체로부터 수득한 플라스미드 DNA의 DNA 서열을 결정하였다.
사이클로헥실 B1에 비해서 생산되는 사이클로헥실 B2의 양을 감소하는 8개의 형질전환체를 확인하였다. 이들 형질전환체 중에서 달성된 가장 낮은 B2:B1 비율은 0.4:1이었다(하기 표 4 참조). 플라스미드 DNA를 8개의 형질전환체 각각으로부터 단리하고, aveC 유전자에서의 돌연변이를 확인하기 위해 DNA 서열을 결정하였다. 상기 돌연변이는 다음과 같다.
pSE290은 317번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로, 353번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 A로, 438번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로, 및 1155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로 변화된 4개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 317번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 48번 AA 위치에서 아미노산을 D로부터 E로 변화하고, 438번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 89번 AA 위치에서 아미노산을 A로부터 T로 변화한다. 상기 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.42:1이었다(하기 표 4 참조).
pSE291은 272번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로, 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로, 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로, 및 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로 변화된 4개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 585번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 138번 AA 위치에서 아미노산을 S로부터 T로 변화하고, 588번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 139번 AA 위치에서 아미노산을 A로부터 T로 변화하고, 708번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 179번 AA 위치에서 아미노산을 G로부터 S로 변화한다. 상기 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.57:1이었다(하기 표 4 참조).
pSE292는 pSE290과 동일한 4개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 이 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.40:1이었다(하기 표 4 참조).
pSE293은 24번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로, 286번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 C로, 497번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로, 554번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로, 580번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로, 및 886번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로 변화된 6개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 286번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 38번 AA 위치에서 아미노산을 Q로부터 P로 변화하고, 580번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 136번 AA 위치에서 아미노산을 L로부터 P로 변화하고, 886번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 238번 AA 위치에서 아미노산을 E로부터 D로 변화한다. 상기 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.68:1이었다(하기 표 4 참조).
pSE294는 469번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로, 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로, 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로, 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로, 833번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로, 및 1184번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로 변화된 6개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 또한, 173번, 174번 및 175번 위치의 뉴클레오타이드는 결손된다. 469번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 99번 AA 위치에서 아미노산을 F로부터 S로 변화하고, 585번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 138번 AA 위치에서 아미노산을 S로부터 T로 변화하고, 588번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 139번 AA 위치에서 아미노산을 A로부터 T로 변화하고, 708번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 179번 AA 위치에서 아미노산을 G로부터 S로 변화한다. 상기 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.53:1이었다(하기 표 4 참조).
pSE295는 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로, 856번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로 변화된 2개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 588번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 139번 AA 위치에서 아미노산을 A로부터 T로 변화하고, 856번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 228번 AA 위치에서 아미노산을 M으로부터 T로 변화한다. 상기 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.80:1이었다(하기 표 4 참조).
pSE296은 155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로, 505번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로, 1039번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로, 1202번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로, 및 1210번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로 변화된 5개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 505번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 111번 AA 위치에서 아미노산을 G로부터 V로 변화하고, 1039번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 289번 AA 위치에서 아미노산을 P로부터 L로 변화한다. 상기 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.73:1이었다(하기 표 4 참조).
pSE297은 377번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로, 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로, 633번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로, 및 1067번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로 변화된 4개의 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함한다. 588번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 139번 AA 위치에서 아미노산을 A로부터 T로 변화하고, 633번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 154번 AA 위치에서 아미노산을 K로부터 E로 변화하고, 1067번 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변화는 298번 AA 위치에서 아미노산을 Q로부터 H로 변화한다. 상기 플라스미드를 운반하는 세포에 의해 생산되는 B2:B1 비율은 0.67:1이었다(하기 표 4 참조).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주(형질전환 플라스미드) 시험한형질전환체의 수 상대적인 B2의 농도 상대적인 B1의 농도 B2:B1의 평균 비율
SE180-11(없음) 4 0 0 0
SE180-11(pWHM3) 4 0 0 0
SE180-11(pSE290) 4 87 208 0.42
SE180-11(pSE291) 4 106 185 0.57
SE180-11(pSE292) 4 91 231 0.40
SE180-11(pSE293) 4 123 180 0.68
SE180-11(pSE294) 4 68 129 0.53
SE180-11(pSE295) 4 217 271 0.80
SE180-11(pSE296) 1 135 186 0.73
SE180-11(pSE297) 1 148 221 0.67
실시예 4
5' 결손 돌연변이주의 구성
상기 단락 5.1에서 설명된 바와 같이, 도 1에 도시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호: 1)은 잠재적인 개시 부위인 42번, 174번, 177번 및 180번 bp 위치에서 4개의 상이한 GTG 코돈을 포함한다. 이 실시예는 이들 코돈중 어느 것이 단백질 발현을 위해 aveC ORF의 개시 부위로서 작용할 수 있는지를 규명하기 위해 aveC ORF(도 1; 서열 번호: 1)의 5' 영역이 다중 결손 구성을 기술한다.
5' 말단에서 다양하게 결손된 aveC 유전자의 단편들을 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체 DNA로부터 PCR 증폭에 의해 단리하였다. PCR 프라이머를 aveC DNA 서열에 기초하여 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드에서 구입하였다. 우측 방향 프라이머들은 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3'(서열 번호: 16)(D1F1); 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3'(서열 번호: 17)(D1F2); 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3'(서열 번호: 18)(D1F3); 및 5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3'(서열 번호: 19)(D2F2)이었다. 좌측 방향 프라이머들은 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3'(서열 번호: 20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3'(서열 번호: 21); 및 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3'(서열 번호: 22)이었다. PCR 반응은 상기 단락 8.3에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 전기 영동에 의해 분리하고, 약 1.0Kb 또는 약 1.1Kb의 단일 DNA 밴드를 검출하였다. 이 PCR 산물을 겔로부터 정제하고, 1:10 몰비의 벡터:삽입물 중의 25ng의 선형화된 pCR2.1 벡터(인비트로겐)에 제조회사의 지시에 따라 연결하였다. 이 연결 혼합물을 사용하여 원 샷(One Shot, 등록상표) 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 세포(인비트로겐)를 제조회사의 지시에 따라 형질전환하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 삽입물의 존재를 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 pSE190(프라이머 D1F1로 수득), pSE191(프라이머 D1F2로 수득), pSE192(프라이머 D1F3으로 수득) 및 pSE193(프라이머 D2F2로 수득)이라고 명명하였다.
삽입물 DNA은 각각 BamHI/XbaI로 분해되고, 전기 영동으로 분리한 후, 겔로부터 정제하고, BamHI/XbaI로 분해된 셔틀 벡터 pWHM3에 1:5 몰비의 벡터:삽입물 중의 1㎍의 총 DNA 농도에서 연결하였다. 이 연결 혼합물을 사용하여 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포를 형질전환하였다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE194(D1F1), pSE195(D1F2), pSE196(D1F3) 및 pSE197(D2F2)이라고 명명된 이들 플라스미드는 각각 에스케리키아 콜라이 균주 DM1 내고 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. 상기 DNA를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC로 분석함으로써 Thior Ermr 형질전환체를 분석하여 GTG 부위가 aveC 발현에 필수적임을 확인하였다. 상기 결과로부터 42번 위치의 GTG 코돈이 aveC 발현에 영향을 미치지 않고 제거될 수 있음이 밝혀졌는데, 그 이유는 42번 위치에서 GTG 부위가 결핍되었지만 174번, 177번 및 180번 위치에서 3개의 GTG 부위를 포함하는 pSE194, pSE195 및 pSE196이, SE180-11 내로 형질전환되었을 때 정상적인 아베르멕틴을 생산하기 위해 회복할 수 있었기 때문이다. 균주 SE180-11은 4개의 모든 GTG 부위가 결핍된 pSE197로 형질전환되었을 때 정상적인 아베르멕틴을 생산하기 위해 회복되지 않았다(하기 표 5 참조).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주(형질전환 플라스미드) 시험한형질전환체의 수 상대적인 B2의 농도 상대적인 B1의 농도 B2:B1의 평균 비율
SE180-11(없음) 6 0 0 0
SE180-11(pWHM3) 6 0 0 0
SE180-11(pSE186) 6 241 152 1.58
SE180-11(pSE194) 6 35 15 2.43
SE180-11(pSE195) 6 74 38 1.97
SE180-11(pSE196) 6 328 208 1.58
SE180-11(pSE197) 12 0 0 0
실시예 5
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 및 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스로부터 aveC 동족체의 클로닝
본 발명은 스트렙토마이세스의 다른 아베르멕틴-생산 종 또는 밀베마이신-생산종으로부터 유래한 aveC 상동 유전자를 확인하고 클로닝하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(FERM BP-1901)의 게놈 DNA의 코스미드 총합체를 상기 기재된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 수득한 1.2Kb aveC 탐침과 혼성화하였다. 강하게 혼성화된 몇 가지 코스미드 클론이 확인되었다. 이들 코스미드로부터 염색체 DNA를 단리하고, aveC 탐침과 혼성화되는 4.9Kb의 KpnI 단편을 확인하였다. 이 DNA의 서열을 분석하고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF에 대해 매우 큰 상동성을 갖는 ORF(서열 번호: 3)를 확인하였다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 aveC 상동 ORF로부터 추론된 아미노산 서열(서열 번호: 4)을 도 6에 나타내었다.
또한, 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스 게놈 DNA의 코스미드 총합체를 상기 기재된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 수득한 1.2Kb aveC 탐침과 혼성화하였다. 강하게 혼성화된 몇 가지 코스미드 클론이 확인되었다. 이들 코스미드로부터 염색체 DNA를 단리하고, aveC 탐침과 혼성화되는 5.4Kb의 PstI 단편을 확인하였다. 상기 DNA의 서열을 분석하고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF에 대해 매우 큰 상동성을 갖는 aveC 상동 부분 ORF를 확인하였다. 추론된 부분적인 아미노산 서열(서열 번호: 5)을 도 6에 나타내었다.
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 및 스트렙토마이세스 그리세오크로모게네스로부터 수득한 aveC 동족체의 DNA 및 아미노산 서열을 분석한 결과, 이들 영역들이 서로, 및 스트렙토마이세스 아베르메틸리스 aveC ORF 및 AveC 유전자 산물에 대해서 모두 상당한 상동성(아미노산 수준에서 약 50%의 서열 동일성)을 공유하고 있음이 밝혀졌다(도 6).
실시예 6
ermE 프로모터 이하에 aveC 유전자를 갖는 플라스미드의 구성
pSE186으로부터 유래한 1.2Kb aveC ORF를, pWHM3의 KpnI/BamHI 부위에서 KpnI/BamHI 단편으로서 삽입된 300bp의 ermE 프로모터를 갖는 셔틀 벡터 pWHM3인 pSE34에 서브클로닝하였다(문헌[Ward et al., Mol. Gen. Genet., 203, 468-478, 1986] 참조). pSE186은 BamHI 및 HindIII로 분해되고, 이 분해물을 전기 영동으로 분리한 후, 1.2Kb의 단편을 아가로스 겔로부터 단리하여 BamHI 및 HindIII로 분해된 pSE34에 연결하였다. 이 연결 혼합물은 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 제조사의 지시에 따라 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 1.2Kb 삽입물의 존재를 제한 분석으로 확인하였다. pSE189라고 명명된 상기 플라스미드로 에스케리키아 콜라이 DM1 내로 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. pSE189로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 발효 산물을 HPLC 분석에 의해 분석하였다.
pSE189를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38 형질전환체는 균주 1100-SC38(34:1)과 비교하여 생산되는 아베르멕틴 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비율(약 3:1)을 변화하고, pSE119로 형질전환된 균주 1100-SC38과 비교하여 아베르멕틴의 총 생산은 약 2.4배 증가하였다(하기 표 6 참조).
또한, pSE189는 야생형 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 원형질체 내로 형질전환되었다. 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC 분석에 의해 분석하였다. pSE189로 형질전환된 야생형 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 생산되는 총 아베르멕틴은 pSE119로 형질전환된 야생형 스트렙토마이세스 아베르미틸리스와 비교하여 약 2.2배 증가하였다(하기 표 6 참조).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스(형질전환 플라스미드) 시험한형질전환체의 수 상대적인 B2의 농도 상대적인 B1의 농도 상대적인 아베르멕틴의 총 생산량 B2:B1의 평균 비율
1100-SC38 6 155 4.8 176 33.9
1100-SC38(pSE119) 9 239 50.3 357 4.7
1100-SC38(pSE189) 16 546 166 849 3.3
야생형 6 59 42 113 1.41
야생형(pSE119) 6 248 151 481 1.64
야생형(pSE189) 5 545 345 1,071 1.58
실시예 7
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC ORF 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 aveC 동족체로부터 유래한 서열을 포함하는 키메라 플라스미드
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC ORF의 564bp 상동성 일부를 대치하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 aveC 동족체의 564bp의 일부를 포함하는, pSE350이라고 명명된 혼성 플라스미드를 하기와 같이 구성하였다. pSE350은, 양쪽 서열 모두에서 보존되는 BsaAI 제한 부위(aveC의 225번 위치), 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC 유전자에 존재하는 KpnI 제한 부위(aveC의 810번 위치)를 사용하여 구성되었다. 상기 단락 7.1.10에 기재된 PCR 조건, 우측 방향 프라이머 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3'(서열 번호: 23) 및 좌측 방향 프라이머 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3'(서열 번호: 24)(지노시스 바이오테크놀로지스에서 구입)를 사용하여 PCR에 의해 KpnI 부위를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 DNA 내로 도입하였다. PCR 산물은 BsaAI 및 KpnI로 분해되고, 단편들을 1% 아가로스 겔에서 전기 영동에 의해 분리한 후, 564bp의 BsaAI/KpnI 단편을 겔로부터 단리하였다. pSE179(상기 단락 7.1.10에 기재)는 KpnI 및 HindIII로 분해되고, 단편들을 1% 아가로스 겔에서 전기 영동에 의해 분리한 후, 약 4.5Kb의 단편을 겔로부터 단리하였다. pSE179는 HindIII 및 BsaAI로 분해되고, 단편들을 1% 아가로스 겔에서 전기 영동에 의해 분리한 후, 약 0.2Kb의 BsaAI/HindIII 단편을 겔로부터 단리하였다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스로부터 수득한 약 4.5Kb의 HindIII/KpnI 단편, 약 0.2Kb의 BsaAI/HindIII 단편, 및 564bp의 BsaAI/KpnI 단편을 3방향 연결로 함께 연결하고, 이 연결 혼합물로 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 KpnI 및 AvaI을 사용하여 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드는 HindIII 및 XbaI로 분해되어 1.2Kb의 삽입물을 방출한 후, HindIII 및 XbaI으로 분해된 pWHM3에 연결하였다. 이 연결 혼합물은 콤피텐트 에스케리키아 콜라이 DH5α세포 내로 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 HindIII 및 AvaI을 사용하여 제한 분석으로 확인하였다. 상기 플라스미드 DNA는 에스케리키아 콜라이 DM1 내로 형질전환되고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE350이라고 명명하고, 이를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환하였다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC 분석함으로써, Thior Ermr 형질전환체를 분석하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스/스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 혼성 플라스미드를 포함하는 형질전환체는 약 109:1의 평균 B2:B1 비율을 갖는 것으로 나타났다(하기 표 7 참조).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주(형질전환 플라스미드) 시험한형질전환체의 수 상대적인 B2의 농도 상대적인 B1의 농도 B2:B1의 평균 비율
SE180-11(없음) 8 0 0 0
SE180-11(pWHM3) 8 0 0 0
SE180-11(pSE350) 16 233 2 109
생물학적 물질의 기탁
하기 생물학적 물질을 1998년 1월 29일자로 미국 메릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 미국 종균 보존소)에 기탁하고, 다음의 수탁번호를 부여받았다:
플라스미드 수탁번호
플라스미드 pSE180 209605
플라스미드 pSE186 209604
상기 인용된 모든 특허, 특허원 및 공개 문헌들은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본원에 기재된 특이적인 양태는 본 발명의 개별 양태를 하나씩 예시하고자 하는 것으로, 본 발명의 범주를 제한하지 않으며, 이와 기능적으로 등가의 방법 및 성분들도 본 발명의 범주내에 포함된다. 사실, 본원에 나타내고 기재된 것 이외에, 본 발명의 다양한 변형은 상기 명세서 및 첨부된 도면들로부터 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 하기 첨부된 청구의 범위의 범주내에 포함된다.
<110> PFIZER PRODUCTS INC. <120> STREPTOMYCES AVERMITILIS GENE DIRECTING THE RATIO OF B2:B1 AVERMECTINS <130> PC10650A <140> PC10650A <141> 1999-08-12 <150> 60/148,645 <151> 1999-08-12 <160> 25 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220> <221> CDS <222> (174)..(1082) <400> 1 tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60 tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120 aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg 173 gtg gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg 221 Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala 1 5 10 15 tac gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag 269 Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu 20 25 30 acg gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat 317 Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp 35 40 45 gtg gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg 365 Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 tgg ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gcc 413 Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala 65 70 75 80 ctt ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg agc tgg cag agc ccg ctc atg 461 Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met 85 90 95 aac tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg 509 Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala 100 105 110 gtg ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg 557 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro 115 120 125 ggt gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg tcg gcc tcc gtc tgc atg tcg 605 Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser 130 135 140 gct ctg atc gtc acc gtg ctg tgc agc aag gca ctg ggg tgg atc aag 653 Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys 145 150 155 160 gcc cgc cgg ccg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc 701 Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe 165 170 175 ttc atc ggc atc gtg ctc ggt ctg tcc gag ccg ctg ccg tcc gcc tcc 749 Phe Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser 180 185 190 ggg atc agc gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt 797 Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser 195 200 205 ggc gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg 845 Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu 210 215 220 gtc tgc tgc atg ctg ggc tcg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat 893 Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp 225 230 235 240 gag tcg tgg gtg gaa cgg gga gcc tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg 941 Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala 245 250 255 aac tgg gcg cgt ttc ctc gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gcc gtg atg 989 Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met 260 265 270 ttc ctc tac acc tgt ttc cat atc ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag 1037 Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln 275 280 285 ccg ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa gcg ccg gcc gct tac 1082 Pro Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 tgagttca gggcaggtcg gaggagacgg agaaggggag gcgaccggag ttccggtcac 1140 ctcccctttg tgcatgggtg gacggggatc acgctcccat ggcggcgggc tcctccagac 1200 gcaccacact cctcggttca gcgatcatg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 2 Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu 20 25 30 Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp 35 40 45 Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser 130 135 140 Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe 165 170 175 Phe Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser 180 185 190 Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser 195 200 205 Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu 210 215 220 Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp 225 230 235 240 Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala 245 250 255 Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met 260 265 270 Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln 275 280 285 Pro Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <220> <221> CDS <222> (58)..(987) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg 57 gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg 105 Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac agc ggc 153 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 tac cgc atc gag aag gcg tcc ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag 201 Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 cgg atc gcc gat gtg ctg atc ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg 249 Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 gtc ctc gca gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg 297 Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 acg ttc gac gcg tcg ctc ttc atc ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag 345 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln 85 90 95 agt ccc ttg atg aac tgg atc aat ccg gtg ctc gcg tca aac gtc aat 393 Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 441 Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 ggg gcg ggg gcg cac cag gag gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg agc 489 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 atc tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg 537 Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc 585 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile 165 170 175 gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg 633 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu 180 185 190 gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gca gtg ccc gag ctg 681 Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 acc atc tgg agt ggg cac tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg 729 Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 gct tcg gcg ctc ttc ggc gcc tct ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc 777 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg 825 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 aac atc agc atc gcc ctc tac acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg 921 Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu 275 280 285 ttc tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatgt 1020 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 gcggccgggg 1150 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 4 Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln 85 90 95 Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile 165 170 175 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu 180 185 190 Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu 275 280 285 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400> 5 Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gln Val 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp 20 25 30 Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp 35 40 45 Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe 50 55 60 Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr 130 135 140 Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg 145 150 155 160 Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Phe 165 170 175 Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala 180 185 190 Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg 195 200 205 Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 tcacgaaacc ggacacac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 9 aactccggtc gactcccctt c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 10 gcaaggatac ggggactac 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 11 gaaccgaccg cctgatac 18 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 12 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg 43 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 13 ggaaccgacc gcctgataca 20 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 14 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc 46 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 15 ggaacatcac ggcattcacc 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 16 aacccatccg agccgctc 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 17 tcggcctgcc aacgaac 17 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 18 ccaacgaacg tgtagtag 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 19 tgcaggcgta cgtgttcagc 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 20 catgatcgct gaaccga 17 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 21 catgatcgct gaaccgagga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 22 aggagtgtgg tgcgtctgga 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 23 cttcaggtgt acgtgttcg 19 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 24 gaactggtac cagtgccc 18 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 25 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc 46

Claims (84)

  1. 도 1(서열 번호: 1)에 존재하는 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 aveC ORF의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들의 유전자 코드의 축퇴에 따라 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 침묵 변화를 갖는 축퇴성 변이체와 동일하지만, 서열 번호: 2의 38번, 48번, 89번, 99번, 111번, 136번, 154번, 179번, 228번, 238번, 289번 또는 298번 아미노산 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기에서,
    (a) P, 또는 A, V, L, I, G, C, F, W 및 M으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 38번 위치에서의 아미노산 잔기 Q;
    (b) E에 의해 대치된 48번 위치에서의 아미노산 잔기 D;
    (c) T, 또는 S, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 89번 위치에서의 아미노산 잔기 A;
    (d) S, 또는 T, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 99번 위치에서의 아미노산 잔기 F;
    (e) V, 또는 A, L, I, G, C, F, W, M 및 P로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 111번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
    (f) P, 또는 A, V, L, I, G, C, F, W 및 M으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 136번 위치에서의 아미노산 잔기 L;
    (g) E 또는 D에 의해 대치된 154번 위치에서의 아미노산 잔기 K;
    (h) S, 또는 T, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 179번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
    (i) T, 또는 S, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 228번 위치에서의 아미노산 잔기 M;
    (j) D에 의해 대치된 238번 위치에서의 아미노산 잔기 E;
    (k) L, 또는 A, V, I, G, C, F, W, M 및 P로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 289번 위치에서의 아미노산 잔기 P; 및
    (l) H, K, 및 R로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 298번 위치에서의 아미노산 잔기 Q로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 아미노산 치환체를 암호화하는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 야생형 aveC 유전자가 불활성화되고 상기 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포가 야생형 aveC 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포에 의해 생산된 비율과 상이한 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴이 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상이한 유형 2:1 아베르멕틴 비율이 야생형 aveC 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포에 의해 생산된 유형 2:1 비율과 비교하여 감소된 비율인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  4. 제 3 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.8:1 이하인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  5. 제 3 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.68:1 이하인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  6. 제 3 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.53:1 이하인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  7. 제 3 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.42:1 이하인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  8. 제 3 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.40:1 이하인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  9. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 서열이 S138T, A139T, A139F, S138T/A139T 및 S138T/A139F로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  10. 삭제
  11. 제 2 항에 있어서,
    아미노산 잔기의 조합이 돌연변이되고, 이때 조합이
    (a) 아미노산 잔기 D48 및 A89;
    (b) 아미노산 잔기 Q38, L136 및 E238; 및
    (c) 아미노산 잔기 G111 및 P289로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  12. 제 11 항에 있어서,
    아미노산 치환체의 조합이 (a) D48E/A89T; (b) S138T/A139T/G179S; (c) Q38P/L136P/E238D; (d) F99S/S138T/A139T/G179S; (e) A139T/M228T; (f) G111V/P289L; 및 (g) A139T/K154E/Q298H로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  13. 제 12 항에 있어서,
    D48E/A89T를 암호화하는 aveC 서열에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 317번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 438번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  14. 제 13 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 353번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  15. 제 12 항에 있어서,
    S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 서열에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  16. 제 15 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 272번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  17. 제 12 항에 있어서,
    Q38P/L136P/E238D를 암호화하는 aveC 서열에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 286번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 580번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 886번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  18. 제 17 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 24번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 497번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 554번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  19. 제 12 항에 있어서,
    F99S/S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 서열에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 173번, 174번 및 175번 뉴클레오타이드 위치에서 3개의 염기 쌍 결손, 서열 번호: 1의 469번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  20. 제 19 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 833번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1184번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  21. 제 12 항에 있어서,
    A139T/M228T를 암호화하는 aveC 서열에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 856번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  22. 제 12 항에 있어서,
    G111V/P289L을 암호화하는 aveC 서열에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 505번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1039번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  23. 제 22 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 1202번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1210번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  24. 제 12 항에 있어서,
    A139T/K154E/Q298H를 암호화하는 aveC 서열에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 633번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1067번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  25. 제 24 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 377번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로의 염기 변화를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  26. 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  27. 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 제 26 항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    스트렙토마이세스 세포인 숙주 세포.
  29. 돌연변이된 aveC 유전자를 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규 균주의 세포가 야생형 aveC 유전자만을 발현하는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 비율과 상이한 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하도록 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포의 aveC 유전자를 돌연변이시킴을 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규 균주를 제조하는 방법:
    상기 돌연변이는 서열 번호: 2의 38번, 48번, 89번, 99번, 111번, 136번, 154번, 179번, 228번, 238번, 289번 또는 298번 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 잔기로 치환된 AveC 유전자 산물이 생겨나게 하고, 상기 아미노산 치환은,
    (a) P, 또는 A, V, L, I, G, C, F, W 및 M으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 38번 위치에서의 아미노산 잔기 Q;
    (b) E에 의해 대치된 48번 위치에서의 아미노산 잔기 D;
    (c) T, 또는 S, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 89번 위치에서의 아미노산 잔기 A;
    (d) S, 또는 T, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 99번 위치에서의 아미노산 잔기 F;
    (e) V, 또는 A, L, I, G, C, F, W, M 및 P로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 111번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
    (f) P, 또는 A, V, L, I, G, C, F, W 및 M으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 136번 위치에서의 아미노산 잔기 L;
    (g) E 또는 D에 의해 대치된 154번 위치에서의 아미노산 잔기 K;
    (h) S, 또는 T, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 179번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
    (i) T, 또는 S, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 228번 위치에서의 아미노산 잔기 M;
    (j) D에 의해 대치된 238번 위치에서의 아미노산 잔기 E;
    (k) L, 또는 A, V, I, G, C, F, W, M 및 P로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 289번 위치에서의 아미노산 잔기 P; 및
    (l) H, K, 및 R로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 298번 위치에서의 아미노산 잔기 Q로 구성된 군에서 하나 이상 선택된다.
  30. 제 29 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴이 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴인 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상이한 유형 2:1 아베르멕틴 비율이 감소된 비율인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    aveC 유전자가 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.8:1 이하인 방법.
  33. 제 31 항에 있어서,
    aveC 유전자가 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.68:1 이하인 방법.
  34. 제 31 항에 있어서,
    aveC 유전자가 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.53:1 이하인 방법.
  35. 제 31 항에 있어서,
    aveC 유전자가 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.42:1 이하인 방법.
  36. 제 31 항에 있어서,
    aveC 유전자가 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 유형 2:1 아베르멕틴의 비율이 0.40:1 이하인 방법.
  37. 제 31 항에 있어서,
    S138T, A139T, A139F, S138T/A139T 및 S138T/A139F로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이를 도입함을 추가로 포함하는 방법.
  38. 삭제
  39. 제 30 항에 있어서,
    aveC 유전자가 아미노산 위치의 조합에서 아미노산 치환체를 암호화하도록 돌연변이되고, 이때 조합이
    (a) 아미노산 잔기 D48 및 A89;
    (b) 아미노산 잔기 Q38, L136 및 E238; 및
    (c) 아미노산 잔기 G111 및 P289로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    아미노산 치환체의 조합이 (a) D48E/A89T; (b) S138T/A139T/G179S; (c) Q38P/L136P/E238D; (d) F99S/S138T/A139T/G179S; (e) A139T/M228T; (f) G111V/P289L; 및 (g) A139T/K154E/Q298H로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    D48E/A89T를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 317번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 438번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 353번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화를 도입함을 추가로 포함하는 방법.
  43. 제 40 항에 있어서,
    S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 272번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 도입함을 추가로 포함하는 방법.
  45. 제 40 항에 있어서,
    Q38P/L136P/E238D를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 286번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 580번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 886번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 24번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 497번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 554번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화를 도입함을 추가로 포함하는 방법.
  47. 제 40 항에 있어서,
    F99S/S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 173번, 174번 및 175번 뉴클레오타이드 위치에서 3개의 염기 쌍 결손, 서열 번호: 1의 469번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 833번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1184번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 도입함을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제 40 항에 있어서,
    A139T/M228T를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 856번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화를 포함하는 방법.
  50. 제 40 항에 있어서,
    G111V/P289L을 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 505번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1039번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 1202번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1210번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화를 도입함을 추가로 포함하는 방법.
  52. 제 40 항에 있어서,
    A139T/K154E/Q298H를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 633번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1067번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 377번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로의 염기 변화를 도입함을 추가로 포함하는 방법.
  54. 서열 번호: 2의 38번, 48번, 89번, 99번, 111번, 136번, 154번, 179번, 228번, 238번, 289번 또는 298번 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 위치에서,
    (a) P, 또는 A, V, L, I, G, C, F, W 및 M으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 38번 위치에서의 아미노산 잔기 Q;
    (b) E에 의해 대치된 48번 위치에서의 아미노산 잔기 D;
    (c) T, 또는 S, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 89번 위치에서의 아미노산 잔기 A;
    (d) S, 또는 T, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 99번 위치에서의 아미노산 잔기 F;
    (e) V, 또는 A, L, I, G, C, F, W, M 및 P로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 111번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
    (f) P, 또는 A, V, L, I, G, C, F, W 및 M으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 136번 위치에서의 아미노산 잔기 L;
    (g) E 또는 D에 의해 대치된 154번 위치에서의 아미노산 잔기 K;
    (h) S, 또는 T, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 179번 위치에서의 아미노산 잔기 G;
    (i) T, 또는 S, Y, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 228번 위치에서의 아미노산 잔기 M;
    (j) D에 의해 대치된 238번 위치에서의 아미노산 잔기 E;
    (k) L, 또는 A, V, I, G, C, F, W, M 및 P로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 289번 위치에서의 아미노산 잔기 P; 및
    (l) H, K, 및 R로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 대치된 298번 위치에서의 아미노산 잔기 Q로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 치환을 갖는 AveC 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된 aveC 유전자를 가지며, 야생형 aveC 유전자만을 발현하는 것을 제외하고는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에 의해 생산된 비율과 상이한 유형 2:1 비율의 아베르멕틴을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  55. 제 54 항에 있어서,
    유형 2:1 아베르멕틴이 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1 아베르멕틴인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  56. 제 55 항에 있어서,
    상이한 유형 2:1 아베르멕틴 비율이 감소된 비율인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  57. 제 56 항에 있어서,
    0.8:1 이하의 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  58. 제 56 항에 있어서,
    0.68:1 이하의 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  59. 제 56 항에 있어서,
    0.53:1 이하의 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  60. 제 56 항에 있어서,
    0.42:1 이하의 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  61. 제 56 항에 있어서,
    0.40:1 이하의 유형 2:1 아베르멕틴의 비율을 생산하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  62. 제 55 항에 있어서,
    aveC 유전자가 S138T, A139T, A139F, S138T/A139T 및 S138T/A139F로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이를 추가로 암호화하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  63. 삭제
  64. 제 55 항에 있어서,
    aveC 유전자가 아미노산 위치의 조합에서 아미노산 치환체를 암호화하도록 돌연변이되고, 이때 조합이
    (a) 아미노산 잔기 D48 및 A89;
    (b) 아미노산 잔기 Q38, L136 및 E238; 및
    (c) 아미노산 잔기 G111 및 P289로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  65. 제 64 항에 있어서,
    아미노산 치환체의 조합이 (a) D48E/A89T; (b) S138T/A139T/G179S; (c) Q38P/L136P/E238D; (d) F99S/S138T/A139T/G179S; (e) A139T/M228T; (f) G111V/P289L; 및 (g) A139T/K154E/Q298H로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  66. 제 65 항에 있어서,
    D48E/A89T를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 317번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 438번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  67. 제 66 항에 있어서,
    서열 번호: 1의 353번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화를 추가로 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  68. 제 65 항에 있어서,
    S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  69. 제 68 항에 있어서,
    S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 272번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 추가로 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  70. 제 65 항에 있어서,
    Q38P/L136P/E238D를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 286번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 580번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 886번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  71. 제 70 항에 있어서,
    Q38P/L136P/E238D를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 24번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 497번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 554번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화를 추가로 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  72. 제 65 항에 있어서,
    F99S/S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 173번, 174번 및 175번 뉴클레오타이드 위치에서 3개의 염기 쌍 결손, 서열 번호: 1의 469번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 585번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 708번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  73. 제 72 항에 있어서,
    F99S/S138T/A139T/G179S를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 833번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1184번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화를 추가로 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  74. 제 65 항에 있어서,
    A139T/M228T를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 856번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  75. 제 65 항에 있어서,
    G111V/P289L을 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 505번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1039번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  76. 제 75 항에 있어서,
    G111V/P289L을 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 155번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 1202번 뉴클레오타이드 위치에서 C로부터 T로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1210번 뉴클레오타이드 위치에서 T로부터 C로의 염기 변화를 추가로 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  77. 제 65 항에 있어서,
    A139T/K154E/Q298H를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 588번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 A로의 염기 변화, 서열 번호: 1의 633번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 G로의 염기 변화, 및 서열 번호: 1의 1067번 뉴클레오타이드 위치에서 A로부터 T로의 염기 변화를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  78. 제 77 항에 있어서,
    A139T/K154E/Q298H를 암호화하는 aveC 유전자에서의 돌연변이가 서열 번호: 1의 377번 뉴클레오타이드 위치에서 G로부터 T로의 염기 변화를 추가로 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
  79. 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배지에서 제 55 항의 세포를 배양하는 단계; 및 이 배양액으로부터 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴의 제조 방법.
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 제 9 항에 있어서,
    아미노산 잔기의 조합이 돌연변이되고, 이때 조합이
    (a) 아미노산 잔기 S138, A139 및 G179;
    (b) 아미노산 잔기 F99, S138, A139 및 G179;
    (c) 아미노산 잔기 A139 및 M228; 및
    (d) 아미노산 잔기 A139, K154 및 Q298로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  83. 제 37 항에 있어서,
    aveC 유전자가 아미노산 위치의 조합에서 아미노산 치환체를 암호화하도록 돌연변이되고, 이때 조합이
    (a) 아미노산 잔기 S138, A139 및 G179;
    (b) 아미노산 잔기 F99, S138, A139 및 G179;
    (c) 아미노산 잔기 A139 및 M228; 및
    (d) 아미노산 잔기 A139, K154 및 Q298로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 방법.
  84. 제 62 항에 있어서,
    aveC 유전자가 아미노산 위치의 조합에서 아미노산 치환체를 암호화하도록 돌연변이되고, 이때 조합이
    (a) 아미노산 잔기 S138, A139 및 G179;
    (b) 아미노산 잔기 F99, S138, A139 및 G179;
    (c) 아미노산 잔기 A139 및 M228; 및
    (d) 아미노산 잔기 A139, K154 및 Q298로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포.
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