CZ2002296A3 - Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká preparátů a způsobů přípravy avermektinů primárně v oboru zdraví živočichů. Konkrétněji se předkládaný vynález týká polynukleotidových molekul obsahujících nukleotidové sekvence kódující produkt genu aveC, který může být použit k modulaci poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných fermentací kultur S. avermitilis, a preparátů a způsobů vyhledávání takových polynukleotidových molekul. Předkládaný vynález se dále týká vektorů, transformovaných hostitelských buněk a nových mutovaných kmenů S. avermitilis, v kterých byl gen aveC inaktivován nebo mutován tak, že došlo ke modulaci vytvářeného poměru nebo množství třídy 2: 1 avermektinů.

příbuzných majících silnou Osm odlišných a

2. Dosavadní stav techniky

2.1. Avermektiny

Streptomycety produkují celou řadu sekundárních metabolitů včetně avermektinů, které zahrnují sérii osmi šestnáctičlenných makrocyklických laktonů antihelmintickou a insekticidální aktivitu, blízce příbuzných sloučenin je označováno jako Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a a B2b. Série a” sloučenin se týká přirozeného avermektinů, kde substituentem v pozici C25 je ( S)-sec-butyl, a b série sloučenin se týká těch sloučenin, kde substituentem v C5 pozici je izopropyl. Označení A a B se týká avermektinů, kde substituent v C5 pozici je metoxy, respektive hydroxy skupina. Číslo 1” se týká avermektinů, kde dvojná vazba je přítomná v pozici C22,23 a číslo 2 se týká avermektinů majících vodík v pozici C22 a hydroxy skupinu v pozici C23. Mezi příbuznými avermektiny je typ Bl avermektinů rozeznáván jako avermektin mající nejúčinnější • · · · • · · * « antiparazitickou a pesticidovou aktivitu a je nejvíce žádoucím avermektinem.

proto komerčně

Avermektiny a jejich produkce aerobní fermentací kmenů S. avertimilis jsou popsány v patentech United States Patents 4310519 a 4429042. Biosyntéza přirozených avermektinů je pravděpodobně zahajována endogenně z CoA thioesterových analogů kyseliny izomáselné a kyseliny S-( +) -2-metylmáselné.

Kombinace zlepšení kmene náhodnou mutagenezí i použití exogenně dodaných mastných kyselin vedlo k účinné tvorbě analog avermektinů. Mutanty S. avertimitilis s deficiencí dehydrogenázy 2-oxo kyselin (bkd deficientní mutanty) mohou produkvat avermektiny pouze, jsou-li fermentace suplementovány mastnými kyselinami. Vyhledávání a izolace mutant s deficiencí dehydrogenázové aktivity větvených řetězců ( například S. avarmitilis, ATCC 535567) jsou popsány v patentu European Patent (EP) 276103. Fermentace takových mutant v přítomnosti exogenně dodaných mastných kyselin vede k produkci pouze čtyř avermektinů odpovídajících použitým mastným kyselinám. Takto dochází suplementací fermentací S. avermitilis (ATCC 53567) S(+)-2-metylmáselnou kyselinou k tvorbě přirozených avermektinů Ala, A2a, Bia a B2a, suplementace fermentací kyselinou izomáselnou vede k tvorbě přirozených avermektinů Alb, A2b, Blb a B2b, a suplementace fermentací kyselinou cyklopentankarboxylovou vede k tvorbě čtyř nových cyklopentylavermektinů Al, A2, B1 a B2.

Pokud je provedena suplementace jinými mastnými kyselinami, dochází k tvorbě nových avermektinů. Vyhledáváním více než 800 potenciálních prekurzorů bylo identifikováno více než 60 dalších nových avermektinů ( viz například Dutton et al. , 1991,

J Antibiot 44:357-367, a Banks et al. , 1994, Roy Soc Chem

147:16-26). Mutanty S. avermitilis s deficiencí aktivity 5-O• « * · · ·

metyltransferázy navíc produkují zásadně pouze B analogové avermektiny. Mutanty S. avermitilis bez aktivity dehydrogenázy větvených 2-oxo kyselin i 5-0-metyltransferázy produkují pouze B avermektiny odpovídající mastným kyselinám použitým k suplementaci fermentace. Suplementace takových dvojitých mutant S-(+)-2-metylmáselnou kyselinou vede k tvorbě pouze přirozených avermektinů Bia a B2, zatímco suplementace kyselinou izomáselnou nebo cyklopentankarboxylovou vede k tvorbě přirozených avermektinů Blb a B2b, nebo nových cyklopentyl B1 a B2 avermektinů. Suplementace dvojitých zmutovaných kmenů cyklohexan karboxylovou kyselinou je přednostní způsob pro produkci komerčně důležitého nového avermektinů, cyklohexylavermektinu B1 (doramektinu). Izolace a charakteristiky takových dvojitých mutantů, například S. avermitilis (ATCC 53692) jsou popsány v EP 276103.

2.2. Geny hrající roli v biosyntéze avermektinů

V mnoha případech jsou geny hrající roli v produkci sekundárních metabolitů a geny kódující konkrétní antibiotikum nacházeny ve shlucích na chromozómu. Toto je případ například shluků genů Streptomyces pro polyketid syntézu ( PKS) ( viz Hopwood a Sherman, 1990, Ann Rev Genet 24:37-66). Jednou ze strategií klonování genů v biosyntetické dráze byla izolace genu pro lékovou rezistenci a poté testování přilehlých oblastí chromozómu na další geny mající vztah k biosyntéze takového konkrétního antibiotika. Další ze strategií klonování genů hrajících roli v biosyntéze důležitých metabolitů byla komplementace mutantů. Části DNA knihovny z organismu produkujícího konkrétní metabolit jsou vloženy do neprodukujícího mutovaného kmene a transformované kmeny jsou vyhledávány podle tvorby metabolitů. Navíc byla použita k identifikaci a klonování genů v biosyntetických drahách hybridizace knihovny za použití prób odvozených z kmenů Streptomyces.

• 4 · · 4

4 · • •44

Geny hrající roli v biosyntéze avermektinu (ave geny), podobně jako geny vyžadované pro biosyntézu jiných sekundárních metabolitů Streptomyces ( například PKS) jsou nacházeny ve shlucích na chromozómu. Za použití vektorů ke komplemetaci mutantů S. avermitilis s blokádou biosyntézy avermektinu byla úspěšně nakloňována celá řada ave genů. Klonování takových genů je popsáno v patentu US Patent 5252474. Ikeda et al. 1995, J Antibiot 48:532-534 navíc popsal lokalizaci chromozomální oblasti obsahující C22,23 dehydratační krok ( aveC) na fragmentu S. avermitilis 4,82 Kb BamHI, stejně tak jako mutace v genu aveC, které vedou k produkci jedné komponenty B2a. Protože ivermektin, účinná antihelmintická sloučenina, může být chemicky produkována z avermektinu B2a, je tento kmen produkující jednu kompoentu avermektinu B2a považován za obzvlášt užitečný pro komerční tvorbu ivermektinu.

Identifikace mutací aveC genu, které minimalizují komplexnost tvorby avermektinu, jako jsou například mutace, které snižují poměr B2: B1 avermektinů, by mohli zjednodušit produkci a purifikaci komerčně důležitých avermektinů.

3. Popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující kompletní aveC ORF S. avemitilis nebo jeho významnou část, kterážto izolovaná polynukleotidová molekula postrádá další kompletní ORF, který je lokalizován směrem dolů od aveC ORF in sítu na chromozómu S. avermitilis. Izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu obsahuje přednostně nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako produkt genu AveC S. avermitilis kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která je stejná jako nukleotidová sekvence aveC ORF z Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1), nebo ·· · · · · · · • · · · • ·

její významná část. nukleotidovou sekvenci variantu.

Předkládaný SEQ ID č. 1, vynález dále zahrnuje nebo její degenerovanou

Předkládaný vynález polynukleotidovou molekulu poskytuje izolovanou nukleotidovou sekvenci, dále maj ící která je homologní s produktem genu AveC S. avermitilis kódujícím sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která je stejná jako nukleotidová sekvence aveC ORF z Obrázku 1 (SEQ ID č. 1) , nebo jako její významná část.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s produktem genu AveC S. avermitilis kódujícím sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo jako aminokyselinová sekvence z Obrázku 1 (SEQ ID č. 2), nebo jako její významná část.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující homologní AveC genový produkt. V přednostní formě vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula nukleotidovou sekvenci kóduj ící homologní AveC produkt genu S. hygroscopicus, kterýžto homologní genový produkt obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č: 4, nebo její významnou část. V přednostní formě vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem vynálezu, a která kóduje homologní AveC produkt, nukleotidovou sekvenci SEQ ID č: 3, nebo její významnou část.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO:3.

• · « · * ·

.................

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, který je homologní s homologním AveC produktem genu S. hygroscopicus, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č: 4.

Předkládaný vynález dále poskytuje oligonukleotidy, které hybridizují s polynukleotidovou molekulou mající nukleotidouvou sekvenci uvedenou na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) , nebo SEQ ID č. 3, nebo s polynukleotidovou molekulou mající nukleotidouvou sekvenci, která je komplementární s nukleotidovou sekvencí uvedenou na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1), nebo SEQ ID č. 3.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní klonovací vektory a expresní vektory, které jsou užitečné pro klonování a expresi polynukleotidu, který je předmětem předkládaného vynálezu, včetně polynukleotidových molekul obsahujících aveC ORF S. avermitilis nebo aveC homologní ORF. V nelimitující formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), který obsahuje celý ORF aveC genu S. avermitilis. Předkládaný vynález dále poskytuje transformované hostitelské buňky obsahující polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor, který je předmětem vynálezu, a nové kmeny, nebo buněčné linie od nich odvozené.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantně exprimovaný AveC genový produkt nebo AveC homologní genový produkt, nebo jejich významnou část. Předkládaný vynález dále poskytuje způsob produkce rekombinantního AveC genového produktu, zahrnující kultivaci transformované hostitelské buňky s rekombinantním expresním vektorem, kde řečený rekombinantní expresní vektor obsahuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt nebo AveC • · η .:.. .............

homologní genový produkt, kterážto polynukleotidová molekula je v operačním spojení s jedním nebo více regulačními elementy, které kontrolují expresi polynukleotidové molekuly hostitelské buňky, za podmínek napomáhajících produkci rekombinantního AveC genového produktu nebo AveC homologního genového produktu, a zahrnující získání AveC genového produktu nebo AveC homologního genového produktu z buněčné kultury.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je jinak stejná jako AveC alela S. avermitilis, nebo AveC genový produkt kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo její degenerovanou variantu, nebo nukleotidovou sekvenci aveC ORF S. avermitilis, jak je uvedeno na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1), nebo její degenerovanou variantu, ale která dále obsahuje jednu nebo více mutací, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, v kterých byla divoká aveC alela inaktivována, a která exprimuje polynukleotidovou molekulu obsahující zmutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují odlišný poměr nebo množství avermektinů, které jsou produkovány buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely. Podle předkládaného vynálezu mohou být takové polynukleotidové molekuly použity k produkci nových kmenů S. avermitilis, které vykazují detekovatelnou změnu v produkci avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné k produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují avermektiny ve sníženém poměru 2:1, ve srovnání se stejným kmenem, který místo toho exprimuje pouze divoký ty aveC alely. V další přednostní formě vynálezu jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují zvýšená množství avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který místo toho exprimuje pouze jednu divokou • · aveC alelu. V další přednostní formě vynálezu jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů

S. avermitilis, v kterých byl aveC gen inaktivován.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby identifikace mutací aveC ORF S. avermitilis schopných změnit poměr a/nebo množství produkovaných avermektinů. V přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález způsob identifikace mutací aveC ORF schopných změnit poměr třídy 2:1 produkovaných avermektinů, kterýžto způsob zahrnuje: ( a) určení poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující zmutovaný AveC genový produkt, a tato molekula je exprimována; ( b) určení poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis jako v kroku ( a) , ale kteréžto buňky místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely nebo ORF z Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1), nebo nukleotidovou sekvenci, která je k ORF homologní; a ( c) porovnání poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku ( a) s poměrem třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b); takže je-li poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) odlišný od poměru třídy 2: 1 avermektinů produkovaných buňkami S.

avermitilis z kroku ( b) , poté může být identifikována mutace aveC ORF schopná pozměnit poměr třídy 2: 1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je poměr třídy 2: 1 avermektinů touto mutací snížen.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsoby identifikace mutací aveC ORF nebo genetických konstruktů obsahujících aveC ORF schopných změnit množství produkovaných avermektinů, kterýžto způsob zahrnuje: (a) určení množství exprimována; ( b) stejným kmenem S, avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující zmutovaný AveC genový produkt, nebo obsahující genetický konstrukt zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt a tato molekula je určení množství avermektinů produkovaných avermitilis jako v kroku ( a) , ale kterýžto kmen místo toho exprimuje pouze jednu aveC alelu mající nukleotidovou sekvenci jako ORF z Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) , nebo nukleotidovou sekvenci, která je k ORF homologní; a (c) porovnání množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku ( a) s množstvím avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku ( b) ; takže je-li množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) odlišné od množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku ( b) , poté může být identifikována mutace aveC ORF nebo genetického konstruktu schopná pozměnit poměr třídy 2: 1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je produkované množství avermektinů touto mutací zvýšeno.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní vektory, které jsou užitečné pro přípravu nových kmenů S. avermitilis s narušenou produkcí avermektinů. Předkládaný vynález navíc posyktuje vektory, které mohou být použity k cílení jakýchkoli polynukleotidových molekul obsahujících mutované nukleotidové sekvence, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, do místa aveC genu chromozómu S. avermitilis buďto k inzerci nebo k nahrazení aveC alely nebo ORF nebo jejich části pomocí homologní rekombinace. Podle předkládaného vynálezu však může zde poskytnutá polynukleotidová molekula obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, také modulovat biosyntézu avermektinů, je-li inzerována do chromozómu S. avermitilis do místa jiného, než • * • · » · · * · · • · · · « · je místo aveC genu, nebo je-li v buňkách S. avermitilis udržována epizomálně. Předkládaný vynález tedy poskytuje také vektory obsahující mutovanou polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, kteréžto vektory mohou být použity k inzerci polynukleotidové molekuly do místa v chromozómu S. avermitilis jiného, než je místo aveC genu, nebo která může být v těchto buňkách udržována epizomálně. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genu, které mohou být použity k inzerci mutované aveC alely do chromozómu S. avermitilis za účelem tvorby nových kmenů buněk, které produkuji avermektiny ve sníženém poměru

třídy 2: 1	ve srovnání	s buňkami	stejného kmene,	které
exprimují pouze divoký typ	aveC alely.
Předkládaný	vynález dále	poskytuje	způsoby	přípravy	nových
kmenů S.	avermitilis zahrnující	buňky,	které exprimují

mutovanou aveC alelu, čímž vznikají narušené poměry a/nebo množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy nových kmenů S. avermitilis obsahujících buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, čímž vzniká narušený poměr třídy 2: 1 avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, dále zahrnující transformující buňky kmene S. avermitilis s vektorem, který nese mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, který narušuje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, které exprimuj í mutovaný typ aveC alely ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a dále výběr transformovaných buněk, které produkují avermektiny v narušeném poměru třídy 2:1 avermektinů ve srovnání s poměrem třídy 2: 1 produkovaným buňkami kmene S.

• · « · « · · · • · « · * » « · • · · avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaných v buňkách nového kmene.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy nových kmenů S. avermitilis zahrnující buňky, které produkují narušená množství avermektinů, zahrnující transformující buňky kmene S. avermitilis s vektorem, který nese mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, jejichž exprese vede k narušenému množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, které exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a dále zahrnující výběr transformovaných buněk, které produkují avermektiny v narušeném množství ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je množství avermektinů produkovaných v buňkách nového kmene zvýšeno.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky obsahují inaktivovanou aveC alelu, obsahující transformující buňky kmene S. avermitiis, které exprimují jakoukoli aveC alelu s vektorem, který inaktivuje aveC alelu a dále výběr transformovaných buněk, v kterých byla aveC alela inaktivována.

Předkládaný vynález dále poskytuje nové kmeny S. avermitilis, které byly transformovány jakoukoli polynukleotidovou molekulou nebo vektory obsahujícími mutované nukleotidové sekvence, které jsou předmětem předkládaného vynálezu.

V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S.

• · • · · « · · · avermitilis zahrnující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu na místo nebo navíc k divokému typu aveC alely, kde buňky nového kmene produkují avermektiny v narušeném poměru třídy 2:1 ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostnější formě vynálezu produkuje nový kmen avermektiny v narušeném poměru třídy 2: 1 ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. Takové nové kmeny jsou užitečné k produkci komerčně žádoucích avermektinů, jako je například doramektin, ve velkém měřítku.

V další přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis, které exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu na místo nebo navíc k nativní aveC alele, což vede k buněčné produkci narušeného množství avermektinů ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely.

V přednostní formě vynálezu produkují nové buňky zvýšené množství avermektinů.

V další přednostní formě vynálezu poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis obsahující buňky, v kterých byl aveC gen inaktivován. Takové kmeny jsou užitečné pro různé spektrum avermektinů, které tyto buňky produkují ve srovnání s divokým kmenem, i pro komplementaci vyhledávacích analýz, jak jsou zde popsané, aby se určilo, zdali cílená nebo náhodná mutageneze aveC genu ovlivňuje produkci avermektinů.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, kteréžto buňky exprimují mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který alteruje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími • · · · * » · · « * mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely v kultivačním médiu za podmínek, které z nich umožňují nebo indukují produkci avermektinů, a získání řečených avermektinů z kultury. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami exprimuj ících mutaci. Postup poskytuje zvýšenou účinnost produkce komerčně hodnotných avermektinů, jako je například doramectin.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, kteréžto buňky exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, které vedou k narušenému množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které neexprimují pouze mutovanou aveC alelu nebo genetiký konstrukt, ale místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely, v kultivačním médiu za podmínek, které z nich umožňují nebo indukují produkci avermektinů, a kterýžto způsob zahrnuje dále získání řečených avermektinů z kultury. V přednostní formě vynálezu je zvýšeno množství avermektinů produkovaných buňkami exprimujících mutaci nebo genetický konstrukt.

Předkládaný vynález dále poskytuje nové složení avermektinů produkované kmenem S. avemitilis exprimujícím mutovanou aveC alelu, která je předmětem předkládaného vynálezu, kde avermektiny jsou produkovány ve sníženém poměru třídy 2: 1 ve srovnání poměrem 2: 1 třídy avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis, které neexprimují mutovanou aveC alelu, ale místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely. Nové složení avermektinů může být přítomno, jak je produkováno ve fermentační kultivační tekutině, nebo z ní může staženo nebo může být z ní významně purifikováno.

• · ·

4. Stručný popis obrázků

Obrázek 1. DNA sekvence ( SEQ ID č. 1) obsahující aveC ORF S. avermitilis a odvozenou aminokyselinovou sekvenci ( SEQ ID č. 2) .

Obrázek 2. Plazmidový vektor pSE186 (ATCC 209604) obsahující celý ORF aveC genu S avermitilis.

Obrázek 3. Gen nahrazující vektor pSE180 (ATCC 209605) obsahující ermE gen Sace. erythraea inzerovaný do aveC ORF S. avermitilis.

Obrázek 4. BamHI restrikční mapa shluků genů pro avermektin polyketid syntházu ze S. avermitilis s identifikovanými pěti přesahujícími kosmidovými klony (tj. pSE65, pSE 66, pSE67, pSE68, pSE69). Uveden je také vztah pSE118 a PSE119.

Obrázek 5. HPLC analýza fermentačních produktů produkovaných kmeny S. avermitilis. Kvantifikace vrcholu byla provedena srovnáním množství standard cyklohexylu Bl. Retenční čas cyklohexyiu B2 byl 7,4-7,7 minuty, retenční čas cyklohexylu Bl byl 11,9-12,3 minuty. Obrázek 5A. Kmen S. avermitilis SE180-11 s inaktivovaným aveC ORF. Obr. 5B. Kmen S. avermitilis SE18011 transformovaný pomocí pSE187. Obr. 5D. Kmen S. avermitilis SE180-11 transformovaný pomocí pSE188.

Obrázek 6. Srovnání vyvozených aminokyselinových sekvencí kódovaných aveC ORF S. avermitilis ( SEQ ID č. 2) , aveC homologním částečným ORF z S. griseochromogenes ( SEQ ID č. 5) , a aveC homologním ORF z S. hygroscopicus ( SEQ ID č.4). Valinové reziduum označené tučně je domnělé startovací místo pro bílkovinu. Konzervovaná rezidua jsou uvedena velkými písmeny pro homologii ve všech třech sekvencích a malými písmeny pro homologii ve dvou ze tří sekvencí. Aminokyselinové sekvence mají přibližně 50% identitu sekvencí.

Obrázek 7. Hybridní plazmidový konstrukt obsahující 564 bp BsaAl/KpnI fragment z S. hygroscopicus aveC homologního genu inzerovaného do BaaAl/KpnI místa v S. avermitilis aveC ORF.

5. Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká identifikace a charakterizace polynukleotidových molekul majících nukleotidové sekvence, které kódují aveC genový produkt ze Streptomyces avermitilis, konstrukce nových kmenů S. avermitilis, které mohou být použity k vyhledávání mutovaných AveC genových produktů pro jejich efekt na produkci avermektinů, a objevu, že určité mutované AveC genové produkty mohou snižovat poměr B2: B1 avermektinů produkovaných S. avermitilis. Vynález je popsán příkladem v částech uvedených níže jako polynukleotidová molekula mající buďto nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako pro S. avermitilis AveC genový produkt-kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo nukleotidovou sekvenci ORF uvedenou na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1) , a polynukleotidová molekuly maj ící z nich odvozené mutované nukleotidové sekvence a jejich degenerované varianty. Principy uvedené v předkládaném vynálezu však mohou být analogicky aplikovány na další polynukleotidové molekuly, včetně aveC homologních genů z jiných druhů Streptomyces, zahrnující mezi jinými například S. hygroscopicus a S. griseochromogenes.

5.1. Polynukleotidové molekuly kódující S. avermitilis AveC genový produkt

Předkládaný vynález poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující kompletní aveC ORF S. avermitilis nebo jeho významnou část, kterážto izolovaná polynukleotidová • · · * « · • · · molekula postrádá další kompletní ORF, který je lokalizován směrem dolů od ORF in šitu na chromozómu S. avermitilis.

Izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu obsahuje přednostně nukleotidovou sekvenci, která je stejná, jako je S. avermitilis AveC genový produkt kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo je stejná jako nukleotidová sekvence ORF z Obrázku 1 (SEQ ID č. 1) , nebo její významná část. Jak je zde použito, významná část izolované polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou kódující S. avermitilis AveC genový produkt znamená izolovanou polynukeotidovou molekulu obsahující alespoň 70% kompletní aveC ORF sekvence uvedené na Obrázku 1 (SEQ ID č.1), který kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt. V tomto ohledu je fukčně ekvivalentní AveC genový produkt definován jako genový produkt, který je-li exprimován v kmeni S. avermitilis ATCC 53692, v kterém byla nativní aveC alela inaktivována, vede k produkci významně stejného poměru a množství avermektinů, jako je produkováno kmenem S. avermitilis ATCC 53692, který exprimuje pouze divokou, funkční aveC alelu nativní pro kmen S. avermitilis ATCC 53692.

Navíc k nukleotidové sekveci aveC ORF může izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu, dále obsahovat nukleotidové sekvence, které přirozeně hraničí s aveC genem in šitu v S. avermitilis, jako jsou například hraničící nukleotidové sekvence uvedené na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) .

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 1, nebo její degenerovanou variantu.

• · · · · · • ·♦*

Jak je zde používáno, týkají se termíny polynukleotidová molekula, polynukleotidová sekvence, kódující sekvence, otevřený čtecí rámec a ORF, DNA i RNA molekul, které mohou být buďto jednovláknové nebo dvouvláknové, a které mohou být transkribované nebo translatované (DNA), nebo translatované (RNA) do AveC genového produktu, nebo do polypeptidu, který je homologní s AveC genovým produktem nebo s AveC homologním genovým produktem v příslušném expresním systému hostitelské buňky, je-li pod kontrolou příslušných regulačních elementů. Kódující sekvence může zahrnovat, ale není omezena na prokaryotické sekvence, cDNA sekvence, genomické DNA sekvence a chemicky syntetizované DNA a RNA sekvence.

Nukleotidová sekvence uvedená na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) zahrnuje čtyři odlišné GTG kodóny v pozicích bp 42, 174, 177 a

180. Jak je uvedeno níže byly konstruovány mnohočetné delece 5' - oblasti aveC ORF ( Obrázek 1, SEQ ID č. 1) , aby se pomohlo definovat, který z těchto kodónů by mohl fungovat v aveC ORF jako starovací místo pro expresi bílkovin. Delece prvního GTG místa v pozici 42 bp neeliminovalo AveC aktivitu. Další delece všech GTG kodónů v pozicích 174, 177 a 180 bp společně eliminovaly AveC aktivitu, což ukazuje, že tato oblast je nezbytná pro expresi bílkovin. Předkládaný vynález tedy zahrnuje aveC ORF o variabilní délce.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která je homologní s S. avermitilis AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATC 209604), nebo s nukleotidovou sekvencí aveC ORF prezentovanou na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1) nebo s její významnou částí. Termín homologní, je-li polynukleotidové molekule, která avermitilis AveC genový produkt-kódující sekvencí, znamená polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci: a) použit ve vztahu k je homologní s s S.

• · 9··· • » · · která kóduje stejný AveC genový produkt jako S. avermitilis genový produkt-kódujíci sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která kóduje stejný AveC genový produkt, jako je nukleotidová sekvence aveC ORF prezentovaná na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), ale která zahrnuje jednu nebo více němých změn nukleotidové sekvence podle degenerace genetického kódu (tj. degenerační varianta); nebo b) která hybridizuje, aby zkomplementovala polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která kóduje AveC genový produktkódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvdenou na Obrázku 1 (SEQ ID č. 2) za mírně přísných podmínek, tj. hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5 M NaHPO₄, 7% sodném dodecylsulfátu (SDS), 1 mM EDTA při teplotě 65°C, a promytí v 0, 2 x SSC/0,1% SDS při teplotě 42°C (viz Ausubel et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Sv. I, Green Publishing Associates, lne, a John Wiley and Sons, lne, New York, strana 2.10.3), která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše. V přednostní formě hybridizuje homologní polynukleotidová molekula, aby zkomplementovala AveC genový produkt-kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo zkomplementovala nukleotidovou sekvenci aveC ORF prezentovanou na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její významnou část za vysoce přísných podmínek tj . hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA při teplotě 6 5°C, a promytí v 0,1 x SSC/0,1% SDS při teplotě 68°C (viz Ausubel et al., 1989, výše), která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše.

Aktivita AveC genového produktu a jeho potenciálně funkčních ekvivalentů může být určena HPLC analýzou fermentačních produktů, jak je popsáno v příkladech provedení vynálezu níže. Polynukleotidové molekuly mající nukleotidové sekvence, které

kódují funkční ekvivalenty S. avermitilis AveC genového produktu, zahrnují přirozeně se vyskytující se aveC geny přítomné v jiných kmenech S. avermitilis, aveC homologní geny přítomné v jiných druzích Streptomyces, a mutované aveC alely přirozeně se vyskytující se nebo připravené genetickým inženýrstvím.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologní s aminokyselinovou sekvencí kódovanou AveC genový produktkódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo aminokyselinovou sekvencí z Obrázku 1 ( SEQ ID č. 2) nebo s její významnou částí. Jak je zde použito, znamená významná část aminokyselinové sekvence z Obrázku 1 ( SEQ ID č. 2) polypeptid obsahující okolo 70% aminokyselinové sekvence uvedené na Obrázku 1 (SEQ ID č. 2), která konstituje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše.

Jak je zde používáno s odkazem na aminokyselinové sekvence, které jsou homologní s aminokyselinovými sekvencemi AveC genového produktu S. avermitilis, týká se termín homologní” polypeptidu, který má jinak aminokyselinovou sekvenci uvedenou na Obrázku 1 (SEQ ID č. 2), ale v kterém jedno nebo více aminokyselinových reziduí je konzervativně substituováno odlišným aminokyselinovým reziduem, kde řečená aminokyselinová sekvence má alespoň zhruba 70%, přednostněji alespoň zhruba 80%, a nej přednostněji alespoň zhruba 90% identity aminokyselinové sekvence s polypeptidem kódovaným AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604) aminokyselinové sekvence z Obrázku 1 (SEQ ID č.

určeno jakýmkoli standardním

2), jak je identity algoritmus algoritmem aminokyselinových sekvencí, jako je například

BLASTP (GENBANK, NCBI), a kde taková konzervativní substituce • · · · on tm ·* • · « · * · · · » • · · · · · * * • · · · · ^β * •« ♦ * ··· ·· ···· vede ke vzniku funkčně ekvivalentního genového produktu, jak je definováno výše. Konzervativní aminokyselinové substituce jsou dobře známy v oboru. Pravidla pro provádění takových substitucí zahrnují pravidla popsaná mezi jinými Dayhofem MD, 1978, Nat Biomed Res Found, Washington, DC, sv. 5, Sup. 3. Konzervativní aminokyselinové substituce jsou specifičtěji ty substituce, které se obecně uskutečňují v rámci rodiny aminokyselin, které jsou příbuzné aciditou nebo polaritou. Geneticky kódované aminokyseliny jsou obecně rozděleny do čtyřech skupin: 1) kyselé = aspartát, glutamát; 2) bázické = lysin, arginin, histidin; 3) nepolární = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan; a 4) polární bez náboje = glycin, asparigin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan tyrosin jsou také společně klasifikovány jako aromatické aminokyseliny. Jedna nebo více náhrad v jakékoli konkrétní skupině, například náhrada leucinu za izoleucin nebo valin, nebo aspartátu za glutamát, nebo threonin za serin, nebo za jakékoli jiné aminokyselinové reziduum se strukturálně příbuzným aminokyselinovým reziduem, například aminokyselinové reziduum s podobnou aciditou nebo polaritou, nebo podobných v kombinaci těchto vlastností, budou mít obecně nevýznamný efekt na funkci polypeptidu.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC homologní genový produkt. Jak je zde používáno, je AveC homologní genový produkt definován jako genový produkt mající alespoň zhruba 50% aminokyselinovou sekvenční identitu s AveC genovým produktem S. avermitilis obsahujícím aminokyselinovou sekvenci kódovanou kódující sekvencí plazmidu pSE186 aminokyselinové sekvence uvedené na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 2) , jak je určeno jakýmkoli standardním algoritmem identity

AveC genový produkt(ATCC 209604), nebo •4 **·♦ ·· *··· ♦« **„ • · · · · .

• · «♦··· • ···· ··· * • « · · · · *

.................

aminokyselinových sekvencí, jako je například algoritmus BLASTP (GENBANK, NCBI). V neomezující formě vynálezu je AveC homologní genový produkt ze S. hygroscopicus (popsaný v přihlášce EP 0298423; depozit FERM BP-1901) a obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. : 4 nebo její významnou část. Významná část aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 4 znamená polypeptid obsahující alespoň 70% aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 4, a který konstituje funkčně ekvivalentní AveC homologní genový produkt. Funkčně ekvivalentní AveC homologní genový produkt je definován jako genový produkt, který je-li exprimován v kmeni S. hygroscopicus FERM BP-1901, v kterém byla nativní aveC homologní alela inaktivována, vede k produkci významně stejného poměru a množství milbemycinů, jako jsou produkovány kmenem S. hygroscopicus FERM BP-1901 exprimujícím místo divokého typu funkční aveC homologní alelu nativní kmeni S. hygroscopicus FERM BP-1901. V neomezující formě vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula, která je předmětem předkládaného vynálezu, a která kóduje S. hygroscopicus AveC homologní genový produkt, nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 3 nebo její významnou část. V tomto ohledu znamená významná část izolované polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 3 izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující alespoň 70% nukleotidové sekvence SEQ ID č.3, která kóduje funkčně ekvivalentní AveC homologní genový produkt, jak je definováno výše.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní s S. hygroscopicus nukleotidovou sekvencí SEQ ID č. 3. Termín homologní, je-li použit k odkazu na polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní s S. hygroscopicus AveC homologní genový produkt-kódující sekvencí SEQ ID č. 3, znamená polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci: a) která kóduje stejný genový produkt, • Φ ··· ·

4» ··«· ** ··*· « · * · · * • · · * · · · • · · * · * • · · · · » ···· ·« ·· ··· jako je nukleotidové sekvence SEQ ID č. 3, ale která obsahuje jednu nebo více němých změn v nukleotidové sekvenci podle degenerace genetického kódu (tj. degenerovaná varianta); nebo b) která hybridizuje, aby komplementovala polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4 za mírně přísných podmínek, tj. hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA při teplotě 65 °C, a promytí v 0,2 x SSC/0,1% SDS při teplotě 42°C (viz Ausubel et al. viz výše), která kóduje funkčně ekvivalentní AveC homologní genový produkt, jak je definováno výše. V přednostní formě vynálezu hybridizuje homologní polynukleotidové molekula, aby zkomplementovala AveC genový produkt-kódující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 3 za vysoce přísných podmínek tj. hybridizace k odfiltrování navázané DNA v 0,5 M NaHPO_4/ 7% SDS, 1 mM EDTA při teplotě 65°C, a promytí v 0, 1 x SSC/0,1% SDS při teplotě 68°C (viz Ausubel et al., 1989, výše), která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak je definováno výše.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, který je homologní s S. hygroscopicus AveC homologním genovým produktem. Jak je zde používáno, týká se termín homologní s odkazem na polypeptidy, které jsou homologní s AveC homologním genovým produktem se sekvencí SEQ ID č. 4 ze S. hygroscopicus, polypeptidu, který má jinak aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4, ale v které jedno nebo více aminokyselinových reziduí bylo konzervativně substituováno odlišným aminkyselínovým reziduem, jak je definováno výše, kde řečená aminokyselinová sekvence má alespoň 70%, přednostněji alespoň 80%, nej přednostněji alespoň 90% aminokyselinovou sekvenční identitu k polypeptidu o sekvenci SEQ ID č.4, jak je určeno jakýmkoli standardním algoritmem ·» • * · « · · · · » * »»·» ·· ·· ·** ·· ··*· aminokyselinové sekvenční identity, jako je například algoritmus BLASTP (GENBANK), NCBI), kde taková konzervativní substituce vede k funkčně ekvivalentnímu AveC homolognímu genovému produktu, jak je definováno výše.

Předkládaný vynález dále poskytuje oligonukleotidy, které hybridizují s polynukleotidovou molekulou mající nukleotidovou sekvenci uvedenou na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) nebo SEQ ID č. 3, nebo polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která je komplementární nukleotidové sekvenci uvedené na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) nebo SEQ ID č. 3. Takové oligonukleotidy mají alespoň 10 nukleotidů, přednostně od zhruba 15 do zhruba 30 nukleotidů, a hybridizují s jednou s výše uvedených polynukleotidových molekul za vysoce přísných podmínek tj. promytí v 6 x SSC/0,5% pyrofosfátu sodném při teplotě zhruba 37 °C pro oligonukleotidy o zhruba 14 bázích, při teplotě zhruba 48°C pro oligonukleotidy o zhruba 17 bázích, při teplotě zhruba 55°C pro oligonukleotidy o zhruba 20 bázích, a při teplotě zhruba 60 °C pro oligonukleotidy o zhruba 23 bázích. V přednostní formě vynálezu jsou oligonukleotidy komplementární k části jedné z výše zmíněných polynukleotidových molekul. Tyto oligonukleotidy jsou užitečné pro celou řadu účelů včetně kódování nebo účinkování jako antisense molekuly pro regulaci genů, nebo jako primery pro amplifikaci aveC nebo aveC homolog-kóduj icích polynukleotidových molekul.

Další aveC homologní geny mohou být identifikovány u jiných druhů nebo kmenů Strptomyces za použití polynukleotidových molekul nebo oligonukleotidů uvedených zde ve spojení se známými technikami. Například oligonukleotidová molekula obsahující část S. avermitilis nukleotidové sekvence z Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) , nebo část S. avermitilis nukleotidové sekvence SEQ ID č. 3 může být detekovatelně označena a použita ·· ···· • · · * • r - » • · · · ⁸ * ₂₄ *-“···’ ·· — k vyhledávání genomické knihovny konstruované z DNA odvozené z organismu, který je předmětem zájmu. Přísnost hybridizačních podmínek je zvolena na základě vztahu referenčního organismu, v tomto případě S. avermitilis nebo S. hygroscopicus, k organismu, který je předmětem zájmu. Požadavky na různě přísné podmínky jsou dobře známy osobám zkušeným oboru, a tyto podmínky se liší v závislosti na specifických organismech, z nichž jsou knihovna a označené sekvence odvozeny. Takové oligonukleotidy mají přednostně alespoň zhruba 15 nukleotidů, například se jedná o oligonukleotidy popsané v příkladech provedení vynálezu níže. Amplifikace homologních genů může být provedena za použití těchto i jiných oligonukleotidů použitím standardních technik, jako je například polymerázová řetězová reakce ( PCR) , ačkoli mohou být použity i jiné amplifikační techniky známé v oboru.

Klony identifikované jako obsahující aveC homologní nukleotidové sekvence mohou být testovány na schopnost kódovat funkční AveC homologní genový produkt. Pro tento účel mohou být klony podrobeny sekvencí analýze za účelem identifikace vhodného čtecího rámce, stejně tak jako iniciačních a terminačních signálů. Klonované DNA sekvence mohou být alternativně nebo navíc inzerovány do vhodného expresního vektoru, tj . do vektoru, který obsahuje nezbytné elementy pro transkripi a translaci inzerované protein-kódující sekvence. Může být použit jakýkoli z celé řady hostitelských/vektorových systémů, jak je popsáno níže, které zahrnují, ale nejsou omezeny na bakteriální systémy, jako jsou například plazmidové, bakteriofágové nebo kosmidové expresní vektory. Příslušné hostitelské buňky transformované takovými vektory zahrnující potenciální aveC homolog-kódující sekvence mohou být poté analyzovány na aktivitu AveC za použití způsobů, jako je například HPLC analýza fermentačních produktů, jak je popsáno například v Části 7 níže.

• · · ·

Produkce a manipulace polynukleotidových molekul zde uvedených jsou známé v oboru a mohou být provedeny podle rekombinantních technik popsaných například v Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrok et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR strategies, Academie Press, lne., San Diego; a Erlich (ed) , 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, kteréžto publikace jsou všechny do vynálezu začleněny jako reference. Polynukleotidové klony kódující AveC genové produkty nebo AveC homologní genové produkty, mohou být identifikovány za pomoci metod známých v oboru, které zahrnují, ale nejsou omezeny na způsoby uvedené v Části 7 níže. Genomické knihovny mohou být vyhledávány na aveC a aveC homologní kódující sekvence za použití technik, jako jsou například metody uvedené v publikaci Benton a Davis, 1977, Science 196:180 pro bakterifágové knihovny, a v publikaci Grunstein a Hodness, 1975, Proč Nati Acad sci USA, 72: 39613965 pro plazmidové knihovny. Polynukleotidové molekuly mající nukleotidové sekvence, o kterých je známo, že zahrnují aveC ORF jako takový, například v plazmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo v plazmidu pSE119 (popsáno v Části 7 níže) , mohou být použity jako próby v těchto vyhledávacích experimentech. Oligonukleotidové próby mohou být syntetizovány alternativně tak, že korespondují s nukleotidovými sekvencemi odvozenými od částečných nebo úplných aminokyselinových sekvencí purifikovaného AveC homologního genového produktu.

5.2 Rekombinantní systémy

5.2.1 Klonovací a expresní vektory

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní klonovací vektory a expresní vektory, které jsou užitečné pro klonování nebo exprimování polynukleotidových molekul, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, například aveC ORF S. avermitilis nebo jakýchkoli aveC homologních ORF. V nelimitující formě poskytuje předkládaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), který obsahuje kompletní ORF aveC gen S. avermitilis.

Všechny z následujících popisů týkajících se aveC ORF z S. avermitilis, nebo polynukleotidové molekuly obsahující aveC ORF z S. avermitilis, nebo její část, nebo S. avermitilis AveC genový produkt, se také týkají aveC homolog a AveC homologních genových produktů, ledaže je výslovně nebo z kontextu uvedeno j inak.

Pro specifické použití u Sterptomycet byla použita celá řada různých vektorů, zahrnujících mezi jinými vektory fágové, plazmidy s vysokým počtem kopií, plazmidy s nízkým počtem kopií a E. coli-Streptomyces přenosové vektory, a jakýkoli z nich může být použit k provedení předkládaného vynálezu. Ze Streptomycet byla také klonována celá řada genů pro lékovou rezistenci a některé z těchto genů byly začleněny do vektorů jako vektory, které je možno zvolit. Příklady běžných vektorů pro použití v Streptomyces jsou prezentovány mezi jinými místy v publikaci Hutchinson 1980, Applied Biochem Biotech 16:169190.

Rekombinantní vektory, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, obzvláště expresní vektory, jsou přednostně konstruovány tak, že kódující sekvence polynukleotidové • · · · • · · • · molekuly, která je předmětem vynálezu, je v operačním spojení s jedním nebo více regulačních elementů nezbytných pro· transkripci a translaci kódující sekvence za účelem produkce polypeptidů. Jak je zde používáno, termín regulační element” zahrnuje, ale není omezen na nukleotidové sekvence, které kódují induktibilní a neinduktibilní promotory, enhancery a další elementy známé v oboru, které slouží k regulaci exprese polynukleotid-kódujících sekvencí. Jak je zde také použito, je kódující sekvence v operačním spojení s jedním nebo více regulačních elementů, kde regulační elementy účinně regulují a umožňují transkripci kódující sekvence nebo translaci jeho mRNA, či obojí.

Typické plazmidové vektory, které mohou být připraveny, aby obsahovaly mezi mnoha jinými pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) a transportní vektor pWHM3 (Vara et al. , 1989, J. Bact. 171:5872-5881).

Způsoby pro konstrukci rekombinantních vektorů obsahující konkrétní kódující sekvence v operačním spojení s příslušnými regulačními elementy jsou dobře známy v oboru, a tyto způsoby mohou být použity k provedení předkládaného vynálezu. Tyto způsoby zahrnují in vitro rekombinantní techniky, syntetické techniky a in vivo genetickou rekombinaci. Viz například techniky popsané v publikaci Maniatis et al. , 1989, výše;

Ausubel et al., 1989, výše; Sambrook et al., 1989, výše; Innis et al., 1995, výše; Erlich 1992, výše.

Regulační elementy těchto vektorů se mohou lišit ve své síle ve svých specifitách. V závislosti na použitém hostitelském/vektorovém systému může být použito jakékoli množství vhodných transkripčních a translačních elementů. Neomezující příklady transkripčních regulačních oblastí nebo promotorů pro baktérie β-gal promotor, T7 promotor, TAC • * « · • · · · · · promotor, λ levý a pravý promotor, trp a lac promotory, trp-lac fúzní promotory a specifičtěji pro Streptomyces, promotory ermE, mele a tipA, atd. Ve specifické formě popsané v Části 11 níže byl generován expresní vektor, který obsahuje klonovaný aveC ORF přilehle k silnému konstitutivnímu ermE promotoru ze Sacharopolyspora erythraea. Vektor bl transformován do S. avermitilis a následná HPLC analýza ferementačních produktů ukázala zvýšený titr produkovaných avermektinů ve srovnání s produkcí stejného kmene, který ale exprimuje divoký typ aveC alely.

Fúzní proteinové expresní vektory mohou být použity k expresi AveC genový produkt-fúzního proteinu. Purifikovaný fúzní protein může být použit k získání antiséra proti AveC genovému produktu, ke studiu biochemických vlastností AveC genového produktu, k přípravě AveC fúzních proteinů s odlišnými biochemickými aktivitami a k pomoci identifikovat nebo purifikovat exprimovaný AveC genový produkt. Možné expresní vektory pro fúzní protein zahrnují, ale nejsou omezeny na vektory inkorporující sekvence, které kódují β-galaktosidázu a trpE fúze, maltózu vázající proteinové fúze, glutathion-Stranferázové fúze a polyhistidinové fúze ( nosičové oblasti) . V alternativní formě vynálezu mohou být AveC genový produkt nebo jeho část zfúzovány s AveC homologním genovým produktem nebo jeho částí, odvozené od jiných druhů nebo kmene Streptomyces, jako jsou například S. hygroscopicus nebo S. griseochromogenes. V konkrétní formě vynálezu popsané v Části 12 níže a zobrazené na Obrázku 7 byl zkonstruován chimérický plazmid. Který obsahuje 564 bp oblast S. avermitilis aveC ORF. Takové hybridní vektory mohou být transformovány do buněk S. avermitilis a testovány za účelem určení jejich efektu například na poměr třídy 2: 1 produkovaných avermektinů.

• · ···· · · • · · · ··· ·

AveC fúzní proteiny mohou být připraveny, aby obsahovaly oblast užitečnou pro purifikaci. Fúzní AveC-maltózu vázající protein může být například purifikován za použití amylózové pryskyřice; fúzní proteiny AveC-glutathion-S-tranferáza mohou být purifikovány za použití glutathion-agarózy; fúzní proteiny AveC-polyhistidin mohou být purifikovány za použití pryskyřice s bivalentním niklem. Pro purifikaci fúzního proteinu afinitní chromatografii mohou být alternativně použity protilátky proti nosičovému proteinu nebo peptidu. Například nukleotidová sekvence kódující cílový epitop monoklonální protilátky může být připravena do expresního vektoru v operačním spojení s regulačními elementy a situována tak, že exprimovaný epitop je zfúzován do AveC polypeptidu. Například nukleotidová sekvence kódující FLAG™ epitopovou návěst’ (International Biotechnologies lne. ) , což je hydrofilní markerový peptid, může být inzertován standardními technikami do expresního vektoru v bodě odpovídajícím například karboxylovému konci AveC polypeptidu. Exprimovaný AveC polypeptid-FLAG™ epitop fúzní produkt může být poté detekován a afinitně purifikován za použití komerčně dostupných anti-FLAG™ protilátek.

Expresní faktor kódující AveC fúzní protein může být také připraven, aby obsahoval polyspojující sekvence kódující specifická proteázová štěpící místa tak, že exprimovaný AveC polypeptid může být uvolněn z nosičové oblasti nebo z fúzního partnera pomocí specifické proteázy. Fúzní proteinový vektor může například zahrnovat DNA sekvence kódující mezi jinými trombin nebo faktor Xa štěpící místa.

Signální sekvence nahoru od, a ve čtecím rámci aveC ORF může být vpravena do expresního vektoru známými způsoby, aby se usměrnil směr a sekrece exprimovaného genového produktu. Neomezující příklady signálních sekvencí zahrnují mezi jinými • · sekvence α-faktoru, imunoglobulinů, vnějších membránových proteinů, penicilinázy a T buněčných receptorů.

jsou předmětem připraven tak,

K pomoci při výběru hostitelských buněk transformovaných nebo transfektovaných klonovacími nebo expresními vektory, které předkládaného vynálezu může být vektor že dále obsahuje kódující sekvenci pro reportérový genový produkt nebo jiný volitelný markér. Taková kódující sekvence je přednostně v operačním spojení se sekvencemi kódujícícmi regulační element, jak je popsáno výše. Reportérové geny, které jsou užitečné ve vynálezu, jsou dobře známé v oboru a zahrnují geny kódující mezi jinými zelený fluorescenční protein luciferázu, xylE a tyrosinázu. Nukleotidové sekvence kódující volitelné markéry jsou dobře známé v oboru a zahrnují sekvence, které kódují genové produkty udělující rezistenci vůči antibiotikům nebo antimetabolitům, nebo které dodávají auxotrofické požadavky. Příklady takových sekvencí zahrnují sekvence, které kódují rezistenci mezi mnoha jinými k erytromycinu, thiostreptonu nebo kanamycinu.

5.2.2. Transformace hostitelských buněk

Předkládaný vynález dále poskytuje transformované hostitelské buňky obsahující polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor, které jsou předmětem vynálezu, a nové kmeny nebo buněčné linie od nich odvozené. Hostitelské buňky užitečné pro provedení vynálezu jsou přednostně buňky Streptomyces, ačkoli mohou být použity i jiné prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Takové transformované hostitelské buňky typicky zahrnují, ale nejsou omezeny na mikroorganismy, jako jsou například baktérie transformované mezi jinými rekombinantní bakteriofágovými DNA, plazmidovými DNA nebo kosmidovými DNA vektory, nebo kvasinkami transformovanými rekombinantními vektory.

···· ·· · * • · · · · • · · · · · • · · · · • · · · ··· ·· · · · ·

Polynukleotidové molekuly, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, jsou zamýšlené, aby fungovaly u buněk Streptomyces, ale mohou být také transformovaný do jiných bakteriálních nebo eukaryotických buněk, napříkad pro klonovací nebo expresní účely. Může být typicky použit kmen E. coli, jako například kmen DH5a, dostupný z Americké sbírky typových kultur (ATCC), Rockville, MD, USA) ( přístupové číslo 31343) a z komerčních zdrojů ( Stratagene) . Přednostní hostitelské buňky zahrnují kvasinkové buňky, ačkoli mohou být účinně použity i savčí buňky nebo buňky hmyzu.

Rekombinantní expresní vektor, který je předmětem vynálezu, je přednostně transformován nebo tranfektován do jedné nebo více hostitelských buněk nebo významně homogenní kultury buněk. Expresní vektor je obecně začleněn do hostitelských buněk ve shodě se známými technikami, jako jsou například protoplastová transformace, precipitace kalcium fosfátem, reakce s chloridem vápenatým, mikroinjikace, elektroporace, transfekce kontaktem s rekombinovaným virem, transfekce řízená lipozómem, transfekce s DEAE dextranem, transdukce, konjugace nebo bombardování mikroprojektiy. Volba transformačních látek může být provedena standardními postupy, jako je například pro buňky exprimující volitelný markér volba, například antibiotické rezistence sdružené s rekombinantním vektorem, jak je popsáno výše.

Jakmile je expresní vektor začleněn do hostitelské buňky, může být integrace a udržení aveC kódující sekvence, buďto v chromozómu hostitelské buňky, nebo epizomálně, potvrzena standardními technikami, například Southern hybridizační analýzou, restrikční enzymovou analýzou, PCR analýzou zahrnující PCR s reverzní transkriptázou (rt-PCR), nebo imunologickou analýzou za účelem detekce očekávného genového ·· · * » · · · · • » ····· · · <

• ···· ···· · ··· · · · ··♦

...... ’· ··· ·· ···' produktu. Hostitelské buňky obsahující a/nebo exprimující rekombinantní aveC kódující sekvenci, mohou být identifikovány jakýmkoli z alespoň čtyř obecných přístupů, které jsou dobře známé v oboru, které zahrnují: i) DNA-DNA, DNA-RNA, nebo RNAantisense RNA hybridizaci; ii) detekci přítomnosti funkčnosti markerového genu; iii) posouzení stupně transkripce měřením exprese aveC-specifických mRNA transkriptů v hostitelské buňce; a iv) detekci přítomnosti zralého polypetidového produktu například imunoanalýzou nebo přítomností AveC biologické aktivity (jako je například produkce nebo specifické poměry a množství avermektinů ukazující na AveC aktivitu v například S. avermitilis hostitelských buňkách) .

5.2.3. Exprese a charakterizace rekombinantního AveC genového produktu

Jakmile byla stabilně vložena do příslušné hostitelské buňky aveC kódující sekvence, je transformovaná hostitelská buňka klonově propagována, a výsledné buňky mohou růst za podmínek napomáhajících maximální produkci AveC genového produktu. Takové podmínky typicky zahrnují rostoucí buňky do vysoké denzity. Kde expresní vektor obsahuje induktibilní promotor, jsou použity příslušné indukční podmínky, jako jsou například teplotní posun, deplece živin, přidání bezdůvodných induktérů (jako jsou například analoga karbohydrátů, jako například izopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG)), akumulace nadbytku metabolických vedlejších produktů, nebo podobně, jak je požadováno k indukování exprese.

Kde je exprimovaný AveC genový produkt zadržen uvnitř hostitelských buněk, jsou tyto buňky sesbírány a zlyzovány, a produkt je izolován a purifikován z lyzátu za extrakčních podmínek známých v oboru, aby se minimalizovala degradace bílkovin, jako jsou například teplota 4°C nebo přítomnost inhibitorů proteáz, nebo obojí. Kde je exprimovaný AveC genový • · • · · · produkt sekretován z hostitelských buněk, může být vyčerpané živné médium jednoduše sebráno a produkt z něj může být izolován.

Exprimovaný AveC genový produkt může být izolován nebo významně purifikován podle vhodnosti z buněčných lyzátů nebo kultivačního média za použití standardních způsobů zahrnujících, ale neomezujících se na jakoukoli kombinaci z následujících způsobů: amonsulfátová precipitace, frakcionce podle velikosti, ionexová chromatografie, HPLC, denzitní centrifugace a afinitní chromatografie. Kde exprimovaný AveC genový produkt vykazuje biologickou aktivitu, může být zvyšující se čistota preparátu monitorována v každém kroku purifikačního postupu použitím jakékoli vhodné analýzy. Ať už exprimovaný AveC genový produkt vykazuje biologickou aktivitu či nikoli, může být detekován na základě například velikosti, nebo reaktivity s protilátkou jinak specifickou pro AveC, nebo pomocí přítomnosti fúzní návěsti. Jak je zde používáno, je AveC genový produkt významně purifikován tam, kde produkt konstituje více než 20 váhových % bílkoviny v konkrétním preparátu. Jak je zde také používáno, je AveC genový produkt izolován, kde tento produkt konstituje alespoň 80 váhových % bílkoviny v konkrétním preparátu.

Předkládaný vynález tedy poskytuje rekombinantně-exprimovaný izolovaný nebo významně purifikovaný S.avermitilis AveC genový produkt obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou AveC genový produkt-kódující sekvencí plazmidu pSE186 (ATCC 209604) , nebo aminokyselinovou sekvencí z Obrázku 1 (SEQ ID č. 2), nebo její významnou část a její homologa.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantně-exprimovaný izolovaný nebo významně purifikovaný S.hygroscopicus AveC • · ·· · · ♦ · · · · · • · ····· ·· · • ·«·· · · · · · ·»··· · · · ·

...... ·· ··· ” ·*** homologní genový produkt obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4, nebo její významnou část a její homologa.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob produkce AveC genového produktu zahrnující kultivaci hostitelské buňky transformované rekombinantním expresním vektorem, kde řečený vektor zahrnuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt, kterážto polynukleotidová molekula je v operačním spojení s jedním nebo více regulačních elementů, které kontrolují expresi polynukleotidové molekuly v hostitelské buňce za podmínek napomáhajících produkci rekombinantního AveC genového produktu a získání AveC genového produktu z buněčné kultury.

Rekombinantně exprimovaný S. avermitilis AveC genový produkt je užitečný pro celou řadu účelů zahrnujících vyhledávání sloučenin, které narušují funkci AveC genového produktu a tím modulují biosyntézu avermektinů, a dále získávání protilátek namířených proti AveC genovému produktu.

Jakmile je AveC genový produkt o dostatečné čistotě získán, může být charakterizován standardními způsoby zahrnujícími SDS-PAGE, chromatografíí na základě separace podle velikosti, aminokyselinovou sekvenční analýzu, biologickou aktivitu v produkujících příslušných produktech v biosyntetické dráze avermektinů, atd. Aminokyselinová sekvence AveC genového produktu může být například určena za použití standardních sekvenčních technik pro peptidy. AveC genový produkt může být dále charakterizován za použití analýzy hydrofility (viz napříkad Hopp a Woods, 1981, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 78:3824), nebo analogickým softwarovým algoritmem za účelem identifikace hydrofobních a hydrofílních oblastí AveC genového produktu. Strukturální analýza může být provedena za účelem identifikace oblastí AveC genového produktu, které jsou • · ···· ·· · · 4 · · 4 · · • · 4 ··· · 4 · · • 4 44444 44 4

44>4 · · 4 4 4

444» 4 4 44 ··· ·· 44 4 4 zodpovědné za sekundární strukturu. K mapování a studiu míst interakcí mezi AveC genovým produktem a jeho substrátem mohou být použity biofyzikální metody, jako jsou například rentgenová krystalografie (Engstrom, 1974, Biochem Exp Biol 11:7-13) počítačové modelování ( Fletterick a Zoller ( eds), 1986, v: Current Communications in Molecular Biology, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) a nukleární magnetická rezonance (NMR). Informace získané z těchto studií mohou být použity k vybrání nových míst pro mutace v aveC ORF, aby se pomohlo vyvinout nové kmeny S. avermitilis mající více žádoucí charakteristiky produkce avermektinů.

5.3. Konstrukce a použití AveC mutant

Předkládaný vynález poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je jinak stejná jako S. avermitilis aveC alela nebo její degenerační varianta, nebo AveC genový produkt-kódující sekvence plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo její degenerační varianta, nebo nukleotidová sekvence aveC ORF S. avermitilis, jak je prezentováno na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její degenerační varianta, ale které dále obsahují jednu nebo více mutací, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, v kterých byl divoký typ aveC alely inaktivován, a který exprimuje polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, nebo její degenerační variantu, produkují odlišný poměr nebo množství avermektinů, které jsou produkovány buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které exprimuji pouze divoký typ aveC alely.

Podle předkládaného vynálezu mohou být takové polynukleotidové molekuly použity k produkci nových kmenů S. avermitilis, které vykazují detekovatelnou změnu v produkci avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu jsou takové • · • · · · • · ··· · · · · · · .··· ·· .. ..· ......

polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují avermektiny ve sníženém poměru třídy 2: 1 ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V další přednostní formě jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, které produkují zvýšená množství avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze jediný divoký typ aveC alely. V další přednostní formě jsou takové polynukleotidové molekuly užitečné pro produkci nových kmenů S. avermitilis, v kterých aveC gen inaktivován.

Mutace aveC alely nebo kódující sekvence jakékoli mutace, které vedou k jedné nebo více delecím, adicím nebo substitucím do AveC genového produktu, nebo které vedou ke vzniku zkomoleného AveC genového produktu, nebo k jakékoli jejich kombinaci, a které vedou k požadovanému výsledku. Takové mutované sekvence aveC alely jsou také zamýšleny, aby obsahovaly jejich degenerované varianty. Předkládaný vynález například poskytuje polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci aveC alely nebo její degenerované varianty, nebo AveC genový produkt-kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo její degenerovanou variantu, nebo nukleotidovou sekvenci aveC ORF S. avermitilis, jak je uvedeno na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její degenerovanou variantu, ale které dále obsahují jednu nebo více mutací, které kódují substituci aminokyselinového rezidua odlišným aminokyselinovým reziduem ve zvolených pozicích v AveC genovém produktu. V několika neomezujících formách vynálezu, z nichž několik je uvedeno příkladem níže, mohou být takové substituce provedeny v jakýchkoli aminokyselinových pozicích AveC genového produktu, které korespondují s aminokyselinovými pozicemi 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238,

266, 27 5, 289 nebo 298 sekvence SEQ ID č. 2, nebo některými jejich kombinacemi.

» «

Mutace aveC kódující sekvence jsou provedeny jakoukoli ze známých metod- zahrnujících použití PCR náchylné k chybám, nebo kazetové mutageneze. K narušení sekvence aveC alely nebo ORF definovaným způsobem, například vložením jednoho nebo více restrikčních míst, nebo terminačního kodónu, do specifických oblastí v aveC alele nebo ORF může být například použita mutageneze řízená oligonukleotidem. K tvorbě velkých knihoven polynukleotidů mající nukleotidové sekvence kódující aveC mutace mohou být také použity metody například popsané v patentech US Patent 5605793, US Patnt 5830721 a US Patent 5837458, které zahrnují náhodnou fragmentaci, opakované cykly mutageneze a nukleotidové přemísťování.

Užitečné mohou být cílené mutace, obzvláště tam, kde slouží k narušení jednoho nebo více konzervovaných aminokyselinových reziduí v AveC genovém produktu. Například srovnání odvozených aminokyselinových sekvencí AveC genových produktů a AveC homologních genových produktů ze S. avermitilis (SEQ ID č. 2) , S. griseochromogenes ( SEQ ID č. 5) a S. hygroscopicus ( SEQ ID č. 4), jak jsou uvedeny na Obrázku 6, ukazuje místa významné konzervace aminokyselinových reziduí mezi těmito druhy. V tvorbě nových mutovaných kmenů, které vykazují požadované alterace produkce avermektinů může být obzvláště účinná cílená mutageneze, která vede ke změně v jednom nebo více těchto konzervovaných aminokyselinových reziduích.

Užitečná může být také náhodná mutageneze, která může být provedena expozicí buněk S. avermitilis ultrafialovému záření nebo rentgenovému záření, nebo chemickým mutagenům, jako jsou například N-metyl-N' -nitrosoguanidin, etyl metan sulfonát, kyselina dusičná nebo nitrogen mustard. Pro shrnutí technik mutageneze viz například Ausubel, 1989 výše.

• · • · · · · ·

Jakmile jsou mutované polynukleotidová sekvence generovány, jsou prohlíženy, aby se určilo, zdali mohou modulovat biosyntézu avermektinů v S. avermitilis. V přednostní formě vynálezu je polnukleotidová molekula mající mutovanou nukleotidovou sekvenci testována komplementací kmene S.

avermitilis, v kterém byl aveC gen inaktivován za vzniku aveC negativního (aveC) pozadí. V neomezujícím způsobu je mutovaná polynukleotidová molekula sestříhaná do expresního plazmidu v operačním spojení s jedním nebo více regulačních elementů, kterýžto plazmid také přednostně obsahuje jeden nebo více genů pro lékovou rezistenci, které umožňují výběr transformovanýh buněk. Tento vektor je poté transformován do aveC hostitelských buněk za pomocí známých technik a transformované buňky jsou vybrány a kultivovány v příslušném fermentačním médiu za podmínek, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů. Fermentační produkty jsou poté analyzovány pomocí HPLC, aby se určila schopnost mutované polynukleotidové molekuly ke komplementaci hostitelské buňky. Některé vektory nesoucí mutované polynukleotidové molekuly schopné snížit B2: B1 poměr avermektinů zahrnující pSE 188, pSE 199, pSE 231, pSE 239 a pSE 290 až pSE 297, jak je uvedeno příkladem v Části 8, 3 níže.

Předkládný vynález poskytuje způsoby identifikace mutací S. avermitilis aveC ORF schopných narušit poměr a/nebo mnoožství produkovaných avermektinů. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob identifikace mutací schopných narušit poměr třídy 2: 1 produkovaných avermktinů, kterýžto způsob zahrnuje (a) určení poměru třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt, a tato molekula je exprimována; ( b) určení poměru třídy 2: 1 avermektinů

	39	·· ···· 44 »*»· ·· ·· • · « 4 · * ·«· 4 4 44444 ·« 4 4«·· · · * · · • 444 44 44 444 ·· · · »
produkovaných	buňkami stejného kmene	S. avermitilis jako
v kroku ( a) ,	ale kteréžto buňky místo	toho exprimují pouze
divoký typ aveC alely nebo ORF z Obrázku	1 ( SEQ ID č. 1) , nebo
nukleotidovou	sekvenci, která je k ORF homologní; a (c)

porovnání poměru třídy 2: 1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) s poměrem třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku ( b) ; takže je-li poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku ( a) odlišný od poměru třídy 2: 1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b) , poté může být identifikována mutace aveC ORF schopná pozměnit poměr třídy 2: 1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je poměr třídy 2: 1 avermektinů touto mutací snížen.

avermektinů, avermektinů

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob identifikace mutací aveC ORF nebo genetických konstruktů obsahujících aveC ORF schopné změnit množství produkovaných kterýžto způsob zahrnuje: ( a) určení množství produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, v kterých byla nativní aveC alela inaktivována, a do kterých byla vložena polynukleotidové molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt, nebo obsahující genetický konstrukt zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt a tato molekula je exprimována; ( b) určení množství avermektinů produkovaných stejným kmenem S. avermitilis jako v kroku (a), ale kterýžto kmen místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely nebo homologní nukleotidovou sekvenci; a ( c) porovnání množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) s množstvím avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku ( b) ; takže je-li množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (a) odlišné od množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b) , poté může být identifikována mutace aveC ORF nebo genetického • · · · * · * • · · · * * « ···· .. ..... ......

konstruktu schopná pozměnit poměr třídy 2: 1 avermektinů.

V přednostní formě vynálezu je produkované množství avermektinů touto mutací zvýšeno.

Jakýkoli z výše uvedených způsobů k identifikaci mutací může být proveden za použití fermentačního kultivačního média přednostně suplementovaného cyklohexan karboxylovou kyselinou, ačkoli mohou být použity i jiné vhodné prekurzory mastných kyselin, jako jsou například jakékoli prekurzory mastných kyselin uvedených v Tabulce 1.

Jakmile je identifikována mutovaná polynukleotidová molekula, která moduluje produkci avermektinů žádoucím směrem, může být určeno umístění mutace v nukleotidové sekvenci.

Polynukleotidová molekula mající nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt může být například izolována pomocí PCR a podrobena DNA sekvenční analýze za použití známých způsobů. Mutace zodpovědná( é) za alteraci produkce avermektinů může být určena srovnáním DNA sekvence mutovaé aveC alely se sekvencí divokého typu aveC alely. Ve specifických, avšak neomezujících formách předkládaného vynálezu vedly S. avermitilis AveC genové produkty obsahující buďto jedinou aminokyselinovou substituci v jakémkoli z reziduí 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T), nebo 230 ( G230D) , nebo dvě substituce v pozicích 138 (S138T) a 139 ( A139T nebo A139F) ke změnám ve funkci AveC genového produktu, takže poměř třídy 2: 1 produkovaných avermektinů byl narušen ( viz Část 8 níže), kde uvedené aminokyselinové pozice korespondují s pozicemi na Obrázku 1 (SEQ ID č. 2) . Navíc bylo prokázáno, že následujících sedm kombinací mutací účinně snižuje poměr třídy 2: 1 S138T/A139T/G179S; 3) avermektinů: 1) D48E; 2)

Q38P/L136P/E238D; 4)

F99S/S138T/A139T/G179S; 5) A139T/M228T; 6) G111V/P289T. Jak je zde používáno, výše uvedená označení, jako například A139T, ♦ · · ·- . · · ' ♦ ···· ·· ·♦ ·*· ·* ·*·· ukazují původní aminokyselinové reziduum jednopísměnovým označením, v kterém je v tomto případě alanin ( A) v uvedené pozici, která je v tomto případě pozice 139 ( týká se SEQ ID č. 2) polypeptidu, a následuje aminokyselinové reziduum, které nahrazuje původní aminokyselinové reziduum, kterým je v tomto případě threonin ( T) . Z tohoto důvodu jsou polynukleotidové sekvence mající nukleotidové sekvence, které kódují mutované S. avermitilis genové produkty obsahující aminokyselinové substituce nebo delece v jedné nebo více aminokyselinových pozic 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228,

230, 238, 266, 275, 289, nebo 298 (viz Obrázek 1), nebo jakékoli jejich kombinace, zahrnuty předkládaným vynálezem.

V přednostní formě vynálezu kódují takové mutace aminokyselinové substituce vyrané z jedné nebo více skupin obsahuj ící:

a) aminokyselinové reziduum Q v pozici 38 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P;

b) aminokyselinové reziduum D v pozici 48 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E;

c) aminokyselinové reziduum A v pozici 89 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T;

d) aminokyselinové reziduum F v pozici 99 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S;

e) aminokyselinové reziduum G v pozici 111 nahrazené V nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro V;

f) aminokyselinové reziduum L v pozici 136 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P;

g) aminokyselinově reziduum S v pozici 138 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T;

h) aminokyselinové reziduum A v pozici 139 nahrazené T nebo F nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T nebo F;

• ·« · • 99 ···» ·· ·· ··· «· ··»<

i) aminokyselinové reziduum K v pozici 154 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E;

j) aminokyselinové reziduum G v pozici 179 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S;

k) aminokyselinové reziduum M v pozici 228 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T;

l) aminokyselinové reziduum E v pozici 238 nahrazené D nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro D;

m) aminokyselinové reziduum P v pozici 289 nahrazené L nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro L; a

n) aminokyselinové reziduum Q v pozici 298 nahrazené H nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro H;

kde konzervativní aminokyselinové substituce jsou stejné, jako je definováno výše v Sekci 5.1

V další přednostní formě vynálezu kódují takové mutace kombinaci aminokyselinových substitucí, kde kombinace substituovaných aminokyselinových reziduí je vybrána ze skup iny ob s ahuj ící:

a) aminokyselinová rezidua S138 a A13 9;

b) aminokyselinová rezidua D48 a A89;

c) aminokyselinová rezidua S138 a A139 a G179;

d) aminokyselinová rezidua Q38, L136 a E238;

e) aminokyselinová rezidua F99, S138, A139 a G179;

f) aminokyselinová rezidua A139 a M228;

g) aminokyselinová rezidua GUI a P289; a

h) aminokyselinová rezidua A139, K154 a Q298.

V další přednostní formě vynálezu jsou specifické kombinace mutací aveC alely užitečné pro efektivní snížení poměru třídy 2:1 avermektinů podle předkládaného vynálezu vybrány z jedné nebo více skupin obsahujících:

a) S138T/A139T

b) S138T/A139F ř»t»

c) D48E/A89T;

d) S138T/A139T/G179S;

e) Q38P/L136P/E238D;

f) F99S/S138T/A139T/G179S;

g) A139T/M228T;

h) G111V/P289L; a

i) A139T/K154E/Q298H.

Předkládaný vynález dále poskytuje preparáty pro přípravu nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky obsahují mutovanou aveC alelu, která vede k narušení produkce avermektinů. Předkládaný vynález například poskytuje rekombinantní vektory, které mohou být použity k zacílení jakékoli polynukleotidové molekuly obsahující mutované nukleotidové sekvence, které jsou předmětem předkládaného vynálezu na místo aveC genu chromozómu S. avermitilis buďto k inzerci nebo k nahrazení aveC ORF nebo jeho části pomocí homologní rekombinace. Podle předkládaného vynálezu však může polynukleotidová molekula obsahující zde poskytnutou mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, také modulovat biosyntézu avermektinů, je-li inzerována do chromozómu v místě jiném než je aveC gen, nebo je-li udržována epizomálně v buňkách S. avermitilis. Předkládaný vynález tedy také poskytuje vektory obsahuj ící polynukleotidovou molekulu obsahuj ící mutovanou nukleotidovou sekvenci, která je předmětem předkládaného vynálezu, kteréžto vektory mohou být použity k inzerci polynukleotidové molekuly na místo v chromozómu S. avermitilis jiné než je aveC gen, nebo mohou být udržovány epizomálně.

V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genů, které mohou být použity k inzerci mutované aveC alely nebo její degenerované varianty do buněk kmene S. avermitilis, čímž dochází k tvorbě nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky produkují avermektiny v narušeném

- » · · »« »9« • * « · 99« · ·· poměru třídy 2:1 ve srovnání s buňkami stejného kmene, který místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě je poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami snížen. Takové vektory nahrazující geny mohou být konstruovány za použití mutovaných polynukleotidových molekul přítomných ve zde poskytnutých expresních vektorech, jako jsou například pSE188, pSE199 a pSE231, kteréžto expresní vektory jsou uvedeny příkladem v Části 8 níže.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory, které mohou být použity k inzerci mutované aveC alely nebo její degenerované varianty do buněk kmene S. avermitilis k tvorbě nových kmenů buněk, které produkují avermektiny v narušeném množství ve srovnání s buňkami stejného kmene, který místo toho exprimuje pouze divoký typ aveC alely.

V přednostní formě je množství avermektinů produkovaných buňkami zvýšeno. Ve specifické, avšak neomezující formě vynálezu zahrnují takový vektor silný promotor, jak je známý v oboru, jako je například silný konstitutivní ermE promotor z Sacharopolysora erythraea, který je situován ve směru nahoru od a v operačním spojení s aveC alelou. Takovým vektorem může být pSE189, popsaný v Příkladu provedení vynálezu 11 níže, nebo může být konstruován za použití mutované aveC alely plazmidu pSE189.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genů, které jsou užitečné pro inaktivaci aveC genu u divokého typu kmene S. avermitilis. V neomezující formě vynálezu mohou být takové vektory nahrazující gen zkonstruovány za použití mutované polynukleotidové molekuly přítomné v plazmidu pSE180 (ATCC 209605), která je uvedena příkladem v Části 8. 1 níže ( Obrázek 3) . V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález vektory pro náhradu genů, které zahrnují polynukleotidovou molekulu obsahující nebo • · ···* • ft »* ···· ·»·* ·· ··· ·· ···· skládající se z nukleotidových sekvencí, které přirozeně hraničí s aveC genem in šitu v chromozómu S. avermitilis, a zahrnují například hraničící nukleotidové sekvence uvedené na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1) , kteréžto vektory mohou být použity k vymazání S, avermitilis aveC ORF.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro přípravu nových kmenů S. avermitilis zahrnující buňky, které exprimuj i mutovanou aveC alelu, a které produkují porušený poměr a/nebo množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S. avermitilis zahrnující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, a které produkují porušený poměr třídy 2:1 avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, dále zahrnující transformující se buňky kmene S. avermitilis s vektorem, který nese mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, který narušuje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a vybrání transformovaných buněk, které produkují narušený poměr třídy 2:1 ve srovnání s poměrem rřídy 2:1 produkovaným buňkami kmene, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostnější formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nového kmene S.

zahrnující transformující se buňky kmene S.

avermitilis avermitilis s vektorem schopným vytvořit mutaci v aveC alele takových buněk, kde mutace aveC alely vede k substituci v kódovaném AveC genovém produktu různého aminokyselinového rezidua v jedné nebo více aminokyselinových pozicích odpovídajících aminokyselinovým reziduím 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138,

139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, nebo 298 o • · · ·

sekvenci · SEQ ID č. 2, takže buňky kmene S. avermitilis, v kterých byla aveC alela mutována, produkují poměr třídy 2:1, který je odlišný od poměru produkovaného buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2: 1 avermektinů.

Jak je zde používáno, tam, kde aminokyselinové reziduum kódované aveC alelou v chromozómu S. avermitilis, nebo ve vektoru či izolované polynukleotidové molekule, která je předmětem předkládaného vynálezu je označováno jako ‘odpovídající konkrétnímu aminokyselinovému reziduu se sekvencí SEQ ID č. 2, nebo kde aminokyselinová substituce je označována jako vyskytující se v konkrétní pozici 'odpovídající’· specifickému očíslovanému aminokyselinovému reziduu se sekvencí SEQ ID č. 2, týká se aminokyselinové reziduum stejného relativního umístění v AveC genovém produktu, který osoba znalá oboru může rychle určit pomocí odkazu na aminokyselinovou sekvenci prezentovanou zde jako SEQ ID Č. 2.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro přípravu nových kmenů, kde specifické mutace v aveC alele kódující konkrétní mutace jsou uváděny jako základní změny ve specifických nukleotidových pozicích v aveC alele odpovídající konkrétním nukleotidovým pozicím, jak je uvedeno v sekvenci SEQ ID č. 1. Jak je uvedeno výše, s ohledem na odpovídající aminokyselinové pozice, kde nukleotidová pozice v aveC alele je uváděna jako odpovídající konkrétní nukleotidové pozici v sekvenci SEQ ID č. 1, týká se nukleotid stejného relativního umístění v aveC nukleotidové sekvenci, kterou může osoba znalá oboru rychle určit pomocí odkazu na na nukleotídovou sekvenci prezentovanou zde jako sekvence SEQ ID č. 1.

• ·

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S. avermitilis zahrnující buňky, které produkují porušená množství avermektinů, zahrnující transformující se buňky kmene S. avermitilis s vektorem, který nese mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, jejíž exprese vede k narušení množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, a vybrání transformovaných buněk, které produkují avermektiny v narušeném množství ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaným buňkami kmene, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je zvýšeno množství avermektinů produkovaných transformovanými buňkami.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S. avermitilis, jejichž buňky obsahují inaktivovanou aveC alelu, zahrnující transformující se buňky kmene S. avermitilis, které exprimují jakoukoli aveC alelu s vektorem, který ínaktivuje aveC alelu, a vybrání transformovaných buněk, v kterých byla aveC alela ínaktivována. V přednostnější, avšak neomezující formě vynálezu jsou buňky kmene S. avermitilis transformovány vektorem nahrazujícím gen, který nese aveC alelu, která byla ínaktivována mutací nebo náhradou části aveC alely heterologní genovou sekvencí, a jsou vybrány transformované buňky, v kterých byla jinak nativní aveC alela nahrazena inaktivovanou aveC alelou. Inaktivace aveC alely může být určena HPLC analýzou fermentačních produktů, jak je popsáno níže. Ve specifické, avšak neomezující formě vynálezu popsané v Části 8. 1 níže byla aveC alela ínaktivována inzercí ermE genu ze Sacharopolyspora erythraea do aveC ORF.

• · · · · «

Předkládaný vynález dále poskytuje nové kmeny S. avermitilis zahrnující buňky, které byly transformovány jakýmikoli polynukleotidovými molekulami nebo vektory, které jsou předmětem předkládaného vynálezu. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahrnující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, nebo její degenerovanou variantu na místo nebo navíc k divokému typu aveC alely, kde buňky nového kmene produkují avermektiny v narušeném poměru třídy 2: 1 ve srovnání s poměrem třídy 2: 1 avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu je snížen narušený poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaný novými buňkami. Takové nové kmeny jsou užitečné pro produkci komerčně žádoucích avermektinů, jako je například doramektin, ve velkém měřítku. V přednostnější formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahrnující jakoukoli z výše uvedených mutací nebo kombinaci mutací v aveC alele v nukleotidových pozicích odpovídajících pozicím prezentovaných výše, nebo které jinak kódují jakoukoli z výše uvedených aminokyselinových substitucí AveC genového produktu. Ačkoli takové mutace mohou být přítomny v takových buňkách na extrachromozomální části, jako je například plazmid, je preferováno, že takové mutace jsou přítomny v aveC alele lokalizované na chromozómu S. avermitilis. V přednostní formě poskytuje předkládaný vynález kmen Streptomyces avermitilis zahrnující buňky mutaci v aveC alele, která kóduje AveC genový produkt mající substituci v jedné nebo více aminokyselinových pozicích odpovídajících aminokyselinovým reziduím 38, 48, 55,

89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275,

289, nebo 2 98 v sekvenci SEQ ID č.

poměr třídy 2: 1 avermetinů, který produkovaného buňkami stejného kmene S. avermitilis, který exprimuje divoký typ aveC alely.

2, kde buňky produkují je odlišný od poměru • ·

Primárním cílem vyhledávacích analýz zde popsaných je identifikovat mutované alely aveC genu, jejichž exprese je buňkách S. avermitilis narušena a konkrétněji dochází ke snížení poměru třídy 2: 1 avermektinů. V přednostní formě vynálezu je poměr B2: B1 avermektinů produkovaných buňkami nového kmene S. avermitilis, který je předmětem předkládaného vynálezu, a který exprimuje mutovanou aveC alelu nebo její degenerovanou variantu, a který je předmětem předkládaného formě

vynálezu,	zhruba	1, 6: 1	nebo	méně.	V	přednostnější
vynálezu	je poměr	0, 84: 1	nebo	méně.	V	přednostnější
vynálezu	j e poměr	0, 80: 1	nebo	méně.	V	přednostnější
vynálezu	j e poměr	0, 75: 1	nebo	méně.	V	přednostnější
vynálezu	je poměr	0, 73: 1	nebo	méně.	V	přednostnější
vynálezu	je poměr	0,68: 1	nebo	méně.	V	ještě přednost
formě vynálezu je	poměr	0,67: 1	nebo	méně. V přednost

formě vynálezu je poměr 0,57:1 nebo méně. V ještě přednostnější formě vynálezu je poměr 0,53:1 nebo méně. V ještě přednostnější formě vynálezu je poměr 0,42:1 nebo méně. V ještě přednostnější formě vynálezu je poměr 0,40:1 nebo méně.

V specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 1,6:1. V odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,94:1. V další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,88:1. V další .odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,84:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,75:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,73:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,68:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,67:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,57:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,53:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,42:1. V ještě další odlišné specifické formě vynálezu popsané níže produkují nové buňky, které jsou předmětem vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,40:1.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahnující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu, nebo její degenerovanou variantu, nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu nebo její degenerovanou variantu na místo nebo navíc k divokému typu alely, kde buňky nového kmene produkují narušená množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. V přednostní formě vynálezu produkuje nový kmen zvýšená množství avermektinů.

V neomezující formě vynálezu zahrnuje genetický konstrukt r * ·*·· *· silný promotor, jako je například silný konstitutivní promotor ermE ze Sacharopolyspora erythraea ve směru nahoru a v operačním spojení s aveC ORF.

V další přednostní formě poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S. avermitilis zahnující buňky, v kterých byl aveC gen inaktivován. Takové kmeny jsou užitečné pro rozličné spektrum avermektinů, které produkují ve srovnání s divokým typem kmene i pro komplementaci vyhledávacích analýz, jak je zde popsáno, aby se určilo, zdali cílená nebo náhodná mutageneze aveC genu ovlivňuje produkci avermektinů. Ve specifické formě vynálezu popsané níže byly hostitelské buňky S. avermitilis geneticky upraveny, aby obsahovaly inaktivovaný aveC gen. Například kmen SE180-11 popsaný v příkladech níže byl generován za použití plazmidu pSE180 nahrazujího gen (ATCC 209605) (Obrázek 3) , který byl konstruován, aby inaktivoval S. avermitilis aveC gen inzercí genu ermE rezistence do aveC kódující oblasti.

Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantně exprimované mutované S. avermitilis AveC genové produkty kódované jakoukoli z výše uvedených polynukleotidových molekul, které jsou předmětem vynálezu a způsoby jejich přípravy.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, kteréžto buňky expimují mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který narušuje poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze divoký typ aveC alely, v kultivačním médiu za podmínek, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů z těchto buněk. V přednostní formě vynálezu je snížen poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaných v kultuře buňkami exprimuj ícími mutovanou aveC alelu. Tento způsob poskytuje ► · · · · · • · zvýšenou účinnost v produkci komerčně cenných avermektinů, jako je například doramektin.

Předkládaný vynález dále poskytuje postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk kmene S. avermitilis, kteréžto buňky expimují mutovanou aveC alelu neb genetický konstrukt obsahující aveC alelu, která vede k produkci narušeného množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene, které neexprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt, ale místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely, v kultivačním médiu za podmínek, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů z těchto buněk, a získání řečených avermektinů z kultury. V přednostní formě vynálezu je zvýšeno množství avermektinů produkovaných v kultuře buňkami exprimujícími mutovanou aveC alelu, degenerovanou variantu nebo genetický konstrukt.

genový produkt, který produkovaných buňkami tekutině, preparát

Předkládaný vynález dále poskytuje nový preparát avrmektinů produkovaných kmenem S. avermitilis exprimujícím mutovanou aveC alelu nebo její degenerovanou variantu, která kóduje snižuje poměr třídy 2: 1 avermektinů kmene S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu nebo její degenerovanou variantu ve srovnání s buňkami stejného kmene, které místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely, kde avermektiny v novém preparátu jsou produkovány ve sníženém poměru třídy 2: 1 ve srovnání s poměrem třídy 2:1 avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis, které místo toho exprimují pouze divoký typ aveC alely. Nový avermektinový preparát může být přítomen, jak je produkován ve vyčerpané fermentační kultivační nebo z ní může být stažen. Nový avermektinový může být částečně nebo významně purifikován • * ·

· · · »» z kultivační tekutiny pomocí známých biochemických technik purifikace, jako jsou například precipitace amonium sulfátem, dialýza, frakcionace podle velikosti, ionexová chromatografie, HPLC, atd.

5. 4. Použití avermektinů

Avermektiny jsou vysoce aktivní antiparazitární látky mající obzvláštní využití jako antihelmintika, ektoparaziticidy, insekticidy a akaricidy. Avermektinové sloučeniny produkované podle způsobů předkládaného vynálezu jsou užitečné pro jakýkoli z těchto účelů. Avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou užitečné například k léčbě různých onemocnění či stavů člověka, obzvláště těch, které jsou způsobené parazitickými infekcemi, jak je známo v oboru. Viz například Ikeda a Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609. Konkrétněji avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou účinné v léčbě celé řady onemocnění nebo stavů způsobených endoparazity, jako jsou například parazitická nematoda, která mohou infikovat člověka, domácí zvířata, prasata, ovce, drůbež, koně nebo dobytek.

Specifičtěji avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou účinné nematodům, která infikují člověka, stejně tak jako nematoda, která infikují různé druhy živočichů. Taková nematoda zahrnují gastrointestinální parazity, jako jsou například Ancylostoma, Necatotor, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria a parazité, které jsou nacházeni v krvi jiných tkání a orgánů, jako jsou například filariální červi a střevní formy Strongyloides a Trichinella.

Avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou také účinné v léčbě ektoparazitických infekcí zahrnujících například infestaci savců a ptáků arthropody, • · · · • · «·· ·· ··· způsobené klíšťaty, roztoči, všemi, blechami, masařkami, bodavým hmazem nebo migrujícími larvami dvoukřídlého hmyzu, které mohou napadnout mezi jinými dobytek a koně.

Avermektinové sloučeniny produkované podle předkládaného vynálezu jsou také užitečné jako insekticidy proti domácím škůdcům, jako jsou například mezi jinými švábi, moli, kobercoví brouci a domácí mouchy, stejně tak jako hmyz napadající uskladněné zrní a zemědělské rostliny, kterýžto škůdci zahrnují mezi jinými roztoče, mšice, housenky a hmyz z rodu Orthoptera, jako jsou například kobylky.

Zvířata, která mohou být léčena avermektinovými sloučeninami produkovanými podle vynálezu, zahrnují ovce, dobytek, jeleny, kozí, prasata, ptáky včetně drůbeže a psi a kočky.

Avermektinové sloučenina produkovaná podle předkládaného vynálezu je podávána v preparátu vhodném pro specifické zamýšlené použití, konkrétní druh hostitelského zvířete, které má být léčeno a parazita či hmyzu, který je infekčním agens. Pro použití jako paraziticidum může být avermektinová sloučenina produkovaná podle předkládaného vynálezu podávána ve formě kapsle, bolu, tablety nebo tekutého léku, nebo může být alternativně podána jako forma polévací, injekční nebo jako implantát. Takové formy jsou připraveny konvenčním způsobem ve shodě se standardní veterinární praxí. Kapsle, bolusy nebo tablety mohou být tedy připraveny smíšením aktivní složky s vhodnou přesně rozdělenou ředící látkou nebo s nosičem, dále obsahujícím dezintegrační látku a/nebo vazebnou látku, jako jsou například škrob, laktóza, talek, magnézium stearát, atd. Namáčecí preparáty mohou být připraveny disperzí aktivní složky ve vodném roztoku spolu s například disperguj ící nebo zvlhčující látkou. Injekční preparáty mohou být připraveny ve formě sterilního roztoku, • · ·

který může obsahovat další substance, jako jsou například dostatečné soli a/nebo glukóza, aby mohl být připraven roztok izotonický s krví.

Takové preparáty se liší vahou aktivní sloučeniny v závislosti na pacientovi, druhu hostitelského zvířete, které má být léčeno, závažnosti a typu infekce a tělesné váhy hostitele. Obecně je pro perorální podání dostatečná dávka aktivní sloučeniny od zhruba 0,001 do 10 mg na kg tělesné váhy pacienta nebo zvířete podané jako jedna dávka nebo rozděleně po dobu od 1 do 5 dnů. Mohou však nastat případy, kde je indikováno vyšší nebo nižší dávkovači rozmezí, jak je určeno například lékařem nebo veterinářem podle klinických příznaků.

Jako alternativa může být avermektinová sloučenina produkována podle předkládaného vynálezu podána v kombinaci s krmivém pro zvířata a pro tento účel může připraveno koncentrované krmivové aditivum nebo premix pro smíšení s normálním krmivém pro zvířata.

Pro použití jako insekticidům a pro léčbu zemědělských škůdců může být avermektinová sloučenina produkovaná podle předkládaného vynálezu podaná jako sprej, prášek, emulze a podobně ve shodě se standardní zemědělskou praxí.

Příklady provedení vynálezu

6. Fermentace Streptomyces avermitilis a analýza B2-.B1 avermektinů

Kmeny postrádající aktivitu dehydrogenázy větvených 2-oxo kyselin i 5-O-metyltransfreázy neprodukují žádné avermektiny, pokud fermentační médium není suplementováno mastnými kyselinami. Tento příklad demonstruje, že u takových mutant může být získáno široké spektrum poměrů B2: B1 avermektinů, jeli fermentace zahájena v přítomnosti různých mastných kyselin.

6.1 Materiál a metodika

Buňky Streptomyces avermitilis ATCC 53692 byly skladovány při teplotě -70°C jako plný bujón připravený v očkovacím médiu složeném z: škrobu ( Nadex, Laing National) - 20g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g; Ardamin pH (Yeast

Products lne. ) - 5 g; uhličitanu vápenatého - 1 g. Finální objem byl upraven na 1 litr tekoucí vodou, pH bylo upraveno na

7.2 a médium bylo autoklávováno při tepotě 121°C po dobu 25 minut.

K inokulaci nádoby obsahující stejné médium byly použity dva ml rozmražené suspenze výše uvedeného preparátu. Po 4 8 hodinách inkubace při teplotě 28 °C na rotační třepačce při rychlosti 180 rpm, byly použity 2 ml bujónu k inokulaci nádoby obsahující 50 ml produkčního média obsahujícího: škrob - 80 g; uhličitan vápenatý - 7 g; Pharmamedia - 5 g; hydrogen fosfát draselný - lg; síran hořečnatý - 1 g; kyselina giutamová -0,6 g; heptahydrát síranu železnatého - 0,01 g; síran zinečnatý 0,001 g; síran manganatý - 0,001 g. Finální objem byl upraven do 1 litru tekoucí vodou, pH bylo upraveno na 7,2 a médium bylo autoklávováno při teplotě 121°C po dobu 25 minut.

Rozličné substráty karboxylové kyseliny ( viz Tabulka 1) byly rozpuštěny v metanolu a přidány do fermentačního bujónu 24 hodin po inokulaci za vzniku finální koncentrace 0,2 g/litr. Fermentační bujón byl inkubován 14 dnů při teplotě 28°C, poté byl bujón zcentrifugován (2500 rpm, po dobu 2 minut) a supernatant byl odstraněn. Mycéliová peleta byla extrahována acetonem (15 ml) , poté dichlormetanem (3 0 ml) a organická fáze byla separována, zfiltrována a poté odpařena do sucha. Reziduum bylo extrahováno do metanolu (1 ml) a analyzováno pomocí HPLC pomocí kapalinového chromatografu Hewlett-Packard 1090A vybaveném skenovacím diode-array detektorem při 240 nm.

···’ ·* .....

Byla použita kolona Beckman Ultrasphere C-18, 5 um, 4,6 mm x cm, teplota kolony byla udržována na 40 °C. Na kolonu bylo injikováno 25 ul výše uvedeného metanolického roztoku. Eluce byla provedena lineárním gradientem metanol-voda z poměru 80:20 do 95:5 po dobu 40 minut při průtoku 0,85 ml/minutu. Ke kalibraci odpovědi detektoru byly použity dvě standardní koncentrace cyklohexylu B1 a byla měřena plocha pod křivkami B2 a B1 avermektinů.

6.2 Výsedky

HPLC retenční časy pozorované pro B2 a B1 avermektiny a poměry 2:1 j sou uvedeny v Tabulce 1

Tabulka 1

	HPLC retenční čas ( min)	Poměr
Substrát	B2	B1	B2:B1
4-Tetrahydropyran karboxylová kyselina	8,1	14,5	0,25
Kyselina izomáselná	10,8	18,9	0,5
Kyselina 3-furoová	7,6	14,6	0,62
Kyselina S-(+)-2-metylmáselná	12,8	21, 6	1,0
Kyselina cyklohexankarboxyloá	16,9	26,0	1,6
Kyselina 3-thiofenkarboxylová	8,8	16,0	1,8
Kyselina cyklopentankarboxylová	14,2	23,0	2,0
Kyselina 3-trifluorometylmáselná	10,9	18,8	3,9
Kyselina 2-metylpentanocvá	14,5	24,9	4,2
Kyselina cykloheptankarboxylová	18,6	29,0	15,0

Data prezentovaná v Tabulce 1 demonstrují extrémně široké rozmezí poměrů B2: B1 avermektinových produktů, což ukazuje na významný rozdíl ve výsledcích dehydratační konverze třídy 2 sloučenin na třídu 1 sloučenin, v závislosti na charakteru postranního řetězce mastné kyseliny dodávané jako iniciační sloučenina. To ukazuje, že změny v poměrech B2: B1 , které jsou výsledkem alterací AveC proteinu, mohou být specifické konkrétním substrátům. Následné vyhledávání mutant vykazujících změny v poměru B2: B1 získané s konkrétním • * substrátem musí být prováděno v přítomnosti tohoto substrátu. Následné příklady popsané níže používají kyselinu cyklohexankarboxylovou jsko substrát pro vyhledávání mutant. Tento subsrát je však používán čistě jáko příklad potenciálu a není zamýšlen jako omezující použitelnost předkládaného vynálezu.

7. Izolace aveC genu

Tento příklad popisuje izolaci a charakterizaci oblasti chromozómu Streptomyces avermitilis, který kóduje AveC genový produkt. Jak je demonstrováno níže, byl aveC gen identifikován jako schopný modifikovat poměr produkovaných cyklohexyl B2 avermektinů na cyklohexyl Bl avermektiny (B2:Bl) .

7.1. Materiál a metodika

7. 1. 1. Růst Streptomyces pro izolaci DNA

Pro růst Streptomyces byla použita následující metoda. Jednotlivé kolonie S. avermitilis ATCC 31272 (izolát jednotlivé kolonie č. 2) byly izolovány na poloviční půdě YPD6 obsahující: Difco kvasničný extrakt - 5 g; Difco Bactopepton - 5 g; dextróza - 2,5 g; MOPS - 5 g; Difco Bacto agar 5 g. Finální objem byl upraven na 1 litr pomocí dH₂O, pH bylo upraveno na 7,0 a médium bylo autoklávováno při teplotě 121°C po dobu 2 5 minut.

Mycélia vykultivovaná na výše uvedeném médiu byla použita k inokulaci 10 ml TSB média (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, v 1 litru dH₂0, autoklávováno při teplotě 121°C po dobu 25 minut) ve zkumavce o rozměrech 25 x 150 mm, která byla protřepávána (300 rpm) při teplotě 28°C po dobu 48-72 hodin.

7.1.2. Chromozomální DNA izolace ze Streptomyces

Alikvóty (0,25 ml nebo 0,5 ml) mycélia vykultivováného, jak bylo popsáno výše, byly umístěny v 1, 5 ml mikrocentrifugačních ··· · » ···· zkumavkách a buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 12 000 g po dobu 60 sekund. Supernatant byl odstraněn a buňky byly re suspendovány v 0,25 ml TSE pufru (20 ml 1,5 M sacharózy, 2,5 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 ml 1M EDTA, pH 8,0 a 75 ml dH₂O) obsahujícím 2 mg/ml lysozymu. Vzorky byly inkubovány při teplotě 37°C po dobu 20 minut při protřepávání, vloženy do automatizovaného zařízení na izolaci nukleových kyselin AutoGen 540™ (Integrated Separation systems, Natick, MA) a genomická DNA byla izolována za použití Cycle 159 ( software zařízení) podle instrukcí výrobce.

Alternativně bylo 5 ml mycélia umístěno do zkumavky o rozměrech 17 x 100 mm, buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 3000 rpm po dobu 5 minut a supernatant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 1 ml TSE pufru, zakoncentrovány centrifugací při 3000 rpm po dobu 5 minut a supernatant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 1 ml TSE pufru obsahujícím 2 mg/ml lysozymu a inkubovány při teplotě 37°C při protřepávání po dobu 30-60 minut. Po inkubaci bylo přidáno 0,5 ml 10% dodecyl sulfátu sodného (SDS) a buňky byly inkubovány pří teplotě 37°C až do dokončení lýzy. Lyzát byl inkubován při teplotě 65°C po dobu 10 minut, ochlazen na pokojovou teplotu, rozdělen do dvou ependorfek a extrahován lx 0,5 ml fenol/chloroformem ( 50% fenol předem ekvilibrovaný 0,5 M Trisem, pH 8,0; 50% chloroform) . Vodná fáze byla odstraněna a extrahována 2 až 5 x směsí chloroform: izoamylalkohol (24:1). DNA byla precipitována přidáním 1/10 objemu 3M octanu sodného, pH 4,8, inkubací směsí na ledu 10 minut, centrifugací směsi pří 15000 rpm při teplotě 5°C po dobu 10 minut, a vyjmutím supernatantu do čisté zkumavky, do které byl přidán 1 objem izopropanolu. Supernatant plus směs izopropanolu byla poté inkubována na ledu po dobu 20 minut při 5°C, supernatant byl odstraněn a DNA peleta byla promyta lx 70% etanolem. Po k · • · · vysušení pelety byla DNA resuspendována v TE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).

7.1.3. Izolace plazmidové DNA ze Streptomyces

Alikvóta (1,0 ml) mycélia byla umístěna do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund. Supernatant byl odstraněn, buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharóze a zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund a supernatant byl odstraněn. Buňky byly poté resuspendovány v 0,25 ml TSE pufru obsahující 2 mg/ml lysozymu a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 20 minut při protřepávání a naneseny do automatizovaného zařízení pro izolaci nukleových kyselin AutoGen 540™. Plazmidová DNA byla izolována za použití softwaru Cycle 106 podle instrukcí výrobce.

Alternativně bylo 1,5 ml mycélia umístěno do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund. Supernatant byl odstraněn, buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharózy a zakoncentrovány centrifugací při 12000 g po dobu 60 sekund a supernatant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 0, 5 ml TSE pufru obsahující 2 mg/ml lysozymu a inkubovány při teplotě 37^cC po dobu 15-30 minut. Po inkubaci bylo přidáno 0, 25 ml alkalického SS (0,3 N NaOH, 2% SDS) a buňky byly inkubovány při teplotě 55 °C po dobu 15-30 minut, až byl roztok čistý. K roztoku DNA byl přidán octan sodný (0,1 ml, 3M, pH 4,8) a roztok byl poté inkůbován na ledu po dobu 10 minut. Vzorky DNA byly centrifugovány při 14000 rpm po dobu 10 minut při teplotě 5°C. Supernatant byl vyjmut do čisté zkumavky a bylo přidáno 0,2 ml směsi fenol: chloroform (50% fenol: 50% chloroform) a směs byla jemně promíchávána. Roztok DNA byl centrifugován při 14000 rpm po dobu 10 minut při teplotě 5°C a vrchní vrstva byla vyjmuta di čisté ependorfky. Byl přidán izopropanol (0,75 ml) • · • · · · • · a roztok byl jemně promícháván a poté inkubován při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Roztok DNA byl centrifugován při 14000 rpm po dobu 15 minut při teplotě 5°C, supernatant byl odstraněn a DNA peleta byla promyta 70% etanolem, vysušena a re suspendována v TE pufru.

7.1.4. Izolace plazmidové DNA z E. coli

Jediná transformovaná kolonie E. coli byla inokulována do 5 ml Luria-Bertani (LB) média (Bacto-Trypton - 10 g, Bactokvasničný extrakt - 5 g a NaCl - 10 g v 1 litru dH₂O, pH 7,0, autoklávováno při 121°C po dobu 25 minut a suplementováno 100 ug/ml ampicilinu) . Kultura byla inkubována přes noc a 1 ml alikvóty byly umístěny do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky. Vzorky kultury byly naneseny na automatizované zařízení pro izolaci nukleových kyselin AutoGen 540™ a plazmidová DNA byla izolována za použití softwaru Cycle 106 podle instrukcí výrobce.

7. 1. 5. Příprava a transformace protoplastů S. avermitilis Jednotlivé kolonie S. avermitilis byly izolovány na 1/2 médiu YPD-6. Mycéiia byla použita k inokulací 10 ml média TSB ve zkumavce o rozměrech 25 mm x 150 mm, které bylo poté inkubováno při protřepávání (300 rpm) při teplotě 28°C po dobu 48 hodin. Jeden ml mycéiia byl použit k inokulaci 50 ml YEME média. YEME médium obsahuje na jeden litr: Dif co kvasničný extrakt - 3 g; Difco Bacto-pepton - 5 g; Difco Mat Extract - 3 g; sacharóza - 300 g. Po autoklávování při teplotě 121 °C po dobu 25 minut byly přidány následující substance: 2, 5 M MgCl₂ · 6 H₂O (separátně autoklávované při teplotě 11 °C po dobu 25 minut) - 2 ml; a glycín (20%) (sterilizace filtrem) - 25 ml.

Mycéiia byla kultivována při teplotě 30°C po dobu 48-62 hodin a sbírány centrifugací v 50 ml centrifugční zkumavce (Falcon) při 3000 rpm po dobu 20 minut. Supernatant byl odstraněn a • ·« · mycélia byla resuspendována v P pufru, který obsahuje: sacharózu - 205 g; K₂SO₄ - 0,25 g; MgCl₂ . 6 H₂O - 2,02 g; H₂O 600 ml; K_2PO4 (0,55) - 10 ml; roztok stopových prvků* - 20 ml; CaCl₂ . 2H₂O (3,68%) - 100 ml; a MES pufr (1,0 M, pH 6,5 - 10 ml. (* Roztok stopových prvků obsahuje na jeden litr: ZnCl₂ 40 mg; FeCl₃ . 6H₂O - 200 mg; CuCl₂ . 2H₂O - 10 mg; MnCl₂ . 4H₂O - 10 mg; Na₂B₄O₇ . 10H₂0 - 10 mg; (NH₄) ₆ Mo₇0₂₄ . 4H₂O - 10 mg) . PH bylo uparveno na 6,5, finální objem byl upraven na 1 litr a médium bylo horké zfiltrováno přes 0,45 mikronový filtr.

Mycélia byla zpeletována při 3000 rpm po dobu 20 minut, supernatant byl odstraněn a mycélia byla resuspendována v 20 ml P pufru obsahujícím 2 mg/ml lysozymu. Mycélia byla inkubována při teplotě 35°C po dobu 16 minut při protřepávání a kontrolována mikroskopicky, aby se určil rozsah tvorby protoplastů. Když byla tvorba protoplastů dokončena, byly protoplasty centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut. Supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 10 ml P pufru. Protoplasty byly centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut, supernatant byl odstraněn, protoplasty byly resuspendovány ve 2 ml P pufru a přibližně 1 x 10⁹ protoplastů bylo disribuováno do 2,0 ml kryogenních vialek (Nalgene).

Vialka obsahující 1 x 10⁹ protoplastů byla centrifugována při 8000 rpm po dobu 10 monut, supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 0,1 ml pufru.

K protoplastům byly přidány 2 až 5 ug transformující se DNA okamžitě následované přidáním 0, 5 ml pracovního T pufru. Základ T pufru obsahoval: PEG-1000 (Sigma)-25 g; sacharózu-2,5 g; H₂O-83 ml. pH bylo upraveno na 8,8 pomocí IN NaOH (sterilizace filtrací) a základ T pufru byl sterilizován filtrací a uskladněn při 4°C. Pracovní T pufr připravený ve stejný den, kdy byl připraven, se skládal ze základu T pufru8,3 ml; K₂PO₄ (4 mM)-l,0 ml; CaCL₂.2H₂O (5M)-0,2 ml; a TS (1M, • · · · pH 8) - 0,5 ml. Každá složka pracovního T pufru byla individuálně sterilizována filtrací.

Během 20 sekund přidávání T pufru k protoplastům byl také přidán 1, 0 ml P pufru a protoplasty byly centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut. Supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 0,1 ml P pufru. Protoplasty byly poté umístěny do RM14 média, které obsahuje: sacharózu205 g; K₂SO₄-0,25 g; MgCl₂.6H₂O-10,12 g; glukóza 10 g; Difco Casamino kyseliny-0,1 g; Difco kvasničný extrakt-5 g; Difco Oatmeal Agar-3g; Difco Bacto Agar-22 g; dH₂0-800 ml. Roztok byl zautoklávován při teplotě 121° po dobu 25 minut. Po autoklávování byly přidány sterilní zásobní roztoky: K₂PO₄ (0,5%)-10 ml; CaCl₂. 2 H₂O (5 M) ; L-prolin (20%)-15 ml; MES pufr (1,0 M, pH 6,5)-10 ml; roztok stopových prvků (stejný jako je uvedeno výše)-2 ml; cykloheximidový zásobní roztok (25 mg/ml-40 ml; a 1 N NaOH-2 ml. Dvacet pět ml média RM14 bylo alikvótně naneseno na destičku a destičky byly vysoušeny 24 hodin před použitím.

Protoplasty byly inkubovány v 95% vlhkosti při teplotě 30°C po dobu 20-24 hodin. Pro výběr transformantů rezistentních na thiostrepton byl rovnoměrně rozptýlen 1 ml překryvného pufru obsahujícího 125 ug thiostreptonu na 1 ml na regenerační desičky RM14. Překryvný pufr obsahoval na 100 ml: sacharózu10,3 g; roztok stopových prvlů (stejný jako je uvedeno výše)0,2 ml; a MES (1M, pH 6,5)-1 ml. Protoplasty byly inkubovány v 95% vlhkosti při teplotě 30°C po dobu 7-14 dnů do té doby, než se staly kolonie rezistentní na thiostrepton (Thio^r) viditelné.

7. 1. 6. Transformace protoplastů Streptomyces lividans

V některých případech byla použita k transformacím S. lividans TK64 (poskytnutá John Innes Institute, Norwich, Spojené království) . Způsoby a složení k růstu, tvorbě protoplastů a « ·

transformaci S. lividans jsou popsány v publikaci Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Spojené království, a provedené podle postupů zde popsaných. Plazmidová DNA byla izolována ze S. lividans, jak je popsáno v Čássti 7.1.3. výše.

7. 1. 7. Fermentační analýza kmenů S. avermitilis

Mycélia S. avermitilis kultivovaná na 1/2 YPD-6 po dobu 4-7 dnů byla inokulována 1x6 palcových zkumavek obsahujících 8 ml přeformovaného média a dvě 5 mm skleněné kuličky. Přeformované médium obsahovalo: rozpustný škrob (buďto málo povařený škrob neboli KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/1; Pharmamedia-15 g/1; Ardamin pH-5 g/1 (Champlain Ind. Clifton, NJ) ; CaCO₃-2 g/1; 2xbcfa (bcfa'· znamená mastné kyseliny s větveným řetězcem) obsahující finální koncentraci v médiu 50 ppm 2-(+/-)-metylmáselné kyseliny, 60 ppm izomáselné kyseliny a 20 ppm kyseliny izovalerové. pH bylo upraveno na 7,2 a médium bylo zautoklávováno při teplotě 121°C po dobu 25 minut.

Zkumavka byla protřepávána v úhlu 17° při 215 rpm pří teplotě 29°C po dobu 3 dnů. K inokulaci 300 ml Erlenmeyerovy nádoby obsahující 25 ml produkčního média obsahujícího: škrob (buďto málo povařený škrob neboli KOSO) - 160 g/1; Nutrisoy ( Archer daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/1; Ardamin pH-10 g/1;

K₂HPO₄-2 g/1; MgSO₄.4H₂0-2 g/1; FeSO₄.7H₂O-0,02 g/1; MnCl₂-0,002 g/1; ZnSO₄.7H₂O-0,002 g/1; CaCO₃-14 g/1; 2xbcfa (jako výše); a cyklohexan karboxylovou kyselinu ( CHC) vytvořenou jako 20% roztok při pH 7, 0) - 800 ppm byla použita 2 ml alikvóta inokulační kultury. pH bylo upraveno na 6,9 a médium bylo zautoklávováno při teplotě 121°C po dobu 25 minut.

Po inokulaci byla nádoba inkubována při teplotě 29°C po dobu 12 dnů s protřepáváním při 200 rpm. Po inkubaci byly 2 ml vzorku odebrány z nádoby, naředěny 8 ml metanolu, smíšeny a směs byla • « · · • · · ·* * * « · · · » · • · · · * ^fc “ <- Γ- ····«· · » · * · centrif ugována při 1250 g po dobu 10 minut, aby došlo k peletizaci zbytků. Supernatant byl poté analyzován pomocí HPLC za použiti kolony Beckamn Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm vnitřní průměr) s průtokem 0,75 ml/min a s detekcí pomocí absorbance při 240 nm. Mobilní fáze byla 86/8,9/5,1 metanol/voda/acetonitril.

7.1.8. Izolace genů S. avermitilis

Kosmidová knihovna S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) chromozomální DNA byla připravena a hybridizována s ketosyntházovou próbou připravenou z fragmentu genu pro polyketid syntházu (PKS) ze Saccharopolyspora erythraea. Detailní popis přípravy kosmidových knihoven může být nalezen v publikaci Sambrook et al., 1989, výše. Detailní popis přípravy chromozomálních DNA knihoven Streptomyces je uveden v publikaci Hopwood et al. , 1985, výše. Kosmidové klony obsahující ketosyntházu hybridizující oblasti byly identifikovány hybridizací s 2,7 kB Nde/Eco47III fragmentem z pEX26 (laskavě poskytnutým dr. P. Leadlay, Cambridge, Spojené království). Přibližně 5 ng pEX26 bylo natráveno pomocí Ndel a Eco47III. Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel SeaPlaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME) . Po elektroforéze byl vyříznut z gelu 2,7 kB Ndel/Eco47III fragment a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ od Epicentre Technologies za použití Fst Protocol. 2,7 kB Ndel/Eco47III fragment byl označen [ct-³²]dCTP (deoxycytidin 5'trifosfát, tetra (trietylamonium) sůl, [a-³²P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) za použití systému BRL Nick Translation Systém (BRL Life Technologies, lne., Gaithersburg, MD) , podle instrukcí dodavatele. Typická reakce byla provedena v objemu 0, 05 ml. Po přidání 5 ul zastavovacího pufru byla označená DNA oddělena od neinkorporovaných nukleotidů za použití G-25 Sehadex Quick Spin™ kolon (Boehringer Manheim) podle instrukcí dodavatele.

Přibližně 1800 kosmidových klonů bylo prohlíženo hybridizací kolonií. Deset klonů bylo identifikováno jako silně hybridizujících s Sace. erythraea KS próbou. Kolonie E. coli obsahující kosmidovou DNA byly kultivovány v LB tekutém médiu a kosmidová DNA byla izolována z každé kultury v automatizovaném zařízeni na izolaci nukleových kyselin AutoGen 540™ za použití programu Cycle 3 ( software zařízení) podle instrukcí výrobce. Mapování restrikční endonukleázou a analýzy Southern blot odhalily, že pět z klonů obsahovalo překrývající se chromozomální oblasti. Genomická BamHI restrikční mapa S. avermitilis pěti kosmidů (tj. pSE65, pSE 66, pSE67, pSE68, pSE69) byla zkonstruována analýzou překrývajících se kosmidů a hybridizací (Obrázek 4).

7. 1. 9. Identifikace DNA, která moduluje poměry Avermektinů B2:B1 a identifikace aveC ORF

K testování subklonovaných fragmentů odvozených od pSE66 kosmidového klonu byly použity u AveC mutant následující metody na zjištění schopnosti modulace poměrů avermektinů B2:Bl. PSE66 (5 ug) byl natráven pomocí Sací a BamHI. Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel SeaPlaque GTG ( FMC BioProducts, Rockland, ME) , po elektroforéze byl vyříznut z gelu 2,9 kB SacI/BamHI fragment a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ ( Epicentre Technologies) za použití Fast Protocol. Přibližně 5 ug transportního vektoru pWHM3 ( Vara et al. , 1989, J Bacteriol 171:5872-5881) bylo natráveno pomocí

Sací a BamHI. Okolo 0,5 ug 2,9 Kb inzertu a 0,5 ug natráveného pWHM3 bylo spolu smíšeno a inkubováno přes noc s 1 jednotkou ligázy ( New England Biolabs, lne, Beverly, MA) při teplotě 15°C v celkovém objemu 20 ul podle instrukcí dodavatele. Po inkubaci bylo 5 ul ligační směsi inkubováno při teplotě 70°C po dobu 10 minut, směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a použita k transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk (BRL) • · fc « ·· · · ·· · · · e · ♦ · • · ····· ·· • ···· ···· · ····· · · · ·

·.·· ·· ·· ··· ·· ··· podle instrukcí dodavatele. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost 2,9 kB Sac/BamHI inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE119.

Protoplasty kmene S. avermitilis 1100-SC38 (kmen od společnosti Pfizer) byly připraveny a transformovány pomocí pSE119, jak je popsáno v Části 7.1.5 výše. Kmen 1100-SC38 je mutant, který produkuje významně více cyklohexyl-B2 formy avermektinů ve srovnání s cyklohexyl-Bl formou avermektinů, je-li suplementován cyklohexan karboxylovou kyselinou (B2:B1 je zhruba 30:1). PSE119 použitý k transformaci protoplastů Ξ. avermitilis byl izolován buďto z kmene E. coli GM2163 (získaný od dr. BJ Bachmanna, správce, E. coli Genetic Stock Center,

Yale University), kmene E. coli DMI (BRL) , nebo z kmene S. lividans TK64. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Transformanty kmene S. avermitilis 1100-SC38 obsahující pSE119 vedly k narušenému poměru cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl avermektinů, který byl zhruba 3,7:1 (Tabulka 2).

Po zjištění, že pSE119 je schopný modulovat poměry B2: B1 avermektinů u AveC mutant byla sekvenována inzerovaná DNA Přibližně 10 ug pSE119 bylo izolováno za pomoci izolačního kitu na plazmidovou DNA (Qiagen, Valencia, CA) podle instrukcí výrobce, a sekvenováno za použití automatizovaného sekvenačního zařízení ABI 373A Automated DNA Sequencer ( Perkin Elmer, Foster City, CA) . Sekvenační údaje byly seřazeny a edítováy za použití programů Genetic Computer Group ( GCG, Madison, WI) . DNA sekvence a aveC ORF jsou prezentovány na Obrázku 1 ( SEQ ID č. 1) .

• · • · 4 ·

Nový plazmid, označený jako pSE118, byl zkonstruován následujícím způsobem. Přibližně 5 ug pSE66 bylo natráveno pomocí Sphl a BamHI. Reakční směs byla nanesena na 0,8% agarózový gel SeaPlaque GTG (FMC BioProducts) , po elektroforéze byl vyříznut z gelu 2,8 kB SphI/BamHI fragment a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ (Epicentre Technologies) za použití Fast Protocol. Přibližně 5 ug transportního vektoru pWHM3 bylo natráveno pomocí Sphl a BamHI. Okolo 0,5 ug 2,8 Kb inzertu a 0,5 ug natráveného pWHM3 bylo spolu smíšeno a inkubováno přes noc s 1 jednotkou ligázy ( New England Biolabs) při teplotě 15°C v celkovém objemu 20 ul podle instrukcí dodavatele. Po inkubaci bylo 5 ul ligační směsi inkubováno při teplotě 70°C po dobu 10 minut, směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a použita k transformaci DH5a buněk ( BRL) podle instrukcí byla izolována z ampicilin přítomnost 2,8 kB Sph/BamHI Plazmid byl a pSE119 se kompetentních E. coli dodavatele. Plazmidová DNA rezistentních transformantů a inzertu byla potvrzena restrikční analýzou, označen jako pSE118. Inzerovaná DNA v pSE118 překrývaly přibližně 838 nukleotidy ( Obrázek 4) .

Protoplasty kmene S. avermitilis 1100-SC38 byly transformovány pomocí pSE118, jak je uvedeno výše. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Transformanty kmene S. avermitilis 1100-SC38 obsahující pSE118 vedly k narušení poměrů cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl avermektinů ve srovnání s kmenem 1100-SC38 (Tabulka 2).

7.1.10. PCR amplifikace aveC genu z chromozomální DNA S. avermitilis

Zhruba 1,2 Kb fragment obsahující aveC ORF byl izolován z chromozomální DNA pomocí PCR amplifikace za použití primerů označených na základě aveC nukleotidové sekvence získané výše.

• · > · ··»· · · ·· ·· · · · * » · « • · ····· · · • ···· · · Β · * ···· ·« ·· »»* ·· ···

PCR primery byly dodané společností Genosys Biotechnologies lne. (Texas). Pravostranný primer byl: 5'-TCACGAAACCGGACACAC3' ( SEQ ID č: 6) a levostranný primer byl: 5' CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID č: 7) . PCR reakce byla provedena polymerázou Deep Vent™ (New England Biolabs) v pufru poskytnutém výrobcem a v přítomnosti 300 uM dNTP, 10% glycerolu, 200 pmol každého primeru, 0,1 ug templátu a 2,5 jednotek enzymu ve finálním objemu 100 ul za použití termocykléru Perkin-Elmer Cetus. Termální profil prvního cyklu byl 95°C po dobu 5 minut ( denaturační krok) , 60 °C po dobu 2 minut (chladící krok) a 72°C po dobu 2 minut ( rozšiřovací krok). Následných 24 cyklů mělo stejný termální profil s výjimkou toho, že denaturační krok byl zkrácen na 45 sekund a chladící krok byl zkrácen na 1 minutu.

PCR produkt byl podroben elektroforéze na 1% agarózovém gelu a byl detekován jeden DNA proužek o velikosti 1,2 Kb. Tato DNA byla purifikována z gelu a ligována s 25 ng linearizovaného, hrubého pCR-Blunt vektoru (Invitrogen) v 1:10 molárním vektor/inzert poměru podle instrukcí výrobce. Ligační směs byla použita k transformaci One Shot™ Competent E. coli buněk (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu o velikosti zhruba 1,2 Kb byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE179.

DNA inzertu z pSE179 byla izolována natrávením pomocí BamHI/Xbal, separována elektroforézou, purifikována z gelu a ligována s transportním vektorem pWHM3, který byl natráven pomocí BamHI/Xbal v celkové koncentraci DNA 1 ug v 1:5 molárním vektor/inzert poměru. Ligační směs byla použita k transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk ( BRL) podle instrukcí dodavatele. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost zhruba • · ·*·· ·· ··* · • · ····· ·· • · · · · · · · · · ♦··· ·· ·· ··· ·· ···

1, 2 kB inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE186 (Obrázek 2, ATCC 209604), byl transformován do E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů.

7.2. Výsledky

2,9 Kb SacI/BamHI z pSE119 byl identifikován tak, že po transformaci do kmene S. avermitilis 1100-SC38 významně narušil poměr B2: B1 avermektinové produkce. Kmen S. avermitilis 1100-SC38 má normální poměr B2: B1 zhruba 30:1, ale je-li transformován vektorem obsahujícícm 2,9 Kb SacI/BamHI fragment, poměr B2: B1 avermektinů se snížil na zhruba 3, 7: 1.

Postfermentační analýza kultur transformantů potvrdila přítomnost transformující DNA.

2,9 Kb pSE119 fragment byl sekvenován a byl identifikován zhruba 0,9 Kb ORF (Obrázek 1) SEQ ID č: 1) , který zahrnuje Pst/Sphl fragment, který byl předtím jinde mutován, aby produkoval pouze B2 produkty (Ikeda et al., 1995, výše).

Srovnání tohoto ORF, nebo jeho odpovídajícího odvozeného polypeptidu proti známým databázím (GenEMBL, SWIS-PROT) neprokázal silnou homologii se známou DNA nebo proteinovou sekvencí.

Tabulka 2 uvádí fermentační anylýzu kmene S. avermitilis 1100SC38 transformované různými plazmidy.

• « * φ φ · > · » 9 · φ ·

Tabulka 2

Kmen S. avermitilis	Počet	testovaných	Průměrný poměr
(transformující plazmid	transformantů	B2 :B1
1100-SC38 ( žádný)	9	30,66
1100-SC38 (pWHM3)	21	31,3
1100-SC38 (pSE119)	12	3,7
1100-SC38 (pSE119)	12	30,4
1100-SC38 (pSE185)	14	27,9

8. Příklad: Konstrukce mutant AveC S. avermitilis

Tento příklad popisuje konstrukci několika různých mutant AveC S. avermitilis za použití preparátů a metod zde popsaných. Obecný popis technik pro zavedení mutací do genu Streptomyces je popsán Kieserem a Hopwoodem, 1991, Meth Enzym 204:430-458. Detailnější popis je poskytnut Anzaiem et al 1988, J Antibiot XLI(2) :226-233 a Stutzman-Engwallem et al. , 1992, J. Bacteriol. 174(1):144-154. Tyto reference jsou tímto začleněny v celém svém rozsahu.

8.1 Inaktivace genu aveC S. avermitilis

AveC mutanty obsahující inaktivované aveC zkonstruovány za použití několika metod, jak uvedeno níže.

geny byly je detailně

V první metodě byl 640 bp Sph/Pstl fragment z aveC genu v pSE119 (plazmid popsaný v Části 7.1.9 výše) nahrazen genem ermE (pro rezistenci na erytromycin) ze Sace. Eryhraea. Gen ermE byl izolován z pIJ4026 (poskytnutý ústavem John Innes Institute, Norwich, Spojené království, viz také Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368) natrávením restrikčním enzymem pomocí Bg/ll a EcoRI s následnou elektroforézou a poté byl z gelu purifikován. Tento zhruba 1,7 Kb fragment byl ligován do pGEM72f (Promega), který byl natráven pomocí BamHI a EcoRI a ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5ct φφ φφφφ φφ ·ΦΦ· ·» ·Φ • · · 4 · < · · · · • · «*44« 4 · » • ·«·· 4 r » · · «·· 44 4 4*4 ·*·· ·* ·* “* ** **” buněk podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost zhruba 1, 7 Kb inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE27.

PSE118 (popsaný v Části 7.1.9. výše) byl natráven pomocí Sphl a BamHI, natrávený produkt byl podroben elektroforéze a zhruba 2,8 Kb Sphl/BamHI inzert byl purifikován z gelu. PSE119 byl natráven pomocí Pstl a EcoRI, natrávený produkt byl podroben elektroforéze a zhruba 1,5 Kb Pstl/EcoRI inzert byl purifikován z gelu. Transportní vektor pWHM3 byl natráven pomocí BamHI a EcoRI. PSE27 byl natráven pomocí Pstl a Sphl, natrávený produkt byl podroben elektroforéze a zhruba 1,7 Kb Pstl/Sphl inzert byl purifikován z gelu. Všechny čtyři fragmenty (tj. zhruba 2,8 Kb, zhruba 1,5 Kb, zhruba 7,2 Kb, zhruba 1,7 Kb) byly spolu ligovány v čtyřcestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coii DH5a buněk podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE180 (Obrázek 3; ATCC 209605).

PSE180 byl transformován do S. lividans TK64 a transformované kolonie byly identifikovány pomocí rezistence k thiostreptonu a erytromycinu. PSE180 byl izolován ze S. lividans a použit k transformaci protoplastů S. avermitilis. Byly identifikovány čtyři transformanty rezistentní na thiosterpton a protoplasty byly připraveny a umístěny za neselektivních podmínek do RM14 média. Po regeneraci protoplastů byly jednotlivé kolonie prohlíženy na přítomnost rezistence k erytromycinu a nepřítomnost rezistence na thiostrepton, což ukazuje na chromozomální integraci inaktívovaného aveC genu a ztrátu volného replikonu. Jeden Erm^r Thio^s transformant byl identifikován a označen jako kmen SE180-11, natráven • 4 4444 •··4 ··

4« »444

I · ’ » · * 4 · k · 4 » 4 ·

4« 444 restrikčními enzymy BamHI, HindlII, Pstl, nebo Sphl, podroben elktroforéze na 0,8% agarózovém gelu, přenesen na nylonové membrány a hybridizován s ermE próbou. Tyto analýzy prokázaly, ze chromozomální integrace genu ermE rezistence konkomitantní delece 640 bp Pstl/Sphl fragmentu se vyskytla v důsledku dvojitého crossoveru. HPLC analýza fermentačních produktů kmene SE180-11 prokázala, že normální avermektiny již nebyly produkovány (Obrázek 5A).

V druhé metodě inaktivace aveC genu byl 1,7 Kb erm gen odstraněn z chromozómu kmene S. avermitilis SE180-11 zanechávajíce 640 bp Pstl/Sphl deleci v aveC genu. Plazmid pro náhradu genu byl zkonstruován následujícím způsobem: pSE180 byl částečně natráven pomocí Xbal a zhruba 11,4 Kb fragment byl purifikován z gelu. Proužek o velikosti zhruba 11,4 Kb postrádá 1,7 Kb gen pro ermE rezistenci. DNA byla poté ligována a transformována do E. coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSEl84, byl transformován do E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transf ormantů. Tento plazmid byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE18011. Protoplasty byly připraveny z transformantů kmene SE180-11 rezistentních na thistrepton a byly umístěny jako jednotlivé kolonie do RM14. Po zregenerování protoplastů byly jednotlivé kolonie prohlíženy na nepřítomnost rezistence na erytromycin i thiostrepton, což ukazuje na chromozomální integraci inaktivovaného aveC genu a ztrátu volného replikonu obsahujícího ermE gen. Jeden Erm^s Thio^s transformant byl identifikován a označen jako SE184-1-13. Fermentační analýza SE184-1-13 prokázala, že normální avermektiny již nebyly produkovány, a že SE184-1-13 měl stejný fermentační profil jako SE180-11.

·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · · » · · · • · ·»··« » * « * · · · β · · · * ·

9···« · (f · * ···· 11 11 ··· ·· ··*·

V třetím způsobu inaktivace aveC genu byl do chromozomálního aveC genu začleněn posun rámce přidáním dvou bází G po C v nt pozici 471 za použití PCR, čímž došlo k vytvoření místa BspEl. Přítomnost vytvořeného místa BspEl byla užitečná pro detekci náhrady genu. PCR produkty byly navrženy tak, aby došlo k začlenění frameshift mutace do aveC genu a tyto primery byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. Pravostranný primer měl sekvenci: 5^Z-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID č: 8) a levostranný primer měl sekvenci: 5' -AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3 (SEQ ID č: 9) . Podmínky PCR byly stejné, jako je posáno v Části 7.1.10. výše. 666 bp PCR produkt byl natráven pomocí Sphl za vzniku dvou fragmentů o velikosti 278 bp a 388. Fragment o velikosti 388 bp byl purifikován z gelu.

Plazmid pro náhradu genu byl zkonstruován následujícím způsobem: transportní vektor pWHM3 byl natráven pomocí EcoRI a BamHI. pSE119 byl natráven pomocí BamHI a Sphl, natrávená směs byla podrobena elektroforéze a zhruba 840 bp fragment byl purifikován z gelu. PSE119 byl natráven pomocí EcoRI a XmnI, natrávená směs byla podrobena elektroforéze a fragment o velikosti zhruba 1,7 Kb byl purifikován z gelu. Všechny čtyři fragmenty (tj . zhruba 7,2 Kb, zhruba 840 bp, zhruba 1,7 Kb a zhruba 388 bp) byly spolu ligovány v čtyřcestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a DNA analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE185, byl transmorfován do E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů. Tento plazmid byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis 1100-S38. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. PSE185 nenarušoval významně poměry • · · • · · <

· • · · · · ·

B2: Bl avermektinů po transformaci do kemne S. avermitilis 1100-SC38 (Tabulka 2).

PSE185 byl použit k transformaci protoplastů S. avermitilis pro tvrbu frameshift mutace v chromozomálním aveC genu. Protoplasty byly připraveny z thiostrepton rezistentních transformantů a umístěny jako jednotlivé kolonie do RM14. Po regeneraci protoplastů byly jednotlivé protoplasty prohlíženy na rezistenci k thiostreptonu. Z thiostrepton senzitivních, kolonií byla izolována chromozomální DNA, která byla prohlížena pomocí PCR na frameshift mutace integrované do byly navrženy na základě aveC byly

Biotechnologies, lne. ( Texas) sekvenci: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID č: 10) a levostranný primer měl sekvenci: 5' -GAACCGACCGCCTGATAC-3' ( SEQ ID č: 11) . Podmínky PCR byly stejné, jako je popsáno v Části 7. 1. 10. výše. Získaný PCR produkt měl 543 bp, po natrávení pomocí Bsp byly pozorovány tři fragmenty o vellikosti 368 bp, 96 bp a 79 bp, což ukazuje na chromozomální integraci inaktivovaného aveC genu a ztrátu volného replikonu.

chromozómu. PCR primery nukleotidové sekvence a dodány společností Genosys Pravostranný primer měl obsahuj ících že normální

Fermentační frameshift analýza mutant S. avermitilis mutaci v aveC genu prokázala, avermektiny již nebyly produkovány, a že tyto mutanty měly stejný fermentační HPLC profil jako kmeny SE180-11 a SE184-113. Jeden Thio^s transformant byl identifikován a označen jako kmen SE185-5a.

Navíc došlo k tvorbě mutace v aveC genu, která mění nt pozici 520 z G na A, která vede k záměně kodónu kódujícího tryptofan (W) v pozici 116 za terminační kodón. Kmen S. avermitilis s touto mutací neprodukoval normální avermektiny a měl stejný fermentační profil jako kmeny SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5a.

• · · · • · · · • · · · ··· ·· ····

Navíc došlo k tvorbě mutací v aveC genu, které mění: ( i) nt pozici 970 z G na A, což mění aminokyselinu v pozici 266 z glycinu (G) na aspartát (D) , a (ii) nt pozici 996 z T na C, což mění aminokyselinu v pozici 275 z tyrosinu (Y) na histidin (H). Kmen S. avermitilis s těmito mutacemi (G256D/Y275H) neprodukoval normální avermektiny a měl stejný fermentační profil jako kmeny SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5a.

Mutované kmeny S. avermitilis SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a a další zde poskytnuté s inaktivací aveC, poskytují vyhledávací nástroj k posouzení dopadu jiných mutací aveC genu. PSE186, který obsahuje divokou kopii aveC genu, byl transformován do

E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transf ormantů. Tato pSE186 DNA byla použita k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány a byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu, a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost funkčního aveC genu in trans byla schopna restaurovat normální produkci avermektinů v kmeni SE180-11 (Obrázek 5B).

8.2. Analýza mutací v aveC genu, které narušují poměry tříd B2 :B1

Jak je popsáno výše, byl kmen S. avermitilis SE180-11 obsahující neaktivní aveC gen komplementován transformací s plazmidem obsahujícím funkční aveC gen (pSE186). Kmen SE18011 byl také využit jako hostitelský kmen k charakterizaci dalších mutací aveC genu, jak je popsáno níže.

Chromozomální DNA byla izolována z kmene 1100-SC38 a použita jako templát pro PCR amplifikaci aveC genu. ORF o velikosti 1,2 Kb byl izolován PCR ampifikací za použití primerů ···· '··* ..... *’ ’ navržených na základě aveC nukleotidové sekvence. Pravostranný primer měl sekvenci SEQ ID č: 6 a levostranný primer měl sekvenci SEQ ID č: 7 ( viz Část 7. 1. 10 výše) . Podmínky PCR a sůbklonování byly stejné, jako je popsáno v Části 7.1.10. Analýza DNA sekvence ORF o velikosti 1,2 Kb prokázala mutaci v aveC genu, která mění nt pozici 337 z C na T, což mění aminokyselinu v pozici 55 ze šeřinu (S) na fenylalanin (F) . AveC gen obsahující mutaci S55F byl sůbklonován do pWHM3 za vzniku plazmidu, který byl označen jako pSEl87, a který byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE18011. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost aveC genu kódujícího záměnu v aminokyselinovém reziduu 55 (S55F) byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů ( Obr. 5C) ; avšak cyklohexyl B2: cyklohexyl Bl poměr byl zhruba 26: 1 ve srovnání s kmenem SE180-11 transformovaném pomocí pSE186, který měl poměr B2: Bl zhruba 1,6:1 (Tabulka 3), což ukazuje, že jediná mutace ( S55F) moduluje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-31.

Další mutace v aveC genu byla identifikována, že mění nt pozici 862 z G na A, což vede k záměně aminokyseliny v pozici 230 z glycinu (G) na aspartát (D) . Kmen S. avermitilis mající tuto mutaci (G230D) produkuje avermektiny v poměru B2:Bl zhruba 30:1.

8.3. Mutace, které redukují B2: Bl poměr

Některé mutace byly konstruovány, že snižují množství cyklohexyl-Bl následujícím způsobem.

Mutace v aveC genu byla identifikována, že mění nt pozici 588 z G na A, což vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 • · · · · · • · · · • · · · • · · • · · · • · · • · · · · · z alaninu (A) na threonin (T) . aveC gen obsahující A13 9T mutaci byl subklonován do pWHM3 za vzniku plazmidu, který byl označen pSE188, a který byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího záměnu v aminokyselinovém reziduu 139 (A139T) byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů ( Obr. 5D) ; avšak B2: Bl poměr byl zhruba 0,94:1, což ukazuje, že tato mutace snižuje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyi-Bl. Tento výsledek byl neočekávaný, protože publikované výsledky, stejně tak jako výsledky mutací popsaných výše, pouze demonstrovaly buďto inaktivaci aveC genu nebo zvýšenou produkci B2 formy avermektinů ve vztahu k Bl formě ( Tabulka 3) .

Protože A139T mutace narušila poměr B2: Bl v prospěšnějším Bl směru, byla zkonstruována mutace, která kódovala threonin místo šeřinu v aminokyselinové pozici 138. PSE186 byl tedy natráven pomocí EcoRI a klonován do pGEMšZf (Promega), který byl natráven pomocí EcoRI. Plazmid, který byl označen jako pSE186a, byl natráven pomocí Apal a KpnI, DNA fragmenty byly separovány na agarózovém gelu a dva fragmenty o velikosti zhruba 3,8 Kb a 0,4 Kb byly purifikovány z gelu. DNA inzert o velikosti zhruba 1,2 Kb z pSE186 byl použit jako PCR templát k založení záměny jediné báze v nt pozici 585. Byly navrženy PCR primery k založení mutace v nt pozici 585, které byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. ( Texas) . Pravostranný primer měl sekvenci: 5' GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID č:12); a levostranný primer měl sekvenci: 5' -GGAACCGACCGCCGCCTGATACA3' (SEQ ID č:13). PCR reakce byla provedena za použití • · · · • · (Clonetech Laboratoties, genomického PCR kitu Advantage GC

Palo Alto, CA) v pufru poskytnutém výrobcem, v přítomnosti 200 uM dNTP, 200 pmol každého primeru, 50 ng templátové DNA, 1, 0 M GC-Melt a 1 jednotky KlenTaq Polymerase mix ve finálním objemu 50 ul. Termální profil prvního cyklu byl 94°C po dobu 1 minuty, následovaný 25 cykly při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund a 68°C po dobu 2 minut, a 1 cyklem při teplotě 68 °C po dobu 3 minut. PCR produkt o velikosti 295 bp byl natráven pomocí Apal a KpnI, aby došlo k uvolnění 254 bp fragmentu, který byl podroben elektroforéze a purifikován z gelu. Všechny 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) byly spolu ligovány v troj čestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSEl98.

PSE198 byl natráven pomocí EcoRI, klonován do pWHM3, který byl natráven pomocí EcoRI a transformován do E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA. Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE190, byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího záměnu v aminokyselinovém reziduu 138 (S138T) byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů; avšak B2:B1 poměr byl zhruba 0,88:1, což ukazuje, že tato mutace snižuje • · ·· · »·· · · · · • · ····· ·· * • · · · · ···· · ··· ·· · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ···· množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl (Tabulka 3). Tento poměr B2: B1 je dokonce nižší než poměr 0,94:1 pozorovaný u mutace A139T produkované transformací kmene SE180-11 pomocí pSE188, jak je popsáno výše.

Další mutace byla zkonstruována za účelem začlenění threoninu do aminokyselinových pozic 13 8 i 13 9. DNA inzert o velikosti zhruba 1,2 Kb z pSE186 byl použit jako PCR templát. Byly navrženy PCR primery k založení mutací v nt pozicích 585 a 588, které byly dodány společností Genosys Biotechnologies, lne. ( Texas) . Pravostranný primer měl sekvenci: 5' GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID č: 14) ; a levostranný primer měl sekvenci: 5' GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID č: 15) . PCR reakce byla provedena za použití podmínek popsaných výše v této Části. PCR produkt o velikosti 449 bp byl natráven pomocí Apal a KpnI, aby došlo k uvolnění 254 bp fragmentu, který byl podroben elektroforéze a purifikován z gelu. PSE186a byl natráven pomocí Apal a KpnI, DNA fragmenty byly separovány na agarózovém gelu a dva fragmenty o velikosti zhruba 3,8 Kb a 0,4 Kb byly purifikovány z gelu. Všechny 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) byly spolu ligovány v troj čestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE230.

PSE230 byl natráven pomocí EcoRI, nakloňován do pWHM3, který byl natráven pomocí EcoRI a transformován do E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA. Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE231, byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího S138T/A139T byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů; avšak B2: Bl poměr byl zhruba 0,84:1, což ukazuje, že tato mutace dále snižuje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl (Tabulka 3) ve srovnání se snížením dosaženým transformací kmene SE180-11 pomocí pSE188 nebo pSE199, jak je popsáno výše.

Další mutace byla zkonstruována za účelem dalšího snížení množství produkovaného cyklohexyl B2 k cyklohexyl Bl. Protože S138T/A139T mutace narušila poměr B2: Bl v prospěšnějším Bl směru, byla zkonstruována mutace za účelem začlenění threoninu v aminokyselinové pozici 138 a fenylalaninu v aminokyselinové pozici 139. DNA inzert o velikosti zhruba 1,2 Kb z pSE186 byl použit jako PCR templát. Byly navrženy PCR primery k založení mutace v nt pozici 585 ( záměna T za A) , 588 ( záměna G za T) a

589 ( záměna C za T) , které byly dodány společností Genosys

Biotechnologies, lne. ( Texas) . Pravostranný primer měl sekvenci: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3 měl sekvenci:

PCR reakce

5' byla ( SEQ ID č: 25) ; a levostranný primer GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID č: 15) , provedena za použití genomického PCR kitu Advatnage GC (Clonetech Laboratoties, Palo Alto, CA) v pufru poskytnutém výrobcem, v přítomnosti 200 uM dNTP, 200 pmol každého primeru, 50 ng templátové DNA, 1,0 M GC-Melt a 1 jednotky Tth DNA Polymerase ve finálním objemu 50 ul. Termální profil prvního cyklu byl 94°C po dobu 1 minuty, následovaný 25 cykly při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund a 68°C po dobu 2 minut, a 1 cyklem při teplotě 68°C po dobu 3 minut. PCR produkt o velikosti 449 bp byl natráven pomocí Apal a KpnI, aby došlo k uvolnění 254 bp fragmentu, který byl podroben elektroforéze a purifikován z gelu. Všechny 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) byly spolu ligovány v troj čestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid byl označen jako pSE238.

PSE238 byl natráven pomocí EcoRI, nakloňován do pWHM3, který byl natráven pomocí EcoRI a transformován do E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plazmid, který byl označen jako pSE239, byl použit k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu a Thio¹’ Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Přítomnost dvojitě mutovaného aveC genu kódujícího S138T/A139F byla schopna restaurovat u kmene SE180-11 normální produkci avermektinů; avšak B2: B1 poměr byl zhruba 0,75:1, což ukazuje, že tato mutace dále snižuje množství produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl (Tabulka 3) ve srovnání se snížením dosaženým transformací kmene SE180-11 pomocí pSE188, pSE199, nebo pSE231, jak je popsáno výše.

• φ • · • φ φ · » · ·

I ΦΦΦΦ

Tabulka 3

Kmen S. avermitilis (transformuj ící plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní c B2	Relativní c B1	Průměrný poměr B2 :B1
SE180-11 ( žádný)	30	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	26	222	140	1,59
SE180-11 (pSE187)	12	283	11	26,3
SE180-11 (pSE188)	24	193	206	0,94
SE180-11 (pSE199)	18	155	171	0,88
SE180-11 (pSE231)	6	259	309	0,84
SE180-11 (pSE239)	20	184	242	0,75

Další mutace byly zkonstruovány za účelem dalšího snížení množství produkovaného cyklohexyl B2 k cyklohexyl B1 za použití techniky DNA přesouvání, jak je popsáno v publikaci Stemmer, 1994, Nátuře 370:389-391; a Stemmer, 1994, Proč Nati Acad Sci USA 91:10747-10751, a dále v patentech United States Patents 5605793, 5811238, 5830721 a 5837458.

DNA přesouvací plazmidy obsahující mutované aveC geny byly transformovány do kompetentních dam dcm E.coli buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a použita k transformaci protoplastů kmene SE180-11. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE18011 byly izolovány a analyzovány na produkci avermektinů s poměrem cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl 1: 1 nebo méně. Byla určena DNA sekvence plazmidové DNA z SE180-11 transformantů produkujících avermektiny s poměrem B2: B1 1:1 nebo méně.

Bylo identifikováno osm transformantů produkujících snížená množství cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl. Nejnižší poměr B2: B1 dosažený mezi těmito transformanty byl 04: 1 ( Tabulka 4).

Plazmidová DNA byla izolována z každého z osmi transformantů a byla určena DNA sekvence za účelem identifikace mutací v aveC genu. Mutace jsou následující.

• · · · • · · · • · · · .-.

• · · * · · * • · « · · · · • ·· · * ·

...............

PSE290 obsahuje 4 nukleotidové mutace v nt pozici 317 z T na A, v nt pozici 353 z C na A, v nt pozici 438 z G na A a v nt pozici 1155 z T na A Nukleotidové záměna v nt pozici 317 vede k záměně aminokyseliny v pozici 48 z D na E a nukleotidová záměna v nt pozici 438 vede k záměně aminokyseliny v pozici 89 z A na T. Poměr B2: B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,42:1 (Tabulka 4).

PSE291 obsahuje 4 nukleotidové mutace v nt pozici 272 z G na A, v nt pozici 585 z T na A, v nt pozici 588 z G na A a v nt pozici 708 z G na A Nukleotidová záměna v nt pozici 585 vede k záměně aminokyseliny v pozici 138 z S na T, nukleotidová záměna v nt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici

139 z A na T a nukleotidová záměna v nt pozici 708 vede k záměně aminokyseliny v pozici 179 z G na S. Poměr B2: B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,57:1 (Tabulka 4).

PSE292 obsahuje stejné 4 nukleotidové mutace jako pSE290. Poměr B2: B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,40:1 (Tabulka 4).

PSE293 obsahuje 6 nukleotidových mutací v nt pozici 24 z A na G, v nt pozici 286 z A na C, v nt pozici 497 z T na C, v nt pozici 554 z C na T, v nt pozici 580 z T na C a v nt pozici 886 z A na T. Nukleotidová záměna v nt pozici 286 vede k záměně aminokyseliny v pozici 38 z Q na P, nukleotidová záměna v nt pozici 580 vede k záměně aminokyseliny v pozici

136 z L na P a nukleotidová záměna v nt pozici 886 vede k záměně aminokyseliny v pozici 238 z E na G. Poměr B2: B1 produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,68:1 (Tabulka 4).

PSE294 obsahuje 6 nukleotidových mutací v nt pozici 469 z T na C, v nt pozici 585 z T na A, v nt pozici 588 z G na A, v nt pozici 708 z G na A, v nt pozici 833 z C na T a v nt pozici 1184 z G na A. Navíc jsou nukleotidy v pozicích 173, 174 a 175 deletovány. Nukleotidová záměna v nt pozici 469 vede k záměně aminokyseliny v pozici 99 z F na S, nukleotidová záměna v nt pozici 585 vede k záměně aminokyseliny v pozici 138 z S na T, nukleotidová záměna v nt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 z A na T a nukleotidová záměna v nt pozici 708 vede k záměně aminokyseliny v pozici 179 z G na S. Poměr B2: Bl produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,53:1 (Tabulka 4).

PSE295 obsahuje 2 nukleotidové mutace v nt pozici 588 z G na A a v nt pozici 856 z T na C. Nukleotidová záměna v nt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 z A na T a nukleotidová záměna v nt pozici 856 vede k záměně aminokyseliny v pozici 228 z M na T. Poměr B2: Bl produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,80:1 ( Tabulka 4) .

PSE296 obsahuje 5 nukleotidových mutací v nt pozici 155 z T na C, v nt pozici 505 z G na T, v nt pozici 1039 z C na T, v nt pozici 1202 z C na T a v nt pozici 1210 z T na C. Nukleotidová záměna v nt pozici 505 vede k záměně aminokyseliny v pozici 111 z G na V a nukleotidová záměna v nt pozici 103 9 vede k záměně aminokyseliny v pozici 289 z P na L. Poměr B2: Bl produkovaný buňkami nesoucími tento plazmid byl 0,73:1 (Tabulka 4).

PSE297 obsahuje 4 nukleotidové mutace v nt pozici 377 z G na T, v nt pozici 588 z G na A, v nt pozici 633 z A na G, v nt pozici 1067 z A na T. Nukleotidová záměna v nt pozici 588 vede k záměně aminokyseliny v pozici 139 z A na T, nukleotidová záměna v nt pozici 633 vede k záměně aminokyseliny v pozici • · • · · · • · • · ♦ · • ·

154 z K na E, nukleotidová záměna v k záměně aminokyseliny v pozici 298 z produkovaný buňkami nesoucími tento (Tabulka 4).

nt pozici 1067 vede Q na H. Poměr B2: B1 plazmid byl 0,67:1

Tabulka 4

Kmen S. avermitilis (transformuj ící plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní c B2	Relativní c B1	Průměrný poměr B2:B1
SE180-11 ( žádný)	4	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	4	0	0	0
SE180-11 (pSE290)	4	87	208	0,42
SE180-11 (pSE291)	4	106	185	0,57
SE180-11 (pSE292)	4	91	231	0,40
SE180-11 (pSE293)	4	123	180	0,68
SE180-11 (pSE294)	4	68	129	0,53
SE180-11 (pSE295)	4	217	271	0,80
SE180-11 (pSE296)	1	135	186	0,73
SE180-11 (pSE297)	1	148	221	0,67

9. Konstrukce 5'delečních mutant

Jak je vysvětleno v Části 5.1 výše, obsahuje nukleotidová sekvence S. avermitilis uvedená na Obrázku 1 ( SEQ ID č: 1) čtyři různé GTG kodóny v bp pozicích 42, 174, 177 a 180, které jsou potenciálními startovacími místy. Tato část popisuje konstrukci mnohočetných deleci 5' oblasti aveC ORF ( Obrázek 1; SEQ ID č:1), aby se definovalo, který z těchto kodónů může účinkovat jako startovací místo v aveC ORF pro expresi proteinu.

Fragmenty aveC genu různě deletované na	5' konci	byly
izolovány z chromozomální DNA S.	avermitilis pomocí	PCR
amplifikace. PCR primery byly navrženy na	základě aveC	DNA
sekvence a byly dodány	společností	Genosys	Biotechnologies,
lne. Pravostranné	primery	měly	sekvenci:	5' -
AACCCATCCGAGCCGCTC-3'	(SEQ ID	č: 16)	( D1F1) ;	5' -
TCGGCCTGCCAACGAAC-3'	(SEQ ID	č: 17)	( D1F2) ;	5' -
CCAACGAACGTGTAGTAG-3'	(SEQ ID	č: 18)	(D1F3); a	5' -
TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3'	( SEQ ID č:	:19) (D2F2) . Levostranné

> · · · » ··» ' • ·· · · · · ‘ 87 ...... ..... .....

primery měly sekvenci: 5' -CATGATCGCTGAACCGA-3' ( SEQ ID č: 20) ;

5' -CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' ( SEQ ID Č: 21) ; a 5' AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID č: 22) . PCR reakce byla provedena, jak je popsáno v Části 8,3 výše.

PCR produkty byly separovány elktroforeticky na 1% agarózovém gelu a byly detekovány jednotlivé DNA bandy o velikosti buďto zhruba 1,0 Kb nebo 1,1 Kb. PCR produkty byly purifikovány z gelu a ligovány s 25 ng linearizovaného pCR2.1 vektoru ( Invitrogen) v 1: 10 molárním vektor/inzert poměru podle instrukcí výrobce. Ligační směsi byly použity k transformaci One Shot™ kompetentních E. coli buněk ( Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampiciiin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA Tyto plazmidy byly označeny jako pSE190 (získán s primerem D1F1), pSE191 (získán s primerem D1F2), pSE192 (získán s primerem D1F3) a pSE193 (získán s primerem D2F2).

DNA inzerty byly natráveny pomocí BamHI/Xbal, separovány elktroforeticky na 1% agarózovém gelu, a odděleně ligovány s transportním vektorem pWHM3, který byl natráven pomocí BamHI/Xbal v celkové DNA koncentraci 1 ug v 1:5 molárním vektor/inzert poměru. Ligační směsi byly použity k transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampiciiin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tyto plazmidy, které byly označeny jako pSE194 ( D1F1), pSE195 ( D1F2) , pSE196 ( D1F3) a pSE197 ( D2F2) byly každý odděleně transformovány do kmene E. coli DMI, plazmidová DNA byla izolována z ampiciiin rezistentních transformantů a přítomnost inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tato DNA byla použita k transformaci protoplastů kmene S. avermitilis SE18011. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly • » · 4 ti * · * • · · * · * * • 4 9 · » · _ _ «4444* ···· ·» ·· ’·· izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu, a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů za účelem určení, kteá GTG místa byla nezbytná pro aveC expresi. Výsledky ukazují, že GTG kodón v pozici 42 může být eliminován bez ovlivnění aveC exprese, protože pSE194, pSE195 a pSE196, z nichž každý postrádá GTG místo v pozici 42, ale každý obsahuje tři GTG místa v pozicích 174, 177 a 180, byly všechny schopny restaurovat normální produkci avermektinů po transformaci do SE180-11. Normální produkce avermektinů nebyla restaurována transformací kmene SE180-11 pomocí pSE197, který postrádá všechny čtyři GTG místa (Tabulka 5).

Tabulka 5

Kmen S. avermitilis (transformuj ící plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní c B2	Relativní c B1	Průměrný poměr B2:B1
SE180-11 ( žádný)	6	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	6	241	152	1,58
SE180-11 (pSE194)	6	35	15	2,43
SE180-11 (pSE195)	6	74	38	1,97
SE180-11 (pSE196)	6	328	208	1,58
SE180-11 (pSE197)	δ	0	0	0

10. Klonování aveC homologů ze S. hygroscopicus a S. gri seochromogene s

Předkládaný vynález umožňuje identifikovat a klonovat aveC homologní geny z jiných avermektin nebo milbemycin produkujících druhů Streptomyces. Například byla hybridizována s 1,2 Kb aveC próbou ze S. avermitilis kosmidová knihovna genomické DNA ze S. hygrosopicus (FERM BP-1901), jak je popsáno výše. Bylo identifikováno několik kosmidových klonů, které silně hybridizují. Chromozomální DNA byla izolována z těchto kosmidů a byl identifikován 4,9 Kb KpnI fragment, který hybridizoval s aveC próbou. Tato DNA byla sekvenována a byl identifikován ORF (SEQ ID č: 3) mající významnou homologii s aveC ORF S. avermitilis. Aminokyselinová sekvence (SEQ ID • · · * • « > ·« * · · · « • * · « · * • ·« a ·» č: 4) odvozená z aveC homologního ORF S. hygroscopicus je uvedená na Obrázku 6.

Navíc byla hybridizována s 1,2 Kb aveC próbou ze S. avermitilis kosmidová knihovna genomické DNA ze S. gríseochromogenes, jak je popsáno výše. Bylo identifikováno několik kosmidových klonů, které silně hybridizují. Chromozomální DNA byla izolována z těchto kosmidů a byl identifikován 5,4 Kb Pstl fragment, který hybridizoval s aveC próbou. Tato DNA byla sekvenována a byl identifikován avec homologní částečný ORF mající významnou homologii s aveC ORF S. avermitilis. Odvozená částečná aminokyselinová sekvence (SEQ ID č: 5) je uvedená na Obrázku 6.

DNA a aminokyselinová sekvenční analýza aveC homologů ze S. hygroscopicus a S. gríseochromogenes ukazují, že tyto oblasti sdlejí významnou homologii ( zhruba 50% sekvencí identita na aminokyselinové úrovni), jak vůči sobě tak i s genovými produkty aveC ORF S. avermitilis a AveC (Obrázek 6).

11. Konstrukce plazmidu s aveC genem za ermE promotérem

1,2 Kb aveC ORF z pSE186 byl subklonován v pSE34, což je transportní vektor pWHM3 mající 300 bp ermE promotér inzerovaný jako KpnI/BamHI fragment v KpnI/BamHI místě pWHM3 (viz Ward et al., 1986, Mol Gen Genet 203:468-478). PSE186 byl natráven pomocí BamHI a HindlII, natrávená směs byla podrobena elektroforéze a 1,2 Kb fragment byl izolován z agarózového gelu a ligován s pSE34, který byl natráven pomocí BamHI a HindlII. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk podle instrukcí výrobce. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost

1,2 Kb inzertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tento plazmid, který byl označen jako pSE189 byl transformován do kmene E. coli DMI a plazmidová DNA byla izolována z ampicilin

9999 rezistentních transf ormantů. Protoplasty kmene S. avermitilis 1100-SC38 byly transformovány pomocí pSE189. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene 1100-SC38 byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů.

Transformanty kmene 1100-SC38 obsahující pSE189 měly narušené poměry produkovaných avermektin cyklohexyl-B2: avermektin-Bl (zhruba 3:1) ve srovnání s kmenem 1100-SC38 (zhruba 34:1) a celková produkce avermektinů se zvýšila přibližně 2,4 krát ve srovnání s kmenem 1100-SC38 transformovaným pomocí pSE119 (Tabulka 6).

PSE189 byla také transformována do protoplastů divokého typu kmene S. avermitilis. Thiostrepton rezistentní transformanty byly izolovány a analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Celkové avermektiny produkované divokým typem S. avermitilis transformovaným pomocí pSE189 se zvýšily přibližně

2,2 krát ve srovnání s divokým kmenem S. avermitilis transformovaným pomocí pSE119 (Tabulka 6).

Tabulka 6

Kmen S. avermitilis (transformující plazmid)	n testovaných transformantů	Relativní B2	Relativní B1	Relativní celkové avermektiny	Průměrný poměr B2: B1
1100-SC38	6	155	4,8	176	33,9
1100-SC38 (pSE119)	9	239	50,3	357	4,7
1100-SC38 (pSE189)	16	546	166	849	3,3
Divoký typ	6	59	42	113	1,41
Divoký typ (pSE119)	6	248	151	481	1,64
Divoký typ (pSE189)	5	545	345	1, 071	1,58

12. Chimérický plazmid obsahující sekvence z aveC ORF S. avermitilis i aveC homologa S. hygroscopicus

Hybridní plazmid označený jako pSE350 byl zkonstruován, aby obsahoval 564 bp část aveC homolog S. hygroscopicus • · · · · · nahrazující 564 homologní část aveC ORF S. avermitilis (Obrázek 7) následujícím způsobem. PSE350 byl zkonstruován za použití BsaAI restrikčního místa, které je konzervováno v obou sekvencích ( aveC pozice 225) a KpnI restrikčním místě, které je přítomno v aveC genu S. avermitilis (aveC pozice 810). KpnI místo bylo začleněno do DNA S. hygroscopicus pomocí PCR za použití pravostranného primeru 5' -CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' ( SEQ ID č: 23) a levostranného primeru 5' -GAACTGGTACCAGTGCCC-3' ( SEQ ID č:24) (dodané společností Genosys Biotechnolgies) za použití PCR podmínek popsaných v Části 7.1.10 výše. PCR produkt byl natráven pomocí BsaAI a KpnI, fragmenty byly separovány na 1% agarózovém gelu a 564 bp BsaAl/KpnI fragment byl izolován z gelu. pSE179 (popsaný v Části 7.1.10 výše) byl natráven pomocí KpnI a HindlII, fragmenty byly separovány elektroforeticky na 1% agarózovém gelu a fragment o velikosti zhruba 4,5 Kb byl izolován z gelu. pSE179 byl natráven pomocí HindlII a BsaAI, fragmenty byly separovány elektroforeticky na 1% agarózovém gelu a BsaAI/HindlII fragment o velikosti zhruba 0,2 Kb byl izolován z gelu. HindlII/KpnI fragment o velikosti zhruba 4,5 Kb, BsaAI/HindlII fragment o velikosti zhruba 0,2 Kb a BsaAl/KpnI fragment o velikosti zhruba 564 bp ze S. hygroscopicus byly spolu ligovány v troj čestné ligaci a ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5c* buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou za použití KpnI a Aval. Plazmid byl natráven pomocí HindlII a Xbal, aby došlo k uvolnění inzertu o velikosti 1,2 Kb, který byl poté ligován s pWHM3, který byl natráven pomocí HindlII a Xbal. Ligační směs byla transformována do kompetentních E.coli DH5a buněk. Plazmidová DNA byla izolována z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou za použití HindlII a Aval. Plazmidová DNA byla transformována do E.coli DMI, plazmidová DNA byla izolována • ·· · z ampicilin rezistentních transformantů a přítomnost správného inzertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou sekvence DNA Plazmid byl označen jako pSE350 a použit k transformaci protoplastů kmene SE180-11 S. avermitilis. Thiostrepton rezistentní transformanty kmene SE180-11 byly izolovány, byla určena přítomnost rezistence k erytromycinu, a Thio^r Erm^r transformanty byly analyzovány HPLC analýzou fermentačních produktů. Výsledky ukazují, že transformanty obsahující S. avermitilis/S. hygroscopicus hybridní plazmid mají průměrný B2: Bl poměr zhruba 109: 1 ( Tabulka 7) .

Tabulka 7

Kmen S. avermitilis (transformuj ící plazmid)	n testovaných transformantú	Relativní c B2	Relativní c Bl	Průměrný poměr B2:B1
SE180-11 ( žádný)	8	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	8	0	0	0
SE180-11 (pSE350)	16	233	2	109

Uložení biologického materiálu

Následující biologický materiál byl uložen v Americké sbírce typových kultur (ATCC), Parklawn Drive, Rockvílle, MD, 20852, USA, 29. ledna 1998 a byly mu přiřazeny následující přístupová čísla:

Plazmid _Přístupové číslo

Plazmid pSE180 209605

Plazmid PSE186 209604

Všechny patenty, patentové přihlášky a publikace výše citované jsou tímto začleněny jako reference v celé své šíři.

Předkládaný vynález není omezen rozsahem specifických forem vynálezu zde popsaných, které jsou zamýšleny jako jednotlivé ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu a funkčně ekvivalentní metody a komponenty jsou v rozsahu vynálezu. Různé modifikace • · · vynálezu, navíc k těm, které byly uvedeny a popsány, budou skutečně zjevné osobám znalým oboru z předchozího popisu a doprovodných obrázků. Takové modifikace jsou považovány za patřící do rozsahu přiložených patentových nároků.

·«·· ·· ···· · ♦ ·· • · · · · · · · · • · ····· · · * , ···· · ♦ · · ♦

........ ,·· ··· ......

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKY Polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která je jinak stejná aveC alela Streptomyces avermitilis, AveC genový produkt-kódující sekvenci plazmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo nukleotidovou sekvenci aveC ORF S. avermitilis, jak je uvedeno na Obrázku 1 (SEQ ID č. 1), nebo její degenerovanou variantu, ale kterážto nukleotidová sekvence dále obsahuje jednu nebo více mutací, které kódují substituci aminokyseliny v jedné nebo více aminokyselinových s aminokyselinovými 154, 179, 228, 238, reziduích, které korespondují pozicemi 38, 48, 89, 99, lil, 136, 289 nebo 298 sekvence SEQ ID č. 2, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53 692, v kterých byla divoká aveC alela inaktivována, a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují poměr třídy 2: 1 avermektinů, který je odlišný od poměru produkovaného buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 1, kde třídou 2:1 avermektinů jsou cykiohexyl B2: cykiohexyl B1 avermektiny. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 2, kde odlišný poměr třídy 2:1 avermektinů je snížen ve srovnání s poměrem třídy 2: 1 produkovaným buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, které exprimují pouze divoký typ aveC alely. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 3, kde poměr třídy 2:1 avermektinů je zhruba 0,8:1 nebo méně. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 3, kde poměr třídy 2:1 avermektinů je zhruba 0,68:1 nebo méně. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 3, kde poměr třídy 2:1 avermektinů je zhruba 0,53:1 nebo méně. • · · · • · · · * * · · • · ····· · * 7. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 3, kde poměr třídy 2:1 avermektinů je zhruba 0,42:1 nebo méně. 8. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 3, kde poměr třídy 2:1 avermektinů je zhruba 0,40:1 nebo méně. 9. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 1, kde nukletidová sekvence dále obsahuje jednu nebo více mutací kódujících aminokyselinovou substituci v jednom nebo obou aminokyselinových reziduích odpovídajících aminokyselinovým pozicím 138 a 139 SEQ ID č: 2. 10. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 2, kde aminokyselinové substituce jsou vybrány z jedné nebo více skupin obsahujících: a) aminokyselinové reziduum Q v pozici 38 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P; b) aminokyselinové reziduum D v pozici 48 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E; c) aminokyselinové reziduum A v pozici 89 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T; d) aminokyselinové reziduum F v pozici 99 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S; e) aminokyselinové reziduum G v pozici 111 nahrazené V nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro V; f) aminokyselinové reziduum L v pozici 136 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P; g) aminokyselinové reziduum K v pozici 154 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E; • · 4 4 4 · * · ·· • « · · 4 4 • · 44444 44 4 4444 4 · 4 · * ··» *·· ·· ·♦· ·· ···· h) aminokyselinové reziduum G v pozici 179 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S; i) aminokyselinové reziduum M v pozici 228 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T; j) aminokyselinové reziduum E v pozici 238 nahrazené D nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro D; k) aminokyselinové reziduum P v pozici 289 nahrazené L nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro L; a l) aminokyselinové reziduum Q v pozici 298 nahrazené H nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro H. 11. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 2, kde je mutována kombinace aminokyselinových reziduí, a kde kombinace je vybrána z jedné nebo více skupin obsahuj ících: a) aminokyselinová rezidua D48 a A89; b) aminokyselinová rezidua S138 a A139 a G179; c) aminokyselinová rezidua Q38, L136 a E238; d) aminokyselinová rezidua F99, S138, A139 a G179; e) aminokyselinová rezidua A139 a M228; f) aminokyselinová rezidua Glll a P289; a g) aminokyselinová rezidua A139, K154 a Q298. 12. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 11, kde je kombinace aminokyselinových substitucí je vybrána z jedné nebo více skupin obsahujících: a) D48E/A89T; b) S138T/A139T/G179S; c) Q38P/L136P/E238D; d) F99S/S138T/A139T/G179S; ·· ···« ·· ·««« *· ** • 9 9 9 9 ···· • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 4··» ···· 4 • · · · · 9 9 9 9 999 99 99, 999 99 99 99 e) A139T/M228T; f) G111V/P289L; a g) A139T/K154E/Q298H. 13. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 12, kde mutace v aveC sekvenci kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 317 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 438 SEQ ID č: 1. 14. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 13 dále zahrnující záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 353 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 1155 SEQ ID č: 1. 15. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 12, kde mutace v aveC sekvenci kódující S138T/A139/G179S zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 708 SEQ ID č: 1. 16. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 15 dále zahrnující záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 272 SEQ ID č: 1. 17. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 12, kde mutace v aveC sekvenci kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze z A na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 286 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 580 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 886 SEQ ID č: 1. 18. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 17 dále zahrnující záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 24 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C •4 4··4 4, 444· 4 » 4 '» <·♦ » • 4 * 4 » 4 4 «4 t 4 4 · 4 4 4 4 1 4 QQ 444 44 4 4« **<w 444444 44 444 444444 v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 497 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 554 SEQ ID č: 1. 19. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 12, kde mutace v aveC sekvenci kódující F99S/S138T/A139T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidových pozicích odpovídající nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 708 SEQ ID č: 1. 20. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 19 dále zahrnující záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 833 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 1184 SEQ ID č: 1. 21. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 12, kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 856 SEQ ID č: 1. 22. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 12, kde mutace v aveC sekvenci kódující G111V/P289L zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 505 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 1039 SEQ ID č: 1. 23. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 22 dále zahrnující záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 155 SEQ ID č: 1, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 1202 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 1210 SEQ ID č: 1. • · · · • · · • · · · · · 24. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 12, kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 633 SEQ ID č:l, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 1067 SEQ ID č: 1. 25. Polynukleotidová molekula podle patentového nároku 24 dále zahrnující záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 377 SEQ ID č: 1. 26. Rekombinantní vektor obsahující polnukleotidovou molekulu podle patentového nároku 1. 27. Hostitelská buňka obsahující polnukleotidovou molekulu podle patentového nároku 1 nebo rekombinantní vektor podle patentového nároku 26. 28. Hostitelská buňka podle patentového nároku 27, kteroužto buňkou je buňka Streptomyces. 29. Způsob přípravy nového kmene S. avermitilis zahrnující mutaci aveC alely v buňkách kmene S. avermitilis, kterážto mutace vede k substituci různých aminokyselinových reziduí v aveC genovém produktu v jedné nebo více aminokyselinových pozicích odpovídajících aminokyselinovým reziduím 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 nebo 298 sekvence SEQ ID č. 2, takže buňky kmene S. avermitilis ATCC 53692, v kterých byla aveC alela mutována produkují poměr třídy 2: 1 avermektinů, který je odlišný od poměru produkovaného buňkami kmene S. avermitilis ATCC 53692, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. 30. Způsob podle patentového nároku 29, kde třídou 2:1 avermektinů jsou cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny. 31. Způsob podle patentového nároku 30, kde odlišný poměr třídy 2:1 avermektinů je snížený poměr. ·· · · · » * « · • · ····· * « -ΙΛΛ · ···· · · * 100 * · · · * · * ···· ·· ·· ··· · · · ' 32. Způsob podle patentového nároku 31, kde poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0,8:1 nebo méně. 33. Způsob podle patentového nároku 31, kde poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0,68:1 nebo méně. 34. Způsob podle patentového nároku 31, kde poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0,53:1 nebo méně. 35. Způsob podle patentového nároku 31, kde poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0,42:1 nebo méně. 36. Způsob podle patentového nároku 31, kde poměr třídy 2:1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0,40:1 nebo méně. 37. Způsob podle patentového nároku 31 dále zahrnující začlenění jedné nebo více mutací v aveC alele, která kóduje aminokyselinovou substituci v jednom nebo obou aminokyselinových reziduích odpovídajících aminokyselinovým pozicím 138 a 139 SEQ ID č: 2. 38. Způsob podle patentového nároku 30, kde aminokyselinové substituce jsou vybrány z jedné nebo více skupin obsahuj ících: a) aminokyselinové reziduum Q v pozici 38 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P; b) aminokyselinové reziduum D v pozici 48 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E; 101 .:.. ’.. ..... ·· ··' c) aminokyselinové reziduum A v pozici 89 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T; d) aminokyselinové reziduum F v pozici 99 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S; e) aminokyselinové reziduum G v pozici 111 nahrazené V nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro V; f) aminokyselinové reziduum L v pozici 136 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P; g) aminokyselinové reziduum K v pozici 154 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E; h) aminokyselinové reziduum G v pozici 179 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S; i) aminokyselinové reziduum M v pozici 228 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T; j) aminokyselinové reziduum E v pozici 238 nahrazené D nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro D; k) aminokyselinové reziduum P v pozici 289 nahrazené L nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro L; a l) aminokyselinové reziduum Q v pozici 298 nahrazené H nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro H. 39. Způsob podle patentového nároku 30, kde avec alela je mutována, aby kódovala substituce kombinací aminokyselinových pozic, a kde kombinace je vybrána z jedné nebo více skupin obsahujících: • · · · ·· ·«·« ·* * • , · e · * · · ' • · · · « · · * * 102 a) aminokyselinová rezidua D48 a A89; b) aminokyselinová rezidua S138 a A139 a G179; c) aminokyselinová rezidua Q3 8, L136 a E238; d) aminokyselinová rezidua F99, S138, A139 a G179; e) aminokyselinová rezidua A139 a M228; f) aminokyselinová rezidua GUI a P289; a g) aminokyselinová rezidua A139, K154 a Q298. 40. Způsob podle patentového nároku 39, kde je kombinace aminokyselinových substitucí je vybrána z jedné nebo více skupin obsahujících: a) D48E/A89T; b) S138T/A139T/G179S; c) Q38P/L136P/E238D; d) F99S/S138T/A139T/G179S; e) A139T/M228T; f) G111V/P289L; a g) A139T/K154E/Q298H. 41. Způsob podle patentového nároku 40, kde mutace v aveC alele kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 317 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 438 SEQ ID č: I. 42. Způsob podle patentového nároku 41 dále zahrnující záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici v aceC alele odpovídající nt pozici 353 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1155 SEQ ID č: 1. 43. Způsob podle patentového nároku 40, kde mutace v aveC sekvenci kódující S138/A139/G179S zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č:1., a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 708 SEQ ID č: 1. • · • · 44. Způsob podle patentového nároku 43 dále zahrnující záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 272 SEQ ID č: 1. 45. Způsob podle patentového nároku 40, kde mutace v aveC sekvenci kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze z A na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 286 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 580 SEQ ID č:1. , a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 886 SEQ ID č: 1. 46. Způsob podle patentového nároku 45 dále zahrnující záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 24 SEQ ID č:1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 497 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 554 SEQ ID č: 1. 47. Způsob podle patentového nároku 40, kde mutace v aveC sekvenci kódující F99S/S138T/A139T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidovych pozicích v aveC alele odpovídající nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 708 SEQ ID č: 1. 48. Způsob podle patentového nároku 47 dále zahrnující záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 833 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1184 SEQ ID č: 1. 49. Způsob podle patentového nároku 40, kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze z G na A 104 .I..*..* .· .· v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 856 SEQ ID č: 1. 50. Způsob podle patentového nároku 40, kde mutace v aveC sekvenci kódující G111V/P289L zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 505 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1039 SEQ ID č: 1. 51. Způsob podle patentového nároku 50 dále zahrnující záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 155 SEQ ID č: 1, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1202 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1210 SEQ ID č:1. 52. Způsob podle patentového nároku 40, kde mutace v aveC sekvenci kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č:1, záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 633 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1067 SEQ ID č: 1. 53. Způsob podle patentového nároku 52 dále zahrnující záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 377 SEQ ID č: 1. 54. Buňka Streptomyces avermitilis s mutací aveC alely, která kóduje aveC genový produkt mající substituci v jedné nebo více aminokyselinových pozicích odpovídajících aminokyselinovým reziduím 38, 48, 89, 99, 111, 136, 154, 179, 228, 238, 289 nebo 298 sekvence SEQ ID č. 2, kde buňka produkuje poměr třídy 2: 1 avermektinů, který je odlišný od poměru produkovaného buňkami kmene S. avermitilis, který exprimuje pouze divoký typ aveC alely. • · · · 105 55. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 54, kde třídou 2: 1 avermektinů jsou cyklohexyl B2: cyklohexyl Bl avermektiny. 56. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 55, kde odlišný poměr třídy 2: 1 avermektinů je snížený poměr. 57. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 56, kde poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0, 8: 1 nebo méně. 58. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 56, kde poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0,68:1 nebo méně. 59. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 56, kde poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0, 53: 1 nebo méně. 60. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 56, kde poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0, 4 2: 1 nebo méně. 61. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 56, kde poměr třídy 2: 1 avermektinů produkovaný buňkami kmene S. avermitilis, v kterém byla aveC alela mutována je zhruba 0, 4 0: 1 nebo méně. 62. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 55, v které aveC alela dále kóduje aminokyselinovou substituci v jednom nebo obou aminokyselinových reziduích odpovídajících aminokyselinovým pozicím 138 a 139 SEQ ID č: 2. 63. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 55, kde aminokyselinové substituce jsou vybrány z jedné nebo více skupin obsahujících: a) aminokyselinové reziduum Q v pozici 38 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P; b) aminokyselinové reziduum D v pozici 48 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E; c) aminokyselinové reziduum A v pozici 89 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T; d) aminokyselinové reziduum F v pozici 99 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S; e) aminokyselinové reziduum G v pozici 111 nahrazené V nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro V; f) aminokyselinové reziduum L v pozici 136 nahrazené P nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro P; g) aminokyselinové reziduum K v pozici 154 nahrazené E nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro E; h) aminokyselinové reziduum G v pozici 179 nahrazené S nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro S; i) aminokyselinové reziduum M v pozici 228 nahrazené T nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro T; j) aminokyselinové reziduum E v pozici 238 nahrazené D nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro D; k) aminokyselinové reziduum P v pozici 289 nahrazené L nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro L; a 107

1) aminokyselinové reziduum Q v pozici 298 nahrazené H nebo aminokyselinou, která je konzervativní substitucí pro H.

64. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 55, kde avec alela je mutována, aby kódovala aminokyselinové substituce kombinací aminokyselinových pozic, a kde kombinace je vybrána z jedné nebo více skupin obsahujících:

a) aminokyselinová rezidua D48 a A89;

b) aminokyselinová rezidua S138 a A139 a G179;

c) aminokyselinová rezidua Q38, L136 a E238;

d) aminokyselinová rezidua F99, S138, A139 a G179;

e) aminokyselinová rezidua A139 a M228;

f) aminokyselinová rezidua GUI a P289; a

g) aminokyselinová rezidua A139, K154 a Q298.

65. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 64, kde je kombinace aminokyselinových substitucí je vybrána z jedné nebo více skupin obsahujících:

a) D48E/A89T;

b) S138T/A139T/G179S;

C) Q38P/L136P/E238D;

d) F99S/S138T/A139T/G179S;

e) A139T/M228T;

f) G111V/P289L; a

g) A139T/K154E/Q298H.

66. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 65, kde mutace v aveC alele kódující D48E/A89T zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 317 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 438 SEQ ID č: 1.

67. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 66, kde mutace v aveC alele kódující D48E/A89T dále zahrnují záměnu báze z C na A v nukleotidové pozici v aceC alele odpovídající nt pozici 353 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na • · • · · ·

A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1155 SEQ ID č: 1.

68. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 65, kde mutace v aveC alele kódující S138/AI39/G179S zahrnují záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 708 SEQ ID č: 1.

69. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 68, kde mutace v aveC alele kódující S138/A139/G179S dále zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 272 SEQ ID č: 1.

70. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 65, kde mutace v aveC alele kódující Q38P/L136P/E238D zahrnují záměnu báze z A na C v nukleotidové pozici odpovídající nt pozici 286 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 580 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 886 SEQ ID č: 1.

71. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 70, kde mutace v aveC alele kódující Q38P/L136P/E238D dále zahrnují záměnu báze z A na G v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozicí 24 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 497 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 554 SEQ ID č: 1.

72. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku

65, kde mutace v aveC alele kódující F99S/S138T/A139T/G179S zahrnují deleci 3 párů bází v nukleotidových pozicích v aveC alele odpovídající nukleotidům 173, 174 a 175 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 469 SEQ ID č: 1, záměnu báze z T na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici

109 • » · ·

585 SEQ ID č: 1, záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 708 SEQ ID č: 1.

73. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 72, kde mutace v aveC alele kódující F99S/S138T/A139T/G179S dále zahrnují záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 833 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1184 SEQ ID č: 1.

74. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 65, kde mutace v aveC alele kódující A139T/M228T zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 856 SEQ ID č: 1.

75. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 65, kde mutace v aveC alele kódující G111V/P289L zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 505 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1039 SEQ ID č: 1.

76. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 75, kde mutace v aveC alele kódující G111V/P289L dále zahrnují záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 155 SEQ ID č: 1, záměnu báze z C na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1202 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z T na C v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1210 SEQ ID č: 1.

77. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 65, kde mutace v aveC alele kódující A139T/K154E/Q298H zahrnují záměnu báze z G na A v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 588 SEQ ID č: 1, záměnu báze z A • · · · ··· ♦ · * • · · > » * • · · · * * · no .:.. ·..· ·..·... ’..·.:

na G v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 633 SEQ ID č: 1, a záměnu báze z A na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 1067 SEQ ID č: 1.

78. Buňka Streptomyces avermitilis podle patentového nároku 52, kde mutace v aveC alele kódující A13 9T/K.154E/Q298H dále zahrnují záměnu báze z G na T v nukleotidové pozici v aveC alele odpovídající nt pozici 377 SEQ ID č: 1.

79. Postup produkce avermektinů zahrnující kultivaci buněk podle patentového nároku 55 v kultivačním médiu za podmínek, které umožňují nebo indukují produkci avermektinů, a získání řečených avermektinů z kultury.

80. Složení cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektinů produkovaných buňkami Streptomyces avermitilis zahrnující cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru 0,68:1 nebo méně v kultivačním médiu, v kterém byly buňky kultivovány.

81. Složení cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektinů produkovaných buňkami kmene Streptomyces avermitilis, který exprimuje mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který vede ke snížení poměru třídy 2: 1 cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 avermektinů produkovaného buňkami ve srovnání s buňkami stejného kmene S. avermitilis, který neexprimuje mutovanou aveC alelu, ale exprimuje pouze divoký typ aveC alely, kteréžto složení zahrnuje cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru 0,68:1 nebo méně v kultivačním médiu, v kterém byly buňky kultivovány.

/7 o o> o o r-I 04

O <=> θ

O O O

U~) V-O Γ- ·· Μ·· * Μ* • · • · « * ·· · ♦· » * ři/^τ,ζ tcacgaaaccggacacaccacacacacgaaggtgagacagcgtgaacccatccgagccgctcggcctgcccaacgaacgtgtagtagacacccgaccgtc

CD + q E-* 4 CD 4· < + X3 E- + CJ 4 Em 4 X CJ 4 CD 4 CJ M- Em 1 CD 1 CJ i t-D Em 1 CJ Em ) 1*4 CD CD • «< 1 Em CJ » 1 O » _3 » CD 1 CD 1 > CD 1 CD 1 CD CD CJ l CJ 1 Em i CD CJ < ·< l tá CD 1 Em 1 Em 1 CJ Em i EM Em I co C 1 cp 1 «< I CD i CD CJ 1 CJ 1 Oá CD 1 CJ 1 CD » > CD CD 1 Em 1 >» CD 1 CJ I CD 1 CD 1 1 «< 1 co EM 1 CJ 1 < to l CJ » MC 1 CJ I CJ 1 ·< 1 to CD I 1 Ctí CD t CD 1 s* CJ 1 CD CD 1 U EM 1 CJ » Em Em i CJ ! Sá CJ 1 CJ 1 CD 1 < CD 1 Em • CJ 1 U3 CP l CJ O » >· CD 1 «< 1 CD 1 < CJ 1 CD l Em i X 1 o l CP 1 CJ | CD l CD 1 CD > 4* 03 CJ 1 Em 1 co Em ( CD l CD 1 C3 Em 1 CD 1 Em | cd + CD CJ CD *< 4- CJ 4- CJ 4 .-3 6m 4 CJ 4 Em 4 Ou «+· CJ 4 CD 1 CD 1 CJ 1 »< > » CJ 1 CJ 1 Em CD i O * CJ l CD I CJ 1 CD 1 CD Em i CJ 1 CD » Em 1 CJ 1 CJ l oá Em 1 EM t CD t O l CD i CD 1 > CJ 1 CD t CD 1 S> CJ l «< l »< i X Em 1 CD | O t 1^5 ·< t Em EM 1 co CJ 1 CD 1 mC 1 Em 1 cd 1 CD 1 CJ I CD í CJ l O CD 1 CJ 1 Em 1 co Em 1 CD CD 1 w EM 1 ·< 1 CD < CD 1 em « CJ 1 Oá Em 1 CD 1 CJ 1 ^3 Em » CJ i CD 1 D* CD 1 CD I Em i 3= CD 1 CJ 1 CD 1 > CJ 1 CD 1 CD 1 t> < 1 CJ I Ε* 1 * CJ t cd · CD i ςρ CD 1 CJ 1 CD 1 CD l CD CD 1 Q CJ 1 CJ I CD 1 Em 1 CD 1 Em l CJ EM 1 CD 1 CJ 1 Ctí mC CJ » CD 1 mC 1 CD I O 4 >· c 4 CD 4 CJ 4» »-D Em 4· CD 4 CD 4 W CD 4 Em + Em 4 >* Em 4 O ‘ CJ » O CD 1 EM 1 CJ 1 CD l CJ CJ 1 04 t*i 1 Em 1 I Em l CJ 1 < . 1 Dá EM 1 CD I Em 1 X CJ CJ * < 1 X CJ 1 CJ 1 CD i >· CD 1 CD 1 CD > D* CJ 1 .CJ 1 Cm\CJ i CJ Pm Em i o 1 CD 1 ·< CJ I CD l CD i CD CD 1 1 Ctí CJ 1 CJ 1 CD Em 1 fr* EM 1 CJ t CJ 1 Em r CD 1 CJ CJ í CD ι< 1 Em 6m CJ < CD 1 > u 1 Em 1 CD » 0> CJ ¹ p EM 1 co Em ^CD 1 CJ M3 EM 1 o 1 cd 1 ·< CJ 1 CD i 1 CD l ·< E-t 1 Em 1 X CD 1 CD EM 1 tu cp l CD 1 CD I CJ 1 CD 1 Em l Cm «< 1 CJ 1 « CJ CJ l CD 1 CD CJ 1 0 1 CJ 1 CJ 1 CJ ( CJ i CG Má 1 CD l CD CD 1 Em 1 CJ 1 0-4 »<.· I CD 4 ·< 4 Cm 6-í 4 CJ M· CD 4· w CD 4 4 CJ 4 04 CD 4 CD 4 CJ 4 em « CD 1 CJ 1 Em 1 CD Em J X CD CD 1 CD 1 CD CJ t Em I em i »< 1 CD 1 Em CJ *Ú 1 ·< « EM l CJ i CD f l< CD 1 CD l Ctí CD 1 cr CD -c CJ CJ CJ 1 t-3 Em l «C 1 CD t CJ l CJ l Em 1 3s CD 1 CD CD < CJ CD i CP 1 > MC i CD 1 e-< i Em » CD 1 E-· ·< CD l CD CJ • CD > O 1 Ol CD k CD > »< i »—» CJ 1 CJ CD M CJ l CD EM 1 CO Em 1 CJ » CD | Ε-» » CD l CD 1 m*5 2 1 CD CJ l A· CD CJ 1 CP t ř»· Em i CJ I CJ l Em 1 CD 1 < as CJ CD 1 6m X CD > CJ 1 6m 1 | CD l CJ t CJ 1 CD 1 CD *< CD 1 *< CD i CD CJ 1 CJ 1 CD t Ε-» 4 CD 4 CD 4 *tí €m 4- Em 4- CJ 4 oá Em 4 CD 4 CP 4 *< CJ 4 CD 4 CJ 1 CD 1 ·< » X CD CJ 1 CD £> Em Ί CJ 1 Em 1 CO Em ·< t CJ 1 Ctí CJ 1 CJ 1 CD CD CD » CJ CJ 1 ►D £m 1 CJ 1 CD | *< * CJ t CD i *á Em 1 CD CJ » Pá CD CD 1 CJ l >-3 »< i CD 1 CD » ·< 1 CJ 1 CJ 1 J3 CJ CJ «< co Em » CJ 1 CD O CD I e-« i &M 1 >M CJ 1 CD 1 CJ CM CJ l CJ «< ι X Em 1 CD 1 Em t CD t CJ 1 CD i CJ 1 CJ CD l < Em CJ 1 Em 1 CJ > *< I CJ » CD l CJ 1 CJ 1 o* CD CD i *< 1 MM CD » Em 1 CJ ο- CJ 1 CJ » CD l CD CJ 1 CJ 1 CD CD ·< 1 CD Em l CJ CD ι CD 1 CD 1 CJ 1 Em 1 »< 1 Em CD 1 CD Má CD CJ l CJ 1 Oá Em 1 Em 1 CJ 4 CD 4 CJ 4 ·< 4· CO CJ 4- CJ 4 CD 4 CD CD 4 Cp 4 CJ 4 »-3 CD 4 CD l CD 1 CD Em 1 CD 1 CD ·< Em CJ Em i CJ CJ > <1 Em 1 Em i CJ 1 *< 1 h-< 1 CD ·< » MM CJ CJ 1 cd l mC i Em 1 CJ l »< 1 CJ 1 CJ l Ol CD CD l Em 1 CO Em 1 CD 1 C_> t O* Em 1 CD i CD l O CD 1 i CJ CD 1 CD CD CD i CJ 1 CD l > CD 1 CJ 1 CJ 1 CJ I CJ l Em CD 1 CD Em X CJ CD 1 Em 1 X *< 1 CJ 1 CD i CJ 1 CJ t Em 1 3= «< CD CD ·< Em » CJ 1 CD 1 O CJ 1 1 CD l ·< Em 1 CJ 1 CJ O* CD i CJ CJ l 1-3 *C 1 CJ 1 CJ 1 CD 1 CD l CD 1 >· CD 1 CD CD CD CJ CJ i «4 1 X CJ 1 Em 1 CD l CJ 1 CJ 1 1 co CD CD Em i CO CD 1 CP 1 CJ Cm CJ i «< 4 CD 4 *C Em 4 CD 4- Em 4- 3C Em 4 CD 4 CD 4 CD CJ 4 CD 4 CJ 4 CJ l CD • CD i D* CJ 1 CJ CJ i »3 CJ 1 CJ t CD 1 *á CJ 1 | 1 CD 1 CJ 1 CD 1 << CD I CJ 4 CM CJ » *C 1 CJ CM CJ I CD 1 e-< 1 3C CJ 1 1 co CJ 1 CD CD CJ CD · Em » co CJ » CD 1 Em 1 CD « CJ 1 EM Ε-» l CJ CD i ·< Em l Em i CP 1 rtí t rn 1 *C I o 1 Em 1 Em i Cm CJ CD CJ l »-3 CD i CD 1 c_> 1 e* 1 CJ » CJ 1 04 Em 1 CD i CJ CM ·< 1 CD l CD i CD CD 1 ·< 1 CJ 1 cr\ «< 1 CJ 1 t H4 Em 1 CD *< 1 « CJ » CJ 1 CJ l Oá CD 1 CJ 1 cs *C 1 CD 1 CD 1 CJ 1 Em CJ 1 CJ i Cm Em 1 *< l CD 1 CD Em » cs CD i *C 1 CO EM 1 CD t CD D> CD 1 CD 1 CD 1 > «< I Em i Em 1 r-i e-« -ί- CJ 4 CD 4- O Em Em 4» *C 4 CO *<í 4 CD 4 CJ 4 Ol CD 4 CD 4 ο » Em i CJ 1 CJ » «< CJ t CD « W CJ ι ςρ 1 CD 1 CD ·< 1 CD 1 CJ < Em l Cm CJ CD 1 t· '>· CD l CJ 1 CD i mC CJ 1 CJ l CD 1 r?M i CD l CD 1 CJ i Cm CD I CD E- í CJ CJ » CD 1 CJ 1 O-ι 6m 1 CD 1 *< ( CD l Em » Em l CD i CD CJ O i Em 1 CO «c i CD * O 1 > CJ 1 CJ 1 CJ 1 CD 1 1 CJ t CJ CM Em i CD 1 CJ ( O Em 1 CJ t CJ 1 Em i CJ l CJ 1 Em 1 >M Em 1 Em CJ t Em l Em 1 Em 1 bJ Em · 1^2 1 MC 1 CD 1 c ) CJ 1 CJ 1 CD CD i CJ l *-□ *< ’ CD 1 CJ 1 bJ CD 1 CD » CD « ε-« 1 >M E-* 1 CJ CD CD Em 1 Em I Em » >· CD 1 CJ 1 Cj 1 CJ t 1 CD l CD i £> Em t CD CD 1 ř> CD 1 CD 1 CJ 1 04 CJ l CD 1 CD 1 CD -ί- CJ 4 ςρ 4 Ε-» 4- Pm CD 4· CJ 4 CD 4 CD Cm 4 ςρ 4 Em M- tO CD 4 4 Ο » CD 1 ·< Em 1 CJ i Em 3= CJ. ) CJ 1 CD 1 > O 1 CD » » CJ 1 CJ 1 CD 1 CD i ř> EM 1 CJ *C 1 Ε-» Em i CJ » Em l X EM 1 3 1 Em t CJ 1 *<; 1 Em t CJ 1 hJ CJ CJ 1 CJ i bO CJ 1 CJ 1 CJ 1 k3 CD 1 Em i < 1 CJ 1 O 1 EM I Em CO EM | CD 1 CJ 1 C* CJ » CJ 1 CD 1 CD 1 CJ » CD Í CD 1 o Em t Em CD i Em í CJ ( O « ·< Em 1 CD 1 CD l ε-» i Em 1 CJ r CJ 1 J CD CJ i CD 1 t> Em t «< 1 CJ 1 bJ 1 CJ 1 CJ » CJ i »J) cj r CJ 1 CD o Em 1 CJ i Em 1 (X· CD 1 CJ 1 * Em i Em i CJ » *< 1 Em CJ 1 CD *< 1 MM Ε-* t CD » CD t CD EM l CD 1 CJ 1 CJ 1 CJ 1 Em 1 CD 1 ·< Em CD l *< 1 MM ·< 1 CD 1 1 h 1 CJ l· CD 4 CD + *c O 4 CJ 4- CD 4· D> Em 4 CJ 4 CJ 4 O CP 4 Em 4 CD 4 Em 4 CJ t CD 1 *c » Em I CD CJ 1 U3 CD 1 CJ 1 CJ 1 < 1 CD 1 CJ 1 -C i Em 1 CD i CD 1 « CJ Em 1 CD i CD > MC 1 CJ 1 X CJ 1 *^5 1 CJ 1 CJ l ►D CD 1 i CD CJ 1 o ·< CJ 1 CJ > Em 1 >M ·< 1 CJ ( «< » CJ 1 CJ 1 Em l CD EM 1 CJ CD 1 ·< Em i CD 1 CD 1 ca EM 1 CD l 1 CD 1 Em 1 CD 1 Em 1 CM CD CD 1 «£ 1 MM CD 1 CD 1 Em 1 tei 1 CJ ( Em 1 Em 1 Dm CJ 1 CD 1 CD CD CJ 1 CJ i EM 1 X Em 1 Em i CD 1 CJ 1 i CD l *< 1 Em Em 1 CD Em I co EM | CD 1 CD > > O 1 CD l «43 1 CD i Em 1 Em 1 CJ 1 CD CD 1 Em i Či* *4 • CD 1 Em 1 ζ_ i<; 1 CJ 1 CJ i CJ 1 ι-D *cC 1 CD 1 Em Em 1 CJ l CD l M CD 1 CJ 1 CD 1 CD 1 τ—1 «-Η »-4 «-4 r4 «•4 tH O O CZ> O O O O O q a O O w-M cs m -Kí* w> KO c—» 00 ΟΊ CZ3 t—t esa

·· *·· · ···· ·»

2/7