BR0013119B1

BR0013119B1 - Molécula polinucleotídica isolada, vetor recombinante purificado, célula hospedeira procariótica e célula de Streptomyces avermitilis mutada, método para obtenção de uma nova cepa de S. avermitilis e processo para produção de avermectinas

Info

Publication number: BR0013119B1
Application number: BRPI0013119-9A
Authority: BR
Inventors: Yan Chen; Claes Gustafsson; Anke Krebber; Jeremy Stephen Minshull; Sun Ai Raillard; Kim Jonelle Stutzman-Engwall
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2014-02-25
Also published as: CN1373809A; HUP0202487A3; BG65902B1; NO20020664L; UY26286A1; AP2002002418A0; PL353874A1; BRPI0013119B8; US7858340B2; BG106479A; SK1392002A3; ES2272299T3; CO5290295A1; CN1186446C; PA8499501A1; MA26813A1; CZ304402B6; CA2380872C; KR100489856B1; PT1200606E

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA POLINUCLEOTÍDICA ISOLADA, VETOR RECOMBINANTE PURIFICADO, CÉLULA HOSPEDEIRA PROCARIÓTICA E CÉLULA DE STREPTOMY- CES AVERMITILIS MUTADA, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA NO- VA CEPA DE S. AVERMITILIS E PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE AVERMECTINAS". 1. Campo do Invenção A presente invenção direciona-se a composições e métodos para a produção de avermectinas, e situa-se essencialmente no campo da saúde animal. Mais particularmente, a presente invenção está relacionada com moléculas de polinucleotídeos compreendendo sequências de nucleo- tídeos codificadoras de um produto protéico AveC, o qual pode ser usado para modular a proporção de avermectinas classes 2:1, produzidas pela fermentação de culturas de Streptomyces avermitilis, e com composições e métodos para o despiste de tais moléculas polinucleotídicas. A presente invenção está ainda relacionada com vetores, células hospedeiras trans- formadas e novas cepas mutantes de S. avermitilis nas quais o gene aveC foi modificado de forma a modular a proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas. 2. Fundamento da Invenção 2.1. Avermectinas As espécies de Streptomyces produzem uma grande variedade de metabólitos secundários, incluindo as avermectinas, as quais compreen- dem uma série de oito lactonas macrocíclicas de dezesseis membros rela- cionados, tendo uma forte atividade anti-helmíntica e insecticida. Os oito compostos distintos, mas estreitamente relacionados, são referidos como A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a e B2b. A série "a" dos compostos refere- se à avermectina natural em que o substituinte na posição C25 é (S)-sec- butilo e a série "b" refere-se aos compostos em que o substituinte na posi- ção C25 é isopropila. As designações "A" e "B" referem-se às avermectinas em que o substituinte na posição C5 é respectivamente metóxi e hidróxi. O numeral Ί" refere-se às avermectinas em que a dupla ligação está presente na posição C22,23 e o numeral "2" refere-se às avermectinas tendo um hi- drogênio na posição 22 e um hidróxi na posição C23. Entre as avermectinas relacionadas, a avermectina do tipo "BI" é reconhecida como tendo as ati- vidades antiparasítica e pesticida mais eficazes e é portanto a mais impor- tante comercialmente.

As avermectinas e a sua produção por fermentação aeróbica de cepas de S. avermitilis estão descritas nas Patentes dos Estados Unidos 4 310 519 e 4 429 042. Acredita-se que a biossíntese de avermectinas natu- rais seja iniciada endogenamente a partir de análogos tioéster de CoA do ácido isobutírico e do ácido S-(+)-2-metilbutírico.

Uma combinação de melhoramento da cepa, através de muta- gênese ao acaso, e da utilização de ácidos graxos fornecidos exogena- mente conduziu à produção eficaz de análogos de avermectina. Os mutan- tes de S. avermitilis que são deficientes em desidrogenase do ácido 2-oxo de cadeia ramificada (mutantes deficientes em bkd) podem produzir apenas avermectinas quando as fermentações são suplementadas com ácidos gra- xos. O despiste e isolamento de mutantes deficientes em atividade de desi- drogenase de cadeia ramificada (por exemplo S. avermitilis, ATCC 53567) estão descritos na Patente Européia (EP) 276103. A fermentação de tais mutantes na presença de ácidos graxos fornecidos exogenamente resulta na produção de apenas quatro avermectinas correspondentes aos ácidos graxos empregues. Assim, a suprimento das fermentações de S. avermitilis (ATCC 53567) com ácido S-(+)-2metilbutírico resulta na produção das avermectinas naturais A1a, A2a, B1a e B2b; o suprimento das fermentações com ácido isobutírico resulta na produção das avermectinas naturais A1 b, A2b, B1 b e B2b; e o suprimento das fermentações com ácido ciclopentanocar- boxílico resulta na produção de quatro novas ciclopentilavermectinas Α1, A2, B1 e B2.

Caso o meio seja suplementado com outros ácidos graxos, são produzidas novas avermectinas. Através do despiste de cerca de 800 po- tenciais precursores, foram identificadas mais de 60 novas avermectinas. (Consultar, por exemplo, Dutton et ai, J. Antibiot. 44:357-365; e Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Ainda, os mutantes de S. avermitilis deficientes em atividade de 5-O-metiltransferase produzem essencialmente apenas análogos de avermectina tipo B. Conseqüentemente, os mutantes de S. avermitilis sem desidrogenase do ácido 2-oxo de cadeia ramificada e sem ativdade de 5-O-metiltransferase produzem apenas as avermectinas B correspondendo ao ácido graxo empregue para suplementar a fermentação.

Assim, o suprimento de tais mutantes duplos com ácido S-(+)-2-metilbutírico resulta apenas na produção de avermectinas naturais B1a e B2a, enquanto que o suprimento com ácido isobutírico ou com ácido ciclopentanocarboxíli- co resulta na produção de avermectinas naturais B1 b e B2b ou das novas ciclopentilavermectinas B1 e B2, um método preferido para a produção da nova avermectina de importância comercial, ciclo-hexilavermectina B1 (do- ramectina). O isolamento e características de tais mutantes duplos, por exemplo, S. avermitilis (ATCC 53692), está descrito na EP 276103. 2.2. Genes envolvidos na biossíntese de avermectinas Em muitos casos, os genes envolvidos na produção de metabó- litos secundários e de genes codificadores de um antibiótico particular estão próximos no cromossoma. É este o caso, por exemplo, do conjunto de ge- nes vizinhos da sintase de poliquetídeo de Streptomyces (PKS) (consultar Hopwood e Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Assim, uma estra- tégia para a clonagem de genes em uma via biossintética tem sido isolar um gene de resistência a uma droga e depois testar regiões adjacentes do cro- mossoma relativamente a outros genes relacionados com a biossíntese do antibiótico particular. Uma outra estratégia para a clonagem de genes en- volvidos na biossíntese de metabólitos importantes tem sido a complemen- tação de mutantes. Por exemplo, fragmentos de uma biblioteca de DNA de um organismo, capaz de produzir um metabólito particular, são introduzidos em um mutante não produtor e os transformantes são despistados relativa- mente à produção do metabólito. Ainda, a hibridização de uma biblioteca usando sondas derivadas de outras espécies de Streptomyces tem sido usada para identificar e clonar genes nas vias de biossíntese.

Os genes envolvidos na biossíntese de avermectinas (genes ave), tal como os genes necessários à biossíntese de outros metabólitos secundários de Streptomyces {por exemplo, PKS), encontram-se concentra- dos em determinadas regiões do cromossoma. Uma série de genes ave fo- ram clonados com êxito, usando vetores que complementam mutantes de S. avermitilis bloqueados na biossíntese de avermectinas. A clonagem de tais genes está descrita na Patente U.S. 5,252,474. Ainda, Ikeda et ai, 1995, J.

Antibiot. 48:532-534, descreve a localização de uma região cromossômica envolvida na etapa de desidratação de C22,23 (aveC) em um fragmento SamHI de 4,82 Kb de S. avermitilis, assim como mutações no gene aveC que resultam na produção de um único componente produtor de B2a. Uma vez que a ivermectina, um composto que é um forte anti-helmíntico pode ser produzida quimicamente a partir da avermectina B2a, tal componente pro- dutor da avermectina B2a é considerado particularmente útil na produção comercial de ivermectina. A identificação de mutações no gene aveC que minimizem a complexidade da produção de avermectina, como seja, por exemplo, muta- ções que diminuem a proporção B2:B1 das avermectinas, simplificará a pro- dução e purificação de avermectinas comercialmente importantes. 3. Sumário da Invenção A presente invenção proporciona uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo a ORF aveC completa de S. avermitilis, ou uma porção substancial dela, molécula polinucleotídica isolada que não possui a ORF seguinte completa que está situada a jusante da ORF aveC in situ no cromossoma de S. avermitilis. A molécula polinucleotídica isolada da pre- sente invenção preferencialmente compreende uma seqüência nucleotídíca que é a mesma da seqüência codificadora do produto gênico AveC de S. avermitilis do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou que é a mesma se- qüência nucleotídíca da ORF aveC da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma parte substancial da mesma. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo a seqüência nucleotídica de SEQID NO:1 ou uma variante degenerada da mesma. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada tendo uma seqüência nucleotídica que é homóloga da se- qüência codificadora do produto protéico AveC de S. avermitilis do plasmí- deo pSE186 (ATCC 209604) ou da seqüência nucleotídica da ORF aveC apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma porção substancial da mesma. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada, compreendendo uma seqüência nucleotídica que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que é homóloga da seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência codificadora do pro- duto protéico AveC do plasmídeo pSE 186 (ATCC 209604), ou a seqüência de aminoácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO:2), ou uma porção substancial da mesma. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada, compreendendo uma seqüência nucleotídica codificadora de um produto protéico homólogo de AveC. Em uma modalidade preferida, a molécula polinucleotídica isolada compreende uma seqüência nucleotídica codificadora do produto protéico homólogo de AveC a partir de S. hygrosco- picus, esse produto protéico homólogo compreende a seqüência de amino- ácidos de SEQ ID NO:4 ou uma porção substancial da mesma. Em uma mo- dalidade preferida, a molécula polinucleotídica isolada da presente invenção que codifica o produto protéico homólogo de AveC de S. hygroscopicus compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3 ou uma porção substancial da mesma. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada, compreendendo uma seqüência nucleotídica que é homólo- ga da seqüência nucleotídica de S. hygroscopicus de SEQ ID NO:3. A pre- sente invenção proporciona ainda uma molécula polinucleotídica isolada que codifica um polipeptídeo que é homólogo do produto protéico homólogo de AveC de S. hygroscopicus tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID Ν0:4. A presente invenção proporciona ainda oligonucleótidos que hibridizam com uma molécula polinucleotídica tendo a seqüência de nucle- otídeos da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou SEQ ID NO:3, ou com uma molé- cula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotídica que é complementar da seqüência nucleotídica da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou SEQ ID NO:3. A presente invenção proporciona ainda vetores de clonagem recombinantes e vetores de expressão, que são úteis na clonagem ou ex- pressão de um polinucleótido da presente invenção, incluindo moléculas polinucleotídicas compreendendo a ORF aveC de S. avermitilis ou uma ORF homóloga de aveC. Em uma modalidade não limitante, a presente invenção proporciona o plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), o qual compreende toda a ORF do gene aveC de S. avermitilis. A presente invenção proporciona ainda células hospedeiras transformadas, compreendendo uma molécula polinucleotídica ou vetor recombinante da invenção, e novas cepas ou li- nhas celulares derivadas a partir delas. A presente invenção proporciona ainda um produto protéico AveC, ou produto genético homólogo de AveC, ou uma parte substancial do mesmo, expresso por via recombinante, que foi substancialmente purificado ou isolado, assim como os respectivos homólogos. A presente invenção proporciona ainda um método para a produção de um produto protéico AveC recombinante, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão recombinante, o referido vetor de expressão recombinante compreendendo uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotídica codificadora de um produto protéico AveC, essa molécula polinucleotídica está operacionalmente associada a um ou mais elementos reguladores, que controlam a expressão da molécula polinucleotídica na célula hospedeira, em condições que conduzem à pro- dução do produto protéico AveC recombinante ou de um produto protéico homólogo de AveC e recuperação do produto protéico AveC ou produto protéico homólogo de AveC a partir da cultura celular. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica compreendendo uma seqüência nucelotídica que é igual ao alelo aveC de S. avermitilis ou a seqüência codificadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou uma variante degenerada do mesmo, ou a seqüência nucleotídica da ORF aveC de S. avermitilis, confor- me apresentado na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma variante degenerada do mesmo, mas que ainda compreende uma ou mais mutações, de forma que as células de S. avermitilis cepa ATCC 53692 em que o aielo tipo sel- vagem aveC tenha sido inativado e que expressam a molécula polinucleotí- dica compreendendo a seqüência nucleotídica mutageneizada produzam uma proporção ou quantidade diferente de avermectinas das que são pro- duzidas pelas células de S. avermitilis cepa ATCC 53692 que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. De acordo com a presente invenção, tais moléculas polinucleotídicas podem ser usadas para produzir novas ce- pas de S. avermitilis que apresentam uma alteração detectável na produção de avermectina comparado com a mesma cepa que expressa apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, tais moléculas polinu- cleotídicas são úteis para produzir novas cepas de S. avermitilis que produ- zem uma proporção reduzida de avermectinas classes 2:1 comparado com a da mesma cepa que expressa apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade mais preferida, tais moléculas polinucleotídicas são úteis para produzir novas cepas de S. avermitilis que produzem níveis aumenta- dos de avermectinas comparado com a mesma cepa que expressa apenas um único alelo aveC tipo selvagem. Em uma outra modalidade preferida, tais moléculas polinucleotídicas são úteis para produzir novas cepas de S. avermitilis em que o gene aveC foi inativado. A presente invenção proporciona métodos para a identificação de mutações da ORF aveC de S. avermitilis capazes de alterar a proporção e/ou quantidade de avermectinas produzidas. Em uma modalidade preferi- da, a presente invenção proporciona um método para a identificação de mutações da ORF aveC capazes de alterar a proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas, compreendendo: (a) determinação da proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis em que o alelo aveC nativo foi inativado e na qual foi introduzida, e é expressa, uma molécula polinucleotídica compreendendo uma seqüên- cia nucleotídica codificadora de um produto protéico AveC mutageneizado; (b) determinação da proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas pe- las células da mesma cepa de S. avermitilis como na etapa (a) mas que ex- pressam o alelo aveC tipo selvagem ou a ORF da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma sequência nucleotídica que é homóloga da mesma; e (c) compara- ção da proporção tipo 2:1 de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (a) com a proporção de avermectinas classes 2:1 produ- zidas pelas células de S. avermitilis da etapa (b); de tal forma que se a pro- porção de avermectinas classes 2:1 produzidas pelas células de S. avermiti- lis da etapa (a) é diferente da proporção de avermectinas classes 2:1 produ- zidas pelas células de S. avermitilis da etapa (b), depois segue-se a identifi- cação de uma mutação da ORF aveC capaz de alterar a proporção de avermectinas classes 2:1. Em uma modalidade preferida, a proporção de avermectinas classes 2:1 é reduzida pela mutação.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona um método para a identificação de mutações da ORF aveC ou constructos genéticos compreendendo a ORF aveC capaz de alterar a quantidade de avermectinas produzidas, compreendendo: (a) determinação da proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis em que o alelo aveC nativo foi inativado e na qual foi introduzida, e é expressa, uma molécula polinucleotídica compreendendo uma seqüên- cia nucleotídica codificadora de um produto protéico AveC mutageneizado ou compreedendo uma construção genética compreendendo uma sequência nucleotídica codificadora do produto protéico AveC; (b) determinação da quantidade de avermectinas produzidas pelas células da mesma cepa de S. avermitilis como na etapa (a) mas que expressam apenas um único alelo aveC tendo a seqüência de nucleotídeos da ORF da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma seqüência nucleotídica que é homóloga da mesma; e (c) comparação da quantidade de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (a) com a quantidade de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (b); de forma a que a quantidade de aver- mectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (a) seja dife- rente da quantidade de avermectinas produzidas pelas células de S. aver- mitilis da etapa (b), seguido da identificação da mutação da ORF aveC ou de uma construção genética capaz de alterar a quantidade de avermectinas.

Em uma modalidade preferida, a quantidade de avermectinas produzidas é aumentada através de mutação. A presente invenção proporciona ainda vetores recombinantes que são úteis para produzir novas cepas de S. avermitilis tendo alterada a produção de avermectinas. Por exemplo, a presente invenção proporciona vetores que podem ser usados para direcionar quaisquer das moléculas polinucleotídicas compreendendo as seqüências nucleotídicas mutagenei- zadas da presente invenção para o local do gene aveC do cromossoma de S. avermitilis para inserir ou substituir o alelo aveC, ou ORF, ou um seu fragmento, por recombinação homóloga. No entanto, de acordo com a pre- sente invenção, uma molécula polinucleotídica compreendendo uma se- qüência nucleotídica mutageneizada proporcionada pela presente invenção pode também funcionar para modular a biossíntese de avermectinas quando inserida no cromossoma de S. avermitilis em um local diferente do gene AveC, ou quando mantida epissomicamente em células de S. avermitilis.

Assim, a presente invenção também proporciona vetores compreendendo uma molécula polinucleotídica compreendendo uma seqüência nucleotídica mutageneizada da presente invenção, esses vetores podem ser usados para inserir a molécula polinucleotídica em um local do cromossoma de S. avermitilis que não seja o gene aveC ou podem ser mantidos epissomica- mente. Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona ve- tores para a substituição de genes, os quais podem ser usados para inserir um alelo aveC mutageneizado no cromossoma de S. avermitilis para gerar novas cepas de células que produzem em uma proporção reduzida aver- mectinas das classes 2:1 comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. A presente invenção proporciona ainda métodos para a produ- ção de novas cepas de S. avermitilis compreedendo células que expressam um alelo aveC mutageneizado e que produz proporções e/ou quantidades alteradas de avermectinas comparado com células da mesma cepa de S. avermitilis que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma mo- dalidade preferida, a presente invenção proporciona um método para prepa- rar novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que expressam um alelo aveC mutageneizado e que produzem uma proporção alterada de avermectinas classes 2:1 comparado com as células da mesma cepa de S. avermitilis que expressam apenas um alelo aveC tipo selvagem, compreen- dendo a transformação de células de uma cepa de S. avermitilis com um vetor portador de um alelo aveC mutageneizado que codifica um produto protéico que altera a proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo mutagenei- zado, comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, e seleção das células transformadas que produ- zem avermectinas em uma proporção alterada das classes 2:1 comparado com a proporção de classes 2:1 produzida pelas células da cepa que ex- pressa o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, é reduzi- da a proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas pelas células da nova cepa.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção pro- porciona um método para a obtenção de novas cepas de S. avermitilis com- preendendo células que produzem quantidades alteradas de avermectina, compreendendo transformação de células de uma cepa de S. avermitilis com um vetor portador de um alelo aveC mutageneizado ou um construto genética compreendendo o alelo aveC, a expressão da qual resulta em uma quantidade alterada de avermectinas produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo aveC mutageneizado ou construto ge- nético, comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, e seleção das células transformadas que produ- zem avermectinas em uma quantidade alterada, comparado com a quanti- dade de avermectinas produzidas pelas células da cepa que expressa ape- nas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, a quantida- de de avermectinas produzidas é aumentada nas células da nova cepa.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção pro- porciona um método para produzir novas cepas de S. avermitilis, as células das quais compreendem um alelo aveC inativado, compreendendo trans- formação de células de uma cepa de S. avermitilis, que expressam qualquer alelo aveC, com um vetor que inativa o alelo aveC e seleção das células transformadas em que o alelo aveC tenha sido inativado. A presente invenção proporciona ainda novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que foram transformadas com qualquer uma das moléculas polinucleotídicas ou vetores compreendendo uma se- quência nucleotídica mutageneizada da presente invenção. Em uma moda- lidade preferida, a presente invenção proporciona novas cepas de S. aver- mitilis compreendendo células que expressam um alelo aveC mutageneiza- do em vez do, ou para além do, alelo aveC tipo selvagem, em que as célu- las da nova cepa produzem avermectinas em uma proporção de classes 2:1 alterada, comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade mais preferida, as células da nova cepa produzem avermectinas em uma proporção de classes 2:1 reduzida, comparado com as células da mesma cepa que expressam ape- nas o alelo aveC tipo selvagem. Tais cepas novas são úteis na produção em larga escala de avermectinas comercialmente importantes tais como dora- mectina.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que expressam um alelo aveC mutageneizado, ou um construto genético com o alelo aveC em vez do, ou para além do, alelo aveC nativo, o que resulta na produção pelas células de uma quantidade alterada de avermectinas comparado com a quantidade de avermectinas produzidas pelas células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferi- da, as novas células produzem um aumento da quantidade de avermecti- nas.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção pro- porciona novas cepas de S. avermitilis, compreedendo células em que o gene aveC foi inativado. Tais cepas são úteis tanto no que respeita ao es- pectro diferente de avermectinas que produzem, comparado com a cepa tipo selvagem, como na complementação de ensaios de despiste, como aqui descrito, para determinar se a mutagênese dirigida ou ao acaso do gene aveC afecta a produção de avermectinas. A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção de avermectinas, compreendendo a cultura de células de uma cepa de S. avermitilis, essas células expressam um alelo aveC mutagenei- zado que codifica um produto protéico que altera a proporção de avermecti- nas das classes 2:1 produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo aveC mutageneizado, comparado com as células da mesma cepa que não expressam o alelo aveC mutageneizado mas que ex- pressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, em meio de cultura em condi- ções que permitem ou induzem a produção de avermectinas e recuperação das referidas avermectinas a partir da cultura. Em uma modalidade preferi- da, é reduzida a proporção das classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células que expressam a mutação. Este processo proporciona uma maior eficiência na produção de avermectinas comercialmente importantes tais como doramectina. A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção de avermectinas, compreedendo a cultura de células de uma cepa de S. avermitilis, essas células expressam um alelo aveC mutageneizado ou um construto genético compreendendo um alelo aveC que resulta na produ- ção de uma quantidade alterada de avermectinas, produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo aveC mutageneizado ou construção genética, comparado com as células da mesma cepa, que não expressam o alelo aveC mutageneizado ou construto genético, mas que ex- pressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, em meio de cultura em condi- ções que permitem ou induzem a prdução de avermectinas e recuperação das referidas avermectinas a partir da cultura. Em uma modalidade preferi- da, é aumentada a quantidade de avermectinas produzidas pelas células expressando a mutação ou construto genético. A presente invenção proporciona ainda uma nova composição de avermectinas produzida por uma cepa de S. avermitilis expressando um alelo aveC mutageneizado da presente invenção, em que as avermectinas são produzidas em uma proporção resuzida das classes 2:1 reduzida com- parado com a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células da mesma cepa de S. avermitilis que não expressam o alelo aveC, mas que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. A nova composição de avermectinas pode estar presente tal como produzida no fluido de fer- mentação, ou pode ser colhida a partir dele e pode ser parcial ou substanci- almente purificada. 4. Breve Descrição das Figuras FIGURA 1. Seqüência de DNA (SEQ ID NO:1) compreendendo a ORF aveC de S. avermitilis e seqüência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO:2). FIGURA 2. Vetor plasmídico pSE186 (ATCC 209604) compre- endendo toda a ORF do gene aveC de S. avermitilis.

FIGURA 3. Vetor para substituição de genes pSE180 (ATCC

209605) compreendendo o gene ermE de Sacc. erythraea inserido na ORF aveC de S. avermitilis. FIGURA 4. Mapa de restrição SamHI do grupo de genes da avermectina sintase de poliquetídeo de S. avermitilis com cinco clones so- breponíveis identificados em cosmídeo (isto é, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). A relação entre pSE118 e pSE119 está também indicada. FIGURA 5. Análise por HPLC dos produtos de fermentação pro- duzidos por cepas de S. avermitilis. A quantificação dos picos foi realizada por comparação com quantidades padronizadas de ciclohexil B1. O tempo de retenção de ciclo-hexil B2 foi de 7,4-7,7 min; o tempo de retenção de ci- clo-hexil B1 foi de 11,9-12,3 min. Fig. 5A. S. avermitilis cepa SE180-11 com uma ORF aveC inativada. Fig. 5B. S. avermitilis cepa SE180-11 transforma- da com pSE186 (ATCC 209604). Fig. 5C. S. avermitilis cepa SE180-11 transformada com pSE187. Fig. 5D. S. avermitilis cepa SE180-11 transfor- mada com pSE188. FIGUFtA 6. Comparação das seqüências de aminoácidos dedu- zidas codificadas pela ORF aveC de S. avermitilis (SEQ ID NO:2), uma ORF parcial homóloga de aveC a partir de S. griseochromogenes (SEQ ID NO:5) e a ORF homóloga de aveC de S. hygroscopicus (SEQ ID NO:4). O resíduo valina a cheio é o sítio de iniciação putativo para a proteína. Os resíduos conservados estão apresentados em letras maiusculas para homologia nas três seqüências e em letras minúsculas para homologia em 2 das 3 seqüên- cias. As seqüências de aminoácidos contêm aproximadamente 50% de identidade de seqüências. FIGURA 7. Construto de plasmídeo recombinante contendo um fragmento Bsa\IKpn\ do gene homólogo de aveC de S. hygroscopicus inse- rido no sítio Bsa\IKpn\ da ORF aveC de S. avermitilis. 5. Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção relaciona-se com a identificação e caracte- rização de moléculas polinucleotídicas, tendo seqüências nucleotídicas que codificam o produto do gene AveC de Streptomyces avermitilis, a construção das novas cepas de S. avermitilis que podem ser usadas no despiste de produtos protéicos AveC através do seu efeito na produção de avermectinas e a descoberta de que certos produtos protéicos AveC podem reduzir a pro- porção de avermectinas B2:B1 produzidas por S. avermitilis. A título exem- plificativo, a invenção está descrita nas seções abaixo para uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotídica que é igual à seqüência codificadora do produto protéico AveC de S. avermitilis do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou a seqüência de nucleotídeos da ORF da FI- GURA 1 (SEQ ID NO:1) e moléculas polinucleotídicas tendo as seqüências nucleotídicas mutageneizadas derivadas delas e suas variantes degenera- das. No entanto, os princípios descritos na presente invenção podem ser aplicados de forma análoga a outras moléculas polinucleotídicas, incluindo os genes homólogos de aveC de outras espécies de Streptomyces incluin- do, por exemplo S. hygroscopicus e S. griseochromogenes, entre outros. 5.1. Moléculas polinucleotídicas codificadoras do produto protéico AveC de S. avermitilis A presente invenção proporciona uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo a ORF aveC completa de S. avermitilis, ou uma parte substancial da mesma, tal molécula polinucleotídica isolada não pos- sui a ORF seguinte completa que está situada a jusante da ORF aveC in situ no cromossoma de S. avermitilis. A molécula polinucleotídica isolada da presente invenção prefe- rencialmente compreende uma sequência nucleotídica que é igual à se- qüência codificadora do produto protéico AveC de S. avermitilis do plasmí- deo pSE186 (ATCC 209604) ou é igual à seqüência nucleotídica da ORF da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma porção substancial da mesma. Tal como aqui é usado, "uma porção substancial" de uma molécula polinucleotídica isolada, compreendendo uma seqüência nucleotídica codificadora do pro- duto protéico AveC de S. avermitilis, significa uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo pelo menos cerca de 70% da seqüência completa de ORF aveC apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) e que codifica um produto protéico AveC funcionalmente equivalente. Neste contexto, um pro- duto protéico AveC "funcionalmente equivalente" é definido como um pro- duto protéico que, quando expresso em S. avermitilis cepa ATCC 53692 em que o alelo aveC nativo foi inativado, resulta essencialmente na produção da mesma proporção e quantidade de avermectinas produzidas por S. avermitilis cepa ATCC 53692 que expressa apenas o alelo aveC nativo fun- cional de S. avermitilis ATCC 53692.

Para além da seqüência nucleotídica da ORF aveC, a molécula polinucleotídica isolada da presente invenção pode ainda compreender se- qüências nucleotídicas que naturalmente flanqueiam o gene aveC in situ em S. avermitilis, como sejam as seqüências nucleotídicas flanqueantes apre- sentadas na FIGURA 1 (SEQ IS NO:1). A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada compreendendo a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:1 ou uma variante degenerada do mesmo.

Tal como aqui é usado "molécula polinucleotídica", "seqüência polinucleotídica", "seqüência codificadora", "grelha de leitura aberta" e "ORF" destinam-se a referir moléculas de DNA e de RNA, as quais podem ser de cadeia simples ou dupla, e que podem ser transcritas e traduzidas (DNA) ou traduzidas (RNA) no produto protéico AveC ou, como descrito abaixo, no produto protéico homólogo de AveC, ou em um polipeptídeo que é homólogo do produto protéico homólogo de AveC em um sistema de ex- pressão em uma célula hospedeira adequada sob o controle de elementos reguladores adequados. Uma seqüência codificadora inclui mas não está limitada a seqüências procarióticas, seqüências de cDNA, seqüências de DNA genômico e seqüências de DNA e RNA obtidas por síntese química.

A seqüência de nucleotídeos apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) compreende quatro códons GTG diferentes, nas posições de pb 42, 174, 177 e 180. Como descrito na Seção 9 abaixo, foram construídas múltiplas deleções da região 5' da ORF aveC (FIGURA 1; SEQ ID NO:1) para ajudar a definir quais destes códons podem funcionar na ORF aveC como locais de iniciação para a expressão de proteína. A deleção do primei- ro sítio GTG no pb 42 não elimina a atividade de AveC. A deleção de todos os códons GTG nas posições 174 pb, 177 pb e 180 pb eliminou a atividade AveC, indicando que esta região é necessária para a expressão da proteí- na. A presente invenção engloba assim ORFs aveC de tamanho variável. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica tendo uma seqüência nucleotídica que é homóloga da seqüência codificadora do produto protéico AveC de S. avermitilis do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou da seqüência nucleotídica da ORF aveC apre- sentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1), ou porção substancial da mesma. O termo "homólogo" quando usado para referir uma molécula polinucleotídica que é homóloga de uma seqüência codificadora do produto do genético AveC de S. avermitilis significa uma molécula polinucleotídica codificadora tendo uma seqüência nucleotídica: (a) que codifica o mesmo produto protéi- co AveC da seqüência codificadora do produto protéico AveC de S. avermi- tilis do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou que codifica o mesmo pro- duto protéico AveC da seqüência nucleotídica da ORF aveC apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1), mas que inclui uma ou mais mutações silencio- sas da seqüência nucleotídica de acordo com a degenerrescência do código genético (isto é, uma variante degenerada); ou (b) que híbrida com o com- plemento de uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotí- dica que codifica a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência codificadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou que codifica a seqüência de aminoácidos apresentada na FI- GURA 1 (SEQ ID NO:2) sob condições moderadamente restringentes, isto é, hibridização com DNA ligado a filtros em NaHP04 0,5M, 7% de dode- cilsulfato de sódio (SDS), EDTA1 mM a 65°C e lavagem em SSC 0,2)(/0,1% SDS a 42°C (ver Ausubel et ai. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Bioloav. Vol. I, Green Publishings Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., New York, p. 2.10.3) e codifica um produto protéico AveC funcional- mente equivalente como definido acima. Em uma modalidade preferida, a molécula polinucleotídica homóloga híbrida com o complemento da seqüên- cia nucleotídica codificadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou com o complemento da seqüência nucleotídica da ORF aveC apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1), ou uma porção substancial da mesma em condições altamente restringentes, isto é, hibridi- zação com DNA ligado a filtros em NaHP04 0>5 M, 7% SDS, EDTA 1 mM a 65°C e lavagem em SSC 0,1X/1% SDS a 68°C (Ausubel et al., 1989, acima) e codifica um produto protéico AveC funcionalmente equivalente conforme definido acima. A atividade de um produto protéico AveC e dos seus potenciais equivalentes funcionais pode ser determinada através da análise por HPLC dos produtos de fermentação, como descrito nos exemplos abaixo. Molécu- las polinucleotídicas tendo seqüências nucleotídicas que codificam equiva- lentes funcionais do produto protéico AveC de S. avermitilis incluem genes aveC naturais presentes em outras cepas de S. avermitilis, genes homólo- gos de aveC presentes em outras espécies de Streptomyces e alelos aveC mutageneizados, naturais ou obtidos por manipulação genética. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica compreedendo uma sequência nucleotídica que codifica um poli- peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que é homóloga da seqüên- cia de aminoácidos codificada pela seqüência codificadora do produto pro- téico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou a seqüência de ami- noácidos da FIGURA 1 (SEQID NO:2), ou uma porção substancial da mes- ma. Tal como aqui é usado, "uma porção substancial" da seqüência de ami- noácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO:2) significa um polipeptídeo compreen- dendo pelo menos 70% da seqüência de aminoácidos apresentada na FI- GURA 1 (SEQ ID NO:2) e que constitui um produto protéico AveC funcio- nalmente equivalente, como definido acima.

Tal como aqui é usado para referir seqüências de aminoácidos que são homólogas da seqüência de aminoácidos de um produto protéico AveC de S. avermitilis, o termo “homólogo" refere-se a um polipeptídeo que tem a seqüência de aminoácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO:2), mas em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram conservativamente substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, em que a referida seqüência de aminoácidos possui pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, de identidade da seqüência de aminoácidos com o polipeptídeo codificado pela seqüência codificadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou a seqüência de aminoácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO:2) conforme determinado por qualquer algoritmo convencional de identidade da seqüência de aminoácidos, como seja o algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI) e em que tal substituição conservativa resulta em um produto protéico funcionalmente equivalente, conforme definido acima. As substituições conservativas de aminoácidos são bem conhecidas. As regras para fazer tais substituições incluem as descritas por Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3, entre outros.

Mais especificamente, as substituições de aminoácidos conservativas são aquelas que geralmente têm lugar dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionadas em termos de carga ou polaridade. Os aminoácidos geneticamente codificados são geralmente divididos em quatro grupos: (1) acídicos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) não-poiares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, meti- onína, triptofano; e (4) polares sem carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são em conjunto classificados como aminoácidos aromáticos. Uma ou mais substi- tuições dentro de qualquer grupo particular, por exemplo, de uma leucina por uma isoleucina ou valina, ou de um aspartato por um glutamato, ou de uma treonina por uma serina, ou de qualquer outro resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido estruturalmente relacionado, por exemplo, um resíduo de aminoácido com acidez ou polaridade semelhante, ou com semelhança em alguma combinação de resíduos, terão de um modo geral um efeito insignificante na função do polipeptídeo. A presente invenção proporciona assim uma molécula polinu- cleotídica isolada compreendendo uma seqüência nucleotídica codificadora de um produto protéico homólogo de AveC. Conforme aqui é usado, um "produto protéico homólogo de AveC" é definido como um produto protéico tendo pelo menos cerca de 50% de identidade da seqüência de aminoáci- dos com um produto protéico AveC de S. avermitilis, compreedendo a se- qüência de aminoácidos codificada pela seqüência codificadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou a seqüência de aminoácidos apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:2), conforme determi- nado por qualquer algoritmo convencional de identidade de seqüências, como seja o algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI). Em uma modalidade não limitante o produto protéico homólogo de AveC é de S. hygroscopicus, (descrito no pedido de patente EP 0298423; depósito FERM BP-1901) e compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, ou uma porção substancial da mesma. Uma "porção substancial" da seqüência de aminoá- cidos de SEQ ID NO:4 significa um polipeptídeo compreendendo pelo me- nos cerca de 70% da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, e que constitui um produto protéico homólogo de AveC funcionalmente equiva- lente. Um produto protéico homólogo de AveC "funcionalmente equivalente" é definido como um produto protéico que, quando expresso em S. hygros- copicus cepa FERM BP-1901 em que o alelo homólogo aveC nativo foi ina- tivado, resulta substancialmente na produção das mesmas proporção e quantidade de milbemicinas conforme produzido por S. hygroscopicus cepa FERM BP-1901 expressando apenas o alelo homólogo de aveC funcional nativo de S. hygroscopicus cepa FERM BP-1901. Em uma modalidade não limitante, a molécula polinucleotídica isolada da presente invenção que co- difica o produto protéico homólogo de AveC de S. hygroscopicus compreen- de a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3 ou uma parte substancial da mesma. Neste contexto, uma "porção substancial" da molécula polinucleotí- dica isolada compreendendo a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3 si- gnifica uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo pelo menos cerca de 70% da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3, e que codifica um produto protéico homólogo de AveC funcionalmente equivalente, conforme definido imediatamente atrás. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica compreendendo uma seqüência nucleotídica que é homóloga da se- qüência nucleotídica de S. hygroscopicus de SEQ ID NO:3. O termo "ho- mólogo" quando usado para referir uma molécula polinucleotídica compre- endendo uma seqüência nucleotídica que é homóloga da seqüência codifi- cadora do produto protéico homólogo de AveC de S. hygroscopicus de SEQ ID NO:3 significa uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nu- cleotídica: (a) que codifica o mesmo produto protéico da seqüência nucleo- tídica de SEQ ID NO:3, mas que inclui uma ou mais mutações silenciosas para a seqüência nucleotídica de acordo com a degenerescência do código genético (isto é, uma variante degenerada); ou (b) que hibridiza com o com- plemento de uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotí- dica que codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, em condi- ções moderadamente restringentes, isto é, hibridização com DNA ligado a filtros em NaHP04 0,5 M, 7% SDS, EDTA 1mM a 65°C e lavagem com SSC0,2X/0,1% SDS a 42°C (ver Ausubel et al. acima referido) e codifica um produto protéico homólogo de AveC funcionalmente equivalente conforme definido acima. Em uma modalidade preferida, a molécula polinucleotídica homóloga hibridiza com o complemento da sequência nucleotídica codifica- dora do produto protéico homólogo de AveC de SEQ ID NO:3, em condições altamente restringentes, isto é, hibridização com DNA ligado a filtros em H2PO4 0,5 M, 7% SDS, EDTA 1 mM a 65°C e lavagem em SSC 0,1X/0,1% SDS a 68°C (Ausubel et ai., 1989, acima) e codifica um produto protéico homólogo de AveC funcionalmente equivalente como definido acima. A presente invenção ainda proporciona uma molécula polinucle- otídica compreendendo uma seqüência nucleotídica que codifica um poli- peptídeo que é homólogo do produto protéico homólogo de AveC de S. hygroscopicus. Conforme aqui é usado para referir polipeptídeos que são homólogos do produto protéico homólogo de AveC de SEQ ID NO:4 de S. hygroscopicus, 0 termo "homólogo" refere-se a um polipeptídeo que tem a seqüência de aminoácídos de SEQ ID NO:4, mas em que um ou mais resí- duos de aminoácídos foi substituído de forma conservada por um resíduo de aminoácido diferente, como definido acima, em que a referida seqüência de aminoácidos tem pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de identidade da seqüência de aminoácidos com 0 polipeptídeo de SEQ ID NO:4, conforme determinado por qualquer um dos algoritmos convencionais de identidade de seqüências de aminoácidos, como seja 0 algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI) e sempre que a substituição conservativa re- sulte em um produto protéico homólogo de AveC funcionalmente equiva- lente, como definido acima. A presente invenção proporciona ainda oligonucleótidos que hibridizam com uma molécula polinucleotídica tendo a seqüência de amino- ácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou SEQ ID NO:3, ou com uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotídica que é 0 complemento da seqüência nucleotídica da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou SEQ ID NO:3. Tais oligonucleótidos têm pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, e preferencialmente entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de com- primento e hibridizam com uma das moléculas polinucleotídicas anterior- mente mencionadas em condições de restringência elevada, isto é, lavagem em SSC 6)(/0,5% de pirofosfato de sódio a « 37°C para oligos de « 14 ba- ses, a = 48°C para oligos de = 17 bases, a ® 55°C para oligos de = 20 bases ea = 60°C para oligos de = 23 bases. Em uma modalidade preferida, os oli- gonucleótidos são complementares de uma porção das moléculas polinu- cleotídicas anteriormente mencionadas. Estes oligonucleótidos são úteis para uma variedade de fins, incluindo para codificarem ou atuarem como moléculas anticódon úteis na regulação de genes, ou como seqüências ini- ciadoras na amplificação de moléculas polinucleotídicas codificadoras de aveC ou homólogas de aveC.

Outros genes homólogos de aveC podem ser identificados em outras espécies ou cepas de Streptomyces usando as moléculas polinucle- otídicas ou oligonucleótidos aqui descritos, conjuntamente com técnicas co- nhecidas. Por exemplo, uma molécula oligonucleotídica compreendendo uma porção da seqüência nucleotídica de S. avermitilis da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma porção da seqüência nucleotídica de S. hygroscopicus de SEQ ID NO:3 podem ser marcados de forma detectável e usados no des- piste de uma biblioteca genômica construída a partir de DNA derivado do organismo com interesse. A restringência das condições de hibridização é selecionada com base nas relações do organismo de referência, neste exemplo S. avermitilis ou S. hygroscopicus, com o organismo com interesse.

As necessidades de diferentes condições de restringência são bem conhe- cidas dos familiarizados com a matéria e tais condições variarão dependen- do dos organismos específicos a partir dos quais a biblioteca e as seqüên- cias marcadas derivam. Tais oligonucleotídeos têm preferencialmente pelo menos cerca de 15 nucleotídeos de comprimento e incluem, por exemplo os descritos nos exemplos abaixo. A amplificação de genes homólogos pode ser realizada usando estes e outros oligonucleótidos através da aplicação de técnicas convencionais, tais como reação em cadeia com polimerase (PCR), se bem que possam ser igualmente usadas outras técnicas de am- plificação conhecidas, por exemplo, a reação em cadeia com ligase.

Os clones identificados como contendo seqüências nucleotídi- cas homólogas de aveC podem ser testados relativamente à sua capacida- de para codificar um produto protéico homólogo de AveC funcional. Para este fim, os clones podem ser sujeitos à análise de sequências para identifi- car uma grelha de leitura aberta adequada, assim como sinais de iniciação e terminação. Como alternativa ou em adição, a seqüência de DNA clonado pode ser inserida em um vetor de expressão adequado, isto é, um vetor que contenha os elementos necessários à transcriçãpo e tradução da seqüência codificadora de proteína inserida. Pode-se usar qualquer um de vários sis- temas hospedeiro/vetor como descrito abaixo, incluindo mas não estando limitado a sistemas bacterianos tais como vetores de expressão do tipo plasmídeo, bacteriófago ou cosmídeo. Células hospedeiras adequadas transformadas com tais vetores compreendendo potenciais seqüências codifi- cadoras homólogas de aveC podem ser então analisadas relativamente à ativi- dade do tipo AveC usando métodos tais como análise por HPLC dos produtos de fermentação, como descrito, por exemplo, na Seção 7 abaixo. A produção e manipulação das moléculas polinucleotídicas aqui descritas estão dentro dos familiarizados com a matéria e podem ser reali- zadas de acordo com técnicas recombinantes descritas, por exemplo, em Maniatis, et ai, 1989, Molecular Clonina A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Bioloav.

Green Publishings Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et ai, 1989, Molecular Clonina, A Laboratorv Manual. 2- ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR

Strategies. Academic Press, Inc., San Diego; e Erlich (ed), 1992, PCR Te- chnoloqy, Oxford University Press, New York, todos eles aqui incluídos como referência. Os clones polinucleotídicos codificadores dos produtos protéicos AveC ou dos produtos protéicos homólogos de AveC podem ser identificados usando qualquer método conhecido, incluindo mas não estan- do limitado aos métodos descritos na Seção 7, abaixo. As bibliotecas de DNA genômico podem ser despistados relativamente às seqüências codifi- cadoras de aveC e de homólogos de aveC usando técnicas tais como des- crito em Benton e Davis, 1977, Science 196:180, para as bibliotecas de bacteriófagos, e em Grunstein e Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72:3961-3965, para as bibliotecas de plasmídeos. As moléculas polinucleo- tídicas tendo sequências nucleotídicas que incluem a ORF aveC, conforme presente, por exemplo, no plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou no plas- mídeo pSE119 (descrito na seção 7, abaixo), podem ser usadas como son- das nestas experiências de despiste. Como alternativa, podem ser sintetiza- das sondas oligonucleotídicas que correspondam às seqüências nucleotídi- cas deduzidas das seqüências de aminoácidos parciais ou completas do produto protéico homólogo de AveC purificado. 5.2. Sistemas recombinantes 5.2.1. Vetores de clonagem e expressão A presente invenção proporciona ainda vetores de clonagem recombinantes e vetores de expressão que são úteis na clonagem ou ex- pressão de moléculas polinucleotídicas da presente invenção compreen- dendo, por exemplo, a ORF aveC de S. avermitilis ou quaisquer ORFs ho- mólogas de aveC. Em uma modalidade não limitante, a presente invenção proporciona o plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), o qual compreende a ORF completa do gene aveC de S. avermitilis.

Toda a descrição que se segue respeitando a ORF aveC de S.

avermitilis, ou uma molécula polinucleotídica compreendendo a ORF aveC ou uma porção da mesma, ou um produto protéico AveC de S. avermitilis, também se refere a homólogos de aveC e produtos protéicos homólogos de AveC, a menos que indicado explicitamente ou pelo contexto.

Foi desenvolvida uma variedade de diferentes vetores para usar especificamente em Streptomyces, incluindo fagos, plasmídeos com um número de cópias elevado, plasmídeos com um número baixo de cópias e vetores vaivém para E. coli-Streptomyces, entre outros, e quaisquer destes podem ser usados na modalidade da presente invenção. Também foram clonados vários genes de resistência a drogas a partir de Streptomyces, e alguns destes genes podem ser incorporados em vetores como marcas se- letivas. Exemplos dos vetores em uso para Streptomyces estão apresenta- dos, de entre outros sítios, em Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190.

Os vetores recombinantes da presente invenção, particular- mente vetores de expressão, são preferencialmente construídos de forma que a seqüência codificadora da molécula polinucleotídica da invenção es- teja em associação operacional com um ou mais elementos reguladores ne- cessários à transcrição e tradução da seqüência codificadora para produzir um polipeptídeo. Conforme aqui é usado, o termo “elemento regulador" in- clui mas não está limitado às sequências nucleotídicas que codificam pro- motores indutíveis e não indutíveis, potenciadores, operadores e outros elementos conhecidos que servem para dirigir e/ou regular a expressão de seqüências codificadoras de polinucleotídeos. Também, conforme aqui usa- do, a seqüência codificadora está em "associação operacional" com um ou mais elementos reguladores sempre que os elementos reguladores efetiva- mente regulem e permitam a transcrição da seqüência codificadora ou a tradução do seu mRNA, ou ambas.

Os vetores plasmídicos típicos que podem ser manipulados ge- neticamente, de forma a conterem uma molécula polinucleotídica da pre- sente invenção, incluem pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Prome- ga) e o vetor vaivém pWHM3 (Vara et ai, 1989, J. Bact. 171:5872-5881), entre outros. São do conhecimento geral os métodos para a construção de vetores recombinantes contendo seqüências codificadoras particulares em associação operacional com elementos reguladores adequados, e estes podem ser usados na modalidade do presente invenção. Estes métodos in- cluem técnicas recombinantes in vitro, técnicas de síntese, e técnicas de recombinação genética in vivo. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et ai, acima; Ausubel etal., acima; Sambrook et ai, 1989, acima;

Innis etal., 1995, acima; e Erlich, 1992, acima.

Os elementos reguladores destes vetores podem variar na sua força e especificidade. Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, pode ser usado qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados. Exemplos não limitantes de regiões reguladoras da transcrição ou promotores para bactérias incluem o promotor β-gal, o promotor T7, o promotor TAC, os promotores esquerdo e direito de λ, os promotores trp e lac, os promotores de fusão trp-lac e mais especificamente para Streptomyces, os promotores ermE, melC e tipA, etc. Em uma modalidade específica descrita na Seção 11 abaixo, produziu-se um vetor de expressão que continha a ORF aveC clonada adjacente ao promotor constitutivo forte ermE derivado de Saccharopolyspora erythrea, O vetor foi usado para transformar S. avermitilis e subseqüente análise por HPLC dos produtos de fermentação indicou um título aumentado de avermectinas produzidas com- parado com a produção pela mesma cepa, mas que expressa o alelo aveC tipo selvagem.

Os vetores de expressão de proteínas de fusão podem ser usa- dos para expressar uma proteína de fusão do produto protéico AveC. A proteína de fusão purificada pode ser usada para induzir anti-soros contra o produto protéico AveC, para estudar as propriedades bioquímicas do pro- duto protéico AveC, para construir proteínas de fusão AveC com diferentes atividades bioquímicas, ou para ajudar na identificação ou purificação do produto protéico AveC expresso. Os vetores de expressão de proteínas de fusão possíveis incluem mas não estão limitados a vetores que incluem se- qüências codificadoras de fusões da β-galactosidase e de trpE, fusões de proteínas que se ligam à maltose, fusões de glutationa-S-transferase e fu- sões de poli-histidina (regiões veículo). Em uma modalidade alternativa, um produto protéico AveC ou uma porção do mesmo pode ser fundido com um produto protéico homólogo de AveC, ou uma porção do mesmo, derivado de uma outra espécie ou cepa de Streptomyces, tais como, por exemplo, S. hygroscopicus ou S. griseochromogenes. Em uma modalidade particular descrita na Seção 12, abaixo, e descrito na FIGURA 7, construiu-se um plasmídeo quimérico que contém uma região de 564 pb da ORF homóloga de aveC de S. hygroscopicus substituindo uma região homóloga de 564 pb da ORF aveC de S. avermitilis. Tais vetores híbridos podem ser usados para transformar células de S. avermitilis e testados para determinar o seu efeito, por exemplo, na proporção de avermectinas classes 2:1 produzidas.

As proteínas de fusão AveC podem ser manipuladas genetica- mente de forma a compreenderem uma região útil para purificação. Por exemplo, as fusões de AveC-proteína de ligação à maltose podem ser puri- ficadas usando resina de amilose; as proteínas de fusão AveC-glutationa-S- transferase podem ser purificadas usando esferas de glutationa-agarose; e as fusões de AveC-poli-histidina podem ser purificadas usando resina de níquel divalente. Como alternativa, os anticorpos contra uma proteína ou peptídeo veículo podem ser usados para purificação por cromatografia de afinidade da proteína de fusão. Por exemplo, uma seqüência nucleotídica codificadora do epítopo alvo de um anticorpo monoclonal pode ser manipu- lada de forma a ser inserida no vetor de expressão, em associação operaci- onal com os elementos reguladores situados de forma a que o epítopo ex- presso seja fundido com o polipeptídeo AveC. Por exemplo, uma seqüência nucleotídica codificadora do epítopo marca FLAG® (International Biotechno- logies Inc.), a qual é uma marca peptídica hidrofílica, pode ser inserida por técnicas convencionais no vetor de expressão em um ponto correspondente, por exemplo, ao terminal carboxila do polipeptídeo AveC. O produto de fu- são expresso polipeptídeo AveC-epítopo FLAG® pode ser então detectado e purificado por afinidade usando anticorpos comerciais anti-FLAG®.

O vetor de expressão codificador da proteína de fusão AveC pode ser também manipulado de forma a conter seqüências poli-adaptado- ras, que codificam sítios específicos de divagem por proteases, de forma que o polipeptídeo AveC expresso possa ser liberado da região veículo ou do parceiro de fusão por tratamento com uma protease específica. Por exemplo, o vetor da proteína de fusão pode incluir seqüências de DNA codi- ficadoras de locais de divagem pela trombina ou pelo fator Xa, entre outros.

Uma seqüência sinal a montante e na mesma grelha de leitura da ORF aveC pode ser introduzida no vetor de expressão por métodos co- nhecidos para dirigir o trânsito e secreção do produto protéico expresso.

Exemplos não limitantes das seqüências sinal incluem os do fator a, imuno- globulinas, proteínas da membrana externa, penicilinase e receptores de células T, entre outros.

Para ajudar na seleção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com vetores de clonagem ou de expressão da presente invenção, o vetor pode ser manipulado de forma a compreender ainda uma sequência codificadora de um produto protéico repórter ou outra marca se- letiva. Tal seqüência codificadora está preferencialmente em associação operacional com as seqüências codificadoras do elemento regulador, con- forme descrito acima. Os genes repórter que são úteis no invenção são bem conhecidos e incluem os que codificam a proteína fluorescente verde, lucife- rase, xylE e tirosinase, entre outros. Seqüências nucleotídicas codificadoras de marcas selecionáveis são bem conhecidos e incluem os que codificam produtos protéicos que conferem resistência a antibióticos ou a anti- metabólitos, ou que forneçam um requisito auxotrófico. Exemplos de tais seqüências incluem as que contêm resistência à eritromicina, tiostreptona ou canamicina, entre muitas outras. 5.2.2. Transformação de células hospedeiras A presente invenção proporciona ainda células hospedeiras transformadas, compreendendo uma molécula polinucleotídica ou vetor re- combinante da invenção, e novas cepas ou linhas celulares derivadas de- las. As células hospedeiras úteis na modalidade da invenção são preferen- cialmente células de Streptomyces, se bem que possam ser igualmente usadas outras células procarióticas ou eucarióticas. Tais células hospedei- ras transformadas tipicamente incluem mas não estão limitadas a microor- ganismos, tais como bactérias transformadas com DNA de bacteriófagos, DNA de plasmídeos ou DNA de cosmídeos recombinantes, ou leveduras transformadas com vetores recombinantes, entre outros.

As moléculas polinucleotídicas da presente invenção destinam- se a funcionar em células de Streptomyces, mas podem também ser usadas para transformar outras células bacterianas ou eucarióticas, por exemplo, para fins de clonagem ou de expressão. Tipicamente pode-se usar uma cepa de E. coli, como seja, por exemplo, a cepa DH5a, disponível na Ameri- can Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (NQ de acesso 31343) e a partir de fontes comerciais (Stratagene). Células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem células de levedura, se bem que as células de mamífero ou as células de inseto possam também ser utilizadas eficaz- mente. O vetor de expressão recombinante da invenção é preferencial- mente usado para transformar ou transfectar uma ou mais células hospedei- ras de uma cultura celular substancialmente homogênea. O vetor de ex- pressão é geralmente introduzido nas células hospedeiras de acordo com técnicas conhecidas, tais como, por exemplo, transformação de protoplas- tos, precipitação com fosfato de cálcio, tratamento com cloreto de cálcio, microinjeção, eletroporação, transfecção por contato com um vírus recombi- nante, transfecção mediada por lipossomas, transfecção com DEAE- dextrano, transdução, conjugação ou bombardeamento com microprojéteis. A seleção dos transformantes pode ser conduzida por processos convenci- onais, como seja por seleção de células que expressam uma marca selecio- nável, por exemplo, resistência a antibióticos, associada ao vetor recombi- nante, como descrito abaixo.

Uma vez introduzido o vetor de expressão na célula hospedeira, a integração e a manutenção da seqüência codificadora de aveC quer no cromossoma da célula hospedeira quer epissomicamente, pode ser confir- mada por técnicas convencionais, por exemplo, por análise de hibridização Southern, análise com enzimas de restrição, análise por PCR, incluindo PCR com transcriptase reversa (rt-PCR) ou por ensaio imunológico para detectar o produto protéico esperado. As células hospedeiras contendo e/ou expressando a seqüência recombinante codificadora de aveC podem ser identificadas por qualquer uma de pelo menos quatro abordagens gerais que são bem conhecidas, incluindo: (i) hibridização DNA-DNA, DNA-RNA ou RNA-RNA anticódon; (ii) detecção da presença de “marcas"; (iii) avaliando o nível de transcrição conforme medido pela expressão de transcritos de mRNA específicos de aveC na célula hospedeira; e (iv) detecção da pre- sença do produto polipeptídico maduro medido, por exemplo, por imunoen- saio ou pela presença de atividade biológica AveC (por exemplo, a produ- ção de proporções e quantidades específicas de avermectinas indicadoras de atividade AveC em, por exemplo, células hospedeiras de S. avermitilis). 5.2.3. Expressão e caracterização de um produto protéico recombinante AveC

Uma vez a seqüência codificadora aveC introduzida estavel- mente em uma célula hospedeira transformada, a células hospedeira trans- formada é propagada clonalmente e as células resultantes podem ser culti- vadas em condições que conduzem à produção máxima do produto protéico AveC. Tais condições tipicamente incluem o crescimento das células até uma densidade elevada. Sempre que o vetor de expressão compreenda um promotor indutível serão empregues condições de indução adequadas tais como, por exemplo mudança de temperatura, exaustão de nutrientes, adição de indutores gratuitos (por exemplo, análogos de açúcares, tais como iso- propil-p-D-tiogalactopiranosideo (IPTG)), acumulação de subprodutos em excesso metabólico, ou similares.

Sempre que o produto protéico AveC expresso seja retido den- tro das células hospedeiras, as células hospedeiras são colhidas e lisadas e o produto isolado e purificado a partir do lisado em condições de extração conhecidas de forma a minimizar a degradação de proteína como seja, por exemplo, a 4°C ou na presença de inibidores de proteases, ou ambos.

Sempre que o produto protéico AveC expresso seja secretado pelas células hospedeiras, o meio nutritivo metabolizado pode ser simplesmente colhido e o produto isolado a partir dele. O produto protéico AveC expresso pode ser isolado ou substan- cialmente purificado a partir dos lisados celulares ou do meio de cultura, conforme adequado, usando métodos convencionais, incluindo mas não estando limitado a qualquer combinação dos seguintes métodos: precipita- ção com sulfato de amônio, fracionamento por tamanho, cromatografia de permuta iônica, HPLC, centrifugação em gradientes de densidade e croma- tografia de afinidade. Sempre que o produto protéico AveC expresso apre- sente atividade biológica, o aumento do grau de pureza da preparação pode ser controlado em cada um das etapas do processo de purificação usando um ensaio adequado. Quer o produto protéico AveC expresso apresente ou não atividade biológica, ele pode ser detectado com base, por exemplo, no tamanho, ou reatividade com um anticorpo específico de AveC, ou pela pre- sença de uma marca de fusão. Tal como aqui é usado, um produto protéico AveC é "substancialmente purificado" sempre que o produto constitua mais de 20% p/v da proteína em uma preparação particular. Igualmente, tal como aqui é usado, um produto protéico AveC é "isolado" sempre que o produto constitua pelo menos cerca de 80% da proteína em uma preparação parti- cular. A presente invenção proporciona assim um produto protéico AveC de S. avermitilis expresso por via recombinante, isolado ou substanci- almente purificado, compreendendo a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência codificadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC209604), ou a seqüência de aminoácidos da FIGURA 1 (SEQID NO:2) ou uma porção substancial da mesma e seus homólogos. A presente invenção proporciona ainda um produto protéico AveC de S. hygroscopicus expresso por via recombinante, isolado ou subs- tancialmente purificado, compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ou uma porção substancial da mesma e homólogos dos mes- mos. A presente invenção proporciona ainda um método para a pro- dução de um produto protéico AveC, compreendendo a cultura de uma cé- lula hospedeira transformada com um vetor de expressão recombinante, o referido vetor compreendendo uma molécula polinucleotídica codificadora do produto protéico AveC, molécula polinucleotídica essa que está em as- sociação operacional com um ou mais elementos reguladores, que contro- lam a expressão da molécula polinucleotídica na célula hospedeira, em condições que conduzem à produção do produto protéico recombinante AveC, e recuperação do produto protéico AveC a partir da cultura celular. O produto protéico AveC de S. avermitilis expresso por via re- combinante é útil para uma variedade de fins, incluindo o despiste de com- postos que alterem a função do produto protéico AveC, modulando assim a biossíntese de avermectinas e indução de anticorpos dirigidos contra o pro- duto protéico AveC.

Uma vez obtido o produto protéico AveC com uma pureza sufi- ciente, ele pode ser caracterizado por métodos convencionais, incluindo por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão por tamanho, análise da seqüência de aminoácidos, atividade biológica na produção de produtos adequados na via de biossíntese das avermectinas, etc. Por exemplo, a seqüência de ami- noácidos do produto protéico AveC pode ser determinada usando técnicas convencionais de seqüenciação de peptídeos. O produto protéico AveC pode ser ainda caracterizado usando análise de hidrofilicidade (ver, por exemplo, Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad, Sei. USA 78:3824) ou algoritmos de software análogo, para identificar regiões hidrofóbicas e hi- drofílicas do produto protéico AveC. A análise estrutural pode ser realizada para identificar regiões do produto protéico AveC que assumem estruturas secundárias específicas. Métodos biofísicos tais como cristalografia de raios X (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13), modulação computacional (Fletterick e Zoller (eds), 1986, em: Current Communications in Molecular Bioloav. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) e resso- nância magnética nuclear (NMR) podem ser usadas para mapear e estudar os locais de interacção entre o produto protéico AveC e o seu substrato. A informação obtida a partir destes estudos pode ser usada para selecionar novos locais para mutação na ORF aveC para ajudar a desenvolver novas cepas de S. avermitilis tendo características de produção de avermectinas mais desejáveis.

5.3. Construção e utilização de mutantes AveC A presente invenção proporciona uma molécula polinucleotídica compreendendo uma seqüência nucleotídica que é igual ao alelo aveC de S. avermitilis, ou uma variante degenerada do mesmo, ou a seqüência codi- ficadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou uma variante degenerada do mesmo, ou a seqüência de nucleotídeos da ORF aveC de S. avermitilis conforme apresentado na FIGURA 1(SEQ ID NO:1) ou uma variante degenerada do mesmo, mas que ainda compreende uma ou mais mutações, de tal modo que as células de S. avermitilis cepa ATCC 53692 em que o alelo aveC tipo selvagem foi inativado e que expres- sam a molécula polinucleotídica compreendendo a sequência nucleotídica mutageneizada, ou uma variante degenerada do mesmo, produz uma pro- porção ou quantidade de avermectinas diferente do que é produzido pelas células de S. avermitilis cepa ATCC 53692 que expressa apenas o alelo aveC tipo selvagem.

De acordo com a presente invenção, tais moléculas polinucleo- tídicas podem ser usadas para produzir novas cepas de S. avermitilis que apresentam uma alteração detectável na produção de avermectina compa- rado com a mesma cepa que expressa apenas o alelo aveC tipo selvagem.

Em uma modalidade preferida, tais moléculas polinucleotídicas são úteis para produzir novas cepas de S. avermitilis que produzem avermectinas em uma proporção de classes 2:1 reduzida comparado com a mesma cepa que expressa apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma outra modalidade preferida, tais moléculas polinucleotídicas são úteis para produzir novas cepas de S. avermitilis que produzem níveis aumentados de avermectinas comparado com a mesma cepa que expressa apenas um alelo aveC tipo selvagem. Em uma outra modalidade preferida, tais moléculas polinucleotí- dicas são úteis para produzir novas cepas de S. avermitilis em que o gene aveC foi inativado.

As mutações do alelo ou seqüência codificadora de aveC inclu- em quaisquer mutações que introduzam deleções, adições ou substituições de um ou mais aminoácidos no produto protéico AveC, ou que resultem na truncagem do produto protéico AveC, ou qualquer combinação das suas combinações e que produzam o resultado pretendido. Tais seqüências mu- tageneizadas do alelo aveC incluem quaisquer variantes degeneradas. Por exemplo, a presente invenção proporciona moléculas polinucleotídicas compreendendo a seqüência nucleotídica do alelo aveC ou uma variante degenerada do mesmo, ou a seqüência codificadora do produto protéico AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou uma variante degenerada do mesmo, ou a seqüência nucleotídica da ORF aveC de S. avermitilis con- forme presente na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma variante degenerada do mesmo, mas que ainda compreende uma ou mais mutações que codifi- cam a substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de amino- ácido diferente em posições selecionadas do produto protéico AveC. Em várias modalidades não limitantes, algumas das quais estão exemplificadas abaixo, tais substituições podem ser realizadas em quaisquer posições de aminoácidos do produto protéico AveC que correspondem às posições de aminoácidos 38,48, 55,89,99,111,136,138,139,154,179,228,230,238, 266, 275, 289 ou 298 de SEQ ID NO:2, ou alguma combinação dos mes- mos.

As mutações da seqüência codificadora aveC são efetuadas por qualquer um de uma variedade de métodos, incluindo a utilização de PCR em que ocorrem erros ou por mutagênese com cassete. Por exemplo a mu- tagênese dirigida com oligonucleotídeos pode ser empregue para alterar a seqüência do alelo aveC ou da ORF de uma forma definida como seja, por exemplo, para introduzir um ou mais sítios de restrição, ou um códon de terminação, em regiões específicas dentro do alelo ou ORF aveC. Métodos tais como os descritos na Patente U.S. 5,605,793, Patente U.S. 5,830,721 e Patente U.S. 5,837,458 que envolvem fragmentação ao acaso, ciclos repeti- dos de mutagênese e erros de incorporação de nucleotídeos, podem ser igualmente usados para produzir bibliotecas grandes de polinucleótidos tendo sequências nucleotídicas codificadoras de mutações aveC.

As mutações dirigidas podem ser úteis, particularmente sempre que sirvam para alterar um ou mais resíduos de aminoácidos conservados no produto protéico AveC. Por exemplo, uma comparação das seqüências de aminoácidos deduzidas dos produtos protéicos AveC e dos produtos protéicos homólogos de AveC de S. avermitilis (SEQ ID NO:2), S. griseo- chromogenes (SEQ ID NO:5) e S. hygroscopicus (SEQ ID NO:4), conforme apresentado na FIGURA 6, indicam sítios de conservação significativa dos resíduos de aminoácidos entre estas espécies. A mutagênese dirigida que conduz a uma alteração em um ou mais destes resíduos de aminoácidos con- servados pode ser particularmente eficaz na produção de novas cepas mutan- tes que apresentam alterações desejáveis na produção de avermectina. A mutagênese ao acaso pode também ser útil, e pode ser reali- zada expondo as células de S. avermitilis à radiação ultravioleta, ou raios X, ou a mutagenes químicos tais como N-metil-N'-nítrosoguanidina, sulfonato de etilmetano, ácido nitroso ou mostardas de nitrogênio. Ver por exemplo, Ausubel, 1989, acima, para uma revisão de técnicas de mutagênese.

Uma vez obtidas as moléculas polinucleotídicas mutageneiza- das, elas podem ser despistadas para se determinar se podem modular a biossíntese de avermectinas em S. avermitilis. Em uma modalidade preferi- da, uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotídica muta- geneizada é testada por complementação de uma cepa de S. avermitilis em que o gene aveC foi inativado para dar um fundo de aveC negativo (aveC‘).

Em um método não limitante, a molécula polinucleotídica mutageneizada é cortada e inserida em um plasmídeo de expressão, em associação operaci- onal com um ou mais elementos reguladores, plasmídeos esses que prefe- rencialmente compreendem genes de resistência a uma ou mais drogas para permitir a seleção de células transformadas. Este vetor é então usado para transformar células hospedeiras aveC~ usando técnicas conhecidas, e as células transformadas são selecionadas e cultivadas em meios de fer- mentação adequados, em condições que permitem ou induzem a produção de avermectinas. Os produtos de fermentação são então analisados por HPLC para determinar a capacidade da molécula polinucleotídica mutage- neizada para complementar a célula hospedeira. Na Seção 8.3 abaixo são exemplificados vários vetores portadores das moléculas polinucleotídicas mutageneizadas capazes de reduzir a proporção B2:B1 de avermectinas, incluindo pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 e pSE290 a pSE297. A presente invenção proporciona métodos para a identificação de mutações da ORF aveC de S. avermitilis capazes de alterar a proporção e/ou quantidade de avermectinas produzidas. Em uma modalidade preferi- da, a presente invenção proporciona um método para a identificação de mutações da ORF aveC capazes de alterar a proporção das classes 2:1 das avermectinas produzidas, compreendendo: (a) determinação da proporção das classes 2:1 das avermectinas produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis, em que o alelo aveC nativo foi inativado e nas quais uma mo- lécula polinucieotídica compreendendo uma seqüência nucleotídica codifi- cadora de um produto protéico AveC mutageneizado foi introduzido e está a ser expresso; (b) determinação da proporção de classes 2:1 das avermecti- nas produzidas pelas células da mesma cepa de S. avermitilis da etapa (a) mas que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem ou um alelo aveC tendo a seqüência nucleotídica da ORF da FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) ou uma seqüência nucleotídica que é homóloga dela; e (c) comparação da pro- porção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis do passo (a) com a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis do passo (b); de tal forma que se a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis do passo (a) for diferente da proporção de classes 2:1 de aver- mectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (b), então a mutação da ORF aveC, capaz de alterar a proporção de classes 2:1 de avermectinas, foi identificada. Em uma modalidade preferida, a proporção de classes 2:1 de avermectinas é reduzida pela mutação.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção pro- porciona um método para a identificação de mutações da ORF aveC ou construtos genéticos compreendendo a ORF aveC capaz de alterar a quan- tidade de avermectinas produzidas, compreendendo: (a) determinação da quantidade de avermectinas produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis em que o alelo aveC nativo foi inativado, e em que uma molécula polinucieotídica compreendendo uma seqüência nucleotídica codificadora do produto protéico AveC mutageneizado ou compreendendo um construto genético contendo uma seqüência nucleotídica codificadora do produto protéico AveC foi introduzida e está a ser expressa; (b) determinação da quantidade de avermectinas produzidas pelas células da mesma cepa de S. avermitilis da etapa (a) mas que expressam apenas o alelo aveC tipo selva- gem ou uma seqüência nucleotídica que é sua homóloga; e (c) comparação da quantidade de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (a) com a quantidade de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (b); de tal forma que se a quantidade de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (a) for diferente da quan- tidade de avermectinas produzidas pelas células de S. avermitilis da etapa (b), então foi identificada uma mutação da ORF aveC ou de um construto genético capaz de alterar a quantidade de avermectinas. Em uma modalida- de preferida, a quantidade de avermectinas produzidas é aumentada pela mutação.

Qualquer um dos métodos atrás referidos para identificação de mutações é realizado usando meios de cultura de fermentação, preferenci- almente suplementados com ciclo-hexano ácido carboxílico, se bem que possam ser igualmente usados outros precursores de ácidos graxos ade- quados, tais como os precursores de ácidos graxos apresentados na Tabela 1.

Uma vez identificada a molécula polinucleotídica mutageneizada que modula a produção de avermectina numa direção desejável, a localiza- ção da mutação na seqüência nucleotídica pode ser determinada. Por exemplo, uma molécula polinucleotídica tendo uma seqüência nucleotídica codificadora de um produto protéico AveC pode ser isolada por PCR e su- jeita à análise da seqüência de DNA usando métodos conhecidos. Por com- paração da seqüência de DNA do alelo aveC mutageneizado com a do alelo aveC tipo selvagem, podem ser determinadas uma ou mais mutações res- ponsáveis pela alteração da produção de avermectinas. Em modalidades específicas mas não limitantes da presente invenção, os produtos protéicos AveC de S. avermitilis, compreendendo substituições de um só aminoácido em um dos resíduos 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) ou 230 (G230D) ou duplas substituições nas posições 138 (S138T) e 139 (A139T ou A139F), deram alterações na função do produto protéico AveC de tal forma que a proporção das classes 2:1 de avermectinas produzidas foi alterada (ver Se- ção 8, abaixo), em que as posições de aminoácidos referidas correspondem às apresentadas na FIGURA 1 (SEQ ID NO:2). Ainda, demonstrou-se que as sete combinações de mutações que se seguem reduzem eficazmente a proporção de classes 2:1 de avermectinas: (1)D48E/A89T; (2) S138T/ A139T/G179S; (3)Q38P/L136P/E238D; (4)F99S/S138T/A139T/G179S; (5) Α139Τ7 Μ228Τ; (6) G111V/P289L; (7) A139T/K154E/Q298H. Tal como aqui é usado, as designações anteriormente mencionadas, tais como A139T, indicam o resíduo de aminoácido original com a designação de uma só letra, que neste exemplo é alanina (A), na posição indicada, que neste exemplo é a posição 139 (referindo a SEQ ID NO:2) do polipeptídeo, seguido do resí- duo de aminoácido que substitui o resíduo de aminoácido original, que neste exemplo é a treonina (T). Assim, as moléculas polinucleotídicas tendo as seqüências nucleotídicas que codificam os produtos protéicos AveC de S. avermitilis mutageneizados compreendendo as substituições ou deleções em uma ou mais posições de aminoácidos 38, 48, 55, 89, 99,111,136,138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 ou 298 (ver FIGURA 1) ou qualquer combinação do mesmo, estão englobadas na presente invenção.

Em uma modalidade preferida, tais mutações codificam substi- tuições de aminoácidos selecionadas de entre uma ou mais do grupo con- sistindo em: (a) resíduo de aminoácido Q na posição 38 substituído por P ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de P; (b) resíduo de aminoácido D na posição 48 substituído por E ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de E; (c) resíduo de aminoácido A na posição 89 substituído por T ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de T; (d) resíduo de aminoácido F na posição 99 substituído por S ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de S;

(e) resíduo de aminoácido G na posição 111 substituído por V ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de V; (f) resíduo de aminoácido L na posição 136 substituído por P ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de P;

(g) resíduo de aminoácido S na posição 138 substituído por T ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de T; (h) resíduo de aminoácido A na posição 139 substituído por T ou F, ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de T ou F; (i) resíduo de aminoácido K na posição 154 substituído por E ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de E; (j) resíduo de aminoácido G na posição 179 substituído por S ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de S;

(k) resíduo de aminoácido M na posição 228 substituído por T ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de T; (l) resíduo de aminoácido E na posição 238 substituído por D ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de D;

(m) resíduo de aminoácido P na posição 289 substituído por L ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de L; e (n) resíduo de aminoácido Q na posição 298 substituído por H ou por um aminoácido que seja uma substituição conservativa de H; em que as substituições de aminoácidos conservativas são como definido atrás na Seção 5.1.

Em uma outra modalidade preferida da invenção, tais mutações codificam uma combinação de substituições de aminoácidos, em que a combinação de resíduos de aminoácidos substituídos é selecionada do gru- po consistindo em: (a) resíduos de aminoácidos S138 e A139; (b) resíduos de aminoácidos D48 e A89; (c) resíduos de aminoácidos S138, A139 e G179; (d) resíduos de aminoácidos Q38, L136 e E238; (e) resíduos de aminoácidos F99, S138, A139 e G179; (f) resíduos de aminoácidos A139 e M228; (g) resíduos de aminoácidos A139, K154 e Q298. (h) resíduos de aminoácidos A139, K154 e Q298.

Em uma outra modalidade preferida, combinações específicas de mutações no alelo aveC úteis na redução eficaz da proporção de classes 2:1 de avermectinas de acordo com a presente invenção são selecionadas de entre um ou mais do grupo consistindo em: (a) S138T/A139T

(b) S138T/A139F (c) D48E/A89T; (d) S138T/A139T/G179S; (e) Q38P/L136P/E238D; (f) F99S/S138T/A139T/G179S; (g) A139T/M228T; (h) G111V/P289L; e (i) A139T/K154E/Q298H. A presente invenção proporciona ainda composições para a obtenção de novas cepas de S. avermitilis, as células das quais contêm um alelo aveC mutageneizado que resulta na alteração da produção de aver- mectinas. Por exemplo, a presente invenção proporciona vetores recombi- nantes que podem ser usados para direcionar qualquer uma das moléculas polinucleotídicas compreendendo as sequências nucleotídicas mutagenei- zadas da presente invenção para o local onde se situa o gene aveC do cromossoma de S. avermitilis para inserir ou substituir a ORF aveC, ou uma porção da mesma, através de recombinação homóloga. De acordo com a presente invenção, no entanto, uma molécula polinucleotídica compreen- dendo uma seqüência nucleotídica mutageneizada da presente invenção aqui proporcionada pode também funcionar de forma a modular a biossínte- se de avermectinas quando inserida no cromossoma de S. avermitilis em um local diferente do gene aveC, ou quando mantido epissomicamente nas cé- lulas de S. avermitilis. Assim, a presente invenção também proporciona ve- tores compreendendo uma molécula polinucleotídica compreendendo uma seqüência nucleotídica mutageneizada da presente invenção, vetores esses que podem ser usados para inserir a molécula polinucleotídica em um local do cromossoma de S. avermitilis, que não seja o gene aveC, ou mantidos epissomicamente.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona vetores para a substituição de genes, que podem ser usados para inserir o alelo aveC mutageneizado ou uma variante degenerada, em células de uma cepa de S. avermitilis, gerando assim novas cepas de S. avermitilis, as cé- lulas das quais produzem avermectinas em uma proporção de classes 2:1 alterada comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células é reduzida. Tais veto- res de substituição de genes podem ser construídos usando moléculas poli- nucleotídicas mutageneizadas presentes nos vetores de expressão propor- cionados, tais como, por exemplo, pSE188, pSE199 e pSE231, cujos veto- res de expressão estão exemplificados na Seção 8 abaixo.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona vetores que possam ser usados para inserir um alelo aveC mutageneizado, ou uma variante degenerada do mesmo, em células de uma cepa de S. avermitilis para gerar novas cepas de células que produzem quantidades alteradas de avermectinas comparado com as células da mesma cepa que expressem apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferi- da, a quantidade de avermectinas produzidas pelas células é aumentada.

Em uma modalidade específica mas não limitante, tal vetor compreende ainda um promotor forte conhecido, como seja por exemplo, o promotor constitutivo forte ermE de Saccharopolyspora erythraea, que está situado a montante e em associação operacional com o alelo aveC. Tal vetor pode ser o plasmídeo pSE189, descrito no Exemplo 11 abaixo, ou pode ser construí- do usando o alelo aveC mutageneizado do plasmídeo pSE189.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção pro- porciona vetores de substituição de genes que sejam úteis para inativar o gene aveC em uma cepa tipo selvagem de S. avermitilis. Em uma modalida- de não limitante, tais vetores de substituição de genes podem ser construí- dos usando a molécula polinucleotídica mutageneizada presente no plasmí- deo pSE180 (ATCC 209605), que está exemplificado na Seção 8.1, abaixo (FIGURA 3). A presente invenção proporciona ainda vetores de substituição de genes que compreendem uma molécula polinucleotídica compreendendo ou consistindo em seqüências nucleotídicas que naturalmente flanqueiam o gene aveC in situ no cromossoma de S. avermitilis, incluindo, por exemplo, as seqüências nucleotídicas flanqueantes apresentadas na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1), tais vetores podem ser usados para eliminar a ORF aveC de S. avermitilis. A presente invenção proporciona ainda métodos para a obten- ção de novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que expres- sam um alelo aveC mutageneizado e que produzem uma proporção e/ou quantidades alteradas de avermectinas comparado com as células da mes- ma cepa de S, avermitilis que expressam apenas o alelo aveC tipo selva- gem, Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona um método para a preparação de novas cepas de S. avermitilis compreendendo as células que expressam um alelo aveC mutageneizado e que produzem uma proporção de ciasses 2:1 alterada de avermectinas comparado com as células da mesma cepa de S. avermitilis que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, compreendendo transformação das células de uma cepa de S. avermitilis com um vetor portador de um alelo aveC que codifica um produto protéico que altera a proporção de classes 2:1 das avermectinas produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo aveC mutageneizado comparado com as células da mesma cepa que ex- pressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, e seleção das células trans- formadas que produzem avermectinas em uma proporção de classes 2:1 alterada, comparado com a proporção de classes 2:1 produzida pelas célu- las da mesma cepa que expressam apenas o alelo tipo selvagem aveC. Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção proporciona um méto- do para a preparação de uma nova cepa de S. avermitilis, compreendendo a transformação de células de uma cepa de S. avermitilis com um vetor capaz de introduzir uma mutação no alelo aveC de tais células, em que a mutação do alelo aveC resulta na substituição no produto protéico AveC de um resí- duo de aminoácido diferente em uma ou mais posições de aminoácidos cor- respondendo aos resíduos de aminoácidos 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 ou 298 de SEQ ID NO:2, de forma que células da cepa S. avermitilis, em que o alelo aveC foi mutage- neizado, produzem uma proporção de classes 2:1 de avermectinas que é diferente da proporção produzida pelas células da mesma cepa de S. aver- mitilis que expressa apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalida- de preferida, a proporção alterada de classes 2:1 das avermectinas é redu- zida.

Tal como aqui é usado, sempre que um resíduo de aminoácido codificado por um alelo aveC no cromossoma de S. avermitilis, ou em um vetor ou molécula polinucleotídica isolada da presente invenção seja referi- do como "correspondendo a" um resíduo de aminoácido particular de SEQ ID NO:2, ou sempre que uma substituição de aminoácido seja referida como ocorrendo em uma posição particular "correspondendo a" um resíduo de aminoácido com um número específico de SEQ ID NO:2, isto pretende refe- rir o resíduo de aminoácido no mesmo local relativo do produto protéico AveC, que os familiarizados com a matéria podem rapidamente determinar por referência à seqüência de aminoácidos apresentada aqui como SEQ ID NO:2. A presente invenção proporciona ainda métodos para preparar novas cepas, em que mutações específicas no alelo aveC codificadoras de mutações particulares são referidas como alterações de bases em posições nucleotídicas específicas no alelo aveC "correspondendo a" posições nu- cleotídicas particulares como se mostra em SEQ ID NO:1. Tal como acima, relativamente às posições de aminoácidos correspondentes, sempre que uma posição de nucleotídeo no alelo aveC seja referida como "correspon- dendo a" uma posição de nucleotídeo particular em SEQ ID NO:1, esta des- tina-se a referir o nucleotídeo na mesma posição relativa na seqüência nu- cleotídica aveC, a qual os familiarizados com a matéria podem facilmente determinar por referência à seqüência nucleotídica aqui apresentadas como SEQ ID NO:1.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção pro- porciona um método para a preparação de novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que produzem quantidade alteradas de avermecti- na, compreendendo a transformação de células de uma cepa de S. avermiti- lis com um vetor portador de um alelo aveC mutageneizado ou um construto genético compreendendo o alelo aveC, a expressão do qual resulta em uma alteração na quantidade de avermectinas produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo aveC mutageneizado ou cons- truto genético comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas um único alelo aveC tipo selvagem e seleção das células transfor- madas que produzem avermectinas em uma quantidade alterada comparado com a quantidade de avermectinas produzidas pelas células da cepa que ex- pressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, a quantidade avermectinas produzidas nas células transformadas é aumentada.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona um método para a obtenção de novas cepas de S. avermitilis, as células das quais compreendem um alelo aveC inativado, compreendendo a transfor- mação das células de uma cepa de S. avermitilis que expressa qualquer alelo aveC com um vetor que inativa o alelo aveC e seleção das células transformadas em que o alelo aveC foi inativado. Em uma modalidade prefe- rida não limitante, as células de uma estirpede S. avermitilis são transforma- das com um vetor de substituição de genes portador de um alelo aveC que foi inativado por mutação ou por substituição de uma porção do alelo aveC com uma seqüência heteróloga e são selecionadas as células transforma- das em que o alelo aveC nativo foi substituído pelo alelo aveC inativado. A inativação do alelo aveC pode ser determinada por análise por HPLC dos produtos de fermentação, como descrito abaixo. Em uma modalidade espe- cífica mas não limitante, descrita na Seção 8.1 abaixo, o alelo aveC é inati- vado através da inserção de um gene ermE de Saccharopolyspora erythra- ea na ORF aveC. A presente invenção proporciona ainda novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que foram transformadas com qualquer uma das moléculas polinucleotídicas ou vetores da presente invenção. Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que expressam um alelo aveC mutageneizado ou variante degenerada do mesmo em lugar de, ou para além do alelo aveC tipo selvagem, em que as células da nova cepa produ- zem avermectinas em uma proporção de classes 2:1 alterada, comparado com a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células da mesma cepa que expressa apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, a proporção de classes 2:1 alterada produzida pelas novas células é reduzida. Tais cepas novas são úteis na produção em larga escala de avermectinas desejáveis tais como doramectina. Em uma modali- dade mais preferida, a presente invenção proporciona células de S. avermi- tilis compreendendo qualquer uma das mutações anteriormente menciona- das, ou combinações de mutações no alelo aveC nas posições de nucleotí- deos correspondendo às apresentadas aqui acima, ou que codifiquem qual- quer uma das substituições de aminoácidos anteriormente mencionadas no produto protéico AveC. Se bem que tais mutações possam estar presentes em tais células em um elemento extracromossômico, como seja um plasmí- deo, prefere-se que tais mutações estejam presentes no alelo aveC situado no cromossoma de S. avermitilis. Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma cepa de Streptomyces avermitilis compreenden- do células tendo uma mutação no alelo aveC que codifica um produto pro- téico AveC tendo uma substituição em uma ou mais posições de aminoáci- dos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 266, 275, 289 ou 298 de SEQ ID NO:2, em que a célula produz uma proporção de classes 2:1 de avermectinas que é diferente da proporção produzida por uma célula da mesma cepa de S. avermitilis que expressa o alelo tipo selvagem.

Constituiu um dos principais objetivos dos ensaios de despiste aqui descritos identificar os alelos mutageneizados do gene aveC, cuja ex- pressão, em células de S. avermitilis, altera e, mais particularmente, reduz a proporção das classes 2:1 de avermectinas produzidas. Em uma modalida- de preferida, a proporção de avermectinas B2:B1 produzida pelas células de uma nova cepa de S. avermitilis da presente invenção expressando um alelo aveC mutageneizado, ou uma variante degenerada do mesmo, da presente invenção é cerca de 1,6:1 ou menos. Em uma modalidade preferida, a pro- porção é de cerca de 1:1 ou menos. Em uma modalidade mais preferida, a proporção é de cerca de 0,84:1 ou menos. Em uma modalidade mais prefe- rida, a proporção é de cerca de 0,80:1 ou inferior. Em uma modalidade mais preferida, a proporção é de cerca de 0,75:1 ou inferior. Em uma modalidade mais preferida, a proporção é de cerca de 0,68:1 ou menos. Em uma moda- lidade ainda mais preferida, a proporção é de cerca de 0,67:1 ou inferior.

Em uma modalidade mais preferia, a proporção é de cerca de 0,57:1 ou in- ferior. Ainda, em uma modalidade mais preferida, a proporção é de cerca de 0,53:1 ou menos. Em uma modalidade ainda mais preferida, a proporção é de cerca de 0,42:1 ou inferior. Em uma modalidade ainda mais preferida, a proporção é de cerca de 0,40 ou menos.

Em uma modalidade específica descrita abaixo, as novas célu- las da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexilB2:cico-hexilB1 em uma proporção inferior a 1,6:1. Em uma modalidade específica diferente, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermec- tinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,94:1. Em uma modalidade específica diferente, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,88:1. Em uma modalidade específica diferen- te, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem aver- mectinas ciclo-hexil B2;ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,84:1.

Ainda em uma modalidade específica diferente, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexilB2:ciclo- hexilBI em uma proporção de cerca de 0,75:1. Ainda em uma modalidade específica diferente, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,73:1. Ainda em uma outra modalidade específica diferente, des- crita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,68:1. Ainda em uma outra modalidade específica diferente, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo- hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,67:1. Ainda em uma outra modali- dade específica diferente, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma pro- porção de cerca de 0,57:1. Ainda em uma outra modalidade específica dife- rente, descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,53:1. Ainda em uma outra modalidade específica diferente descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,42:1. Ainda em uma ou- tra modalidade específica diferente descrita abaixo, as novas células da presente invenção produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1 em uma proporção de cerca de 0,40:1.

Em uma modalidade ainda mais preferida, a presente invenção proporciona novas cepas de S. avermitilis compreendendo células que ex- pressam um alelo aveC mutageneizado ou uma variante degenerada do mesmo, em lugar do, ou em vez do, alelo aveC tipo selvagem, em que as células da nova cepa produzem uma quantidade alterada de avermectinas comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, a nova cepa produz uma quantidade aumentada de avermectinas. Em uma modalidade não li- mitante, o construto genético compreende ainda um promotor forte, como seja o promotor constitutivo forte ermE de Saccharopolyspora erythraea, a montante e em associação operacional com a ORF aveC.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona novas cepas de S. avermitilis compreendendo células em que o gene aveC foi inativado. Tais cepas são úteis pelo espectro diferente de avermectinas que produzem, comparado com a cepa tipo selvagem, e em ensaios de despiste de complementação como aqui descrito, para determinar se a mu- tagênese dirigida ou ao acaso do gene aveC afeta a produção de avermec- tinas. Em uma modalidade específica descrita abaixo, células hospedeiras de S. avermitilis foram geneticamente manipuladas de forma a conter um gene aveC inativado. Por exemplo, a cepa SE180-11, descrita nos exemplos abaixo, foi gerada usando o plasmídeo de substituição de genes pSE180 (ATCC 209605) (FIGURA 3), o qual foi construído para inativar o gene aveC de S. avermitilis através da inserção do gene de resistência a ermE na regi- ão codificadora de aveC.

A presente invenção proporciona ainda produtos protéicos AveC de S. avermitiiis, expressos por via recombinante, codificados por qualquer uma das moléculas polinucleotídicas anteriormente mencionadas do inven- ção, e métodos para a preparação dos mesmos. A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção de avermectinas, compreendendo a cultura de células de uma cepa de S. avermitiiis, células essas que expressam um alelo aveC mutage- neizado que codifica um produto protéico que altera a proporção de classses 2:1 de avermectinas produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitiiis expressando o alelo aveC mutageneizado comparado com as células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, em meio de cultura em condições que permitem ou induzem a produção de avermectinas, e recuperação das referidas avermectinas a partir da cultura.

Em uma modalidade preferida, a proporção de classes 2:1 das avermectinas produzidas nas cultura por células expressando o alelo aveC mutageneiza- do é reduzida. Este processo proporciona uma maior eficiência na produção de avermectinas de importância comercial tais como a doramectina. A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção de avermectinas, compreendendo a cultura das células de uma cepa de S. avermitiiis, células essas que expressam um alelo aveC mutage- neizado ou um construto genético compreendendo um alelo aveC que re- sulta na produção de uma quantidade alterada de avermectinas produzidas pelas células de uma cepa de S. avermitiiis expressando o alelo aveC ou construto genético mutageneizado, comparado com as células da mesma cepa que não expressam o alelo aveC ou construto genético mutageneizado mas que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, em meio de cultura em condições que permitem ou induzem a produção de avermectinas, e re- cuperação das referidas avermectinas a partir da cultura. Em uma modali- dade preferida, é aumentada a quantidade de avermectinas produzidas em cultura pelas células que expressam o alelo aveC mutageneizado, variante degenerada do mesmo ou construto genético. A presente invenção proporciona ainda uma nova composição de avermectinas produzidas por uma cepa de S. avermitiiis, expressando um alelo aveC mutageneizado ou variante degenerada do mesmo, que codifica um produto protéico que reduz a proporção de classes 2:1 das avermectinas produzidas pela células de uma cepa de S. avermitilis expressando o alelo aveC mutageneizado ou variante degenerada, comparado com células da mesma cepa que expressam apenas o alelo aveC tipo selvagem, em que as avermectinas na nova composição são produzidas em uma proporção de classes 2:1 reduzida comparado com a proporção de classes 2:1 das aver- mectinas produzidas pelas células da mesma cepa de S. avermitilis que ex- pressa apenas o alelo aveC tipo selvagem. A nova composição de aver- mectinas pode estar presente conforme produzida no fluido de fermentação metabolizado ou pode ser colhida a partir dele. A nova composição de avermectinas pode ser parcial ou substancialmente purificada a partir do fluido de cultura por técnicas bioquímicas de purificação bem conhecidas, tais como precipitação com sulfato de amônio, diálise, fracionamento pelo tamanho, cromatografia de permuta iônica, HPLC, etc. 5.4. Utilização de avermectinas As avermectinas são agentes antiparasíticos altamente ativos tendo particular utlidade como anti-helmínticos, ectoparasiticidas, insetici- das e acaricida. Os cmpostos de avermectinas produzidos de acordo com os métodos da presente invenção são úteis para qualquer um destes fins.

Por exemplo, os compostos de avermectinas produzidos de acordo com a presente invenção são úteis no tratamento de várias doenças ou estados no homem, particularmente sempre que tais doenças ou estados sejam causa- dos por infecções por parasitas, como é conhecido. Consultar, por exemplo, Ikeda e Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609. Mais particularmente, os compostos de avermectina produzidos de acordo com a presente inven- ção são eficazes no tratamento de uma variedade de doenças ou estados causados por endoparasitas, tais como nematódeos parasitas, os quais po- dem infectar o homem, animais domésticos, suínos, ovelhas, cavalos ou bovinos.

Mais especificamente, os compostos de avermectina produzidos de acordo com a presente invenção são eficazes contra nematódeos que infectam o homem, assim como contra aqueles que infectam várias espécies animais. Tais nematódeos incluem parasitas gastrointestinais tais como An- cylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Tríchuris, Enterobius, Dirofílaria e parasitas que se encontram no sangue ou em outros tecidos ou orgãos, tais como filárias e estádios do tubo digestivo de Stron- gyloides e Trichinella.

Os compostos de avermectina produzidos de acordo com a pre- sente invenção são também úteis no tratamento de infecções por ectopara- sitas incluindo, por exemplo, infestações por artrópodos de mamíferos e aves causadas por carraça, traça, piolho, pulgas, varejeira, insetos que pi- cam ou larvas de dípteros migradores que podem afetar bovinos e cavalos, entre outros.

Os compostos de avermectina produzidos de acordo com a pre- sente invenção são também úteis como insecticidas contra pragas domésti- cas tais como, por exemplo, baratas, traças, escaravelhos dos tapetes e moscas, entre outros, assim como pragas de insetos que atacam grãos de cereais armazenados e culturas agrícolas, pragas essas que incluem, arac- nídeos, traças, lagartas e ortópteros tais como gafanhotos, entre outros.

Os animais que podem ser tratados com compostos de aver- mectinas produzidos de acordo com a presente invenção incluem ovinos, bovinos, cavalos, veados, caprinos, suinos, aves incluindo criação, e cães e gatos.

Um composto de avermectina produzido de acordo com a pre- sente invenção é administrado em uma formulação adequada ao fim preten- dido, às espécies particulares de animal hospedeiro a serem tratadas e ao parasita ou inseto envolvido. Para usar como parasiticida, um composto de avermectina, produzido de acordo com a presente invenção, pode ser admi- nistrado oralmente na forma de uma cápsula, bolo, comprimido ou purga líquida ou, como alternativa, pode ser administrado como um banho, ou por injeção, ou como um implante. Tais formulações são preparadas de forma convencional de acordo com a prática veterinária convencional. Assim, os bolo ou comprimidos podem ser preparados misturando o ingrediente ativo com um diluente ou veículo adequado finamente dividido, contendo ainda um agente de desintegração e/ou aglutinante como seja amido, lactose, tal- co, estearato de magnésio, etc. Uma formulação de purga pode ser prepa- rada através da dispersão do ingrediente ativo em uma solução aquosa juntamente com um agente dispersante ou molhante, etc. As formulações injectáveis podem ser preparadas na forma de uma solução esterilizada, a qual pode conter outras substâncias tais como, por exemplo, sais suficien- tes e/ou glicose para tornar a solução isotónica relativamente ao sangue.

Tais formulações variarão, no que respeita ao peso do com- posto ativo, dependendo do doente, ou espécie de animal hospedeiro a ser tratado, da gravidade e tipo de infecção, e do peso do corpo do hospedeiro.

De um modo geral, para administração oral será satisfatória uma dose de composto ativo de cerca de 0,001 a 10 mg por Kg de peso do corpo do pa- ciente ou animal dado como dose única ou em doses divididas durante um período de 1 a 5 dias. No entanto, pode haver casos em que sejam indica- das gamas de dosagens mais altas ou mais baixas, conforme determinado, por exemplo, por um médico ou veterinário, com base em sintomas clínicos.

Com alternativa, um composto de avermectina produzido de acordo com a presente invenção pode ser administrado em combinação com a ração e para este fim pode ser preparado um aditivo ou pré-mistura alimentar concentrado para adicionar à ração animal normal.

Para usar como inseticida, e para o tratamento de pragas agrí- colas, um composto de avermectina produzido de acordo com a presente invenção pode ser aplicado como líquido de pulverização, pó, emulsão e similares de acordo com a prática agrícola convencional. 6. Exemplo: Fermentação de Streptomyces Avermitilis e Análise das Avermectinas B2:B1 As cepas que não possuem atividades de desidrogenase de ácido 2-oxo de cadeia ramificada e de 5-O-metiltransferase não produzem avermectinas se o meio de fermentação não for suplementado com ácidos graxos. Este exemplo demonstra que em tais mutantes pode ser obtida uma gama larga de proporções B2:B1 de avermectinas quando a biossíntese é iniciada na presença de diferentes ácidos graxos. 6.1. Materiais e Métodos Streptomyces avermitilis ATCC 53692 foi guardada a -70°C como caldo de cultura preparada em meio consistindo em: Amido (Nadex, Laing National) - 20g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) -15 g;

Ardamine pH (Yeasts Products Inc.) - 5g; carbonato de cálcio -1 g. O volu- me final foi ajustado a 1 litro com água da torneira, o pH foi ajustado a 7,2 e o meio foi autoclavado a 121°C durante 25 min.

Dois ml de uma suspensão descongelada da preparação acima foram usados para inocular um frasco contendo 50 ml do mesmo meio. Após 48 horas de incubação a 28°C em um agitador rotativo a 180 rpm, usaram- se 2 ml de caldo para inocular um frasco contendo 50 ml de um meio de produção consistindo em: amido - 80g; carbonato de cálcio - 7 g; Pharma- media - 5g; hidrogeno-fosfato dipotássico - 1g; sulfato de magnésio - 1g; ácido glutâmico - 0,6 g; sulfato ferroso hepta-hidratado - 0,01 g; sulfato de zinco - 0,001 g; sulfato manganoso - 0,001 g. O volume final foi ajustado a 1 litro com água da torneira, o pH foi ajustado a 7,2 e o meio foi autoclavado a 121 °C durante 25 min. Vários substratos de ácido carboxílico (ver Tabela 1) foram dis- solvidos em metanol e adicionados ao caldo de fermentação, 24 horas após inoculação, para dar uma concnetração final de 0,2 g/litro. O caldo de fer- mentação foi incubado durante 14 dias a 28°C, depois o caldo foi centrifu- gado (2500 rpm durante 2 min) e o sobrenadante rejeitado. O sedimento de micélio foi extraído com acetona (15 ml), depois com diclorometano (30 ml) e a fase orgânica separada, filtrada, depois evaporada até secagem. O re- síduo foi ressuspenso em metanol (1 ml) e analisado por HPLC com um cromatógrafo líquido Hewlett-Packard 1090A equipado com um detector com arranjo de diodos para varrimento a 240 nm. A coluna usada foi uma Ο- Ι 8 Beckman Ultrasphere, 5 μπι, de 4,6 mm x 25 cm, mantida a 40°C. Vinte e cinco μΙ da solução de metanol foram injectados na coluna. A eluição foi realizada com um gradiente linear de metanol-água entre 80:20 até 95.5 durante 40 minutos a 0,85ml/min, Usaram-se duas concentrações padrão de ciclo-hexil B1 para calibrar a resposta do detector, e mediu-se a área sob as curvas para as avermectinas B2 e B1. 6.2. Resultados Os tempos de retenção de HPLC observados para as avermec- tinas B2 e B1, e as proporções de 2:1, estão apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1 Os resultados apresentados na Tabela 1 demonstram uma faixa extremamente larga de proporções dos produtos avermectina B2:B1, indi- cando uma diferença considerável nos resultados da conversão por desi- dratação dos compostos da classe 2 em compostos da classe 1, dependen- do da natureza da cadeia lateral dos ácidos graxos inicialmente fornecidos.

Isto indica que as alterações nas proporções B2:B1 resultantes das altera- ções da proteína AveC podem ser específicas de substratos particulares.

Consequentemente, o despiste de mutantes apresentando alterações na proporção B2:B1 obtida com um substrato particular necessita de ser reali- zado na presença do substrato. No entanto, este substrato é usado mera- mente para exemplificar o potencial, e não pretende ser limitante da aplica- bilidade da presente invenção.

7. Exemplo: Isolamento do Gene aveC

Este exemplo descreve o isolamento e caracterização de uma região do cromossoma de Streptomyces avermítilis que codifica o produto protéico AveC, Conforme demonstrado abaixo, o gene aveC foi identificado como sendo capaz de modificar a proporção de avermectinas ciclo-hexil-B2 para ciclo-hexil-B1 (B2:B1) produzidas. 7.1. Materiais e Métodos 7.1.1. Crescimento de Streptomyces para isolamento de DNA O método que se segue foi usado para o crescimento de Streptomyces. Colônias isoladas de S. avermítilis ATCC 31272 (colônia iso- lada #2) foram isoladas em YPD-6 força 1/2 contendo: Difco Yeast Extract - 5g; Difco Bacto-peptona - 5g; dextrose - 2,5 g; MOPS - 5g; ágar Bacto Difco -15g.O volume final foi ajustado a 1 litro com dl-^O, o pH foi ajustado a 7,0 e o meio autoclavado 121°C durante 25 min.

Os micélios crescidos no meio acima foram usados para inocu- lar 10 ml de meio TSB (Difco Tryptic Soy Broth - 30g; em 1 litro de dh^O, autoclavado a 12°C durante 25 min) em um tubo de 25 mm x 150 mm que foi mantido com agitação (300 rpm) a 28°C durante 48-72 horas. 7.1.2. Isolamento de DNA cromossômico de Streotomvces Alíquotas (0,25 ml ou 0,5 ml) de micélio crescido como descrito acima foram colocadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e as células concentradas por centrifugação a 12 000 x g durante 60 seg. O sobrena- dante foi rejeitado e as células foram ressuspensas em 0,25 ml de tampão TSE (20 ml de sacarose 1,5M, 2,5 ml de Tris-HCI 1M, pH 8,0, 2,5 ml de EDTA 1M, pH 8,0 e 75 ml de dh^O) contendo 2 mg/ml de lisozima. As amostras foram incubadas a 37°C durante 20 min com agitação, aplicadas em um sistema automático de isolamento de ácidos nucleicos (Integrated Separation Systems, Natick, MA) e o DNA genômico isolado usando Ciclo 159 (software do equipamento) de acordo com as instruções do fabricante.

Como alternativa, 5 ml de micélio foram colocados em um tubo de 17 mm x 100 mm, as células foram concentradas por centrifugação a 3000 rpm durante 5 min e o sobrenadante removido. As células foram res- suspensas em 1 ml de tampão TSE, concentradas por centrifugação a 3000 rpm durante 5 min, e o sobrenadante removido. As células foram ressus- pensas em 1 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima e incubadas a 37°C com agitação durante 30-60 minutos. Após incubação, adicionou-se 0,5 ml de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 10% e as células foram incubadas a 37°C até a lise ser completa. O lisato foi incubado a 65°C durante 10 min, arrefecido até a temperatura ambiente, dividido por dois tubos Eppendorf de 1,5 ml, e extraído 1X com 0,5 ml de fenol/clorofórmio (50% de fenol previa- mente equilibrado com Tris 0,5M, pH 8,0; 50% de clorofórmio). A fase aquo- sa foi removida e extraída 2 a 5X com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). O DNA foi precipitado pela adição de 1/10 do volume de acetato de sódio 3M, pH 4,8, incubação da mistura em gelo durante 10 min, centrifugação da mistura a 15000 rpm a 5°C durante 10 min e remoção do sobrenadante para um tubo limpo ao qual se adicionou 1 volume de isopropanol. O sobrena- dante mais a mistura de isopropanol foram então incubados em gelo du- rante 20 min, centrifugados a 15 000 rpm durante 20 min a 5°C, o sobrena- dante removido, e o sedimento de DNA lavado 1X com etanol a 70%. Após seco o pélete, o DNA foi ressuspenso em tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). 7.1.3. Isolamento de DNA de plasmídeo a partir de Streptomvces Uma alíquota (1,0 ml) de micélio foi colocada em tubos de mi- crocentrífuga de 1,5 ml e as células concentradas por centrifugação a 12 000 xg durante 60 seg. O sobrenadante foi rejeitado, as células foram res- suspensas em 0,25 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima e in- cubadas a 37°C durante 20 min com agitação e aplicadas em um sistema de isolamento automático de ácidos nucleicos AutoGen 540®. O DNA de plas- mídeo foi isolado usando o Ciclo 106) (software do equipamento) de acordo com as instruções do fabricante.

Como alternativa, 1,5 ml de micélio foi colocado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e as células concentradas por centrifugação a 12 000 x g durante 60. O sobrenadante foi rejeitado, as células foram ressus- pensas em 1,0 ml de sacarose a 10,3% e concentradas por centrifugação a 12 000 x g durante 60 e o sobrenadante rejeitado. As células foram ressus- pensas em 0,5 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima e incuba- das a 37°C durante 15-30 min. Após incubação, adicionou-se 0,25 ml de SDS alcalino (NaOH 0,3N, 2% SDS) e as células foram incubadas a 55°C durante 15-30 min ou até a solução ficar límpida. Adicionou-se acetato de sódio (0,1 ml, 3M, pH 4,8) à solução de DNA, o qual foi então incubado em gelo durante 10 min. As amostras de DNA foram centrifugadas a 14 000 rpm durante 10 min a 5°C. O sobrenadante foi removido para um tubo limpo e adicionou-se 0,2 ml de fenokclorofórmio (50% fenol:50% clorofórmio) e misturou-se suavemente. A solução de DNA foi centrifugada a 14 000 rpm durante 10 min a 5°C e a fase superior removida para um tubo Eppendorf limpo. Adicionou-se isopropanol (0,75ml) e a solução foi misturada suave- mente e depois incubada à temperatura ambiente durante 20 min. A solução de DNA foi centrifugada a 14 000 rpm durante 15 min a 5°C, o sobrenadante foi removido e o pélete de DNA foi lavado com etanol a 70%, seco e ressus- penso em tampão TE. 7.1.4. Isolamento de DNA de plasmídeo a partir de E. coli Uma única colônia isolada de E. coli foi inoculada em 5 ml de meio de Luria-Bertani (LB) (Bacto-Tryptone-10 g; Bacto-yeast extract - 5; e NaCI -10 g em 1 litro de dh^O, pH 7,0, autoclavado a 121°C durante 25 min e suplementado com 100 pg/ml de ampicilina). A cultura foi incubada du- rante a noite e colocada uma alíquota de 1 ml em um tubo de microcentrífu- ga de 1,5 ml. As amostras de cultura foram aplicadas no sistema de isola- mento automático de ácidos nucleicos AutoGen 540® e o DNA de plasmídeo foi isolado usando o Ciclo 3 (software do equipamento) de acordo com as instruções do fabricante. 7.1.5. Preparação e transformação de protoplastos de S. avermitilis Colônias isoladas de S. avermitilis foram isoladas em meio YPD força 1/2. Os micélios foram usados para inocular 10 ml de meio TBS em um tubo de 25 mm x 150 mm, o qual foi então incubado com agitação (300 rpm) a 28°C durante 48 horas. Um ml de micélio foi usado para inocular 50 ml de meio YEME. O meio YEME contém por litro: Difco Yeast Extract - 3g; Difco Bacto-Peptone - 5g; Difco Malt Extract - 3g; Sacarose - 300 g. Após autocla- vagem a 1212 durante 25 min, adicionou-se o seguinte: MgCl2-6H20 2,5 M (autoclavado separadamente a 12°C durante 25 min) - 2 ml; e glicina (20%) (esterilizado por filtração) - 25 ml.

Os micélios cresceram a 30°C durante 48-72 horas e foram co- lhidos por centrifugação em um tubo de centrífuga de 50 ml (Falcon) a 3 000 rpm durante 20 min. O sobrenadante foi rejeitado e os micélios ressuspen- sos em tampão P, o qual contém: sacarose - 205 g; K2SO4 - 0,25 g;

MgCI2.2H20 (3,68%) -100 ml; e Tampão MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml. (A solução de micronutrientes contém por litro: ZnCl2 - 40 mg; FeCl3-6HO - 200 mg; CuCÍ2-2H20 -10 mg; MnCl2-4H20 -10 mg; 1^26407. IOH2O - 10 mg; (ΝΗ4)6Μθ7θ24·4Η2θ -10 mg). O pH foi ajustado a 6,5, 0 volume final foi ajustado a 1 litro e 0 meio foi filtrado quente através de um filtro de 0,45 mícron.

Os micélios foram peletizados a 3 000 rpm durante 20 min, 0 sobrenadante foi rejeitado, e os micélios foram ressuspensos em 20 ml de tampão P contendo 2 mg/ml de lisozima. Os micélios foram incubados a 35°C durante 15 min com agitação e testados ao microscópio para determi- nar 0 grau de formação de protoplastos. Quando a formação de protoplastos estava completa, os protoplastos foram centrifugados a 8 000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi removido e os protoplastos foram ressuspensos em 10 ml de tampãp P. Os protoplastos foram centrifugados a 8 000 rpm durante 10 min, 0 sobrenadante foi removido, os protoplastos foram ressus- pensos em 2 ml de tampão P e aproximadamente 1x10® protoplastos foram distribuídos por ampolas criogénicas de 2,0 ml (Nalgene).

Uma ampola contendo 1x10® protoplastos foi centrifugada a 8 000 rpm durante 10 min, 0 sobrenadante foi removido e os protoplastos fo- ram ressuspensos em 0,1 ml de tampão P. Dois a 5 μg de DNA transfor- mante foram adicionados aos protoplastos, imediatamente seguido da adi- ção de 0,5 ml do tampão de trabalho T. O tampão T base contém: PEG- 1000 (Sigma)- 25 g; sacarose - 2,5 g; H2O - 83 ml. O pH foi ajustado a 8,8 com NaOH 1N (esterilizado por filtração) e 0 tampão T base foi esterilizado por filtração e guardado a 4°C. o tampão T de trabalho, feito no dia em que é usado, foi tampão T base - 8,3 ml; K2PO4 (4 mM) - 1,0 ml; CaCÍ2.2H20 (5M) - 0,2 ml; e TES (1M, pH 8) - 0,5 ml. Cada um dos componentes do tampão T de trabalho foi esterilizado individualmente por filtração.

Dentro de 20 após a adição do tampão T aos protoplastos, adi- cionou-se também 1,0 ml de tampão P e os protoplastos foram centrifuga- dos a 8 000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi rejeitado e os proto- plastos foram ressuspensos em 0,1 ml de tampão P. Os protoplastos foram então semeados em meio RM14, 0 qual contém: sacarose - 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCl2.6H20 -10,12 g; glicose -10g; Difco Casamino Acids - 0,1 g;

Difco Yeast Extract - 5g; Difco Oatmeal Ágar - 3g; Difco Bacto Ágar - 22g; dH20 - 800 ml. A solução foi autoclavada a 121 °C durante 25 min. Após autoclavagem, adiconaram-se as soluções estéreis seguintes: K2PO4 (0,5%) - 10 ml; CaCl2.2H20 (5M) - 5ml; L-prolina (20%) - 15 ml; tampão MES (1,0 M, pH 6,5) -10 ml; solução de micronutrientes (igual à descrita acima) - 2ml; ciclo-heximida (25 mg/ml) - 40 ml; e NaOH 1N - 2 ml. Distribuí- ram-se vinte e cinco ml de meio RM14 por placa e as placas foram secas durante 24 horas antes de serem usadas.

Os protoplastos foram incubados em 95% de umidade a 30°C durante 20-24 horas. Para selecionar os transformantes resistentes à tios- treptona, espalhou-se 1 ml de tampão de cobertura contendo 125 pg por ml de tiostreptona sobre as placas de regeneração de RM14. O tampão de co- bertura contém por 100 ml: sacarose - 10,3 g; solução de micronutrientes (igual à referida acima) - 0,2 ml; e MES (1M, pH 6,5) -1 ml. Os protoplastos foram incubados em 95% de umidade a 30°C durante 7-14 dias até serem visíveis as colônias resistentes à tiostreptona (Thior). 7.1.6. Transformação de protoplastos de Streptomvces lividans S. lividans TK64 (fornecido pelo John Innes Institute, Norwich, U.K.) foi usado em alguns casos para transformações. Os métodos e com- posições para crescimento, formação de protoplastos e transformação de S. lividans estão descritos em Hopwood et ai., 1985, Genetic Manipulation of Streptomvces. A Laboratorv Manual. John Innes Foundation, Norwich, U.K. e realizados como descrito aqui, O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes de S. lividans como descrito na Seção 7.1.3. atrás. 7.1.7. Análise da fermentação de cepas de S. avermitilis Os micélios de S. avermitilis crescidos em YPD-6 força 1/2, du- rante 4-7 dias, foram inoculados em tubos de 2,54 x 15,24 cm (1 x 6 pole- gadas) contendo 8 ml de meio pré-formado e duas esferas de vidro de 5 mm. O meio pré-formado contém: amido solúvel (amido fino fervido ou KO- SO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/l; Pharmamedia -15 g/l; arda- mine pH - 5 g/l (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaC03 - 2 g/l; bcfa 2x ("bcfa" refere-se a ácidos graxos de cadeia ramificada) contendo uma concentração final no meio de 50 ppm de ácido 2-(+/-)-metilbutírico, 60 ppm de ácido iso- butírico, e 20 ppm de ácido isovalérico. O pH foi ajustado a 7,2 e o meio autoclavado a 121°C durante 25 min. O tubo foi agitado em um ângulo de 17°C a 215 rpm, a 29°C, durante 3 dias. Uma alíquota de 2 ml da cultura para semear foi usada para inocular um frasco Erlenmeyer de 300 ml contendo 25 ml de meio de produ- ção que contém: amido (amido fino fervido ou KOSO) -160 g/l; Nutrísoy (Ar- cher Daniels Midland, Decatur, IL) - 10g/l; Ardamine pH - 10g/l; K2HPO4 - 2 g/l; MgS04.4H20 - 2 g/l; FeS04.7H20 - 0,02 g/l; MnCI2 - 0,002 g/l;

ZnS04.7H20 - 0,002 g/l; CaC03 -14 g/l; bcfa 2x (como acima); e ácido ci- clo-hexanocarboxílico (CHC) (solução a 20% a pH 7,0) - 800 ppm. O pH foi ajustado a 6,9 e 0 meio foi autoclavado a 121°C durante 25 min.

Após inoculação, 0 frasco foi incubado a 29°C durante 12 dias com agitação a 200 rpm. Após incubação, uma amostra de 2 ml foi retirada do frasco, diluída com 8 ml de metanol, misturada e a mistura foi centrifuga- da a 1 250 x g durante 10 min para sedimentar os péletes. O sobrenadante foi então testado por HPLC usando uma coluna ODS Beckman Ultrasphere (25 cm x 4,6 mm Dl) com uma taxa de fluxo de 0,75 ml/min e detecção da absorbância a 240 nm. A fase móvel foi 86/8,9/5,1 metanol/água/acetonitrila. 7.1.8. Isolamento de genes PKS de S. avermitilis Preparou-se uma biblioteca de DNA cromossômico de S. aver- mitilis (ATCC 31272, SC-2) em cosmídeo e hibridizou-se com uma sonda de ceto-sintase (KS) feita a partir de um fragmento do gene sintase de polique- tídeos (PKS) de Saccharopolyspora erythraea. Uma descrição detalhada da preparação das bibliotecas em cosmídeo pode ser encontrada em Sambro- ok et ai, 1989, acima. Uma descrição detalhada da preparação de bibliote- cas de DNA cromossômica de Streptomyces está apresentada em Hopwood et a/., 1985, acima. Clones de cosmídeo, contendo regiões que hibridizam com a ceto-sintase, foram identificados por hibridização com um fragmento A/cíel/Eco47lll de 2,7 Kb derivado de pEX26 (gentilmente cedido pelo Dr. P.

Leadlay, Cambridge, UK). Aproximadamente 5 ng de pEX26 foram digeridos usando NdeI e Eco47lll. A mistura de reação foi aplicada em um gel de 0,8% de agarose GTG SeaPlaque (FMC BioProducts, Rockland, ΜΕ). O fragmento A/del/Eco47lll de 2,7 kb foi removido do gel após eletroforese e o DNA recuperado do gel usando GELase® da Epicentre Technologies usan- do o Fast Protocol. O fragmento Ndel/Eco47lll de 2,7 Kb foi marcado com [a -32p]dCTP (desoxicitidina 5'-trifosfato, sal de tetra(trietilamônio), [alfa-32P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) usando o BRL Nick Translation System (BRL

Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) seguindo as instruções do forne- cedor. Uma reação típica foi realizada em um volume de 0,05 ml. Após adi- ção de 5 μΙ de tampão Stop, o DNA marcado foi separado dos nucleotídeos não incorporados usando uma coluna de Sephadex Quick Spin® (Boehringer Mannheim) seguindo as instruções do fornecedor.

Foram despistados aproximadamente 1800 cosmídeos por hi- bridização de colônias. Identificaram-se dez clones que hibridizam forte- mente com a sonda KS de Sacc. erythraea. As colônias de E. coli contendo DNA de cosmídeo foram crescidas em meio líquido LB e o DNA de cosmí- deo foi isolado a partir de cada uma das culturas em um instrumento de isolamento automático de ácidos nucléicos AutoGen 540® usando o Ciclo 3 (software do equipamento) de acordo com as instruções do fabricante. O mapeamento por endonucleases de restrição e a análise por hibridização de Southern blot revelou que cinco dos clones continham regiões cromossômi- cas sobrepostas. Um mapa de restrição BamH do DNA genômico de S. avermitilis dos cinco cosmídeos (isto é, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) foi construído por análise de cosmídeos sobrepostos e hibridações (FIGURA 4). 7.1.9. Identificação do DNA que modula as proporções de avermectinas B2:B1 e identificação de uma ORF aveC

Os métodos que se seguem foram usados para testar os frag- mentos subclonados, derivados do clone de cosmídeo pSE66, quanto a sua capacidade para modular as proporções de avermectinas B2:B1 em mutan- tes AveC. pSE66 (5 pg) foi digerido com Saci e SamHI. A mistura de reação foi aplicada em um gel de 0,8% de agarose GTG SeaPlaque® (FMC BioPro- ducts), um fragmento Sac\IBamH\ de 2,9 Kb foi removido do gel após ele- troforese e o DNA foi recuperado do gel usando GELase® (Epicentre Te- chnologies) usando o Fast Protocol. Aproximadamente 5 pg do vetor vaivém pWHM3 (Vara et aí., 1989, J. Bacteriol. 171:5872-5881) foi digerido com Saci e BamHI. Cerca de 0,5 pg do inserto de 2,9 Kb e 0,5 pg de pWHM3 digerido foram misturados juntos e incubados durante a noite com 1 unidade de ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), a 15°C em um volume total de 20 pl, de acordo com as instruções do fornecedor. Após incubação, 5 pl da mistura de ligação foram incubados a 70°C durante 10 min, arrefeci- dos até a temperatura ambiente e usados para transformar células compe- tentes E. coli DH5a (BRL) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampi- cilina e a presença do inserto Sacl/BamHI de 2,9 Kb foi confirmada por aná- lise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE119.

Os protoplastos de S. avermitilis cepa 1100-SC38 (cepa caseira da Pfizer) foram preparados e transformados com pSE119 como descrito na Seção 7.1.5 acima. A cepa 1100-SC38 é um mutante que produz significati- vamente mais da forma ciclo-hexil-B2 de avermectina comparado com a forma ciclo-hexil-B1 de avermectina quando suplementado com ácido ciclo- hexanocarboxílico (B2:B1 de cerca de 30:1). pSE119 usado para transfor- mar protoplastos de S. avermitilis foi isolado a partir de E. coli cepa GM2163 (obtido pelo Dr. B. Bachmann, Curator, £ coli Genetic Stock Center, Yale University), E. coli cepa DM1 (BRL), ou S. lividans cepa TK64. Os transfor- mantes resistentes à tiostreptona da cepa 1100-SC38 foram isolados e ana- lisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação. Os transfor- mantes de S. avermitilis cepa 1100-SC38 contendo pSE119 produziram uma proporção alterada de avermectinas ciclo-hexil-B2:ciclo-hexil-B1 de cerca de 3,7:1 (Tabela 2).

Tendo estabelecido que pSE119 é capaz de modular as propor- ções de avermectinas B2:B1 em um mutante AveC, o DNA do inserto foi seqüenciado. Aproximadamente 10 pg de pSE119 foram isolados usando um estojo para isolamento de DNA de plasmídeo (Qiagen, Valencia, CA) seguindo as instruções do fabricante e seqüenciados usando um Seqüenci- ador de DNA Automático ABI 373A (Perkin Elmer, Foster City, CA). As se- qüências foram obtidas e editadas usando os programas do Genetic Com- puter Group (GCG, Madison, Wl). A sequência de DNA e a ORF aveC estão apresentadas na FIGURA 1 (SEQID NO:1).

Um novo plasmídeo, designado pSE118, foi construído como se segue. Aproximadamente 5 pg de pSE66 foram digeridos com Sph\ e Ba- mHI. A mistura de reação foi aplicada em um gel de 0,08% de agarose GTG

SeaPlaque (FMC BioProducts), um fragmento Sph\IBamH\ de 2,8 Kb foi re- movido do gel após eletroforese e o DNA foi recuperado do gel usando GE- Lase® (Epicentre Technologies) usando o Fast Protocol. Aproximadamente 5 pg do vetor vaivém pWHM3 foram digeridos com Sph\ e fíamHI. Cerca de 0,5 pg do inserto de 2,8 Kb e 0,5 pg de pWHM3 digerido foram misturados e incubados durante a noite com 1 unidade de ligase (New England Biolabs) a 15°C em um volume total de 20 pl de acordo com as instruções do fornece- dor. Após incubação, 5 pl da mistura de ligação foram incubados a 70°C durante 10 min, arrefecidos até a temperatura ambiente, e usados para transformar células competentes E coli DH5a de acordo com as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir dos transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto Sph\IBamH\ de 2,8 Kb foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE118. O DNA do inserlo de pSE118 e de pSE119 sobrepõe-se em cerca de 838 nucleotídeos (FIGURA 4).

Os protoplastos de S. avermitilis cepa 1100-SC38 foram trans- formados com pSE118 como acima. Os transformantes resistentes à tios- treptona da cepa 1100-SC38 foram isolados e analisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação. Os transformantes de S. avermitilis cepa 1100-SC38 contendo pSE118 não foram alterados nas proporções de avermectina ciclo-hexil-B2: avermectina ciclo-hexil-B1 comparados com a cepa 1100-SC38 (Tabela 2). 7.1.10. Amplificação por PCR do gene aveC a partir de DNA cromossômico de S. avermitilis Um fragmento de ~1,2 Kb contendo a ORF aveC foi isolado a partir de DNA cromossômico de S. avermitilis através de amplificação por PCR usan- do iniciadores projetados com base na seqüência nucleotídica aveC obtida acima. Os iniciadores de PCR foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). O iniciador direito foi: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID

NO:6); e o iniciador esquerdo foi: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO:7). A reação de PCR foi realizada com a polimerase Deep Vent® (New England Biolabs) em tampão fornecido pelo fabricante e na presença de dNTP 300 μΜ, 10% de glicerol, 200 pmoles de cada um dos iniciadores, 0,1 pg de molde e 2,5 unidades de enzima em um volume final de 100 μΙ, usan- do o termociclador Perkin-Elmer Cetus. O perfil térmico do primeiro ciclo foi 95°C durante 5 minutos (etapa de desnaturação), 60°C durante 2 min (etapa de emparelhamento) e 72°C durante 2 min (etapa de extensão). Os 24 ci- clos subsequentes tinham um perfil térmico semelhante exceto que a etapa de desnaturação foi encurtada para 45 seg e a etapa de emparelhamento foi encurtada para 1 minuto. O produto de PCR foi sujeito à eletroforese em um gel de 0,1% de agarose e foi detectada uma única banda de DNA de ~1,2 Kb. Este DNA foi purificado do gel e ligado com 25 ng de vetor de extremos cerses pCR- Blunt (Invitrogen) em uma proporção molar vetor-inserto de 1:10 seguindo as instruções do fabricante. A mistura de ligação foi usada para transformar células E coli One Shot® Competent (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir dos transformantes re- sistentes à ampicilina e a presença do inserto de ~1,2 Kb foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE179. O DNA do inserto de pSE179 foi isolado por digestão com Ba- mHI/Xóal, separado por eletroforese, purificado do gel e ligado com o vetor vaivém pWHM3, o qual tinha sido digerido com BamH\IXba\, em uma con- centração de DNA total de 1 μg em uma proporção molar de vetor:inserto de 1:5. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes £ coli DH5a de acordo com as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir dos transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto de -1,2 Kb foi confirmada por análise de restrição. Este plasmí- deo, que foi designado como pSE186 (FIGURA 2, ATCC 209604), foi transformado em E. coli DM1 e o DNA de plasmídeo foi isolado a partir dos transformantes resistentes à ampicilina. 7.2. Resultados Identificou-se um fragmento Sacl/BamHI de 2,9 Kb de pSE119 que, quando usado para transformar S. avermitilis cepa 1100-SC38, alterou significativamente a proporção da produção de avermectinas B2:B1. S. avermitilis cepa 1100-SC38 normalmente tem uma proporção B2:B1 de cer- ca de 30:1, mas quando transformada com um vetor compreendendo o fragmento Sacl/BamHI de 2,9 Kb, a proporção de avermectinas B2:B1decresceu para cerca de 3,7:1. As análises de pós-fermentação das culturas transformantes confirmaram a presença do DNA transformante. O fragmento de 2,9 Kb pSE119 foi seqüenciado e uma ORF de -0,9 Kb foi identificada (FIGURA 1) (SEQ ID NO:1), a qual engloba um fragmento Pst\ISph\ que tinha sido previamente mutageneizado em alguns ligares para produzir produtos B2 apenas (Ikeda et ai, 1995, atrás). Uma comparação desta ORF, ou do correspondente polipeptídeo deduzido, con- tra bases de dados conhecidas (GenEMBL, SWISS-PROT) não apresentou qualquer homologia forte com seqüências de DNA ou proteína conhecidas. A tabela 2 apresenta a análise de fermentação de S. avermitilis cepa 1100-SC38 transformada com vários plasmídeos.

Tabela 2 8. Exemplo: Construção de Mutantes AveC de $. Avermitilis Este Exemplo descreve a construção de vários mutantes dife- rentes de AveC de S. avermitilis usando as composições e métodos aqui descritos. Uma descrição geral das técnicas para a introdução de mutações em um gene em Streptomyces está descrita por Kieser e Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204:430-458. Uma descrição mais detalhada é fornecida por Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI (2):226-233 e por Stutzman-Engwall et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1):144-154. Estas referências são aqui incluídas como referência na sua totalidade. 8.1. Inativacão do aene aveC de S. avermitilis Os mutantes aveC contendo genes aveC inativados foram construídos usando vários métodos, conforme descrito abaixo.

No primeiro método, um fragmento interno Sph\IPst\ de 640 pb do gene aveC em pSE119 (plasmídeo descrito na Seção 7.1.9., acima) foi substituído com o gene ermE (para resistência à eritromicina) de Sacc. erythraea. O gene ermE foi isolado a partir de plJ4026 (cedido pelo John Innes Institute, Norwich, U.K.; ver também Bibb et al., 1985, Gene 41:357- 368) por digestão com as enzimas de restrição BglW e EcoRI, seguido de eletroforese e purificação a partir do gel. Este fragmento de ~1,7Kb foi liga- do a pGEM7Zf (Promega) que foi digerido com SamHI e EcoRI, e a mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5a se- guindo as instruções do fabricante. Isolou-se DNA de plasmídeo a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto de ~1,7 Kb foi confirmado por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado pSE27. pSE18 (descrito na Seção 7.1.9, acima) foi digerido com Sph\ e BamH\, o produto da digestão foi sujeito a eletroforese e o inserto Sph\/BamH\ de ~2,8 Kb foi purificado a partir do gel. pSE119 foi digerido com Psfl e EcoRI, o produto da digestão foi sujeito a eletroforese e o inserto PsülEcoR\ de ~1,5 Kb foi purificado a partir do gel. O vetor vaivém pWHM3 foi digerido com SamHI e EcoRI. pSE27 foi digerido com Psfl e Sph\, o pro- duto da digestão foi sujeito a eletroforese e o inserto Pst\ISph\ de ~1,7 Kb foi purificado a partir do gel. Os quatro fragmentos (isto é, ~2,8 Kb, ~1,5 Kb, —7,2 Kb, —1,7 Kb) foram ligados em uma ligação paralela. A mistura de liga- ção foi usada para transformar células competentes E. coli DH5a seguindo as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado pSE180 (FIGURA 3, ATCC209605). pSE18 foi usado para transformar S. lividans TK64 e as colônias transformadas foram identificadas por resistência à tiostreptona e eritromici- na. pSE180 foi isolado a partir de S. lividans e usado para transformar pro- toplastos de S. avermitilis. Quatro transformantes de S. avermitilis resisten- tes à tiostreptona foram identificados e os protoplastos foram preparados e semeados em condições não seletivas em meio RM14. Após regeneração dos protoplastos, colônias isoladas foram despistadas quanto à presença da resistência à eritromicina e a ausência de resistência à tiostreptona, indi- cando integração cromossômica do gene aveC inativado e perda do repli- con livre. Identificou-se um transformante Ermr Thios e designou-se cepa SE180-11. DNA cromossómico total foi isolado a partir da cepa SE180-11, digerido com as enzimas de restrição BamHl, Hind\\\, Psfl ou Sph\, separado por eletroforese em gel de 0,8% de agarose, transferido para membranas de náilon e hibridizado com a sonda ermE. Estas análises mostraram que a integração cromossômica do gene de resistência a ermE e a concomitante deleção do fragmento Pst\/Sph\ de 640 pb ocorreu através de uma recombi- nação dupla. A análise por HPLC dos produtos de fermentação da cepa SE180-11 mostrou que as avermectinas normais deixaram de ser produzi- das (FIGURA 5A).

Em um segundo método para inativação do gene aveC, o gene ermE de 1,7 Kb foi removido do cromossoma de S. avermitilis cepa SE 180- 11, deixando uma deleção Pst\/Sph\ de 640 pb no gene aveC. Construiu-se um plasmídeo de substituição de gene como se segue: pSE180 foi parcial- mente digerido com Xba\ e um fragmento de ~11,4 Kb foi purificado a partir de um gel. A banda de ~11,4 Kb não possui o gene de resistência ermE de 1,7 Kb. O DNA foi então ligado e usado para transformar células E. coli DH5 α. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo, que foi designado como pSE184, foi usado para transformar E. coli DM11 e o DNA de plasmídeo isolado a partir dos trans- formantes resistentes à ampicilina. Este plasmídeo foi usado para transfor- mar protoplastos de S. avermitilis cepa SE180-11. Os protoplastos foram preparados a partir de transformantes resistentes à tiostreptona da cepa SE180-11e foram semeados como colônias isoladas em RM14. Após os protoplastos terem regenerado, as colônias isoladas foram testadas quanto à ausência de resistência à eritromicina e resistência à tiostreptona, indi- cando integração cromossômica do gene aveC inativado e perda do repli- con livre contendo o gene ermE. Um transformante Erms Thios foi identifi- cado e designado SE184-1-13. A análise de fermentação de SE184-1-3 mostrou que as avermectinas normais não eram produzidas e que SE184-1- 13 tinha o mesmo perfil de fermentação de SE180-11. O terceiro método para inativação do gene aveC, um quadro de leitura foi introduzido no gene aveC cromossómico através da adição de dois Gs a seguir à posição C, nucleotídeo na posição 47, usando PCR, cri- ando assim um sítio SspE1. A presença do sítio BspE1 introduzido foi útil na detecção da substituição de genes. Os iniciadores de PCR foram projetados para introduzir um quadro de leitura no gene aveC e foram adquiridos à Ge- nosys Biotechnologies, Inc. O iniciador da direita foi: 5’GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3’ (SEQ ID N0:8) e o iniciador da esquer- da foi; 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO:9). As condições de PCR foram as descritas na Seção 7.1.10 acima. O produto de PCR de 666 pb foi digerido com Sph\ para dar dois fragmentos de 278 pb e 388 pb, respectivamente. O fragmento de 388 pb foi purificado a partir do gel. O plasmídeo de substituição de genes foi construído como se segue: o vetor vaivém pWHM3 foi digerido com EcoRI e BamH\. pSE119 foi digerido com BamH\ e Sph\, o produto da digestão foi sujeito a eletroforese e um fragmento de -840 pb foi purificado do gel. pSE119 foi digerido com EcoRI e Xmnl, o produto da digestão foi resolvido por eletroforese e foi puri- ficado um fragmento de -1,7 Kb a partir do gel. Os quatro fragmentos (isto é -7,2 Kb, -840 pb, -1,7 Kb e 388 pb) foram ligados em uma ligação paralela. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes em E. coli DH5a. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes re- sistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição e análise da seqüência de DNA. Este plasmídeo, que foi designado como pSE185, foi usado para transformar E. coli DM1 e o DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina.

Este plasmídeo foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa 1100-SC38. Os transformantes resistentes à tiostreptona da cepa 1100-SC38 foram isolados e analisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação. pSE185 não alterou significativamente as proporções de avermectinas B2:B1 quando usado para transformar S. avermitilis cepa 1100-SC38 (Tabela 2). pSE185 foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis para gerar um quadro de leitura no gene cromossómico aveC. Os protoplastos foram preparados a partir de transformantes resistentes à tiosptreptona e se- meados como colônias isoladas em RM14. Após os protoplastos serem regene- rados, as colônias isoladas foram despistadas quanto à ausência de resistência à tiostreptona. DNA cromossómico de colônias sensíveis à tiostreptona foi iso- lado e despistado por PCR quanto à presença do quadro de leitura integrado no cromossoma. Os iniciadores de PCR foram projetados com base na seqüên- cia nucleotídica aveC e foram fornecidos pela Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). O iniciador de PCR da direita foi:5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO:10) e o iniciador de PCR da esquerda foi: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO:11) e as condições de PCR foram as descritas na Seção 7.1.10 acima. O produto de PCR obtido foi de 543 pb e, quando da digestão com 6spE1, observaram-se 3 fragmentos de 368 pb, 96 pb e 79 pb, indicando a integração cromossômica do gene aveC inativado e a perda do replicon livre. A análise da fermentação dos mutantes de S. avermitilis conten- do o quadro de leitura no gene aveC mostrou que as avermectinas normais deixaram de ser produzidas e que estes mutantes tinham o mesmo perfil por HPLC da fermentação que as cepas SE180-11 e SE184-1-13. Um transfor- mante Thios foi identificado e designado cepa SE185-5a.

Ainda, foi produzida uma mutação no gene aveC que altera o nt na posição 520 de G para A, a qual resulta na alteração do códon codifica- dor de um triptofano (W) na posição 116 para um códon de terminação.

Uma cepa de S. avermitilis com esta mutação não produziu avermectinas normais e tinha o mesmo perfil de fermentação das cepas SE180-11, SE184-1-3 e SE185-5a.

Ainda, foram ainda produzidas mutações no gene aveC que al- teram: (i) o nt na posição 970 de G para A, a qual altera o aminoácido na posição 266 de uma glicina (G) para um aspartato (D), e (ii) o nt na posição 996 de T para C, a qual altera o aminoácido na posição 275 de tirosina (Y) para histidina (H). Uma cepa de S. avermitilis com estas mutações (G256D/ Y275H) não produziu avermectinas normais e tinha o mesmo perfil de fer- mentação das cepas SE180-11, SE184-1-13 e SE185-5a.

As cepas de S. avermitilis mutantes por inativação do gene aveC, SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a, e outras, proporcionam ferra- mentas de despiste para avaliação do impacto de outras mutações no gene aveC. pSE186, a qual contém uma cópia tipo selvagem do gene aveC, foi usada para transformar E. coli DM1 e o DNA de plasmídeo foi isolado a par- tir de transformantes resistentes à ampicilina. Este DNA de pSE186 foi usa- do para transformar protoplastos de S. avermitiiis cepa SE180-11. Os transformantes resistentes à tiostreptona da cepa SE180-11 foram isolados, a presença de resistência à eritromicina foi determinada e os transformantes Thior Ermr foram analisados por análise de HPLC dos produtos de fermen- tação. A presença do gene aveC funcional in trans foi capaz de restaurar a produção normal de avermectinas na cepa SE180-11 (FIGURA 5B). 8.2. Análise de mutações no gene aveC que altera as proporções de clas- ses B2:B1 Tal como descrito acima, S. avermitiiis cepa SE180-11 contendo um gene aveC inativo foi complementada por transformação com um plas- mfdeo contendo um gene aveC funcional (pSE186). A cepa SE180-11 foi também utilizada como uma cepa hospedeira para caracterizar outras muta- ções no gene aveC, como descrito abaixo.

Isolou-se DNA cromossómico a partir da cepa 1100-SC38 e usou-se como molde para a amplificação por PCR do gene aveC. A ORF de 1,2 Kb foi isolada por amplificação por PCR usando iniciadores projetados com base na seqüência de nucleotideos aveC. O iniciador direito foi SEQID NO:6 e o iniciador esquerdo foi SEQ ID NO:7 (ver Seção 7.1.10, acima) As condições de PCR e de subclonagem foram as descritas na Seção 7.1.10. A análise da seqüência de DNA da ORF 1,2 Kb mostra uma mutação no gene aveC que altera o nt na posição 337 de C para T, o que altera o aminoácido na posição 55 de serina (S) para fenilalanina (F). O gene aveC contendo a mutação S55F foi subclonado em pWHM3 para produzir um plasmídeo que foi designado como pSE187, e que foi usado para transformar protoplastos de S. avermitiiis cepa SE180-11. Os transformantes resistentes à tiostrepto- na da cepa SE180-11 foram isolados, determinada a presença de resistên- cia à eritromicina e os transformantes Thior Ermr foram analisados por HPLC relativamente aos produtos de fermentação. A presença do gene aveC codificador de uma alteração do resíduo de aminoácido 55 (S55F) foi capaz de restaurar a produção normal de avermectina à cepa SE180-11 (Fig. 5C); no entanto, a proporção de ciclo-hexilB2:ciclo-hexilB1 foi de cerca de 26:1, comparado com a cepa SE180-11 transformada com pSE186, que tinha uma proporção de B2:B1 de aproximadamente 1,6:1 (tabela 3), indi- cando que a mutação (S55F) por si só modula a quantidade de ciclo-hexil- B2 produzida relativamente a ciclo-hexil-B1.

Foi identificada uma outra mutação no gene aveC que altera o nt na posição 862 de G para A, a qual muda o aminoácido na posição 230 de glicina (G) para aspartato (D). Uma cepa de S. avermitilis tendo esta mutação (G230D) produz avermectinas em uma proporção de B2:B1 de cer- ca de 30:1. 8.3. Mutações que reduzem a proporção B2:B1 Construíram-se várias mutações que reduzem a quantidade de ciclo-hexil-B2 relativamente a ciclo-hexil-B1, como se segue: Identificou-se uma mutação no gene aveC que altera o nt da posição 588 de G para A, o que muda o aminoácido na posição 139 de ala- nina (A) para treonina (T). O gene aveC contendo a mutação A139T foi sub- clonado em pWHM3 para produzir um plasmídeo que foi designado pSE188, e que foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa SE180-11. Os transformantes resistentes à tiostreptona da cepa SE180-11 foram isolados, a presença de resistência à eritromicina foi de- terminada e os transformantes Thior Ermr foram analisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação. A presença do gene aveC mutagenei- zado codificador de uma alteração do resíduo de aminoácido 139 (A139T) foi capaz de restaurar a produção de avermectinas na cepa SE180-11 (FI- GURA 5D); no entanto, a proporção B2:B1 foi de aproximadamente 0,94:1, indicando que esta mutação reduz a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzido relativamente a ciclo-hexil-B1. Este resultado foi inesperado porque resulta- dos publicados, assim como os resultados das mutações descritos acima, demonstraram apenas a inativação do gene aveC ou o aumento da produ- ção da forma B2 de avermectina relativamente à forma B1 (Tabela 3).

Devido à mutação A139T ter alterado as proporções B2:B1 na direção B1 mais favorável, construiu-se uma mutação que codificava uma treonina em vez de uma serina no aminoácido da posição 138. Assim, pSE 189 foi digerido com EcoRI e clonado em pGEM3Zf (Promega) que tinha sido digerido com EcoRI. Este plasmídeo, o qual foi designado como pSE186a, foi digerido com Apa\ e Kpn\, os fragmentos de DNA foram sepa- rados em um gel de agarose, e dois fragmentos de -3,8 Kb e -0,4 Kb foram purificados do gel. O DNA do inserto de -1,2 Kb de pSE186 foi usado como molde de PCR para introduzir uma alteração de uma só base no nt da posi- ção 585. Os iniciadores de PCR foram projetados para introduzir uma muta- ção na posição do nt 585, e foram fornecidos pela Genosys Biotechnologi- es, Inc. (Texas). O iniciador de PCR direito foi: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO:12); e o iniciador de PCR esquerdo foi: 5'- GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO:13). A reação de PCR foi realizada usando um estojo para PCR genômico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Paio Alto, CA) em tampão fornecido pelo fabricante na pre- sença de dNTPs 200 μΜ, 200 pmoles de cada iniciador, 50 ng de DNA mol- de, GC-Melt 1,0M e 1 unidade de Klen Taq Polymerase Mix em um volume final de 50 μΙ. O perfil térmico do primeiro ciclo foi 94°C durante 1 min; se- guido de 25 ciclos de 94°C durante 30 seg e 68°C durante 2 min; e 1 ciclo a 68°C durante 3 min. Um produto de PCR de 295 pb foi digerido com Apal e Kpn\ para produzir um fragmento de 254 pb, o qual foi resolvido por eletrofo- rese e purificado do gel. Os três fragmentos (-3,8 Kb, -0,4 Kb e 254 pb) fo- ram ligados em uma ligação paralela. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5a. O DNA de plasmídeo foi iso- lado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do in- serto correto foi confirmada por análise com enzimas de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE198. pSE198 foi digerido com EcoRI, clonado em pWHM3, o qual tinha sido digerido com EcoRI e usado para transformar células E. coli DH5 a. DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição e análise da seqüência de DNA. Este DNA de plasmídeo foi usado para transformar E. coli DM1, DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE199, foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa SE180-11. Os transformantes resistentes à tiostreptona da cepa SE180-11 foram isolados, a presença de resistentes à eritromicina foi determinada e os transformantes Thior Ermr foram analisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação. A presença do gene aveC mutageneizado codifi- cador de uma alteração do resíduo de aminoácido 138 (S138T) foi capaz de restaurar a produção normal de avermectinas na cepa SE180-11; no en- tanto, a proporção B2:B1 foi de 0,88:1 indicando que esta mutação reduz a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzida relativamente a ciclo-hexil-B1 (Ta- bela 3). Esta proporção B2:B1 é ainda mais baixa da proporção de 0,94:1 observada com a mutação A139T produzida pela transformação da cepa SE180-11 com pSE188, como descrito acima.

Construiu-se uma outra mutação para introduzir uma treonina nas posições de aminoácidos 138 e 139.0 inserto de DNA de -1,2 Kb do pSE186 foi usado como molde de PCR. Projetaram-se inciadores de PCR para introdu- zir mutações nas posições de nt 585 e 588 e foram fornecidos pela Genosys Biotechnologies, Inc.(Texas). O iniciador de PCR direito foi: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQID NO:14); e o iniciador de PCR esquerdo foi: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15). A reação de PCR foi realizada usando as condições descritas imediatamente acima nesta Seção.

Um produto de PCR de 449 pb foi digerido com Apa\ e Kpn\ para libertar um fragmento de 254 pb, o qual foi resolvido por eletroforese e purificado do gel. pSE186a foi digerido com ApaI e Kpn\, os fragmentos de DNA separa- dos em um gel de agarose e dois fragmentos de -3,8 Kb e -0,4 Kb foram purificados do gel. Os três fragmentos (-3,8 Kb, -0,4 Kb e 254 pb) foram ligados em uma ligação paralela e a mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5a. O DNA de plasmídeo foi iso- lado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do in- serto correto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi de- signado pSE230. pSE230 foi digerido com EcoRI, clonado em pHWM3, o qual tinha sido digerido com EcoRI e usado para transformar células E. coli DH5 α. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada pela análise de restrição e análise da seqüência de DNA. Este DNA de plasmídeo foi usado para transformar E. coli DM1, o DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição. Esta plasmídeo, o qual foi designado pSE231, foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa SE180-11. Os transformantes resistentes à tiostreptona de SE180-11 foram isolados, a presença de resistência à erítromicína foi determinada e os transformantes Thior Ermr foram analisados por fermentação. A presença do gene aveC duplamente mutageneizado, codificador de S138T/A139T, foi capaz de restaurar a produção normal de avermectinas na cepa SE180-11, no entanto, a proporção B2:B1 foi de 0,84:1 mostrando que esta mutação reduz mais a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzida relativamente a ciclo- hexil-B1 (tabela 3), relativamente às reduções proporcionadas pela trans- formação da cepa SE180-11 com pSE188 ou pSE199, como descrito acima.

Construiu-se uma outra mutação para reduzir mais a quantidade de ciclo-hexil-B2 relativamente a ciclo-hexil-B1. Devido às mutações S138T/A139T alterarem as proporções B2:B1 na direção mais favorável de B1, construiu-se uma mutação para introduzir uma treonina na posição de aminoácido 138 e uma fenilalanina na posição de aminoácido 139. O inserto de DNA de ~1,2 Kb do pSE186 foi usado como molde de PCR. Os iniciado- res de PCR foram projetados para introduzir mutações nos nt das posições 585 (mudando T para A), 588 (mudando G para T) e 589 (mudando C para T) e foram fornecidos pela Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). O inicía- dor de PCR da esquerda foi: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEQ ID NO:25); e o iniciador de PCR esquerdo foi: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15). A reação de PCR foi realizada usando um estojo de PCR genômico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Paio Alto, CA) em tampão fornecido pelo fabricante na pre- sença de dNTPs 200 μΜ, 200 pmoles de cada um dos iniciadores, 50 ng de DNA molde, acetato de Mg 1,1 mM, GC-Melt 1,0M e 1 unidade de polimera- se de DNA Tth em um volume final de 50 μΙ. O perfil térmico do primeiro ci- clo foi de 94°C durante 1 min; seguido de 25 ciclos de 94°C durante 30 seg e 68°C durante 2 min; e 1 ciclo a 68°C durante 3 min. Um produto de PCR de 449 pb foi digerido com Apa\ e Kpn\ para libertar um fragmento de 254 pb, o qual foi resolvido por eletroforese e purificado a partir do gel. Os três fragmentos (~3,8 Kb, -0,4 Kb e 254 pb) foram ligados em uma ligação pa- ralela. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5oc. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado pSE238. pSE238 foi digerido com EcoRI, clonado em pHWM3, o qual tinha sido digerido com EcoRI e usado para transformar células E. coli DH5 α. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada pela análise de restrição e análise da seqüência de DNA. Este DNA de plasmídeo foi usado para transformar E. coli DM1, o DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição. Esta plasmídeo, o qual foi designado pSE239, foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa SE180-11. Os transformantes resistentes à tiostreptona de SE180-11 foram isolados, a presença de resistentes à eritromicina foi determinada e os transformantes Thior Ermr foram analisados por análise de HPLC dos pro- dutos de fermentação. A presença do gene aveC duplamente mutageneiza- do, codificador de S138T/A139T, foi capaz de restaurar a produção normal de avermectina na cepa SE180-11, no entanto, a proporção B2:B1 foi de 0,75:1 mostrando que esta mutação reduz ainda mais a quantidade de ciclo- hexil-B2 produzida relativamente a ciclo-hexil-B1 (tabela 3), relativamente às reduções proporcionadas pela transformação da cepa SE180-11 com pSE188, pSE199 ou pSE231, como descrito acima.

Tabela 3 Outras mutações foram contruídas para reduzir mais a quanti- dade de ciclo-hexil-B2 relativamente a ciclo-hexil-B1 usando a técnica de incorporação de erros no DNA como descrito em Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; e Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9f:10747-10751; e ainda descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5605793, 5811238, 5830721 e 5837458.

Os plasmídeos alterados contendo os genes aveC mutagenei- zados foram usados para transformar células E. coli dam dem competentes.

Isolou-se DNA de plasmídeo a partir de transformantes resistentes à ampici- lina e usou-se para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa SE180- 11. Os trasnformantes resistentes à tiostreptona da estirpe SE180-11 foram isolados e testados quanto à produção de avermectinas com uma proporção de ciclo-hexil-B2:ciclo-hexil-B1 de 1:1 ou inferior. Determinou-se a sequên- cia de DNA do plasmídeo dos transformantes SE180-11 produtores de avermectinas com uma proporção de B2:B1 de 1:1 ou inferior.

Identificaram-se oito transformantes que produziram quantida- des reduzidas de ciclo-hexil-B2 relativamente a ciclo-hexil-B1. A proporção mais baixa de B2:B1 conseguida entre estes transformantes foi de 0,4:1 (Tabela 4). Isolou-se DNA de plasmídeo de cada um dos oito transformantes e determinou-se a seqüência de DNA para identificar as mutações no gene aveC. As mutações são como se segue. pSE290 contém mutações de 4 nucleotídeos no nt da posição 317 de T para A, no nt da posição 353 de C para A, no nt da posição 438 de G para A, e no nt da posição 1155 de T para A. A alteração do nucleotídeo no nt da posição 317 muda o aminoácido da posição 48 AA de D para E e a alteração do nucleotídeo no nt da posição 438 muda o aminoácido na posi- ção 89 AA de A para T. A proporção de B2:B1 produzida pelas células por- tadoras deste plasmídeo foi de 0,42:1 (Tabela 4). pSE291 contém 4 mutações de nucleotídeos no nt da posição 272 de G para A, no nt da posição 585 de T para A, no nt da posição 588 de G para A e no nt da posição 708 de G para A. A alteração de nucleotídeo na posição 585 muda o aminoácido da posição 138 AA de S para T, a mudança de nucleotídeo no nt da posição 588 muda o aminoácido da posição 139 AA de A para T e alteração de nucleotídeo no nt da posição 708 muda o amino- ácido da posição 179 AA de G para S. A proporção de B2:B1 produzida pe- las células portadoras deste plasmídeo foi de 0,57:1 (Tabela 4). pSE292 contém as mesmas quatro mutações de nucleotídeos de pSE290. A proporção B2:B1 produzida pelas células portadoras deste plasmídeo foi de 0,40:1 (Tabela 4). pSE293 contém 6 mutações de nucleotídeos no nt da posição 24 de A para G, no nt da posição 286 de A para C, no nt da posição 497 de T para C, no nt da posição 554 de C para T, no nt da posição 580 de T para C e no nt da posição 886 de A para T. A alteração do nucleotídeo no nt da posição 286 muda o aminoácido da posição 38 AA de Q para P, a mudança do nucleotídeo no nt da posição 580 muda o aminoácido da posição 136 AA de L para P e alteração do nucleotídeo no nt da posição 886 muda o amino- ácido da posição 238 AA de E para D. A proporção de B2:B1 produzida pe- las células portadoras deste plasmídeo foi de 0,68:1 (Tabela 4). pSE294 contém 6 mutações de nucleotídeos no nt da posição 469 de T para C, no nt da posição 585 de T para A, no nt da posição 588 de G para A, no nt da posição 708 de G para A, no nt da posição 833 de C para T e no nt da posição 1184 de G para A. Ainda, os nucleotídeos das posições 173,174 e 175 foram eliminados. A alteração do nucleotídeo no nt da posição 469 muda o aminoácido da posição 99 AA de F para S, a mu- dança do nucleotídeo no nt da posição 585 muda o aminoácido da posição 138 AA de S para T, a alteração do nucleotídeo no nt da posição 588 muda o aminoácido da posição 139 AA de A para T e a alteração do nucleotídeo no nt da posição 708 muda o aminoácido da posição 179 AA de G para S. A proporção de B2:B1 produzida pelas células portadoras deste plasmídeo foi de 0,53:1 (Tabela 4). pSE295 contém mutações de 2 nucleotídeos no nt da posição 588 de G para A e no nt da posição 856 de T para C. A alteração do nucle- otídeo no nt da posição 588 muda o aminoácido da posição 139 AA de A para T e a alteração do nucleotídeo no nt da posição 856 muda o aminoáci- do na posição 228 AA de M para T. A proporção de B2:B1 produzida pelas células portadoras deste plasmídeo foi de 0,80:1 (Tabela 4). pSE296 contém 5 mutações de nucleotídeos no nt da posição 155 de T para C, no nt da posição 505 de G para T, no nt da posição 1039 de C para T, no nt da posição 1202 de C para T e no nt da posição 1210 de T para C. A alteração do nucleotídeo no nt da posição 505 muda o aminoá- cido da posição 111 AA de G para V e a mudança do nucleotídeo no nt da posição 1039 muda o aminoácido da posição 289 AA de P para L. A propor- ção de B2:B1 produzida pelas células portadoras deste plasmídeo foi de 0,73:1 (Tabela 4). pSE297 contém mutações de 4 nucleotídeos no nt da posição 377 de G para T, no nt da posição 588 de G para A, no nt da posição 633 de A para G, e no nt da posição 1067 de A para T. A alteração do nucleotí- deo do nt da posição 588 muda o aminoácido da posição 139 AA de A para T, a alteração do nucleotídeo no nt da posição 633 muda o aminoácido da posição 154 AA de K para E e a alteração do nucleotídeo no nt da posição 1067 muda o aminoácido na posição 298 AA de Q para Η. A proporção de B2:B1 produzida pelas células portadoras deste plasmídeo foi de 0,67:1 (Tabela 4).

Tabela 4 9. Exemplo: Construção de Mutantes de Deleção 5' Conforme foi explicado na Seção 5.1, acima, a equência de nu- cleotídeos de S. avermitilis apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:1) com- preede quatro códons GTG diferentes nas posições de pb 42, 174, 177 e 180 que são potenciais locais de iniciação. Esta seção descreve a constru- ção de múltiplas deleções da região 5' da ORF aveC (FIGURA 1; SEQ ID NO:1) para ajudar a definir quais destes códons podem funcionar como lo- cais de iniciação na ORF aveC para a expressão de proteína.

Fragmentos do gene aveC com diferentes deleções no extremo 5' foram isolados a partir de DNA cromossómico de S. avermitilis por amplifi- cação por PCR. Os iniciadores de PCR foram projetados com base na se- quência de DNA de aveC e foram fornecidos pela Genosys Biotechnologies, Inc. Os iniciadores do lado direito foram 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID NO: 16) (D1F1); 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID NO:17) (D1F2); 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID NO:18) (D1F3); e 5'- TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-31 (SEQ ID NO: 19) (D2F2). Os iniciadores do lado esquerdo foram 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID NO:20); 5'- CATGATCGCTGAACCGAGGA-3’ (SEQ ID N0:21); e 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3'(SEQ ID NO:22). A reação de PCR foi realizada como descrita na Seção 8.3, acima.

Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em um gel de 1 % de agarose e foram detectadas bandas isoladas de DNA de ~1,0 Kb ou ~1,1 Kb. Os produtos de PCR foram purificados a partir do gel e liga- dos com 25 ng de vetor pCR2.1 linearizado (Invitrogen) em uma proporção molar de vetor:inserto de 1:10 seguindo as instruções do fabricante. As misturas de ligação foram usadas para transformar células E. coli compe- tentes One Shot® (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Isolou- se DNA de plasmídeo a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto foi confirmada por análise de restrição e análise da se- quência de DNA. Estes plasmídeos foram designados pSE190 (obtido com o iniciador D1F1), pSE191 (obtido com o iniciador D1F2), pSE192 (obtido com o iniciador D1F3), e pSE193 (obtido com o iniciador D2F2). O DNA dos insertos foi digerido com BamH\IXba\, separado por eletroforese, purificado do gel e ligado separadamente com o vetor vaivém pWHM3, o qual foi digerido com BamH\/Xba\, em uma concentração de DNA total de 1 pg em uma proporção molar de vetor:inserto de 1:5. As mis- turas de ligação foram usadas para transformar células competentes de £ coli DH5a. Isolou-se DNA de plasmídeo a partir dos transformantes resis- tentes à ampicilina e a presença do inserto foi confirmada por análise de restrição. Estes plasmídeos, que foram designados pSE194 (DF1), pSE195(D1F2), pSE196(D1F3) e pSE197 (D2F2), foram usados separada- mente para transformar E. coli cepa DM1, o DNA de plasmídeo isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição. Este DNA foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa SE 180-11. Os transformantes resistentes à tiostreptona da cepa SE180-11 foram isolados, determinada a presença de resistência à eritromicina e os transformantes Thior Ermr foram analisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação para determi- ar quais os sítios GTG foram necessários para a expressão de aveC. Os resultados indicam que o códon GTG na posição 42 pode ser eliminado sem afetar a expressão e aveC, uma vez que pSE194, pSE195 e pSE196, cada um dos quais sem o sítio GTG na posição 42, mas todos contendo os três sítios GTG nas posições 174,177 e 180 foram capazes de restaurar a pro- dução normal de avermectinas quando usados para transformar SE180-11. A produção normal de avermectina não foi restaurada quando a cepa SE180-11 foi transformada com pSE197, a qual não possui os quatro sítios GTG (Tabela 5).

Tabela 5 10. Exemplo: Clonagem de Homólogos de aveC Derivados de S. Hvarosco- picus e de S. GriseochromoQenes A presente invenção permite a identificação e clonagem de ge- nes homólogos de aveC derivados de outras espécies de Streptomyces produtoras de avermectina ou de milbemicina. Por exemplo, uma biblioteca de cosmídeo de DNA genômico de S. hygroscopicus (FERM BP-1901) foi hibridizada com a sonda aveC de 1,2 Kb de S. avermitilis descrita atrás. Fo- ram identificados vários clones de cosmídeos que hibridaram fortemente.

Isolou-se DNA cromossómico a partir destes cosmídeos e identificou-se um fragmento Kpn\ de 4,9 Kb que hibridizou com a sonda aveC. Este DNA foi seqüenciado e identificou-se uma ORF (SEQ ID NO:3) tendo homologia si- gnificativa com a ORF aveC deS. avermitilis. Uma sequência de aminoáci- dos (SEQID NO:4) deduzida a partir da ORF homóloga aveC de S. hygros- copicus está apresentada na FIGURA 6.

Ainda, uma biblioteca em cosmídeo de DNA genômico de S. griseochromogenes foi hibridizada com uma sonda aveC de 1,2 Kb de S. avermitilis descrita acima. Identificaram-se vários clones de cosmídeos que hibridizaram fortemente. Isolou-se DNA cromossómico a partir destes cos- mídeos e identificou-se um fragmento Pst\ de 5,4 Kb que hibridiza com a sonda aveC. Este DNA foi seqüenciado e uma ORF parcial homóloga de aveC foi identificada tendo homologia significativa com a ORF aveC de S. avermitilis. Na FIGURA 6 está apresentada uma seqüência parcial de ami- noácidos deduzida (SEQ ID NO:5). A análise do DNA e da seqüência de aminoácido dos homólo- gos de aveC de S. hygroscopicus e de S. griseochromogenes indica que estas regiões partilham homologia significativa (~ 50% de identidade de se- qüências ao nível dos aminoácidos) uma com a outra e cada uma com a ORF aveC e com o produto de gene AveC de S. avermitilis (FIGURA 6). 11. Exemplo: Construção de um Plasmídeo com o Gene aveC Atrás do Promotor ermE A ORF aveC de 1,2 Kb do pSE186 foi subclonada em pSE34, o qual é o vetor vaivém pWHM3 tendo o promotor ermE de 300 pb inserido como um fragmento Kpnl/BamHI no sítio Kpnl/BamHI de pWHM3 (ver Ward etal., 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468-478). pSE186 foi digerido com Ba- mH\ e Hind\\\, o produto do gel de digestão foi separado por eletroforese e o fragmeto de 1,2 Kb foi isolado da agarose e ligado com pSE34, o qual tinha sido digerido com BamH\ e Hind\\\. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5a de acordo com as instruções do fabricante. Isolou-se DNA de plasmídeo a partir de transformantes resis- tentes à ampicilina e a presença do inserto de 1,2 Kb foi confirmada por análise de restrição. Este plasmídeo, que foi designado como pSE189, foi usado para transformar E. coli DM1, e isolado o DNA de plasmídeo a partir dos transformantes resistentes à ampicilina. Protoplastos de S. avermitilis cepa 1100-SC38 foram transformados com pSE189. Os transformantes re- sistentes à tiostreptona da cepa 1100-SC38 foram isolados e analisados por HPLC análise de dos produtos de fermentação.

Transformantes de S. avermitilis cepa 1100-SC38 contendo pSE189 foram alterados nas proporções de avermectina ciclo-hexil-B2: avermectina ciclo-hexil-B1 produzida (cerca de 3:1) comparada com a cepa 1100-SC38 (cerca de 34:1), e a produção de avermectina total foi aumenta- da de aproximadamente 2,4 vezes comparado com a cepa 1100-SC38 transformada com pSE119 (Tabela 6). pSE189 foi também usado para transformar protoplastos de uma cepa do tipo selvagem de S. avermitilis. Os transformantes resistentes à ti- ostreptona foram isolados e analisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação. As avermectinas totais produzidas por S. avermitilis do tipo tipo selvagem transformadas com pSE189 foram aumentadas em aproxima- damente 2,2 vezes comparado com S. avermitilis do tipo selvagem transfor- mada com pSE119 (Tabela 6).

Tabela 6 12. Exemplo: Plasmídeo Quimérico Contendo Seaüências da QRF aveC de S. Avermitilis e do Homólogo aveC de S. HvaroscoDicus Construiu-se um plasmídeo híbrido designado pSE350 que contém um fragmento de 564 pb do homólogo aveC de S. hygroscopicus substituindo um fragmento homólogo de 564 pb da ORF aveC de S. avermitilis (FIGURA 7), como se segue. Construiu-se pSE350 usando um sítio de restrição BsaAI que é conservado em ambas as sequências (aveC posição 225), e um sítio de restri- ção Kpn\ que está presente no gene aveC de S. avermitilis (aveC posição 810). O sítio Kpn\ foi introduzido no DNA de S. hygroscopicus por PCR usando o ini- ciador direito 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID NO:23) e o iniciador esquerdo 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID NO:24) (fornecido pela Genosys Biotechnologies) usando as condições de PCR descritas na Seção 7.1.10, acima. O produto de PCR foi digerido com Bsal e Kpn\, os fragmen- tos foram separados por eletroforese em um gel de 1% de agarose, e o fragmento BsaA\IKpn\ de 564 pb foi isolado do gel. pSE179 (descrito na se- ção 7.1.0, acima) foi digerido com Kpn\ e Hind\\\, os fragmentos foram sepa- rados por eletroforese em um gel de 1 % de agarose e um fragmento de —4,5 Kb foi isolado do gel. pSE179 foi digerido com Hind\\\ e BsaI, os fragmentos foram separados por eletroforese em um gel de 1% de garose e um frag- mento SsaAI/H/ndlll de -0,2 Kb foi isolado do gel. O fragmento Hind\\\!Kpn\ de -4,5 Kb, o fragmento SsaAI/H/ncflll de -0,2 Kb e o fragmento BsaA\IKpn\ de 564 pb de S. hygroscopicus foram ligados em uma ligação tripla e a mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5a. Isolou-se o DNA de plasmídeo a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição usando Kpn\ e Aval. Este plasmídeo foi digerido com Hind\\\ e Xbal para libertar o inserto de 1,2 Kb, o qual foi então ligado com pWHM3 que tinha sido digerido com HindlW e Xbal A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli DH5a, isolou-se o DNA de plasmí- deo a partir dos transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição usando Hind\\\ e Aval.

Este DNA de plasmídeo foi usado para transformar E. coli DM1, o DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina e a presença do inserto correto foi confirmada por análise de restrição e análise da seqüência de DNA. Este plasmídeo foi designado pSE350 e usado para transformar protoplastos de S. avermitilis cepa SE180-11. Os transformantes resistentes à tiostreptona da cepa SE180-11 foram isolados, determinou-se a presença de resistêcia à eritromicina e os transformantes Thior Ermr fo- ram analisados por análise de HPLC dos produtos de fermentação. Os re- sultados mostram que os transformantes contendo o plasmídeo híbrido de S.avermitilis/S. hygroscopicus têm uma proporção média B2:B1 de cerca de 109:1 (Tabela 7).

Tabela 7 Depósito de Materiais Biológicos O material biológico que se segue foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC) em 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, em 29 de Janeiro, 1998 e foi atribuído os seguintes números de acesso: Plasmídeo Ns de Acesso plasmídeo pSE 180 209605 plasmídeo pSE 186 209604 Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações citadas acima são incorporados aqui por referência na sua totalidade. A presente invenção não está limitada no seu âmbito por qual- quer modalidade específica aqui descrita, as quais pretendem ser apenas exemplificativas de aspectos individuais da invenção e métodos e compo- nentes funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito da invenção. De fato, várias modificações da invenção, para além das apresentadas e des- critas serão aparentes para os versados na técnica a partir da descrição apresentada e dos desenhos juntos. Tais modificações estarão dentro do âmbito das reivindicações apensas.

Listagem de Seqüências <110> PFIZER PRODUCTS INC.

<120> GENE DE STREPTOMYCES AVERMITILIS GUE REGULA A PROPORÇÃO DE AVERMECTINAS B2:B1 <130> PC10650A

<140> PC10650A <141 > 199-08-12 <150> 60,148,645 <151 > 1999-08-12 <160> 25 <170> PatentlnVer. 2.1 <210> 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220>

<221 > CDS <222> (174).. (1085) <400> 1 tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60 tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120 aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg 176 Vai 1 gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac 224 Vai Vai Trp Ala Gly Vai Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gin Ala Tyr 5 10 15 gtg ttc age cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg ate gag acg 272 Vai Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu lie Glu Thr 20 25 30 gcg ggc cag ggt cag ggc ggc age aag gat acg ggg act acc gat gtg 320 Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Vai 35 40 45 gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc ate acc gec gcg gcg gcg tgg 368 Vai Tyr Pro Vai lie Ser Vai Vai Cys lie Thr Ala Ala Ala Ala Trp 50 55 60 65 ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt 416 Leu Phe Arg Arg Cys Arg Vai Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu 70 75 80 ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg age tgg cag age ccg ctc atg aac 464 Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gin Ser Pro Leu Met Asn 85 90 95 tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg 512 Trp Phe His Ser Vai Leu Vai Ser Asn Ala Ser Vai Trp Gly Ala Vai 100 105 110 ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg ggt 560 Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Vai Pro Gly Trp Gin Gly Ala Gly Pro Gly 115 120 125 gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg tcg gcc tcc gtc tgc atg tcg gct 608 Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Vai Cys Met Ser Ala 130 135 140 145 ctg ate gtc acc gtg ctg tgc age aag gea ctg ggg tgg ate aag gcc 656 Leu lie Vai Thr Vai Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp lie Lys Ala 150 155 160 cgc cgg ccg gea tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc 704 Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Vai Leu Ala Vai Phe Phe 165 170 175 ate ggc ate gtg ctc ggt ctg tcc gcg ccg ctg ccg tcc gcc tcc ggg 752 lie Gly lie Vai Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly 180 185 190 ate age gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc 800 lie Ser Vai Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Vai The Leu Trp Ser Gly 195 200 205 gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc 848 Glu Trp Tyr Gin phe Pro Vai Tyr Gin Ala Vai Gly Ser Gly Leu Vai 210 215 220 225 tgc tgc atg ctg ggc tcg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag 896 Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu 230 235 240 tcg tgg gtg gaa cgg gga gcc tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg aac 944 Ser Trp Vai Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gin Arg Ala Ala Asn 245 250 255 tgg gcg cgt ttc ctc gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gcc gtg atg ttc 992 Trp Ala Arg Phe Leu Ala Vai Vai Gly Gly Vai Asn Ala Vai Met Phe 260 265 270 ctc tac acc tgt ttc cat ate ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ccg 1040 Leu Tyr Thr Cys Phe His lie Leu Leu Ser Leu Vai Gly Gly Gin Pro 275 280 285 ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa gcg ccg gcc gct tac tga 1085 Pro Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctcccl 145 ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205 acactcctcg gttcagcgat catg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 2 Vai Vai Vai Trp Ala Gly Vai Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gin Ala 1 5 10 15 Tyr Vai Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu lie Glu 20 25 30 Thr Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp 35 40 45 Vai Vai Tyr Pro Vai lie Ser Vai Vai Cys lie Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Vai Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gin Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Ser Vai Leu Vai Ser Asn Ala Ser Vai Trp Gly Ala 100 105 110 Vai Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Vai Pro Gly Trp Gin Gly Ala Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Vai Cys Met Ser 130 135 140 Ala Leu lie Vai Thr Vai Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp lie Lys 145 150 155 160 Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Vai Leu Ala Vai Phe 165 170 175 Phe lie Gly lie Vai Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser 180 185 190 Gly lie Ser Vai Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Vai Thr Leu Trp Ser 195 200 205 Gly Glu Trp Tyr Gin Phe Pro Vai Tyr Gin Ala Vai Gly Ser Gly Leu 210 215 220 Vai Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp 225 230 235 240 Glu Ser Trp Vai Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gin Arg Ala Ala 245 250 255 Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Vai Vai Gly Gly Vai Asn Ala Vai Met 260 265 270 Phe Leu Tyr Thr Cys His lie Leu Leu Ser Leu Vai Gly Gly Gin 275 280 285 Pro Pro Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <220>

<221 > CDS <222> (58).. (990) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg 57 gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg 105 Vai Phe Thr Leu Pro Vai Thr Leu Trp Ala Cys Vai Gly Ala Leu Vai 15 10 15 ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac age ggc 153 Leu Gly Leu Gin Vai Tyr Vai Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 tac cgc ate gag aag gcg tcc ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag 201 Tyr Arg lie Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 cgg ate gcc gat gtg ctg ate ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg 249 Arg lie Ala Asp Vai Leu lie Pro Leu Leu Ser Vai Vai Gly Ala Vai 50 55 60 gtc ctc gea gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg 297 Vai Leu Ala Vai Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 acg ttc gac gcg tcg ctc ttc ate ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag 345 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe He Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin 85 90 95 agt ccc ttg atg aac tgg ate aat ccg gtg ctc gcg tea aac gtc aat 393 Ser Pro Leu Met Asn Trp lie Asn Pro Vai Leu Ala Ser Asn Vai Asn 100 105 110 gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 441 Vai Phe Gly Ala Vai Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Vai Pro Gly Trp Gin 115 120 125 ggg gcg ggg gcg cac cag gcg gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg age 489 Gly Ala Gly Ala His Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 ate tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg 537 lie Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Vai Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg ate 585 Gli Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu lie 165 170 175 gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac ate gcc gag ccg ctg 633 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Vai Vai Leu Leu Asp ile Ala Glu Pro Leu 180 185 190 gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gea gtg ccc gag ctg 681 Vai Ser Phe Ala Gly Vai Ser Vai Trp Thr Arg Ala Vai Pro Glu Leu 195 200 205 acc ate tgg agt ggg cac tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg 729 Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gin Phe Pro Leu Tyr Gin Met Vai 210 215 220 gct tcg gcg ctc ttc ggc gcc tet ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc 777 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg 825 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Vai Arg Leu Leu Ala Vai Vai Gly Gly Ala 260 265 270 aac ate age ate gcc ctc tac acc ggc gea cac ggc gea cac ate ctg 921 Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu 275 280 285 ttc tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatg 1020 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 gcggccgggg 1150 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hyg roscopicus <400> 4 Vai Phe Thr Leu Pro Vai Thr Leu Trp Ala Cys Vai Gly Ala Leu Vai 15 10 15 Leu Gly Leu Gin Vai Tyr Vai Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Arg lie Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 Arg lie Ala Asp Vai Leu lie Pro Leu Leu Ser Vai Vai Gly Ala Vai 50 55 60 Vai Leu Ala Vai Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe lie Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin 85 90 95 Ser Pro Leu Met Asn Trp lie Asn Pro Vai Leu Ala Ser Asn Vai Asn 100 105 110 Vai Phe Gly Ala Vai Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Vai Pro Gly Trp Gin 115 120 125 Gly Ala Gly Ala His Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Vai Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile 165 170 175 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Vai Vai Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu 180 185 190 Vai Ser Phe Ala Gli Vai Ser Vai Trp Thr Arg Ala Vai Pro Glu Leu 195 200 205 Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gin Phe Pro Leu Tyr Gin Met Vai 210 215 220 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Vai Arg Leu Leu Ala Vai Vai Gly Gly Ala 260 265 270 Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu 275 280 285 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400> 5 Vai Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Vai Phe Leu Vai Leu Gin Vai 1 5 10 15 Tyr Vai Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp 20 25 30 Vai Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg lie lie Asp 35 40 45 Vai Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Vai Vai Gly Leu Ala Phe 50 55 60 Trp Leu Vai Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Thr Gly Vai Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Pro Vai Leu Met Ala Asn Thr His Vai Trp Gly Ala 100 105 110 Vai Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Vai Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Vai Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr 130 135 140 Vai Leu Leu Gly Vai Leu Gly Cys Cys Gin Vai Met Ser Arg Vai Arg 145 150 155 160 Glu Arg Trp Pro Gly Vai Arg Pro Trp Gin Leu Vai Gly Leu Ala Phe 165 170 175 Leu Thr Ala Vai Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe lie Ser Phe Ala 180 185 190 Gly Vai Ser Vai Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Vai Thr Leu Trp Arg 195 200 205 Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 tcacgaaacc ggacacac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 9 aactccggtc gactcccctt c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 10 gcaaggctac ggggactac 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 11 gaaccgaccg cctgatac 18 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 12 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg 43 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 13 ggaaccgacc gcctgataca 20 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 14 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc 46 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 15 ggaacatcac ggcattcacc 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 16 aacccatccg agccgctc 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 17 tcggcctgcc aacgaac 17 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 18 ccaacgaacgtgtagtag 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 19 tgcaggcgta cgtgttcagc 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 20 catgatcgct gaaccga 17 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 21 catgatcgct gaaccgagga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 22 aggatgtgtgg tgcgtctgga 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilís <400> 23 cttcaggtgt acgtgttcg 19 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilís <400> 24 gaactggtac cagtgccc 18 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilís <400> 25 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc 46 Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Outras Informações: - Nome do Arquivo: P114221-Seq-List.TXT - Data de Geração do Código: 19-01-2011 - Hora de Geração do Código: 11:45:02 - Código de Controle: - Campo 1: BC5374F69B2E1CA5 - Campo 2:1F3C8F9BAB8141CF

Claims

1. Molécula polinucleotídica isolada, caracterizada pelo fato de consistir em uma sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo de SEQ ID No. 2, o dito polipeptídeo consiste em uma ou mais substituições de ami- noácido selecionadas a partir de: (a) resíduos de aminoácido D48 e A89; (b) resíduos de aminoácido S138, A139 e G179; (c) resíduos de aminoácido Q38, L136 e E238; (d) resíduos de aminoácido F99, S138, A139 e G179; (e) resíduos de aminoácido A139 e M228; (f) resíduos de aminoácido G111 e P289; e (g) resíduos de aminoácido A139, K154 e Q298; de SEQ ID NO.2; em que o dito polipeptídeo é transformado em uma cepa de Streptomyces avermitilis ATCC 53692 que produz uma proporção ou quantidade alterada de avermectinas classe 2:1.

2. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as avermectinas de classes 2:1 são avermec- tinas ciclo-hexil-B2:ciclo-hexil-B1.

3. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas é cerca de 0,8:1 ou inferior.

4. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas é cerca de 0,68:1 ou inferior.

5. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas é cerca de 0,53:1 ou inferior.

6. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas é cerca de 0,42:1.

7. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecio- nadas entre uma ou mais do grupo consistindo em: (a) resíduo de aminoácido Q na posição 38 substituído por P; (b) resíduo de aminoácido D na posição 48 substituído por E; (c) resíduo de aminoácido A na posição 89 substituído por T; (d) resíduo de aminoácido F na posição 99 substituído por S; (e) resíduo de aminoácido G na posição 111 substituído por V; (f) resíduo de aminoácido L na posição 136 substituído por P; (g) resíduo de aminoácido S na posição 138 substituído por T; (h) resíduo de aminoácido A na posição 139 substituído por T ou F; (i) resíduo de aminoácido K na posição 154 substituído por E; (j) resíduo de aminoácido G na posição 179 substituído por S; (k) resíduo de aminoácido M na posição 228 substituído porT; (l) resíduo de aminoácido E na posição 238 substituído por D; (m) resíduo de aminoácido P na posição 289 substituído por L; e (n) resíduo de aminoácido Q na posição 298 substituído por H.

8. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as mutações no polinucleotídeo que codifica D48E/A89T consistem em uma mudança de base de T para A na posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 317 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A na posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 438 de SEQ ID NO: 1.

9. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de consistir ainda em uma mudança de base de C para A em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 353 de SEQ ID NO: 1, e uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 1155 de SEQ ID:1.

10. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as mutações no polinucleotídeo que codifica S138T/A139T/G179S consistem em uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 585 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de C para A em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucle- otídeo 708 de SEQ ID NO: 1.

11. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de consistir ainda em uma mudança de base de C para A em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 272 de SEQ ID NO: 1.

12. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as mutações no polinucleotideo que codifica Q38P/L136P/E238D consistem em uma mudança de base de A para C em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 286 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 580 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de A para T em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nu- cleotídeo 886 de SEQ ID NO: 1.

13. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de consistir ainda em uma mudança de base de A para G em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 24 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 497 de SEQ ID:1 e uma mudan- ça de base de C para T em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 554 de SEQ ID NO: 1.

14. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as mutações no polinucleotideo que codifica F99S/S138T/A139T/G179S consistem em uma deleção de 3 pares de bases nas posições de nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 173, 174 e 175 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 469 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo correspon- dente ao nucleotídeo 585 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucieotídeo correspondente ao nucleotídeo 708 de SEQ ID NO: 1.

15. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de consistir ainda em uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 833 de SEQ ID NO: 1, e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 1184 de SEQ ID: 1.

16. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as mutações no polinucleotideo que codifica A139T/M228T consiste em uma mudança de base de G para A na posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de T para C na posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 856 de SEQ ID NO: 1.

17. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as mutações no polinucleotideo que codifica G111V/P289L consistem em uma mudança de base de C para T na posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 505 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de C para T na posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 1039 de SEQ ID NO: 1.

18. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de consistir ainda em uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 155 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 1202 de SEQ ID: 1 e uma mu- dança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 1210 de SEQ ID NO: 1.

19. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as mutações no polinucleotideo que codifica A139T/K154E/Q298H consistem em uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de A para G em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 633 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de A para T em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nu- cleotídeo 1067 de SEQ ID NO: 1.

20. Molécula polinucleotídica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de consistir ainda em uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo correspondendo ao nucleotídeo 377 de SEQ ID NO: 1.

21. Vetor recombinante purificado, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula polinucleotídica compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma do alelo aveC de Streptomyces avermitilis, da sequência que codifica um produto de gene aveC de Streptomyces avermiti- lis de plasmídeo pSE186 de acordo com ATCC 209604 ou a sequência nu- cleotídica de aveC ORF de S. avermitilis de acordo com SEQ ID NO: 1 ou uma variante degenerada do mesmo, em que a sequência nucleotídica com- preende ainda uma ou mais mutações que codificam uma substituição de aminoácido em um ou mais resíduos de aminoácidos selecionadas a partir de: (a) resíduos de aminoácido D48 e A89; (b) resíduos de aminoácido S138, A139 e G179; (c) resíduos de aminoácido Q38, L136 e E238; (d) resíduos de aminoácido F99, S138, A139 e G179; (e) resíduos de aminoácido A139 e M228; (f) resíduos de aminoácido G111 e P289; e (g) resíduos de aminoácido A139, K154 e Q298; de SEQ ID NO.2; de modo que as células da cepa de S. avermitilis ATCC 53692 em que o alelo aveC selvagem foi inativado e que expressam a molécula polinucleotí- dica compreendendo a sequência nucleotídica produzem uma proporção na classe 2:1 de avermectinas que é menor do que a proporção produzida pe- las células de cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que contrariamente ex- pressam somente o alelo aveC selvagem.

22. Célula hospedeira procariótica purificada caracterizada pelo fato de compreender o vetor recombinante como definido na reivindicação 21.

23. Método para a obtenção de uma nova cepa de S. avermitilis, caracterizado pelo fato de compreender a mutagenização do alelo aveC nas células de uma cepa de S. avermitilis, cuja mutação resulta na substituição no produto de gene AveC de um resíduo de aminoácido diferente em uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas a partir de: (a) resíduos de aminoácido D48 e A89; (b) resíduos de aminoácido S138, A139 e G179; (c) resíduos de aminoácido Q38, L136 e E238; (d) resíduos de aminoácido F99, S138, A139 e G179; (e) resíduos de aminoácido A139 e M228; (f) resíduos de aminoácido G111 e P289; e (g) resíduos de aminoácido A139, K154 e Q298; de SEQ ID NO.2; tal que as células da cepa de S. avermitilis nas quais o alelo aveC foi assim mutagenizado produzem uma proporção ou quantidade alterada de avermectinas de classes 2:1.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe- lo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células da cepa de S. avermitilis nas quais o alelo aveC foi assim mutage- neizado é cerca de 0,8:1 ou inferior.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe- lo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células da cepa de S. avermitilis em que o alelo aveC foi assim mutagenei- zado é cerca de 0,68:1 ou inferior.

26. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe- lo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células da cepa de S. avermitilis em que o alelo aveC foi assim mutagenei- zado é cerca de 0,53:1 ou inferior.

27. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe- lo fato de que a proporção de classes 2:1 de avermectinas produzidas pelas células da cepa de S. avermitilis nas quais o alelo aveC foi assim mutage- neizado é cerca de 0,42:1.

28. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe- lo fato de que a combinação de substituições de aminoácidos é selecionada dentre uma ou mais do grupo consistindo em: (a) D48E/A89T; (b) S138T/A139T/G179S; (c) Q38P/L136P/E238D; (d) F99S/S138T/A139T/G179S; (e) A139T/M228T; (f) G111V/P289L; e (g) A139T/K154E/Q298H.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que as mutações no alelo aveC codificadoras de D48E/A89T con- sistem em uma mudança de base de T para A na posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 317 de SEQ ID NO: 1 e uma mu- dança de base de G para A na posição de nucleotídeo no alelo aveC corres- pondente ao nucleotídeo 438 de SEQ ID NO: 1.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pe- lo fato de consistir ainda em uma mudança de base de C para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 353 de SEQ ID NO: 1, e uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 1155 de SEQ ID:1.

31. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que as mutações no alelo aveC codificadoras de S138T/A139T/ G179S consistem em uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 585 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo a- veC correspondente ao nucleotídeo 708 de SEQ ID NO: 1.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pe- lo fato de consistir ainda em uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 272 de SEQ ID NO: 1.

33. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que as mutações no alelo aveC codificadoras de Q38P/L136P/ E238D consistem em uma mudança de base de A para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 286 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 580 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de A para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 886 de SEQ ID NO: 1.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pe- lo fato de consistir ainda em uma mudança de base de A para G em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 24 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nu- cleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 497 de SEQ ID: 1 e uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 554 de SEQ ID NO: 1.

35. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que as mutações no alelo aveC codificadoras de F99S/S138T/ A139T/G179S consistem em uma deleção de 3 pares de bases nas posições de nucleotídeos no alelo aveC correspondentes aos nts 173, 174 e 175 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nu- cleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 469 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 585 de SEQ ID NO: 1, uma mu- dança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspon- dente ao nucleotídeo 708 de SEQ ID NO: 1.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pe- lo fato de compreender ainda uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 833 de SEQ ID NO: 1, e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 1184 de SEQ ID: 1.

37. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que as mutações no alelo aveC codificadoras de A139T/M228T compreendem uma mudança de base de G para A na posição de nucleotí- deo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de T para C na posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 856 de SEQ ID NO: 1.

38. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que as mutações no alelo aveC codificadoras de G111V/P289L compreendem uma mudança de base de G para T na posição de nucleotí- deo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 505 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de C para T na posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 1039 de SEQ ID NO: 1.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pe- lo fato de compreender ainda uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 155 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 1202 de SEQ ID: 1 e uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 1210 de SEQ ID NO: 1.

40. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que as mutações no alelo aveC codificadoras de A139T/K154E/ Q298H consistem em uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de A para G em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 633 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de A para T em uma posição de nucleotídeo no alelo a- veC correspondente ao nucleotídeo 1067 de SEQ ID NO: 1.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pe- lo fato de compreender ainda uma mudança de base de G para T em uma posição de nucleotídeo no aleio aveC correspondente ao nucleotídeo 377 de SEQ ID NO: 1.

42. Célula de Streptomyces avermitilis mutada, caracterizada pelo fato de ter um aleio aveC mutageneizado que codifica um produto de gene AveC de um resíduo de aminoácido diferente em uma ou mais substi- tuições de aminoácido selecionadas dentre: (a) resíduos de aminoácido D48 e A89; (b) resíduos de aminoácido S138, A139 e G179; (c) resíduos de aminoácido Q38, L136 e E238; (d) resíduos de aminoácido F99, S138, A139 e G179; (e) resíduos de aminoácido A139 e M228; (f) resíduos de aminoácido G111 e P289; e (g) resíduos de aminoácido A139, K154 e Q298; de SEQ ID NO.2; tal que as células da cepa de S. avermitilis nas quais o aleio aveC foi assim mutagenizado produzem uma proporção ou quantidade alterada de avermectinas de classes 2:1.

43. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 42, caracterizada pelo fato de que as avermectinas de classes 2:1 são avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil B1.

44. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que produz uma proporção de classes 2:1 de avermectinas de cerca de 0,8:1 ou inferior.

45. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que produz uma proporção de classes 2:1 de avermectinas de cerca de 0,68:1 ou inferior.

46. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que produz uma proporção de classes 2:1 de avermectinas de cerca de 0,53:1 ou inferior.

47. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que produz uma proporção de classes 2:1 de avermectinas de cerca de 0,42:1.

48. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 42, caracterizada pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre uma ou mais do grupo consistindo em: (a) resíduo de aminoácido Q na posição 38 substituído por P; (b) resíduo de aminoácido D na posição 48 substituído por E; (c) resíduo de aminoácido A na posição 89 substituído por T; (d) resíduo de aminoácido F na posição 99 substituído por S; (e) resíduo de aminoácido G na posição 111 substituído por V; (f) resíduo de aminoácido L na posição 136 substituído por P; (g) resíduo de aminoácido K na posição 154 substituído por E; (h) resíduo de aminoácido G na posição 179 substituído por S; (i) resíduo de aminoácido M na posição 228 substituído porT; (j) resíduo de aminoácido E na posição 238 substituído por D; (k) resíduo de aminoácido P na posição 289 substituído por L; e (l) resíduo de aminoácido Q na posição 298 substituído por H.

49. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 48, caracterizada pelo fato de que a combinação de substituições de aminoácidos é selecionada dentre uma ou mais do grupo consistindo em: (a) D48E/A89T; (b) S138T/A139T/G179S; (c) Q38P/L136P/E238D; (d) F99S/S138T/A139T/G179S; (e) A139T/M228T; (f) G111V/P289L; e (g) Α139T/K154E/Q298H.

50. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 49, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de D48E/A89T consistem em uma mudança de base de T para A na posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 317 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A na posição de nucleotí- deo correspondente ao nucleotídeo 438 de SEQ ID NO: 1.

51. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 50, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de D48E/A89T consistem ainda em uma mudança de base de C para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleo- tídeo 353 de SEQ ID NO: 1, e uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 1155 de SEQ ID NO: 1.

52. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 49, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de S138T/A139T/G179S consistem em uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 585 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 708 de SEQ ID NO: 1.

53. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 52, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de S138T/A139T/G179S consistem ainda em uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 272 de SEQ ID NO: 1.

54. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 49, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de Q38P/L136P/E238D consistem em uma mudança de base de A para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 286 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 580 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de A para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 886 de SEQ ID NO: 1.

55. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 54, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de Q38P/L136P/E238D consistem ainda em uma mudança de base de A para G em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 24 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 497 de SEQ ID: 1 e uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondendo ao nucleotídeo 554 de SEQ ID NO: 1.

56. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 49, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de F99S/S138T/A139T/G179S consistem em uma deleção de 3 pares de bases nas posições de nucleotídeos no alelo aveC correspondentes aos nts 173, 174 e 175 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 469 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de T para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 585 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 708 de SEQ ID NO: 1.

57. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 56, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de F99S/S138T/A139T/G179S consistem ainda em uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspon- dente ao nucleotídeo 833 de SEQ ID NO: 1, e uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo 1184 de SEQ ID NO: 1.

58. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 49, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de A139T/M228T consistem em uma mudança de base de G para A na posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de T para C na posição de nucle- otídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 856 de SEQ ID NO: 1.

59. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 49, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de G111V/P289L consistem em uma mudança de base de G para T na posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 505 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de C para T na posição de nucle- otídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 1039 de SEQ ID NO: 1.

60. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 59, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de G111V/P289L consistem ainda em uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 155 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de C para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 1202 de SEQ ID: 1 e uma mudança de base de T para C em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 1210 de SEQ ID NO: 1.

61. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 49, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de A139T/K154E/Q298H consistem em uma mudança de base de G para A em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 588 de SEQ ID NO: 1, uma mudança de base de A para G em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 633 de SEQ ID NO: 1 e uma mudança de base de A para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 1067 de SEQ ID NO: 1.

62. Célula de S. avermitilis mutada de acordo com a reivindica- ção 61, caracterizada pelo fato de que as mutações no alelo aveC codifica- doras de A139T/K154E/Q298H consistem ainda em uma mudança de base de G para T em uma posição de nucleotídeo no alelo aveC correspondente ao nucleotídeo 377 de SEQ ID NO: 1.

63. Processo para a produção de avermectinas, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura das células de S. avermitilis mutage- nizadas como definidas na reivindicação 49 em meios de cultura sob condi- ções que permitem ou induzem a produção de avermectinas e recuperação das referidas avermectinas da cultura.