CZ20002794A3 - Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů - Google Patents

Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů Download PDF

Info

Publication number
CZ20002794A3
CZ20002794A3 CZ20002794A CZ20002794A CZ20002794A3 CZ 20002794 A3 CZ20002794 A3 CZ 20002794A3 CZ 20002794 A CZ20002794 A CZ 20002794A CZ 20002794 A CZ20002794 A CZ 20002794A CZ 20002794 A3 CZ20002794 A3 CZ 20002794A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
avec
avermitilis
avermectins
cells
class
Prior art date
Application number
CZ20002794A
Other languages
English (en)
Inventor
Kim Jonelle Stutzman-Engwall
Yoshihiro Katoh
Hamish Alastair Irvine Mcarthur
Original Assignee
Pfizer Products Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Products Inc. filed Critical Pfizer Products Inc.
Priority to CZ20002794A priority Critical patent/CZ20002794A3/cs
Publication of CZ20002794A3 publication Critical patent/CZ20002794A3/cs

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Řešení se týká polynukleotidových molekul obsahujících nukleotidové sekvence kódující aveC genový produkt, kde tyto polynukleotidové molekuly mohou být použity pro změnu poměru nebo množství avermektinů třídy 2 a třídy 1, produkovaných ve fermentačních kulturách S.avermitilis. Dále se týká vektorů, hostitelských buněk a mutantních kmenů S.avermitilis, ve kterých byl aveC gen inaktivován nebo mutován tak, že mění poměr B2 : B1 produkovaných avermektinů.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká prostředků a způsobů pro produkci avermektinů a spadá primárně do oblasti zdraví živočichů. Přesněji se předkládaný vynález týká polynukleotidových molekul obsahujících nukleotidové sekvence kódující produkt AveC genu, které mohou být použity pro ovlivnění poměru avermektinů třídy 2 a 1, které jsou produkovány fermentací kultur Streptomyces avermitilis, a prostředků a způsobů pro vyhledávání takových polynukleotidových molekul. Předkládaný vynález se dále týká vektorů, transformovaných hostitelských buněk a nových mutantních kmenů S. avermitilis, ve kterých byl aveC gen mutován tak, aby ovlivňoval poměr produkovaných avermektinů třídy 2 a 1.
Dosavadní stav techniky
Avermektiny
Druhy Streptomyces produkují velké množství sekundárních metabolitů, včetně avermektinů, které jsou tvořeny sérií osmi podobných šestnáctičlenných makrocyklických laktonů, které mají silnou antihelmintickou a insekticidní aktivitu. 8 odlišných, ale blízce příbuzných sloučenin, je označováno jako Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a a B2b. a serie sloučenin označuje přirozené avermektiny, ve kterých je substituentem v C25 pozici (S)-sekundární butyl, a b označuje ty sloučeniny, ve kterých je substituentem v C25 pozici isopropyl. Označení A a B označuje avermektiny, ve kterých je substituent v C5 pozici methoxy- a hydroxy-skupina, v příslušném pořadí. Číslice 1 • · • ·
označuje avermektiny, které obsahují dvoujnou vazbu v pozici C22,23 a číslice 2 označuje avermektiny, které obsahují vodík v pozici C22 a hydroxy-skupinu v pozici C23. Z příbuzných avermektinů má avermektin typu B1 nejúčinější antiparasitární a pesticidní aktivitu a je proto komerčně nej žádanějším avermektinem.
Avermektiny a jejich produkce aerobní fermentací kmenů S. avermitilis jsou popsány v U.S. patentech 4310519 a 4429042. Předpokládá se, že biosyntéza přirozených avermektinů je iniciována endogenně z CoA thioesterových analogů kyseliny isomáselné a kyseliny S-(+)-2-methylmáselné.
Kombina úprav kmenů náhodnou mutagenesí a použití exogenně dodávaných mastných kyselin vedla k zlepšení produkce analogů avermektinů. Mutanty S.avermitilis, které jsou deficientní v dehydrogenase rozvětvených 2-oxo kyselin (bkd deficientní mutanty) mohou produkovat avermektiny pouze tehdy, jsou-li fermentace doplňovány mastnými kyselinami. Vyhledávání a izolace mutantů deficientních v dehydrogenasové aktivitě pro rozvětvené řetězce (například S.avermitilis ATCC 53567) jsou popsány v Evropské patentové přihlášce (EP) 276103. Fermentace takových mutantů v přítomnosti exogenně dodávaných mastných kyselin vede k produkci pouze čtyř avermektinů, které odpovídají použitým mastným kyselinám. Tak vede doplňování fermentace S.avermitilis (ATCC 53567) kyselinou S-(+)-2methylmáselnou k produkci přirozených avermektinů Ala, A2a, Bia a B2a; doplňování fermentace kyselinou isomáselnou k produkci přirozených avermektinů Alb, A2b, Blb a B2b; a doplňování fermentace kyselinou cyklopentankarboxylovou k produkci čtyř nových cyklopentylavermektinů Al, A2, Bl a B2.
• ·
Když jsou dodávány jiné mastné kyseliny, tak jsou produkovány nové avermektiny. Při testování více než 800 potenciálních prekursorů bylo identifikováno více než 60 nových avermektinů (viz například Dutton et al., 1991, J. Antibiot.
44: 357-365; a Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Dále, mutanty S.avermitilis deficientní v 5-0methyltransferasové aktivitě produkují v podstatě pouze B analogy avermektinů. V důsledku toho produkují mutanty deficientní jak v dehydrogenasové aktivitě pro rozvětvené 2-oxo kyseliny, tak v 5-0-methyltransferasové aktivitě, pouze B avermektiny odpovídající mastným kyselinám použitým pro doplňování fermentace. Tak vede dodávání kyseliny S-(+)-2methylmáselné k takových dvojitým mutantům k produkci pouze přirozených avermektinů Bia a B2a, zatímco dodávání kyseliny isomáselné a kyseliny cyklopentankarboxylové vede k produkci přirozených avermektinů Blb a B2b nebo nových cyklopentylových Bl a B2 avermektinů, v příslušném pořadí. Dodávání kyseliny cyklopentankarboxylové k takovým dvojitým mutantům je výhodnou metodou pro produkci komerčně významného nového avermektinů, cyklohexylavermektinu Bl (doramektinu) . Izolování a charakteristiky takových dvojitých mutantů, například
S.avermitilis (ATCC 53692), jsou popsány v EP 276103.
Geny účastnící se biosyntézy avermektinů
V mnoha případech jsou geny účastnící se na produkci sekundárních metabolitů a geny kódující určitá antibiotika přítomné v seskupení na chromosomu. Tak je tomu například v případě Strepromyces genového seskupení polyketid-synthasy (PKS) (viz Hopwood and Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24 : 3766). Proto je jednou strategií pro klonování genů v biosyntetické dráze izolování genu pro resistenci na léky a potom testování sousedních regionů chromosomu na jiné geny • · související s biosyntézou určitého antibiotika. Jinou strategií pro klonování genů účastnících se biosyntézy významných metabolitů je komplementace mutantů. Například, části DNA knihovny z organismů schopných produkce určitého metabolitů jsou vkládány do mutantů neprodukujících tento metabolit a transformanty jsou vyšetřovány na produkci metabolitů. Dále byla pro identifikaci a klonování genů v biosyntetické dráze použita hybridizace knihovny sondami z rodu Streptomyces.
Geny účastnící se v biosyntéze avermektinů (ave geny), podobně jako geny nutné pro biosyntézu jiných sekundárních metabolitů Streptomyces (například PKS), se nacházejí v genovém seskupení na chromosomu. Mnoho ave genů bylo úspěšně klonováno za použití vektorů doplňujících mutanty S.avermitilis s blokovanou biosyntézou avermektinů. Klonování takových genů je popsáno v U.S. patentu 5252474. Kromě toho, Ikada et al., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534, popisují lokalizaci chromosomálního regionu nutného pro stupeň dehydrogenace C22,23 (aveC) na 4,82 kb BamHI fragment S.avermitilis, stejně jako popisují mutace v aveC genu, které vedou ke vzniku mutantu produkujícího pouze B2a. Protože ivermektin, účinná antihelmintická sloučenina, může být produkován chemicky z avermektinů B2a, jsou takové kmeny produkující pouze avermektin B2a významné pro komerční produkci ivermektinu.
Identifikace mutací v aveC genu, které minimalizují komplexnost produkce avermektinů, jako jsou například mutace snižující poměr avermektinů B2:B1, zjednoduší produkci a přečištění komerčně významných avermektinů.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález obsahuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující kompletní aveC ORF S.avermitilis nebo jeho významnou část, kde tato izolovaná polynukleotidová molekula neobsahuje další kompletní ORF, který je in sítu v chromosomu S.avermitilis umístěn za aveC ORF. Izolovaná polynukleotidová molekula podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako sekvence kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo je stejná, jako nukleotidová sekvence aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo její významná část.
Předkládaný vynález dále obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní k sekvenci kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo k nukleotidové sekvenci aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo její významné části.
Předkládaný vynález dále obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologní k aminokyselinové sekvencí kódované kódující sekvencí pro AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo k aminokyselinové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) nebo její významné části.
Předkládaný vynález dále obsahuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC produkt homologního genu. Ve výhodném provedení obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula nukleotidovou sekvenci kódující AveC produkt homologního genu z S. hygroscopicus, kde produkt homologního genu obsahuje • ·
aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 nebo její významnou část. Ve výhodném provedení obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula podle předkládaného vynálezu, která kóduje AveC produkt homologního genu S. hygroskopicus, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3 nebo její významnou část.
Předkládaný vynález dále obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologní s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 3 S. hygroscopicus. Předkládaný vynález dále obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, který je homologní k AveC produktu homologního genu Shygroscopicus, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4.
Předkládaný vynález dále obsahuje oligonukleotidy, které hybridizují na polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO: 3, nebo na polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k nukleotidové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo k SEQ ID NO: 3.
Předkládaný vynález dále obsahuje rekombinantní klonovací vektory a expresní vektory, které jsou použitelné pro klonování a expresi polynukleotidu podle předkládaného vynálezu, včetně polynukleotidových molekul obsahujících aveC ORF S.avermitilis nebo aveC homolog ORF. V příkladném provedení obsahuje předkládaný vynález plasmid pSE186 (ATCC 209604), který obsahuje celý ORF aveC genu S.avermitilis. Předkládaný vynález dále obsahuje transformované hostitelské buňky obsahující polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor podle předkládaného vynálezu a nové kmeny nebo buněčné linie odvozené od těchto buněk.
• · • · • · · · · · · · · · « · ·· · · ··· · ·· · • .......· · · ·· · • · ···· ···· *··· ·· ·· ·· ·· ··
Předkládaný vynález dále obsahuje rekombinantně produkovaný produkt AveC genu nebo produkt homologického AveC genu nebo jeho významnou část, který byl významně přečištěn a izolován, stejně jako homology těchto produktů. Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro produkci rekombinantního produktu AveC genu, který obsahuje kultivaci hostitelské buňky transformované rekombinantním expresním vektorem, kde uvedený rekombinantní expresní vektor obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující produkt AveC genu nebo produkt AveC homologického genu, kde tato polynukleotidová molekula je operativně navázaná na jeden nebo více regulačních elementů, které kontrolují expresi polynukleotidové molekuly v hostitelské buňce, kde tato kultivace je provedena za podmínek umožňujících produkci rekombinantního produktu AveC genu nebo AveC homologického genu, a získání produktu AveC genu nebo produktu homologického AveC genu z buněčné kultury.
Předkládaný vynález dále obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je jinak stejná, jako sekvence kódující produkt AveC genu S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo nukleotidová sekvence aveC ORF S.avermitilis, jak je uvedena na obr. 1 (SEQ ID NO: 1), ale která dále obsahuje jednu nebo více mutací, které způsobí, že buňky S.avermitilis kmene ATCC 53692, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují jiný poměr nebo množství avermektinů, než který je produkován buňkami S.avermitilis kmene ATCC 53692, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Podle předkldáaného vynálezu mohou být takové polynukleotidové molekuly použity pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, které vykazují detekovatelné změny v produkci avermektinů ve srovnání se stejnými kmeny, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení • 4 • · 44 44 4« • 4 4 4 · 4 4 • 4 « · · · 4 • 4 · · · · ·· • · ···· 4··.
···· ·· 44 4 · 4 · · · jsou takové polynukleotidové molekuly použitelné pro produkci nových kmenů S.avermitilis, které produkují avermektiny ve sníženém poměru třídy 2 ku třídě 1, ve srovnání se stejnými kmeny, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. V dalším výhodném provedení jsou takové polynukleotidové molekuly použitelné pro produkci nových kmenů S.avermitilis, které produkují vyšší množství avermektinů ve srovnání se stejnými kmeny, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. V ještě dalším výhodném provedení jsou takové polynukleotidové molekuly výhodné pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, ve kterých je aveC gen inaktivován.
Předkládaný vynález obsahuje způsoby pro identifikaci mutací aveC ORF S.avermitilis, které mění poměr a/nebo množství produkovaných avermektinů. Ve výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález způsob pro identifikaci mutací aveC ORF, které mění poměr produkovaných avermektinů třídy 2:1, který obsahuje: (a) stanovení poměrů produkovaných avermektinů třídy 2:třídě 1 pro kmen S.avermitilis, ve kterém byla inaktivována přirozená aveC alela, a do kterého byla vložena a ve kterém je exprimována polynukleotidové molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný produkt aveC genu; (b) stanovení poměrů produkovaných avermektinů třídy 2:třídě 1 pro stejný kmen S.avermitilis jako v kroku (a), který však exprimuje pouze aveC alelu obsahující nukleotidovou sekvenci ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo nukleotidovou sekvenci, která je homologní k této sekvenci; a (c) srovnání poměru avermektinů třídy 2:třídě 1 produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (a) s poměrem avermektinů třídy 2:třídě 1 produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (b); takže pokud se poměr avermektinů třídy 2:třídě 1 produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (a) liší od poměru avermektinů třídy 2:třídě 1 produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (b), tak byla identifikována mutace aveC ORF schopná měnit poměr avermektinů třídy 2;třídě 1. Ve výhodném provedení je poměr avermektinů třídy 2:třídě 1 snížen v důsledku mutace.
V dalším výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález způsob pro identifikaci mutací aveC ORF nebo genetických konstruktů obsahujících aveC ORF, které mění množství produkovaných avermektinů, který obsahuje: (a) stanovení množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S.avermitilis, ve kterém byla inaktivována přirozená aveC alela, a do kterého byla vložena a ve kterém je exprimována polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný produkt aveC genu nebo obsahující genetický konstrukt obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt; (b) stanovení množství avermektinů produkovaných stejným kmenem S.avermitilis jako v kroku (a), který však exprimuje pouze aveC alelu obsahující nukleotidovou sekvenci ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo nukleotidovou sekvenci, která je homologní k této sekvenci; a (c) srovnání množství avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (a) s množství avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (b); takže pokud se množství avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (a) liší od množství avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis z kroku (b), tak byla identifikována mutace aveC ORF nebo genetický konstrukt, které jsou schopné měnit množství avermektinů. Ve výhodném provedení je množství produkovaných avermektinů zvýšeno v důsledku mutace.
Předkládaný vynález dále obsahuje rekombinantní vektory, které jsou použitelné pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, které mají změněnou produkci avermektinů. Například, předkládaný vynález obsahuje vektory, které mohou být použity • 9 ·* ·» »9 99 99
9 9 9 ···· · » · · »· · 9 9 99 « «· « • 999 * · · « 999 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
IQ ··** *· ·* *· ·· ·· pro cílené vložení jakékoliv polynukleotidové molekuly obsahující mutované nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu do místa aveC genu na chromosomu S.avermitilis, kde tyto polynukleotidy jsou použity pro inserci nebo nahrazení aveC ORF nebo jeho části pomocí homologní rekombinace. Nicméně, podle předkládaného vynálezu může polynukleotidové molekula obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu také modulovat biosyntézu avermektinů tehdy, je-li insertována do chromosomu S.avermitilis v místě jiném než v aveC genu, nebo pokud je v buňkách S.avermitilis přítomná episomálně. Tak obsahuje předkládaný vynález také vektory obsahující polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu, které mohou být použity pro inserci polynukleotidové molekuly v jiném místě chromosomu S.avermitilis než v aveC genu, nebo pro episomální lokalizaci. Ve výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález vektory pro nahrazování genů, které mohou být použity pro inserci mutované aveC alely do chromosomu S.avermitilis pro přípravu nových buněčných kmenů, které produkují avermektiny se sníženým poměrem třídy 2:třídě 1 ve srovnání s buňkami stejného kmenu, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu.
Předkládaný vynález dále obsahuje způsoby pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, které jsou tvořeny buňkami, které exprimují mutovanou aveC alelu a které produkují pozměněné poměry a/nebo množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene S.avermitilis, který exprimuje pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, které jsou tvořeny buňkami, které exprimují mutovanou aveC alelu a které produkují pozměněné poměry avermektinů třídy 2:třídě 1 ve srovnání s buňkami stejného kmene S.avermitilis, který *» »· ·* ·* *· ·· * « · · · · φ « · · « «
V · · ·»·· · » · » • ··· » ♦ · · k. · · · t t • · » · » « · · · · ···· 99 99 9 « «· ·« exprimuje pouze přirozenou aveC alelu, kde uvedený způsob obsahuje transformaci buněk kmene S.avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který mění poměr avermektinů třídy 2:třídě 1 produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu; a selekci transformovaných buněk, které produkují avermektiny v pozměněném poměru třídy 2:třídě 1 ve srovnání s poměrem třídy 2:třídě 1, který je produkován buňkami exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení je v buňkách nového kmene poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídě 1 snížen.
V jiném výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, které jsou tvořeny buňkami, které produkují pozměněná množství avermektinů, který obsahuje transformaci buněk kmene S.avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, jehož exprese vede k produkci pozměněného množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu; a selekci transformovaných buněk, které produkují avermektiny v pozměněném množství ve srovnání množstvím avermektinů, které je produkováno buňkami exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení je v buňkách nového kmene produkováno větší množství avermektinů.
V dalším výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález způsob přípravy nových kmenů S.avermitilis, kde buňky těchto kmenů obsahují inaktivovanou aveC alelu, kde uvedený způsob obsahuje transformaci buněk S.avermitilis, které exprimují • · • · přirozenou aveC alelu, vektorem, který inaktivuje aveC alelu; a selekci transformovaných buněk, ve kterých byla aveC alela inaktivována.
Předkládaný vynález dále obsahuje nové kmeny S.avermitilis tvořené buňkami, které byly transformovány jakoukoliv polynukleotidovou molekulou nebo vektorem obsahujícím mutované nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález nové kmeny S.avermitilis tvořené buňkami, které exprimují mutovanou aveC alelu místo, nebo současně s přirozenou aveC alelou, kde tyto buňky nového kmenu produkují avermektiny v pozměněném poměru třídy 2:třídě 1 ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodnějším provedení produkují buňky nového kmene avermektiny ve sníženém poměru třídy 2:třídě 1 ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Takové nové kmeny jsou užitečné pro průmyslovou produkci komerčně žádoucích avermektinů, jako je doramektin.
V dalším výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález nové kmeny S.avermitilis tvořené buňkami, které exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu místo, nebo současně s, přirozenou aveC alelou, což vede k produkci jiných množství avermektinů ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení produkují buňky nového kmene avermektiny ve vyšším množství.
V ještě dalším výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález nové kmeny S.avermitilis tvořené buňkami, ve kterých byl aveC gen inaktivován. Takové kmeny jsou užitečné jak z hlediska odlišného spektra produkovaných avermektinů ve • « srovnání s přirozenými kmeny, tak pro komplementační vyhledávací testy, jak jsou zde popsány, pro stanovení toho, zda cílená nebo náhodná mutagenese aveC genů ovlivňuje produkci avermektinů.
Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro produkci avermektinů, který obsahuje kultivaci buněk kmene S.avermitilis, které exprimují mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který mění poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene neexprimujícími mutovanou aveC alelu, ale pouze přirozenou aveC alelu, v kultivačním mediu za podmínek umožňujících nebo indukujících produkci avermektinů; a získání uvedených avermektinů z kultury. Ve výhodném provedení je poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami exprimujícími mutaci snížen. Tento způsob umožňuje dosažení vyšší účinnosti produkce komerčně hodnotných avermektinů, jako je doramektin.
Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro produkci avermektinů, který obsahuje kultivaci buněk kmene S.avermitilis, které exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, kde tato kultivace vede k produkci pozměněných množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene neexprimujícími mutovanou aveC alelu ani genetický konstrukt, ale pouze přirozenou aveC alelu, v kultivačním mediu za podmínek umožňujících nebo indukujících produkci avermektinů; a získání uvedených avermektinů z kultury. Ve výhodném provedení je množství avermektinů produkovaných buňkami exprimujícími mutaci nebo genetický konstrukt zvýšeno.
• · • · • · · · · · · ·
Předkládaný vynález dále obsahuje nové prostředky obsahující avermektiny produkované kmeny S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu podle předkládaného vynálezu, kde tyto avermektiny jsou produkovány ve sníženém poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání s buňkami stejného kmene neexprimujícími mutovanou aveC alelu, ale pouze přirozenou aveC alelu. Nové prostředky obsahující avermektin mohou být ve formě produkované ve fermentační kultivační kapalině, nebo mohou být získány z této kapaliny a částečně nebo významně přečištěny z této kapaliny.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1: DNA sekvence (SEQ ID NO: 1) obsahující S.avermitilis aveC ORF a odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 2).
Obr. 2: Plasmidový vektor pSE186 (ATCC 209604) obsahující celý ORF aveC genu S.avermitilis.
Obr. 3: Genový substituční vektor pSEl80 (ATCC 209605) obsahující ermE gen Sace. erythraea insertovaný do aveC ORF S.avermitilis.
Obr. 4: BamHI restrikční mapa genové seskupení avermektinsynthasového genu z S.avermitilis s pěti identifikovaným překrývajícími se kosmidovými klony (t.j. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Také je vyznačen vztah pSE118 a pSE119.
Obr. 5: HPLC analýza fermentačních produktů produkovaných kmeny S.avermitilis. Kvantifikace píku byla provedena srovnáním se standardními množstvími cyklohexyl-Bl. Retenční čas cyklohexylB2 byl 7,4-7,7 min.; retenční čas cyklohexyl-Bl byl 11,9-12,3 min. Obr. 5A: Kmen SE180-11 S.avermitilis s inaktivovaným aveC ORF. Obr. 5B: Kmen SE180-11 S.avermitilis transformovaný pSE186 • · • · ♦ · • · (ATCC 209604). Obr. 5C: Kmen SE180-11 S.avermitilis transformovaný pSE187. Obr. 5D: Kmen SE180-11 S.avermitilis transformovaný pSE188.
Obr. 6: Srovnání odvozené aminokyselinové sekvence kódované aveC ORF S.avermitilis (SEQ ID NO: 2), částečného ORF aveC homologu z S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) a ORF aveC homologu z S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4). Valinový zbytek uvedený tučným písmem je předpokládané start-místo pro protein. Konzervované zbytky jsou uvedeny velkými písmeny pro homologii ve všech třech sekvencích a malými písmeny pro homologii ve 2 ze 3 sekvencí. Aminokyselinové sekvence měly přibližně 50% identitu sekvence.
Obr. 7: Hybridní plasmidový konstrukt obsahující 564 bp BsaAI/Kpnl fragment z aveC homologického genu S. hygroscopicus insertovaný do BsaAI/Kpnl místa v S.avermitilis avec ORF.
Předkládaný vynález se týká identifikace a charakterizace polynukleotidových molekul obsahujících nukleotidové sekvence, které kódují AveC genový produkt ze S.avermitilis, konstrukce nových kmenů S.avermitilis, které mohou být použity pro testování mutovaných AveC genových produktů na jejich vliv na produkci avermektinů a zjištění, že některé mutované AveC genové produkty mohou snižovat poměr B2:B1 avermektinů produkovaných S.avermitilis. Vynález je dále popsán na příkladu polynukleotidové molekuly obsahující buď nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako sekvence kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSEl86 (ATCC 209604), nebo nukleotidovou sekvenci ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1), a na příkladu polynukleotidových molekul odvozených od této sekvence obsahující mutované nukleotidové sekvence. Nicméně, principy • 9 uvedené v předkládaném vynálezu mohou být analogicky použity na jiné polynukleotidové molekuly, včetně aveC homologických genů z jiných kmenů Streptomyces, včetně například S. hygroscopicus a S. griseochromogenes.
Polynukleotidové molekuly kódující AveC genový produkt
S.avermitilis
Předkládaný vynález poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující kompletní aveC ORF S.avermitilis nebo jeho významnou část, kde uvedená izolovaná polynukleotidové molekula neobsahuje další kompletní ORF, který je in sítu v chromosomu S.avermitilis umístěn po aveC ORF.
Izolovaná polynukleotidové molekula podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako sekvence kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která je stejná jako nukleotidové sekvence ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo její významná část. Termín významná část izolované polynukleotidové molekuly obsahující nukleoitdovou sekvenci kódující AveC genový produkt S.avermitilis, jak je zde použit, označuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující alespoň 70% sekvence kompletního aveC ORF, jak je uvedena na obr. 1 (SEQ ID NO: 1), která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt. Termín funkčně ekvivalentní AveC genový produkt je v této souvislosti definován jako genový produkt, který při expresi v S.avermitilis kmene ATCC 53692, ve kterém byla inaktivována přirozená alela aveC, vede k produkci v podstatě stejných poměrů a množství avermektinů, jako jsou produkovány v S.avermitilis kmene ATCC 53692, který exprimuje pouze přirozenou, funkční aveC alelu přirozenou pro
S.avermitilis kmen ATCC 53692.
• · • *» • · · · • · • · ·· · · ··
Kromě nukleotidové sekvence aveC ORFmůže izolovaná polynukleotidová molekula podle předkládaného vynálezu obsahovat nukleotidové sekvence, které za přirozených podmínek sousedí s aveC genem in sítu v S.avermitilis, jako jsou například sousední nukleotidové sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 1).
Termíny polynukleotidová molekula, polynukleotidová sekvence, kódující sekvence, otevřený čtecí rámec, a ORF, jak jsou zde použity, označují jak DNA, tak RNA molekuly, které mohou být jednořetězcové bnebo dvouřetězcové a které mohou být transkribovány nebo translatovány (DNA) nebo translatovány (RNA) na AveC genový produkt nebo, jak bude uvedeno dále, na AveC homologní genový produkt, nebo na polypeptid, který je homologní k AveC genovému produktu nebo AveC homolognímu genovému produktu, ve vhodném buněčném expresním systému, za použití vhodných regulačních elementů. Kódující sekvence může obsahovat, bez omezení, prokaryotické sekvence, cDNA sekvence, genomové DNA sekvence a chemicky syntetizované DNA a RNA sekvence.
Nukleotidové sekvence uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) obsahuje čtyři různé GTG kodony v pozicích 42, 174, 177 a 180 bp. Jak je uvedeno dále, vícečetné delece 5’-regionu aveC ORF (obr. 1; SEQ ID NO: 1) byly vytvořeny pro definování toho, které kodony mohou působit v aveC ORF jako start kodony pro expresi proteinu. Delece prvního GTG místa v bp 42 neeliminovala aktivitu AveC. Další delece všech tří GTG kodonů v pozicích 174, 177 a 180 bp dohromady eliminovaly aktivitu AveC, což ukazuje, že tento region je nutný pro expresi proteinu. Předkládaný vynález proto zahrnuje aveC ORF různé délky, které zahajují translaci v jakémkoliv z GTG míst • 9 • 9
9 « · umístěných v pozicích 174, 177 nebo 180 bp, jak jsou uvedeny na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) a příslušné polypeptidy pro každý ORF.
Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologická k sekvenci kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která je homologická k nukleotidové sekvenci aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo její významné části. Termín homologická použitý v souvislosti s polynukleotidovou molekulou homologickou ke kódující sekvenci pro AveC genový produkt označuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci: (a) která kóduje stejný AveC genový produkt jako sekvence kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která kóduje stejný AveC genový produkt jako nukleotidová sekvence aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1), ale která obsahuje jednu nebo více silentních změn nukleotidové sekvence v souladu s degenerací genetického kódů; nebo (b) která hybridizuje na komplementární polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci kodovanou sekvencí kódující AveC genový produkt v plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která kóduje aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), za středně přísných podmínek, t.j. za hybridizace na DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylsíranu sodném (SDS), 1 mM EDTA při 65 °C, s proplachy v 0,2 x SSC/0,1% SDS při 42 °C (viz Ausubel et al., (vyd.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, svazek I, Green Publishing Associates, lne., a John Wiley and Sons, lne., New York, str. 2.10.3), a která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak byl definován výše. Ve výhodném provedení hybridizuje polynukleotidová molekula na komplementární sekvenci k nukleotidové sekvenci kódující AveC genový produkt v plasmidu « · · · pSE186 (ATCC 209604), nebo na komplementární sekvenci k nukleotidové sekvenci uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo na její významnou část, za podmínek vysoké přísnosti, t.j. za hybridizace na DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylsíranu sodném (SDS), 1 mM EDTA při 65 °C, s proplachy v 0,1 x SSC/0,1% SDS při 68 °C (viz Ausubel et al., 1989, výše), a která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak byl definován výše.
Aktivita AveC genového produktu a jeho potenciálních funkčních ekvivalentů může být stanovena pomocí HPLC analýzy produktů fermentace, jak je popsáno v příkladech uvedených dále. Polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidové sekvence kódující funkční ekvivalenty AveC genového produktu S.avermitilis zahrnují přirozené aveC geny přítomné v jiných kmenech S.avermitilis, aveC homologní geny přítomné v jiných druzích Streptomyces a mutované aveC alely, ať přirozené, nebo geneticky upravené.
Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologická k aminokyselinové sekvenci kódované sekvencí kódující AveC genový produkt plasmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo k aminokyselinové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) nebo její významné části. Termín významná část aminokyselinové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), jak je zde použit, označuje polypeptid obsahující alespoň 70% aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2), který tvoří funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak byl definován výše.
Jak je zde použit v souvislosti s aminokyselinovými sekvencemi, které jsou homologické k aminokyselinové sekvenci • ·
AveC genového produktu S.avermitilis, označuje termín homologický polypeptid kódovaný sekvencí kódující AveC genový produkt plasmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo mající aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), ve kterém byl jeden nebo více aminokyselinových zbytků konzervativně substituován jiným aminokyselinovým zbytkem tak, že takové konzervativní substituce vedou ke vzniku funkčně ekvivalentního genového produktu, jak byl definován výše. Konzervativní aminokyselinové substituce jsou dobře známé v oboru. Pravidla pro takové substituce jsou uvedena například v Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., svazek 5, Sup. 3. Přesněji, konzervativní aminokyselinové substituce jsou takové substituce, které probíhají ve skupině aminokyselin, které jsou podobné z hlediska polarity, acidity nebo charakteru vedlejších řetězců. Geneticky kódované aminokyseliny jsou obvykle děleny do čtyřech skupin: (1) acidické = aspartat, glutamat; (2) bazické = lysin, arginin, histidin; (3) nepolární = alanin, valin, leucín, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan; a (4) polární bez náboje = glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan a tyrosin jsou také společně označovány jako aromatické aminokyseliny. Jedna nebo více substitucí provedených v určité skupině, například substituce leucinu za isoleucin nebo valin, nebo aspartatu za glutamat, nebo threoninu za serin, nebo jakékoliv jiné aminokyseliny za strukturálně podobnou aminokyselinu, například za aminokyselinnu s podobnou aciditou, polaritou, velikostí vedlejších řetězců nebo s kombinovanou podobností těchto charakteristik, nemají obyčejně vliv na funkci peptidu.
Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující genový produkt homologický k AveC. Termín genový • · • · produkt homologický k AveC, jak je zde použit, je definován jako genový produkt mající alespoň 50% identitu aminokyselinové sekvence s AveC genovým produktem S.avermitilis obsahujícím aminokyselinovou sekvenci kodovanou sekvencí kódující AveC genový produkt plasmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). V příkladném provedení je genový produkt homologický k AveC získán z S. hygroscopicus (jak je popsáno v EP přihlášce 0298423; depositum FERM BP-1901) a obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 nebo její významnou část. Termín významná část aminokyselinové sekvence podle SEQ ID NO: 4 označuje polypeptid obsahující alespoň 70% aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 4, který tvoří funkčně ekvivalentní genový produkt homologický k AveC. Funkčně ekvivalentní genový produkt homologický k AveC je definován jako genový produkt, který při expresi v S. hygroscopicus kmenu FERM BP-1901, ve kterém je nativní alela homologická k AveC inaktivovaná, vede k produkci v podstatě stejných množství a poměrů milbemycinů, jako je produkováno v S. hygroscopicus kmenu FERM BP-1901 exprimujícím pouze přirozenou, funkční alelu homologickou k AveC, která je přirozená pro S. hygroscopicus kmen FERM BP1901. V příkladném provedení obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula podle předkládaného vynálezu, která kóduje S. hygroscopicus genový produkt homologický k AveC, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3 nebo její významnou část. Termín významná část izolované polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3, jak je zde použit, označuje izolovanou polynukleotidovou molekulu obsahující alespoň 70% nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 3, která kóduje funkčně ekvivalentní genový produkt homologický k AveC, jak byl definován výše.
• · • · · · • ·
Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologická k nukleotidové sekvenci S. hygroscopicus uvedené v SEQ ID NO: 3. Termín homologická použitý v souvislosti s polynukleotidovou molekulou homologickou ke kódující sekvenci pro S. hygroscopicus genový produkt homologický k AveC označuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci:
(a) která kóduje stejný genový produkt jako nukleotidová sekvence SEQ ID NO: 3 nebo její významná část, ale která obsahuje jednu nebo více silentních změn nukleotidové sekvence v souladu s degenerací genetického kódů; nebo (b) která hybridizuje na komplementární polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4, za středně přísných podmínek, t.j. za hybridizace na DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylsíranu sodném (SDS) , 1 mM EDTA při 65 °C, s proplachy v 0,2 x SSC/0,1% SDS při 42 °C (viz Ausubel et al., výše), a která kóduje funkčně ekvivalentní genový produkt homologický k AveC, jak byl definován výše. Ve výhodném provedení hybridizuje polynukleotidová molekula na komplementární sekvenci k nukleotidové sekvenci SEQ ID NO: 3 kódující genový produkt homologický k AveC nebo na její významnou část, za podmínek vysoké přísnosti, t.j. za hybridizace na DNA vázanou na filtr v 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylsíranu sodném (SDS) , 1 mM EDTA při 65 °C, s proplachy v 0,1 x SSC/0,1% SDS při 68 °C (viz Ausubel et al., 1989, výše), a která kóduje funkčně ekvivalentní AveC genový produkt, jak byl definován výše.
Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který je homologický ke genovému produktu S. hygroscopicus homologickému k AveC. Jak je zde použit v souvislosti s • · « · · · polypeptidy, které jsou homologické ke genového produktu homologickému k AveC sekvence SEQ ID NO: 4 z S.hygroscopicus, označuje termín homologický polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 4, ve kterém byl jeden nebo více aminokyselinových zbytků konzervativně substituován jiným aminokyselinovým zbytkem tak, že takové konzervativní substituce vedou ke vzniku funkčně ekvivalentního genového produktu, jak byl definován výše.
Předkládaný vynález dále poskytuje oligonukleotidy, které hybridizují na polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO: 3, nebo na polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k nukleotidové sekvenci podle obr.l (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO: 3. Takové oligonukleotidy mají délku alespoň přibližně 10 nukleotidů, lépe 15 až 30 nukleotidů, a hybridizují na jednu z výše uvedených polynukleotidových molekul za podmínem vysoké přísnosti, t.j. za výplachů v 6xSSC/0,5% pyrofosforečnan sodný při přibližně 37 °C pro oligonukleotidy délky 14 baží, přibližně 48 °C pro oligonukleotidy délky 17 baží, při přibližně 55 °C pro oligonukleotidy délky 20 baží a při přibližně 60 °C pro oligonukleotidy délky 23 baží. Ve výhodném provedení jsou oligonukleotidy komplementární k části jedné z výše uvedených polynukleotidových molekul. Tyto oligonukleotidy jsou použitelné pro různé účely, včetně kódování nebo působení jako protismyslné molekuly použitelné v genové regulaci, nebo jako primery pro amplifikaci polynukleotidových molekul kódujících AveC nebo AveC homology.
Další geny homologické k aveC mohou být identifikovány v dalších druzích nebo kmenech Streptomyces za použití polynukleotidových molekul nebo oligonukleotidů popsaných v • · předkládaném vynálezu a známých technik. Například, oligonukleotidová molekula obsahující část S.avermitilis nukleottidové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo část S. hygrošcopicus nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 3, může být detekovatelně značena a použita pro prohledávání genetické knihovny konstruované z DNA získané z organismu, který je předmětem zájmu. Přísnost hybridizačních podmínek je vybrána podle vztahu referenčního organismu, v tomto případě
S.avermitilis nebo S. hygroscopicus, ke zkoumanéému organismu. Požadavky na různé podmínky přísnosti jsou dobře známé odborníkům v oboru, a takové podmínky budou pravděpodobně záviset na specifickém organismu, ze kterého je získána knihovna a značené sekvence. Takové oligonukleotidy mají délku alespoň 15 nukleotidů a patří mezi ně například oligonukleotidy popsané v následujících příkladech. Amplifikace homologických genů může být provedena za použití těchto a jiných oligonukleotidů a standardních technik, jako je polymerasová řetězová reakce (PCR), ačkoliv jiné amplifikační techniky známé v oboru, jako je například ligasová řetězová reakce, mohou být také použity.
Klony identifikované jako klony obsahující nukleotidové sekvence homologické k aveC mohou být testovány na schopnost kodovat funkční genový produkt homologický k AveC. Pro tento účel mohou být klony podrobeny analýze sekvence, pomocí které se identifikují vhodné čtecí rámce, stejně jako iniciační a terminační signály. Alternativně nebo kromě toho mohou být klonované DNA sekvence insertovány do vhodného expresního vektoru, t.j. do vektoru, který obsahuje nutné elementy pro transkripci a translaci insertované kódující sekvence pro protein. Může být použit jakýkoliv z mnoha systémů vektor/hostitel, včetně bakteriálních systémů, jako jsou plasmidové, bakteriofágové nebo kosmidové expresní vektory.
• · • · • ·
Vhodné hostitelské buňky transformované takovými vektory obsahujícími potenciální aveC homologické kódující sekvence mohou být potom analyzovány na aktivitu AveC typu za použití metod'jako je HPLC analýza fermentačních produktů, jak je popsána, například, dále.
Produkce a zpracování polynukleotidových molekul podle předkládaného vynálezu jsou známé v oboru a mohou být provedeny za použití rekombinantních technik, které jsou popsány například v Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al., (ed.), 1995, PCR Strategies, Academie Press, lne., San Diego; a Erlich (ed.), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, které jsou zde všechny uvedeny jako odkazy. Polynukleotidové klony kódující AveC genové produkty nebo genové produkty homologické k AveC mohou být identifikovány za použití jakékoliv metody známé v oboru, jako jsou například metody uvedené dále. Genomové DNA knihovny mohou být prohledávány na aveC a aveC homologické kódující sekvence za použití technik jako je technika popsaná v Benton and Davis, 1977, Science 196: 180 pro bakteriofágové knihovny, a v Grunstein and Hogness, 1975, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965 pro plasmidové knihovny.
Polynukleotidové molekuly o kterých je známo, že obsahují aveC ORF, jako je například molekula přítomná v plasmidu pSEl86 (ATCC 209604) nebo v plasmidu pSE119 (jak je uveden dále), mohou být použity jako sondy při tomto prohledávání. Alternativně mohou být syntetizovány oligonukleotidové sondy, které odpovídají nukleotidovým sekvencím odvozeným z částečné ·
• · nebo kompletní aminokyselinové sekvence přečištěného genového produktu homologického k AveC.
Rekombinantní systémy
Klonování a expresní vektory
Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantní klonovací vektory a expresní vektory, které jsou použitelné pro klonování nebo expresi polynukleotidových molekul podle předkládaného vynálezu obsahujících, například, aveC ORF S.avermitilis nebo ORF jakéhokoliv homologu aveC. V příkladném provedení poskytuje předkládaný vynález plasmid pSE186 (ATCC 209604), který obsahuje kompletní ORF aveC genu S.avermitilis.
Všechen následující popis týkající se aveC ORF S.avermitilis nebo polynukleotidové molekuly obsahující aveC ORF S.avermitilis nebo jeho část nebo AveC genového produktu S.avermitilis, se také týkají aveC homologů a genových produktů homologických k AveC, pokud není výslovně uvedeno jinak.
Různé vektory byly vyvinuty pro specifické použití v Streptomyces, včetně fágů, plasmidů s vysokým počtem kopií, plasmidů s nízkým počtem kopií a E.coli-Streptomyces kyvadlových vektorů, a jakýkoliv z těchto vektorů může být použit pro provedení předkládaného vynálezu. Ze Streptomyces bylo také klonováno mnoho genů pro lékovou resistenci a několik z těchto genů bylo použito ve vektorech jako selektovatelné markéry. Příklady v současnosti používaných vektorů pro Streptomyces jsou uvedeny, například, v Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16: 169-190.
• ·
Rekombinantní vektory podle předkládaného vynálezu, zejména expresní vektory, jsou výhodně konstruovány tak, že kódující sekvence pro polynukleotidovou molekulu podle předkládaného vynálezu je v operativní asociaci s jedním nebo více regulačními elementy nezbytnými pro transkripci a translaci kódující sekvence za vzniku polypeptidu. Termín regulační elementy, jak je zde použit, označuje - bez omezení nukleotidové sekvence, které kódují indukovatelné a neindukovatelné promotory, zesilovače transkripce, operátory a jiné elementy známé v oboru, o kterých je známo, že slouží pro řízení a/nebo regulaci exprese polynukleotidových kódujících sekvencí. Výraz kódující sekvence je v operativní asociaci s jedním nebo více regulačními elementy znamená, že regulační elementy účinně řídí a umožňují transkripci kódující sekvence nebo translaci její mRNA, nebo oba tyto děje.
Typickými plasmidovými vektory, které mohou být upraveny tak, aby obsahovaly polynukleotidovou molekulu podle předkládaného vynálezu, jsou pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) a kyvadlový vektor pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881), například.
Způsoby pro konstrukci rekombinantních vektorů obsahujících určité kódující sekvence v operativní asociaci s vhodnými regulačními elementy jsou v oboru dobře známé a mohou být použity při provádění předkládaného vynálezu. Mezi tyto metody patří rekombinantní techniky in vitro, syntetické techniky a genetické rekombinace in vivo. Viz například techniky popsané v Maniatis et al., 1989, výše; Ausubel et al., 1989, výše; Sambrook et al., 1989, výše; Innis et al., 1995, výše; a Erlich et al., 1992, výše.
• 9 «V • · · « • · · • · · · • » • ♦ · · · · ν· ·· • · » · • · · · • * · * • 9 · · • · » ·
Regulační elementy těchto vektorů se mohou lišit ve své délce a specificitách. Podle použitého systému hostitel/vektor může být použito mnoho vhodných transkripčních a translačních elementů. Příklady transkripčních regulačních regionů nebo promotorů pro bakterie jsou β-gal promotor, T7 promotor, TAC promotor, λ levý a pravý promotor, trp a lac promotory, trp-lac fúsní promotory a, pro Streptomyces, promotory ermE, melC a tipA atd. V konkrétním provedení popsaném dále byl připraven expresní vektor obsahující aveC ORF klonovaný do sousedství silného konstitutivního ermE promotoru ze Saccharopolyspora erythraea. Vektor byl transformován do S.avermitilis a potom provcedená HPLC analýza produktů fermentace ukázala zvýšený titr produkovaných avermektinů ve srovnání s produkcí ve stejném kmenu, který exprimuje přirozenou aveC alelu.
Expresní vektory pro fúsní proteiny mohou být použity pro expresi AveC genového produktu-fúsního proteinu. Přečištěný fúsní protein může být použit pro získání antiséra proti AveC genovému produktu, pro studium biochemických vlastností AveC genového produktu, pro přípravu AveC fúsních proteinů s odlišnými biochemickými vlastnostmi nebo pro usnadnění identifikace nebo přečištění exprimovaných AveC genových produktů. Možnými expresními vektory pro fúsní proteiny jsou, například, vektory obsahující sekvence kódující β-galaktosidasu a trE fuse, fúse obsahující vazebný protein pro maltosu, fuse obsahující glutathion-S-transferasu a polyhistidinové fúse (nosičové regiony). V alternativním provedení může být AveC genový produkt nebo jeho část fúsován na genový produkt homologický k AveC nebo jeho část, která pochází z jiného druhu nebo kmenu Streptomyces, například ze S. hygroscopicus nebo S. griseochromogenes. V konkrétním provedení popsaném dále a zobrazeném na obr. 7 byl připraven chimérický plasmid obsahující 564 bp region ORF homologický k aveC ze S.
• < · « · 9 >
> 9 · 9 « · · · 9 9 « * * ·
9 9 9 · · 9
99 99 hygroscopicus, který nahradil 564 bp region ORF aveC
S.avermitilis. Takové hybridní vektory mohou být transformovány do buněk S.avermitilis a mohou být testovány pro určení jejich vlivu- například na poměr produkovaných avermektinů třídy 2-.třídy 1.
AveC fúsní proteiny mohou být upraveny tak, aby obsahovaly region užitečný pro přečištění. Například, fuse AveC-vazebný protein pro maltosu mohou být přečištěny za použití amylosové pryskyřice; fúsní proteiny AveC-glutathion-S-transferasa mohou být přečištěny za použití glutathion-agarosových korálků; a fúsní proteiny AveC-polyhistidin mohou být přečištěny za použití divalentní niklové pryskyřice. Alternativě mohou být pro přečištění fúsních proteinů afinitní chromatografii použity protilátky proti proteinovému nebo peptidovému nosiči. Například, nukleotidová sekvence kódující cílový epitop monoklonální protilátky může být vložena do expresního vektoru v operativní asociaci s regulačními elementy a může být umístěna tak, že exprimovaný epitop je fúsovaný na AveC polypeptid. Například, nukleotidová sekvence kódující FLAG™ epitop (International Biotechnologies, lne.), což je hydrofilní markerový peptid, může být insertována za použití standardních technik do expresního vektoru v místě odpovídajícím, například, karboxylovému konci AveC polypeptidu. Exprimovaný fúsní protein AveC polypeptid-FLAG™ epitop může být potom detekován a afinitně přečištěn za použití komerčně dostupných anti-FLAG™ protilátek.
Expresní vektor kódující AveC fúsní protein může být také upraven tak, aby obsahoval polylinkerové sekvence, které kódují specifická vazebná místa pro proteasy, takže exprimovaný AveC polypeptid může být uvolněn z nosiče nebo fúsního partnera reakcí se specifickou proteasou. Například může vektor pro • · ··· .... · i • ·.··· ·· ··. ·· · . · .··· .··· 30 ···· .......* fúsní protein obsahovat DNA sekvence kódující štěpící místa pro trombin nebo faktor Xa.
Signální sekvence umístěná před a ve čtecím rámci s aveC ORF může být vložena do expresního vektoru za použití známých technik a slouží pro transport a sekreci exprimovaného genového produktu. Příkady takových signálních sekvencí jsou například signální sekvence z α-faktoru, imunoglobulinů, zevních membránových proteinů, penicillinasy a receptorů T-buněk.
Pro usnadnění selekce hostitelských buněk transformovaných nebo transfektovaných klonovacími nebo expresními vektory podle předkládaného vynálezu může být vektor dále upraven tak, aby obsahoval kódující sekvenci pro produkt reporterového genu nebo jiný selektovatelný markér. Taková kódující sekvence je výhodně v operativní asociaci s kódujícími sekvencemi pro regulační elementy, jak byly popsány výše. Reportérové geny použitelné v předkládaném vynálezu jsou dobře známé v oboru a patří mezi ně například geny kódující zelený fluorescentní protein, luciferasu, xylE a tyrosinasu. Nukleotidové sekvence kódující selektovatelné markéry jsou dobře známé v oboru a patří mezi ně, například, geny kódující resistenci na antibiotika nebo antimetabolity, nebo geny, které doplňují auxotrofní požadavky. Příklady takových sekvencí jsou například sekvence kódující resistenci na erythromycin, thiostrepton nebo kanamycin.
Transformace hostitelských buněk
Předkládaný vynález dále obsahuje transformované hostitelské buňky obsahující polynukleotidovou molekulu nebo rekombinantní vektor podle předkládaného vynálezu a nové kmeny nebo buněčné linie získané z těchto buněk. Hostitelskými buňkami vhodnými pro provedení vynálezu jsou výhodně buňky Streptomyces, ačkoliv • · • · mohou být použity také jiné prokaryotické a eukaryotické buňky. Takové transformované hostitelské buňky obvykle zahrnují, ale nejsou omezeny na, mikroorganismy, jako jsou bakterie transformované rekombinantní bakteriofágovými DNA, plasmidovými DNA nebo kosmidovými DNA vektory, nebo kvasinky transformované rekombinantními vektory.
Polynukleotidové molekuly podle předkládaného vynálezu jsou určeny pro buňky Streptomyces, ale mohou být transformovány také do jiných bakteriálních nebo eukaryotických buněk, například za účelem klonování nebo exprese. Typicky může být použit kmen E. coli, jako je například DH5ct kmen, dostupný od American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (přírůstkové č. 31343) a z komerčních zdrojů (Stratagene). Výhodnými eukaryotickými hostitelskými buňkami jsou kvasinky, ačkoliv mohou být použity také savčí buňky a hmyzí buňky.
Rekombinantní expresní vektor podle předkládaného vynálezu je výhodně transformován nebo transfektován do jedné nebo více buněk v podstatě homogenní kultury buněk. Expresní vektor je obvykle vložen do hostitelských buněk za použití známých technik, jako je například protoplastová transformace, srážení fosforečnanem vápenatým, zpracování chloridem vápenantým, mikroinjekce, elektroporace, transfekce kontaktem s rekombinantním virem, liposomy-zprostředkovaná transfekce, DEAE-dextranová transfekce, transdukce, konjugace nebo ostřelování mikročásticemi. Selekce transformantů může být provedenna za použití standardních technik, jako je selekce buněk exprimujících selektovatelný markér, například gen pro resistenci na antibiotika, který je asociovaný s rekombinantním vektorem, jak bylo uvedeno výše.
• · • · ···· ···· ··· • · · · ··· · ·· • · · · · · ·· ··· ·· • · · · · · ··· .··.·· .·.· ··
Po vložení expresního vektoru do hostitelské buňky může být integrace a udržování aveC kódující sekvence v chromosomu hostitelské buňky nebo episomálně potvrzena za použití standardních technik, jako je southernův přenos, analýza restrikčními enzymy, PCR analýza, včetně PCR s reverzní transkripcí (rt-PCR), nebo imunologickými testy detekujícími předpokládaný genový produkt. Hostitelské buňky obsahující a/nebo exprimující rekombinantní aveC kódující sekvenci mohou být identifikovány jakoukoliv z nejméně čtyř obecných technik známých v oboru, který jsou: (I) DNA-DNA, DNA-RNA nebo RNAprotismyslná RNA hybridizace; (ii) detekce přítomnosti funkcí markerového genu; (iii) hodnocení úrovně transkripce podle exprese aveC-specifických mRNA transkriptů v hostitelské buňce; a (iv) detekce přítomnosti zralého polypeptidového produktu, která je provedena například imunotestem nebo detekcí AveC biologické aktivity (například, produkce specifických poměrů a množství avermektinů ukazuje na AveC aktivitu v, například,
S.avermitilis hostitelských buňkách).
Exprese a charakterizace rekombinantního AveC genového produktu
Po stabilním vložení aveC kódující sekvence do vhodné hostitelské buňky mohou být transformované hostitelské buňky klonálně propagovány a získané buňky mohou být kultivovány za podmínek umožňujících maximální produkci AveC genového produktu. Takové podmínky obvykle obsahují kultivaci buněk do vysoké hustoty. Pokud obsahuje expresní vektor indukovatelný promotor, tak mohou být pro indukci exprese použity vhodné indukční podmínky, jako je například změna teploty, vyčerpání živin, přidání indukčních činidel (například analogů karbohydrátů, jako je isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid • · (IPTG)), akumulace nadbytečných vedlejších produktů metabolismu.
Pokud zůstává AveC genový produkt uvnitř hostitelských buněk, tak jsou buňky sklízeny a provede se lýza buněk a produkt se izoluje a přečistí z lyzátu za extrakčních podmínek známých v oboru, které minimalizují degradaci proteinů, například při 4 °C, a/nebo za přítomnosti inhibitorů proteas. Pokud je exprimovaný AveC genový produkt secernován z hostitelských buněk, tak může být odebráno pouze vyčerpané živné medium a produkt může být izolován z tohoto media.
Exprimovaný AveC genový produkt může být izolován nebo významně přečištěn z buněčných lyzátu nebo z kultivačního media, za použití standardních metod, včetně například jakékoliv kombinace následujících metod: srážení síranem amonným, frakcionace podle velikosti, iontoměničová chromatografie, HPLC, odstředění podle hustoty a afinitní chromatografie. Pokud vykazuje exprimovaný AveC genový produkt biologickou aktivitu, tak může být zvyšování čistoty přípravku sledováno v každém stupni přečišťování pomocí vhodného testu. Pokud nevykazuje exprimovaný AveC genový produkt biologickou aktivitu, tak může detekován například podle velikosti nebo reaktivity s protilátkou specifickou pro AveC, nebo podle přítomnosti fúsní sekvence.
Předkládaný vynález tak poskytuje rekombinantně exprimovaný AveC genový produkt S.avermitilis obsahující aminokyselinovou sekvenci kodovanou sekvencí kódující AveC genový produkt plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) nebo její významnou část, a jeho homology.
• · • · • ·
Předkládaný vynález dále poskytuje rekombinantně exprimovaný genový produkt homologický k AveC S.hygroscopicus obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 nebo její významnou část, a jeho homology.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob pro produkci AveC genového produktu, který obsahuje kultivaci hostitelských buněk transformovaných rekombinantním expresním vektorem, kde uvedený vektor obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt, kde tato polynukleotidová molekula je v operativní asociaci s jedním nebo více regulačními elementy, které kontrolují expresi polynukleotidové molekuly v hostitelské buňce, kde tato kultivace je provedena za podmínek umožňujících produkci rekombinantního AveC genového produktu, a získání AveC genového produktu z buněčné kultury.
Rekombinantně produkovaný AveC genový produkt S.avermitilis je použitelný pro různé účely, včetně vyhledávání sloučenin, které alterují funkci AveC genového produktu a tak ovlivňují biosyntézu avermektinů, a pro přípravu protilátek namířených proti AveC genovému produktu.
Po získání AveC genového produktu dostatečnné čistoty může být tento produkt charakterizován za použití standardních technik, jako je SDS-PAGE, chromatografie s vylučováním podle velikosti, analýza aminokyselinové sekvence, hodnocení biologické aktivity v produkci správných metabolitu v biosyntetické dráze avermektinů, atd. Například, aminokyselinová sekvence AveC genového produktu může být stanovena za použití standardních technik pro sekvenování peptidů. AveC genový produkt může být dále charakterizován pomocí analýzy hydrofilnosti (viz například Hopp and Woods, • · • · · ·
1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 3824), nebo analogovými softwarovými algoritmy, pro identifikaci hydrofobních a hydrofilních regionů AveC genového produktu. Strukturální analýza může být provedena pro identifikaci regionů AveC genového produktu, které určují specifické sekundární uspořádání. Biofyzikální metody, jako je rentgenová krystalografie (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), počítačové modelování (Fletterick and Zoller (ed.), 1986, v: Currennt Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) a nukleární magnetická rezonance (NMR), mohou být použity pro mapování a studium míst interakcí mezi AveC genovým produktem a jeho substrátem. Informace získané z těchto studií mohou být použity pro výběr nových míst pro mutace v aveC ORF, které by vedly z zisku nových kmenů S.avermitilis majících výhodnější charakteristiky produkce avermektinů.
Konstrukce a použití AveC mutantů
Předkládaný vynález poskytuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci, která je stejná jako sekvence kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo nukleotidové sekvence aveC ORF S.avermitilis uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO: 1), ale která obsahuje jednu nebo více mutací, takže buňky S.avermitilis kmene ATCC 53692, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci produkují jiné poměry nebo množství avermektinů než buňky kmene S.avermitilis ATCC 53692, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu.
Podle předkládaného vynálezu mohou být takové polynukleotidové molekuly použity pro produkci nových kmenů • ·
S.avermitilis, které vykazují detekovatelně změny v produkci avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení jsou takové polynukleotidové molekuly použitelné pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, které produkují avermektiny ve sníženém poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze přirozenou aveC alelu. V jiném výhodném provedení jsou takové polynukleotidové molekuly použitelné pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, které produkují vyšší množství avermektinů ve srovnání se stejným kmenem, který exprimuje pouze přirozenou aveC alelu. V ještě dalším provedení jsou takové polynukleotidové molekuly použitelné pro produkci nových kmenů S.avermitilis, ve kterých byl aveC gen inaktivován.
Mutace aveC kódující sekvence zahrnují jakékoliv mutace, které způsobují aminokyselinové delece, adice nebo substituce v AveC genovém produktu, nebo které vedou ke zkrácení AveC genového produktu, nebo k jakékoliv kombinaci výše uvedených změn, a které vedou k požadovaným výsledkům. Například, předkládaný vynález poskytuje polynukleotidové molekuly obsahující sekvenci kódující AveC genový produkt S.avermitilis v plasmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo nukleotidovou sekvenci aveC ORF S.avermitilis uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO: 1), ale která dále obsahuje jednu nebo více mutací, které kódují substituce aminokyselinových zbytků jinými aminokyselinovými zbytky ve vybraných pozicích v AveC genovém produktu. V několika příkladných provedeních, které jsou uvedeny dále, mohou být takové substituce provedeny v jakékoliv aminokyselinové pozici 55, 138, 139 nebo 230, nebo v několika těchto pozicích.
Mutace aveC kódující sekvence jsou porvedeny jakoukoliv známou technikou, včetně chybové PCR nebo kazetové mutagenese.
• e
Například, oligonukleotidy-řízená mutagenese může být použita pro alteraci aveC ORF sekvence definovaným způsobem, například pro vložení jednoho nebo více restrikčních míst nebo terminačních kodonů, do specifických regionů v aveC ORF sekvenci. Způsoby jako je způsob popsaný v U.S. patentu
5605793, který obsahuje náhodnou fragmentaci, opakované cykly mutagenese a změn nukleotidů, mohou být také použity pro generování rozsáhlých knihoven polynukleotidů obsahujících nukleotidové sekvence kódující aveC mutace.
Řízené mutace mohou být výhodné, zejména tehdy, pokud slouží pro alteraci jednoho nebo více konzervovaných aminokyselinových zbytků v AveC genovém produktu. Například, srovnání odvozených aminokyselinových sekvencí AveC genových produktů a genových produktů homologických k AveC ze S.avermitilis (SEQ ID NO: 2), S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) a S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4), jak je uvedeno na obr. 6, ukazuje místa významné konzervace aminokyselinových zbytků mezi těmito kmeny. Řízená mutagenese, která vede ke změně jednoho nebo více z těchto konzervovaných aminokyselinových zbytků, může být zejména účinná v produkci nových mutantních kmenů vykazujících požadované alterace v produkci avermektinů.
Náhodná mutagenese může být také užitečná a může být provedena pomocí vystavení buněk S.avermitilis ultrafialovému nebo rentgenovému záření, nebo působením chemických mutagenů, jako je N-methyl-N'-nitrosoguanin, ethylmethansulfonat, kyselina dusitá nebo nitrogenmustard. Pro přehled technik mutagenese viz například Ausubel et al., 1989, výše.
Po připravení mutovaných polynukleotidových molekul jsou tyto molekuly testovány pro určení toho, zda mohou modulovat syntézu avermektinů ve S.avermitilis. Ve výhodném provedení je • · polynukleotidová molekula obsahující mutované nukleotidové sekvence testována pomocí komplementace kmene S.avermitilis, ve kterém byl aveC gen inaktivován za dosažení aveC negativního (aveC-) pozadí. V příkladu metody je mutovaná polynukleotidová molekula vložena do expresního plasmidu v operativní asociaci s jedním nebo více regulačními elementy, kde tento plasmid výhodně obsahuje také jeden nebo více genů resistence pro antibiotika umožňujících selekci transformovaných buněk. Tento vektor je potom transformován do aveC- hostitelských buněk pomocí známých technik a transformované buňky jsou selektovány a kultivovány ve vhodném fermentačním mediu za podmínek umožňujících nebo indukujících produkci avermektinů. Produkty fermentace jsou potom analyzovány HPLC pro stanovení schopnosti mutované polynukleotidové molekuly komplementovat hostitelskou buňku. Několik vektorů nesoucích mutovanou polynukleotidovou molekulu schopnou snižovat poměr B2:B1 avermektinů, včetně pSE188, pSE199 a pSE231, je uvedeno dále.
Předkládaný vynález poskytuje způsob pro identifikaci mutací aveC ORF S.avermitilis, které mění poměry a/nebo množství produkovaných avermektinů. Ve výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob pro identifikaci mutací aveC ORF, které mohou měnit poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1, který obsahuje: (a) stanovení poměru avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami kmene S.avermitilis, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a do kterých byla vložena a ve kterých je exprimována polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt; (b) stanovení poměru avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami stejného kmene S.avermitilis jako v kroku (a), které však exprimují pouze aveC alelu mající nukleotidovou sekvenci ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo nukleotidovou sekvenci homologickou k této sekvenci; a (c) srovnání poměru • · avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (a) s poměrem avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (b); kdy pokud je poměr avermektinů třídy. 2:třídy 1 produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (a) odlišný od poměru avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (b), tak byla identifikována mutace aveC ORF, která je schopná měnit poměr avermektinů třídy 2:třídy 1. Ve výhodném provedení mutace snižuje poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1.
V dalším výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob pro identifikaci mutací aveC ORF nebo genetického konstruktu obsahujícího aveC ORF, které mohou měnit množství produkovaných avermektinů, který obsahuje: (a) stanovení množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S.avermitilis, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a do kterých byla vložena a ve kterých je exprimována polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt nebo obsahující genetický konstrukt obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt; (b) stanovení množství avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S.avermitilis jako v kroku (a), které však exprimují pouze aveC alelu mající nukleotidovou sekvenci ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo nukleotidovou sekvenci homologickou k této sekvenci; a (c) srovnání množství avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (a) s množstvím avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (b); kdy pokud je množství avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (a) odlišné od množství avermektinů produkovaných buňkami S.avermitilis kroku (b), tak byla identifikována mutace aveC ORF nebo genetického konstruktu, která je schopná měnit množství avermektinů. Ve výhodném provedení mutace zvyšuje množství produkovaných avermektinů.
a ·
Všechny výše uvedené metody pro identifikaci mutací jsou provedeny za použití fermentačního kultivačního media doplněného kyselinou cyklohexankarboxylovou, ačkoliv mohou být použity jako prekursory použity také jiné vhodné mastné kyseliny, jako jsou například mastné kyseliny uvedené v tabulce 1.
Po identifikaci polynukleotidové molekuly, která moduluje produkci avermektinů žádoucím způsobem, se může stanovit místo mutace v nukleotidové sekvenci. Například, polynukleotidové molekula mající sekvenci nukleotidů kódující mutovaný AveC genový produkt může být izolována PCR a může být analyzována na sekvenci DNA za použití známých metod. Srovnáním DNA sekvence mutované aveC alely se sekvencí přirozené aveC alely mohou být určeny mutace odpovídající za alteraci produkce avermektinů. V konkrétních provedeních předkládaného vynálezu způsobují S.avermitilis AveC genové produkty obsahující buď substituce jedné aminokyseliny v pozici 55 (S55F) , 138 (S138T) , 139 (A139T) nebo 230 (G230D), nebo dvou aminokyselin v pozicích 138 (S138T) a 139 (A139T), změnu funkce AveC genového produktu, která mění poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1 (viz dále). Proto jsou polynukleotidové molekuly mající nukleotidové sekvence, které kódují mutované S.avermitilis AveC genové produkty obsahující aminokyselinové substituce v jednom nebo více aminokyselinových zbytcích 5, 138, 139 nebo 230, nebo v kombinace těchto zbytků, předmětem předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález dále poskytuje prostředky pro přípravu nových kmenů S.avermitilis, kde buňky uvedených kmenů obsahují mutovanou aveC alelu, která způsobuje alteraci v produkci avermektinů. Například, předkládaný vynález poskytuje rekombinantní vektory, které mohou být použity pro cílené ’·'......»
vložení jakékoliv polynukleotidové molekuly obsahující mutované nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu do místa aveC genu na S.avermitilis chromosomu, za účelem inserce nebo nahrazení aveC ORF nebo jeho části homologní rekombinací. Nicméně, podle předkládaného vynálezu může polynukleotidové molekula obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu také modulovat biosyntézu avermektinů tehdy, je-li insertována do chromosomu S.avermitilis v jiném místě než v aveC genu, nebo pokud je přítomná v buňkách S.avermitilis episomálně. Tak předkládaný vynález také poskytuje vektory obsahující polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu, kde tyto vektory mohou být použity pro inserci polynukleotidové molekuly v jiném místě chromosomu
S.avermitilis, než je aveC gen, nebo které mohou být přítomné episomálně.
Ve výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález vektory pro genovou substituci, které mohou být použity pro inserci mutované aveC alely do buněk kmene S.avermitilis, čímž vzniknou nové kmeny S.avermitilis, jejichž buňky produkují avermektiny ve změněném poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení je poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1 snížen. Takové vektory mohou být připraveny za použití mutovaných polynukleotidových molekul přítomných v expresních vektorech podle předkládaného vynálezu, jako je pSE188, pSE199 a pSE231, které jsou uvedeny dále.
V dalším výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález vektory, které mohou být použity pro inserci mutované aveC alely do buněk kmene S.avermitilis, čímž vzniknou nové kmeny, jejichž buňky produkují avermektiny ve změněném množství ve
r. . · · ··.·. ::
srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení je množství produkovaných avermektinů zvýšeno. V konkrétním provedení takový vektor dále obsahuje silný promotor známý v oboru, jako je například silný konstitutivní ermE promotor ze Saccharomyces erythraea, který je umístěn před a který je operativně navázán na aveC ORF. Takovým vektorem může být plasmid pSE189, který je popsán v příkladu 11, nebo může být takový vektor připraven za použití mutované aveC alely plasmidu pSE189.
V jiném výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález vektory, které jsou použitelné pro inaktivaci aveC genu v přirozeném kmenu S.avermitilis. V příkladném provedení mohou být takové vektory připraveny za použití mutované polynukleotidové molekuly přítomné v plasmidu pSE180 (ATCC 209605), který je popsán dále (obr. 3). Předkládaný vynález dále poskytuje vektory, které obsahují polynukleotidovou molekulu obshující nebo skládající se z nukleotidových sekvencí, které v normální situaci sousedí s aveC genem in sítu v chromosomu S.avermitilis, včetně, například, sousedních nukleotidových sekvencí podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1), kde tyto vektory mohou být použity pro deleci S.avermitilis aveC ORF.
Předkládaný vynález dále obsahuje způsoby pro přípravu nových kmenů S.avermitilis tvořených buňkami, které exprimují mutovanou aveC alelu a produkují pozměněný poměr a/nebo množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmenu S.avermitilis, který exprimuje pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S.avermitilis tvořených buňkami, které exprimují mutovanou aveC alelu a které produkují pozměněný poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 ve srovnání s buňkami stejného kmenu S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou • · · · · « aveC alelu, kde uvedený způsob obsahuje transformaci buněk S.avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, který mění poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmenu S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu, a selekci transformovaných buněk, které produkují pozměněný poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 ve srovnání s buňkami stejného kmenu S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení je poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1 snížen.
Ve výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S.avermitilis tvořených buňkami, které produkují pozměněné množství avermektinů, kde uvedený způsob obsahuje transformaci buněk S.avermitilis vektorem, který nese mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, jehož exprese způsobuje změnu množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmenu S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu, a selekci transformovaných buněk, které produkují pozměněné množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmenu S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení je množství produkovaných avermektinů třídy zvýšeno.
V jiném výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob pro přípravu nových kmenů S.avermitilis tvořených buňkami, které obsahují inaktivní aveC alelu, kde uvedený způsob obsahuje transformaci buněk S.avermitilis, které exprimují přirozenou aveC alelu, vektorem, který inaktivuje aveC alelu, a selekci transformovaných buněk, ve kterých byla aveC alela inaktivována. Ve výhodném příkladném provedení jsou buňky kmene S.avermitilis transformovány vektorem, který nese aveC alelu, která byla inaktivována mutací nabo náhradou části aveC alely heterologní genovou sekvencí, a selekci transformovaných buněk, ve kterých byla přirozená aveC alela nahrazena inaktivní aveC alelou. Inaktivace aveC alely může být stanovena HPLC analýzou produktů fermentace, jak je popsána dále. V konkrétním provedení popsaném dále je aveC alela inaktivována insercí ermE genu ze Saccharopolyspora erythaea do aveC ORF.
Předkládaný vynález dále poskytuje nové kmeny S.avermitilis tvořené buňkami, které byly transformovány jakoukoliv polynukleotidovou molekulou nebo vektorem podle předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S.avermitilis, jejichž buňky exprimují mutovanou aveC alelu místo nebo kromě přirozené aveC alely, kde buňky těchto nových kmenů produkují avermektiny v pozměněném poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání s produkcí avermektinů třídy 2:třídy 1 v buňkách stejného kmenu, který exprimuje pouze přirozenou alelu. Ve výhodném provedení je poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1 snížen. Takové nové kmeny jsou použitelné pro průmyslovou produkci komerčně dostupných avermektinů, jako je doramektin.
Cílem vyhledávacích testů podle předkládaného vynálezu je identifikace mutovaných alel aveC genu, jejichž exprese v buňkách S.avermitilis mění, přesněji snižuje, poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1. Ve výhodném provedení je poměr B2:B1 avermektinů produkovaných buňkami nového kmene S.avermitilis podle předkládaného vynálezu exprimujícími mutovanou aveC alelu, která snižuje poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 mezi než 1,6:1 a 0:1; ve
výhodnějším provedení je tento poměr od 1:1 do 0:1; a v nejvýhodnějším provedení je tento poměr od 0,84:1 do 0:1. V konkrétním provedení popsaném dále produkují nové buňky podle předkládaného vynálezu cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektiny v poměru menším než 1,6:1. V jiném konkrétním provedení popsaném dále produkují nové buňky podle předkládaného vynálezu cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektiny v poměru přibližně 0,94:1. V ještě jiném konkrétním provedení popsaném dále produkují nové buňky podle předkládaného vynálezu cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektiny v poměru přibližně 0,88:1. V ještě jiném konkrétním provedení popsaném dále produkují nové buňky podle předkládaného vynálezu cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektiny v poměru přibližně 0,84:1.
V dalším výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S.avermitilis obsahující buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, místo nebo kromě přirozené aveC alely, kde buňky tohoto nového kmenu produkují pozměněná množství avermektinů ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu. Ve výhodném provedení produkují nové kmeny vyšší množství avermektinů. V příkladném provedení obsahuje genetický konstrukt dále silný promotor, jako je silný konstitutivní promotor ermE ze Saccharopolyspora erythraea, který je umístěný před a v operativní vazbě s aveC ORF.
V dalším výhodném provedení poskytuje předkládaný vynález nové kmeny S.avermitilis obsahující buňky, ve kterých byl aveC gen inaktivován. Takové kmeny jsou použitelné jak z důvodů odlišného spektra avermektinů, které produkují ve srovnání s přirozenými kmeny, tak pro stanovení toho, jak ovlivňuje náhodná nebo cílená mutagenese aveC genu produkci avermektinů. V konkrétním provedení popsaném dále byly hostitelské buňky 'Τ' ·-' j-ÁY-
S.avermitilis geneticky upraveny tak, že obsahují inaktivovaný aveC gen. Například, kmen SE 180-11, popsaný v příkladech uvedených dále, byl připraven za použití přenosového plasmidu pSE180 (ATCC 209605) (Obr. 3), který byl konstruován pro inaktivaci aveC genu S.avermitilis insercí ermE genu pro resistenci do aveC kódujícího regionu.
Předkládaný vynález dále obsahuje rekombinantně exprimovaný, mutovaný S.avermitilis AveC genový produkt kódovaný jakoukoliv z výše uvedených polynukleotidových molekul podle předkládaného vynálezu, a způsoby jeho přípravy.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob pro produkci avermektinů, který obsahuje kultivaci buněk kmene S.avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který mění poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou alelu, v kultivačním mediu za podmínek umožňujících produkci avermektinů, a získání uvedených avermektinů z kultury. Ve výhodném prvedení je poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných v kultuře buňkami exprimujícími mutovanou aveC alelu snížen. Tento proces umožňuje dosažení vyšší účinosti při výrobě komerčně hodnotných avermektinů, jako je doramektin.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob pro produkci avermektinů, který obsahuje kultivaci buněk kmene S.avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, která mění množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene, které neexprimují mutovanou aveC alelu i * · * • * nebo genetický konstrukt, ale pouze přirozenou alelu, v kultivačním mediu za podmínek umožňujících produkci avermektinů, a získání uvedených avermektinů z kultury. Ve výhodném prvedení je množství avermektinů produkovaných v kultuře buňkami exprimujícími mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt zvýšeno.
Předkládaný vynález dále poskytuje nové avermektinové přípravky produkované kmenem S.avermitilis exprimujícím mutovanou aveC alelu, která kóduje genový produkt, který snižuje poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaný buňkami kmene S.avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu, kde avermektiny v novém přípravku jsou produkovány s nižším poměrem třídy 2:třídy 1, než je poměr avermektinů třídy 2-.třídy 1 produkovaný buňkami stejného kmene S.avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu.
Nové avermektinové přípravky mohou být připraveny ve formě, ve které jsou produkované ve vyčerpaném fermentačním mediu, nebo mohou být získány z tohoto media. Nové avermektinové přípravky mohou být částečně nebo významně přečištěny z kultivační kapaliny za použití známých biochemických technik pro přečištění, jako je srážení síranem vápenatým, dialýza, frakcionace podle velikosti, iontoměničová chromatografie, HPLC a podobně.
Použití avermektinů
Avermektiny jsou vysoce účinná antiparasitární činidla, které mají použití jako antihelmintika, ektoparasiticidní činidla, insekticidy a akaricidy. Avermektinové sloučeniny připravené způsoby podle předkládaného vynálezu jsou vhodná pro jakékoliv z těchto použití. Například, avermektinové sloučeniny .-.‘.Λ ϊ - -«U r . jb.-'ťi
-. ^ . - -.48 připravené podle předkládaného vynálezu jsou vhodné pro léčbu řízných onemocnění a tsvaů u člověka, zejména pro léčbu onemocnění a stavů způsobených parasitární infekcí, jak jsou v oboru známé. Viz např. Ikeda and Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Přesněji, avermektinové sloučeniny připravené podle předkládaného vynálezu jsou účinné pro léčbu různých onemocnění a stavů způsobených endoparasity, jako jsou hlísti, které mohou infikovat člověka, domácí zvířata, prasata, ovce, drůbež, koně a dobytek.
Přesněji, avermektinové sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou účinné proti hlístům, které infikují člověka, stejně jako proti těm, které infikují různé druhy zvířat. Mezi takové hlísty patří gastrointestinální parasiti jako je Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria a parasiti, kteří jsou nacházeni v krvi a jiných tkáních nebo orgánech, jako jsou filariové formy a extraintestinální formy Strongyloides a Trichinella.
Avermektinové sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou také účinné při léčbě ektoparasitárních infekcí, včetně například zamoření savců a ptáků členovci, které jsou způsobeny klíšťaty, roztoči, vešmi, blechami, masařkami, bodavým hmyzem nebo migrujícími larvami dvoukřídlého hmyzu, které mohou postihovat dobytek a koně, například.
Avermektinové sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou také účinné jako insekticidy proti domácím škůdcům, jako jsou například šváby, moli šatní a mouchy, stejně jako proti hmyzu škodícímu uskladněnému zrnu a zemědělským plodinám, jako jsou například pavouci, mšice, housenky a rovnokřídlí, jako jsou například kobylky.
Mezi zvířata, která mohou být léčena avermektinovými sloučeninami připravenými podle předkládaného vynálezu, patří ovce, dobytek, koně, vysoká zvěř, kozí, prasata, ptáci včetně drůbeže, a psi a kočky.
Avermektinové sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou podány ve formě vhodné pro specifické zamýšlené použití, konkrétní druh léčeného zvířete a podle typu parasita nebo hmyzu, který způsobuje infekci. Při použití jako antiparasitární činidlo může být avermektinová sloučenina připravená podle předkládaného vynálezu podána orálně ve formě kapsle, bolusu, tablety nebo kapaliny, nebo může být podána nástřikem, nebo injekcí nebo ve formě implantátu. Takové prostředky jsou připraveny běžným způsobem, podle standardní veterinární praxe. Kapsle, bolusy nebo tablety mohou být připraveny smísením aktivní složky s vhodným jemně děleným ředidlem nebo nosičem, který dále obsahuje činidlo podporující rozpadavost a/nebo pojivo jako je škrob, laktosa, talek, stearan hořečnatý a podobně. Veterinární prostředky mohou být připraveny rozpuštěním aktivní složky ve vodném roztoku společně s dispergačními nebo smáčivými činidly a podobně. Injekční prostředky mohou být připraveny ve formě sterilních roztoků, které mohou obsahovat další substance, jako jsou například soli a/nebo glukosa upravující izotonicitu roztoku s izotonicitou krve.
Takové prostředky obsahují různé množství aktiviní sloučeniny, v závislosti na pacientovi nebo druhu léčeného zvířete, na závažnosti a typu infekce a na tělesné hmotnosti léčeného jedince. Obecně, pro orální podání je vhodná dávka aktivní sloučeniny od přibližně 0,001 do 10 mg na kg tělesné hmotnosti jedince a je podána v jedné dávce neboje rozdělena do : iytCyvύ-ΐ civyvcy-vv·.
1-5 denních dávek.Nicméně, mohou být případy, u kterých jsou indikovány vyšší nebo nižší dávky, které jsou určeny lékáren nebo veterinářem podle klinických příznaků.
Alternativně může být avermektinová sloučenina produkovaná podle předkládaného vynálezu podána v kombinaci s potravou pro zvířata a pro tento účel může být připravena koncentrovaná potravinová přísada nebo směs pro smísení s normální potravou pro zvířata.
Pro použití jako insekticid a pro hubení zemědělských škůdců může být avermektinová sloučenina připravená podle předkládaného vynálezu použita ve formě spreje, prášku, emulse a podobně, podle standardních zemědělských zvyklostí.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Fermentace Streptomyces avermitilis a analýza B2:B1 avermektinů
Kmeny deficientní v aktivitě dehydrogenasy rozvětvených 2oxo kyselin i 5-0-methyltransferasy neprodukovaly žádné avermektiny, pokud nebylo fermentační medium doplněno mastnými kyselinami. Tento příklad ukazuje, že v takových mutantech je možno získat různé poměry B2:B1 avermektinů, když je biosyntéza iniciována přítomností různých mastných kyselin.
1. Materiály a metody
Streptomyces avermitilis ATCC 53692 byl skladován při -70 °C ve formě celého kultivačního media připraveného v očkovacím mediu skládajícím se z: škrobu (Nadex, Laing National) - 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g; Ardamin pH ·
(Yeast Products lne.) - 5 g; uhličitanu vápenatého - 1 g. Konečný objem byl upraven na 1 litr pomocí vody, pH bylo upraveno na 7,2 a medium bylo autoklavováno při 121 °C po dobu 25 minut.
ml roztáté suspenze přípravku uvedeného výše byly použity pro očkování do nádob obsahujících 50 ml stejného media. Po 48 hodinové inkubaci při 28°C na rotační třepačce při 180 rpm byly 2 ml media použity pro očkování do nádob obsahujících 50 ml produkčního media, které obsahovalo: škrob - 80 g; uhličitan vápenatý - 7 g; Pharmamedia - 5 g; hydrogenfosforečnan vápenatý - 1 g; síran hořečnatý - 1 g; kyselinu glutamovou - 0,6 g; heptahydrat síranu železnatého - 0,01 g; síran zinečnatý 0,001 g; síran manganatý - 0,001 g. Konečný objem byl upraven na 1 litr přidáním vody, pH bylo upraveno na 7,2 a medium bylo autoklavováno při 121 °C po dobu 25 minut.
Substráty tvořené různým karboxylovými kyselinami (viz tabulku 1) byly rozpuštěny v methanolu a byly přidány do fermentačního media 24 hodin po naočkování v konečné koncentraci 0,2 g/litr. Fermentační medium bylo inkubováno po dobu 14 dnů při 28 °C, potom bylo medium odstředěno (2500 rpm po dobu 2 minut) a supernatant byl odstraněn. Myceliální peleta byla extrahována acetonem (15 ml), potom dichlormethanem (30 mi) a organické fáze byla separována, přefiltrována a odpařena do sucha. Zbytek byl vyjmut do methanolu (1 ml) a byl analyzován HPLC za použití Hewlett-Packard 1090A kapalinového chromatografu vybaveného skenovacím diodovým detektorem při 240 nm. Použitou kolonou byla Beckman Ultrasphere C-18, 5 μΜ, 4,6 mm x 25 cm, při teplotě 40 °C. 25 μΐ výše uvedené roztoku bylo injekčně vneseno do kolony. Eluce byla provedena s lineárním gradientem methanol-voda od 80:20 do 95:5 během 40 min při 0,85 ml/min. Dvě standardní koncentrace cyklohexyl B1 byly použity • ·
pro kalibraci detektoru a byla měřena plocha pod křivkou pro B2 a Bl avermektiny.
2. Výsledky
HPLC retenční časy zjištěné pro B2 a Bl avermektiny a poměry třídy 2:třídy 1 jsou uvedeny v tabulce 1.
HPLC retenční čas (min) Poměr
Substrát B2 Bl B2:B1
kyselina 4-tetrahydropyrankarboxylová 8,1 14,5 0,25
kyselina isomáselná 10,8 18,9 0,5
kyselina 5-furoová 7,6 14,6 0, 62
kyselina S-(+)-2-methylmáselná 12,8 21,6 1,0
kyselina cyklohexankarboxylové 16, 9 26, 0 1,6
kyselina 3-thiofenkarboxylová 8,8 16, 0 1,8
kyselina cyklopentankarboxylové 14,2 23, 0 2,0
kyselina 3-trifluormethylmáselná 10, 9 18,8 3,9
kyselina 2-methylpentanová 14,5 24,9 4,2
kyselina cykloheptankarboxylová 18,6 29, 0 15,0
Data uvedená v tabulce 1 ukazují extrémně široké rozmezí poměrů produkovaných B2:B1 avermektinů, což ukazuje na významné odlišnosti v konversi sloučenin třídy 2 na sloučeniny třídy 1, které jsou závislé na charakteru dodané výchozí mastné kyseliny. Tato tabulka ukazuje, že změny poměrů B2:B1 vzniklé v důsledku alterace AveC proteinu mohou být specifické pro konkrétní substráty. Proto musí být vyhledávání mutantů vykazujících změny v poměru B2:B1 pro určitý substrát provedeno za přítomnosti tohoto substrátu. Následující příklad popisuje použití kyseliny cyklohexankarboxylové jako skríningového
substrátu. Tento substrát je použit pouze pro ilustraci předkládaného vynálezu a nijak neomezuje jeho rozsah.
Příklad 2: Izolace aveC genu
Tento příklad popisuje izolaci a charakterizaci regionu chromosomu Streptomyces avermitilis, který kóduje AveC genový produkt. Jak bude uvedeno dále, aveC gen byl identifikován jako gen modifikující poměr produkovaných cyklohexylB2:cyklohexyl-Bl avermektinů.
1. Kultivace Streptomyces pro izolaci DNA
Následující způsob byl použit pro kultivaci Streptomyces. Jedna kolonie S.avermitilis ATCC 31272 (izolét č. 2) byla izolována na polovičním mediu YPD-6 obsahujícím: Difco kvasinkový extrakt - 5 g; Difco Bacto-pepton - 5 g; dextrosu 2,5 g; MOPS - 5 g; Difco Bacto agar - 15 g. Konečný objem byl upraven na 1 litr přidáním dř^O, pH bylo upraveno na 7,0 a medium bylo autoklavováno při 121 °C po dobu 25 minut.
Mycelia kultivovaná na výše uvedeném mediu byla použita pro inokulaci 10 ml TSB media (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, v 1 1 dH2O, autoklavované při 121 °C po dobu 25 minut) ve zkumavce 25 mm x 150 mm, na rotační třepačce (300 rpm) při 28 °C po dobu 48-72 hodin.
2. Izolace chromosomální DNA ze Streptomyces
Alikvoty (0,25 ml nebo 0,5 ml) mycelií kultivovaných způsobem popsaným výše byly umístěny do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly koncentrovány centrifugací při 12000 x g po dobu 60 sekund. Supernatant byl ' » ; -d „ -Λ?.1' -· >-~ζ »·*· ** · 'ί ν'Ρ ^..«Lr.i^isAiSái'!
odstraněn a buňky byly resuspendovány ve 0,25 ml TSE pufru (20 ml 1,5 M sacharosy, 2,5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 ml 1 M EDTA, pH 8,0 a 75 ml dH2O) , který obsahoval 2 mg/ml lysozymu. Vzorky byly inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C za třepání, byly vneseny do AutoGen 540™ automatizovaného přístroje pro izolaci nukleových kyselin (Integrated Separation Systems, Natick, MA) a genomová DNA byla izolována za použití Cycle 159 (softwarová výbava) podle návodu výrobce.
Alternativně bylo 5 ml mycelií umístěno do zkumavky 17 mm x 100 mm, buňky byly koncentrovány centrifugací při 3000 rpm po dobu 5 minut a supernatant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 1 ml TSE pufru, byly koncentrovány centrifugací při 3000 rpm po dobu 5 minut a supernatant byl odstraněn. Buňky byly resuspendovány v 1 ml TSE pufru obsahujícím 2 mg/ml lysozymu a provedla se inkubace při 37 °C s třepáním po dobu 30-60 minut. Po inkubaci se přidalo 0,5 ml 10% dodecylsíranu sodného (SDS) a buňky se inkubovaly při 37 °C, dokud nebyla lýza buněk dokončena. Lyzát se ínkuboval při 65 °C po dobu 10 minut, ochladil se na teplotu okolí, rozdělil se do dvou 1,5 ml Eppendorfových zkumavek a extrahoval se 1 x 0,5 ml fenol/chloroformem (50% fenol předem uvedený do rovnováhy 0,5 M Tris, pH 8,0; 50% chloroform). Vodná fáze se odebrala a extrahovala se 2 až 5 x chloroformem:isoamylalkoholem (24:1). DNA se vysrážela přidáním 1/10 objemu 3M octanu sodného, pH 4,8, inkubací směsi na ledu po dobu 10 minut, centrifugováním směsi při 15000 rpm při 5 °C po dobu 10 minut a odstraněním supernatantu pro pročištění zkumavky, do které se přidal 1 objem isopropanolu. Směs supernatantu a isopropanolu se potom inkubovala na ledu po dobu 20 minut, centrifugovala se při 15000 rpm po dobu 20 minut při teplotě 5 °C, supernatant se odstranil a DNA peleta se promyla lx 70% ethanolem. Po usušení pelety se DNA resuspendovala v TE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
3. Izolace plasmidové DNA ze Streptomyces
Alikvota (1,0 ml nebo 0,5 ml) mycelia byla umístěna do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly koncentrovány centrifugací při 12000 x g po dobu 60 sekund. Supernatant byl odstraněn a buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharosy a byly koncentrovány centrifugací při 12000 x g po dobu 60 sekund a supernatant byl odstraněn. Buňky byly potom resuspendovány ve 0,25 ml TSE pufru, který obsahoval 2 mg/ml lysozymu a byly inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C za třepání a vneseny do AutoGen 540™ automatizovaného přístroje pro izolaci nukleových kyselin. Plasmidová DNA byla izolována za použití Cycle 106 (softwarová výbava) podle návodu výrobce.
Alternativně bylo 1,5 ml mycelia umístěno do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a buňky byly koncentrovány centrifugací při 12000 x g po dobu 60 sekund. Supernatant byl odstraněn a buňky byly resuspendovány v 1,0 ml 10,3% sacharosy a byly koncentrovány centrifugací při 12000 x g po dobu 60 sekund a supernatant byl odstraněn. Buňky byly potom resuspendovány ve 0,5 ml TSE pufru, který obsahoval 2 mg/ml lysozymu a byly inkubovány po dobu 15-30 minut při 37 °C. Po inkubaci bylo přidáno 0,25 ml alkalického SDS (0,3 N NaOH, 2% SDS) a buňky byly inkubovány při 55 °C po dobu 15-30 minut, dokud nebyl roztok čirý. K roztoku DNA byl přidán octan sodný (0,1 ml, 3M, pH 4,8) a roztok byl potom inkubován na ledu po dobu 10 minut. DNA vzorky byly centrifugovány při 14000 rpm po dobu 10 minut při 5 °C. Supernatant byl odstraně pro pročištění zkumavky a bylo přidáno 0,2 ml fenol:chloroformu (50% fenol:50% chloroform) a provedlo se jemné promísení. DNA roztok byl centrifugován při 14000 rpm po dobu 10 minut při 5 °C a horní vrstva byla odstraněna pro pročištěni Eppendorfovi zkumavky. Přidal se isopropanol (0,75 ml), roztok se jemně promísil a potom se inkuboval při teplotě okolí po dobu 20 minut. DNA roztok byl centrifugován při 14000 rpm po dobu 15 minut při 5 °C, supernatant se odstranil a DNA peleta se promyla 70% ethanolem, sušila se a resuspendovala se v TE pufru.
4. Izolace plasmidové DNA z E. coli
Jedna trasnformovaná kolonie E. coli byla naočkována do 5 ml Luria-Bertani (LB) media (Bacto-Trypton - 10 g; Bacto kvasinkový extrakt - 5 g; a NaCl 10 g v 1 litru dH2O, pH 7,0, autoklavované při 121 °C po dobu 25 minut a doplněné 100 pg/ml ampicilinem). Kultura byla inkubována přes noc a 1 ml alikvota byla vnesena do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky. Vzorky z kultury byly vneseny do AutoGen 540™ automatizovaného přístroje pro izolaci nukleových kyselin a plasmidová DNA byla izolována za použití Cycle 3 (softwarová výbava) podle návodu výrobce.
5. Příprava a transformace protoplastů S.avermitilis
Jednotlivé kolonie S.avermitilis byly izolovány na 1/2 YPD6. Mycelia byla použita pro inokulaci 10 ml TSB media ve zkumavce 25 mm x 150 mm, která byla inkubována za třepání (300 rpm) při 28 °C po dobu 48 hodin. 1 ml mycelia byl použit pro inokulaci 50 ml YEME media. YEME medium obsahuje na litr: Difco kvasinkový extrakt - 3 g; Difco Bacto-peptod - 5 g; Difco Malt extrakt - 3 g; sacharosu - 300 g. Po autoklavování při 121 °C po dobu 25 minut byly přidány následující složky: 2,5 M MgCl2.6H2O (separátně autoklavované při 121 °C po dobu 25 minut) - 2 ml; a glycin (20%) (sterilizovaný filtrací) - 25 ml.
·,_ r jj. .. .
Mycelia byla kultivována při 30 °C po dobu 48-72 hodin a byla získána centrifugací v 50 ml centrifugační zkumavce (Falcon) při 3000 rpm po dobu 20 minut. Supernatant byl odstraněn a mycelia byla resuspendována v P pufru, který obsahoval: sacharosu - 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCl2.6H2O - 2,02 g; H2O - 600 ml; K2PO4 (0,2%) - 10 ml; roztok stopových prvků 20 ml; CaCl2 . H2O (3,68%) - 100 ml; a MES pufr (1,0 M, pH 6,5)
- 10 ml (roztok stopových prvků obsahoval na litr: ZnCl2 - 40 mg; FeCl3.6H2O - 200 mg; CuCl2.2H2O - 10 mg; MnCl2.4H2O - 10 mg; Na2B4O7.10 H2O - 10 mg; (NH4) 3Mo7024.4 H2O - 10 mg). pH bylo upraveno na 6,5, konečný objem byl upraven na 1 litr a medium bylo horké filtrováno přes 0,45 mikronový filtr.
Mycelia byla peletována při 3000 x rpm po dobu 20 minut, supernatant byl odstraněn a mycelia byla resuspendována ve 20 ml P pufru obsahujícího 2 mg/ml lysozymu. Mycelia byla inkubována při 35 °C po dobu 15 minut a potom byl mikroskopicky stanoven rozsah tvorby protoplastů. Pokud byla tvorba protoplastů dokončená, tak byly protoplasty centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut. Supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 10 ml P pufru. Protoplasty centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut, supernatant byl odstraněn, protoplasty byly resuspendovány ve 2 ml P pufru a přibližně 1 x 109 protoplastů bylo umístěno do 2,0 ml kryogenických zkumavek (Nalgene).
Zkumavka obsahující 1 x 109 protoplastů byla centrifugována při 8000 rpm po dobu 10 minut, supernatant byl odstraněn a protoplasty byly resuspendovány v 0,1 ml P pufru. 2 μρ transformující DNA byly přidány k protoplastům a potom byl okamžitě přidán pracovní T pufr (0,5 ml). Základ pro T pufr obsahoval: PEG-1000 (Sigma) - 25 g; sacharosa - 2,5 g; H20 - 83 ml. pH bylo upraveno na 8,8 pomocí IN NaOH (sterilizovaného filtrací) a základ pro T-pufr byl sterilizován filtrací a uskladněn při 4 °C. Pracovní T pufr, připravený v den použití, obsahoval: základ pro T pufr - 8,3 ml; K2PO4 (4 mM) - 1,0 ml; CaCl2.2 H2O (5 M) - 0,2 ml; a TES (1 M, pH 8) - 0,5 ml. Každá složka pracovního T pufru byla samostatně sterilizována filtrací.
Během 20 sekund od přidání T pufru k protoplastům byl přidán také 1 ml P pufru a protoplasty byly centrifugovány při 8000 rpm po dobu 10 minut. Supernatant byl odstraně a protoplasty byly resuspendovány v 0,1 ml P pufru. Protoplasty byly potom umístěny na RM14 medium, které obsahovalo: sacharosu - 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCl2.6 H2O - 10,12 g; glukosu - 10 g; Difco Casamino kyseliny - 0,1 g; Difco kvasinkový extrakt - 5 g;
Difco Oatmeal Agar - 3 g; Difco Bacto Agar - 22 g; dH2O - 800 ml. Roztok byl autoklavován při 121 °C po dobu 25 minut. Po autoklavování byly přidány následující sterilní složky: K2PC>4 (0,5% - 10 ml; CaCl2.2 H2O (5 M) - 5 ml; L-prolin (20%) - 15 ml; MES pufr (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml; roztok stopových prvků (jak byl popsán výše) - 2 ml; cykloheximid (25 mg/ml) - 40 ml) ; a 1 N NaOH - 2 ml. 25 ml RM14 media bylo použito na plotnu a plotny byly sušeny po dobu 24 hodin před použitím.
Protoplasty byly inkubovány při 95% vlhkosti při 30 °C po dobu 20-24 hodin. Pro selekci transformantů resistentních na thiostrepton byl na RM14 regenerační plotny rovnoměrně nanesen 1 ml pufru obsahujícího 125 gg/ml thiostreptonu. Tento pufr obsahoval na 100 ml: sacharosu - 10,3 g; roztok stopových prvků (jak byl popsán výše) - 2 ml; a MES (1 M, pH 6,5) - 1 ml. Protoplasty byly inkubovány při 95% vlhkosti při 30 °C po dobu
7-14 dnů, doku nebyly viditelné kolonie resistentní na thiostrepton (Thior) .
.....
• < · ·
6. Transformace protoplastů Streptomyces lividans
V některých případech byly pro transformaci použity S. lividans (získané od John Innes Institute, Norwich, U.K.). Metody a prostředky pro kultivaci, protoplastování a transformování S. lividans jsou popsány v Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K., a byly provedeny způsobem popsaným v této publikaci. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů S. lividans způsobem popsaným výše.
7. Analýza fermentace kmenů S.avermitilis
Mycelia S.avermitilis kultivovaná na 1/2 YPD-6 po dobu 4-7 dnů byla naočkována do zkumavek 1x6 palců obsahujících předem připravené medium a 5 mm skleněné korálky. Předpřipravené medium obsahovalo: rozpustný škrob (buď řídký varem upravený škrob nebo KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/1; Pharmamedia - 15 g/1; Ardamin pH - 5 g/1 (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO3 - 2 gúl; 2x bcfa (bcfa označuje mastné kyseliny s rozvětveným řetězcem) obsahující konečnou koncentraci v mediu 50 ppm kyseliny 2-(+/-)-methylmáselné, 60 ppm kyseliny methylmáselné a 20 ppm kyseliny isovalerové. pH bylo upraveno na pH 7,2 a medium bylo autoklavováno při 121 °C po dobu 25 minut.
Zkumavka se třepala při úhlu 17° při 215 rpm při 29 °C po dobu 3 dnů. 2 ml alikvota očkovací kultury byla použita pro inokulaci 300 ml Erlenmeyerovi zkumavky obsahující 25 ml produkčního media, které obsahovalo: škrob (buď řídký varem upravený škrob nebo KOSO) - 160 g/1; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/1; Ardamin pH - 10 g/1; K2HPO4 - 2 g/1; MgSO4.4 H2O - 2 g/1; FeSO4.7 H2O - 0,02 g/1; MnCl2 - 0,002 g/1; ZnSO4.7 H2O - 0,002 g/1; caCC>3 - 14 g/1; 2x bcfa (jako výše); a kyselinu cyklohexankarboxylovou (CHC) (připravenou jako 20% roztok při pH 7,0) - 800 ppm. pH bylo upraveno na pH 6,9 a medium bylo autoklavováno při 121 °C po dobu 25 minut.
Po inokulaci byla zkumavka inkubována při 29 °C po dobu 12 dnů za třepání při 200 rpm. Po inkubaci byl ze zkumavky odebrán 2 ml vzorek, byl naředěn 8 ml methanolu, promísen a směs byla centrifugována při 1250 x g po dobu 10 minut pro peletování drtě. Supernatant byl potom analyzován HPLC za použití Beckman Ultrasphere ODS kolony (25 cm x 4,6 mm ID) s průtokem 0,75 ml/min a za detekce podle absorbance při 240 nm. Mobilní fází byl methanol/voda/acetonitril (86/8,9/5,1).
8. Izolace PKS genů S.avermitilis
Byla připravena kosmidová knihovna S.avermitilis (ATCC 31272, SC-2) chromosomální DNA a byla hybridizována ketosynthasovou (KS) sondou připravenou z fragmentu genu pro polyketid-synthasu (PKS) Saccharopolyspora erythraea. Podrobný popis přípravy kosmidových knihoven je uveden například v Sambrook et al·., 1989, výše. Podrobný popis přípravy knihoven Streptomyces chromosomální DNA je uveden v Hopwood et al.,
1985, výše. Kosmidové klony obsahující regiony hybridizujicí na ketosynthasu byly identifikovány hybridizací na 2,7 kb NdeI/Eco47III fragment z pEX26 (získaný od Dr. P. Leadlay, Cambridge, UK). Přibližně 5 ng pEX26 bylo tráveno Ndel a Eco47lII. Reakční směs byla vnesena na 0,8% SeaPlaque GTG agarosový gel (FMC BioProducts, Rockland, ME). 2,7 kb NdeI/Eco47III fragment byl excidován z gelu po elektroforese a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ od Epicentre Technologies, za použití Fast protokolu. 2,7 kb NdeI/Eco47III fragment byl označen [a-32P]dCTP (deoxycytidin-5'-trifosfat, tetra (trimethylammoniová) sůl, [a-32P]-) (NEN-DuPont, Boston,
MA) za použití BRL Nick Translation systému (BRL Life technologies, Inc., Gaithersburg, MD, podle návodu výrobce. Typická reakce byla provedena v objemu 0,05 ml. Po adici 5 μΐ stop pufru byla značená DNA oddělena od neinkorporovaných nukleotidů za použití G-25 Sephadex Quick Spin™ kolony (Boehringer Mannheim) podle návodu výrobce.
Přibližně 1800 kosmidových klonů bylo vyšetřováno hybridizací kolonií. Bylo identifikováno 10 klonů, které hybridizovaly silně na KS sondu Sacch. erythraea. E. coli kolonie obshaující kosmidovou DNA byly kultivovány na LB kapalném mediu a kosmidová DNA byla izolována z každé kultury na AutoGen 540™ automatizovaném přístroji pro izolaci za použití Cycle 3 (softwarové výbava) podle návodu výrobce. Mapování restrikčními endonukleasami a southernův přenos ukázaly, že pět klonů obsahuje překrývající se chromosomální regiony. S.avermitilis genomová BamHI restrikční mapa pěti kosmidů (t.j. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) byla konstruována analýzou překrývajících se kosmidů a hybridizací (obr. 4) .
9. Identifikace DNA, která moduluje poměry avermektinů B2:B1 a identifikace aveC ORF
Následující metody byly použity pro testování subklonovaných fragmentů získaných z pSE66 kosmidového klonu na jejich schopnost modulovat poměry avermektinů B2:B1 v AveC mutantech. pSE66 (5 μρ) byl tráven Sací a BamHI. Reakční směs byla vnesena na 0,8% SeaPlaque™ GTG agarosový gel (FMC BioProducts, 2,9 kb fragment byl excidován z gelu po elektroforése a DNA byla • « · · · · • *>
« · získána z gelu za použití GELase™ od Epicentre Technologies, za použití Fast protokolu. Přibližně 5 μρ kyvadlového vektoru pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) bylo tráveno Sací a BamHI. Přibližně 0,5 μρ 2,9 kb insertu a 0,5 μρ tráveného pWHM3 bylo smíseno a provedla se inkubace přes noc s 1 jednotkou ligasy (New England Biolabs, lne., Beverly, MA) při 15 °C, v celkovém objemu 20 μΐ, podle návodu výrobce. Po inkubaci se 5 μΐ ligační směsi inkubovalo při 70 °C po dobu 10 minut, ochladilo se na teplotu okolí a použilo se pro transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk (BRL) podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů . resistentních na ampicilin a přítomnost 2,9 kb SacI/BamHI insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plasmid byl označen pSE119.
Protoplasty S.avermitilis kmene 1100-SC38 (Pfizer in-house kmen) byly připraveny a transformovány pSE119 způsobem popsaným v části 5. Kmen 1100-S38 je mutant, který produkuje významně více cyklohexyl-B2 formy avermektinů než cyklohexyl-Bl formy avermektinů, když mu je dodávána kyselina cyklohexankarboxylová (B2:B1 je přibližně 30:1). pSE119 použitý pro transformaci protoplastů S.avermitilis byl izolován buď z E. coli kmenu GM 2163 (získaného od Dr. B.J. Bachmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), E. coli kmenu DMI (BRL) nebo S. lividans kmenu TK64. Transformanty kmenu 1100-SC38 resistentní na thiostrepton byly izolovány a byla provedena HPLC analýza produktů fermentace. Transformanty S.avermitilis kmenu 1100SC38 obsahující pSE119 produkovaly změněný poměr cyklohexylB2:cyklohexyl-Bl avermektinů přibližně 3,7:1 (tabulka 2).
Po potvrzení toho, že pSE119 může modulovat poměr B2:B1 avermektinů v AveC mutantech byla insertovaná DNA sekvenována.
• 9 ·* • 9 9 * · * ·> · •99« 99
Přibližně 10 pg pSE119 bylo izolováno za použití kitu pro izolování DNA (Qiagen, Valencia, CA) podle návodu výrobce a tato DNA byla sekvenována za použití ABI 373A Automatizovaného DNA sekvenátoru (Perkin Elmer, Foster City, CA). Sekvenační data byla sestavena a editována za použití Genetic Computer Group programů (GCG, Madison, WI). DNA sekvence a aveC ORF jsou uvedeny na obr. 1 (SEQ ID NO: 1).
Nový plasmid, označený jako pSE118, byl připraven následujícím způsobem. Přibližně 5 pg pSE66 bylo tráveno Sphl a BamHI. Reakční směs byla vnesena na 0,8% SeaPlaque™ GTG agarosový gel (FMC BioProducts, 2,8 kb SphI/BamHI fragment byl excidován z gelu po elektroforése a DNA byla získána z gelu za použití GELase™ od Epicentre Technologies, za použití Fast protokolu. Přibližně 5 pg kyvadlového vektoru pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) bylo tráveno Sphl a BamHI. Přibližně 0,5 pg 2,8 kb insertu a 0,5 pg tráveného pWHM3 bylo smíseno a provedla se inkubace přes noc s 1 jednotkou ligasy (New England Biolabs) při 15 °C, v celkovém objemu 20 pl, podle návodu výrobce. Po inkubaci se 5 pl ligační směsi inkubovalo při 70 °C po dobu 10 minut, ochladilo se na teplotu okolí a použilo se pro transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost 2,8 kb SphI/BamHI insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plasmid byl označen pSE118. Insertované DNA v pSE118 a pSE119 se překrývají v přibližně 838 nukleotidech (obr. 4).
Protoplasty S.avermitilis kmene 1100-SC38 byly transformovány pSE118 způsobem popsaným výše. Transformanty kmenu 1100-SC38 resistentní na thiostrepton byly izolovány a byla provedena HPLC analýza produktů fermentace. Transformanty • » « • ·· · »· »·
S.avermitilis kmenu 1100-SC38 obsahující pSE118 neprodukovaly změněný poměr cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů ve srovnání s kmenem 1100-SC38 (tabulka 2).
10. PCR amplifikace aveC genu z chromosomální DNA S.avermitilis
1,2 kb fragment obsahující aveC ORF byl izolován z chromosomální DNA S.avermitilis PCR amplifikaci za použití primerů navržených na základě aveC nukleotidové sekvence uvedené výše. PCR primery byly získány od Genosys
Biotechnologies lne. (Texas). Pravostranný primer měl sekvenci: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6) a levostranný primer měl sekvenci: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3’ (SEQ ID NO: 7). PCR reakce byla provedena za použití Deep Vent™ polymerasy (New England Biolabs) v pufru dodávaném výrobcem a za přítomnosti 300 μΜ dNTP, 10% glycerolu, 200 pmol každého primeru, 0,1 pg templátu a 2,5 jednotek enzymu v konečném objemu 100 μΐ, za použití Perkin Elmer Cetus teplotního cyklovače. Teplotní profil prvního cyklu byl 95 °C po dobu 5 minut (denaturační krok), 60 °C po dobu 2 minut (tepelné zpracování) a 72 °C po dobu 2 minut (extense). Dalších 24 cyklů mělo stejný teplotní profil s tou výjimkou, že denaturační krok byl zkrácen na 45 sekund a tepelné zpracování bylo zkráceno na 1 minutu.
Produkt PCR byl zpracován elektroforesou na 1% agarosovém gelu a byl detekován jeden DNA proužek velikosti přibližně 1,2 kb. DNA byla přečištěna z gelu a byla ligována s 25 ng linearizovaného pCR-Blun vektoru s lepivými konci (Invitrogen) v molárním poměru vektoru:insertu 1:10 podle návodu výrobce. Ligační směs byla použita pro transformaci One Shot™ kompetentních E. coli buněk (Invitrogen) podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na • · · » • · · · ampicilin a přítomnost 1,2 kb insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plasmid byl označen jako pSE179.
Insertová DNA z pSE179 byla izolována trávením BamHI/Xbal, byla separována elektroforesou, byla přečištěna z gelu a byla ligována s kyvadlovým vektorem pWHM3, který byl také tráven BamHI/Xbal, v celkové DNA koncentraci 1 pg a molárním poměru vektor:insert 1:5. Ligační směs byla použita pro transformaci kompetentních E. coli DH5a buněk podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost 1,2 kb insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plasmid, který byl označen jako pSE186 (obr. 2, ATCC 209604), byl transformován do E. coli DMI a plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin.
Výsledky
Byl identifikován 2,9 kb SacI/BamHI fragment pSE119, který po transformaci do S.avermitilis kmene 1100-SC38 významně mění poměr produkovaných avermektinů B2.-B1. Za normálních okolností má S.avermitilis kmene 1100-SC38 poměr B2:B1 přibližně 30:1, ale po transformaci vektorem obsahujícím 2,9 kb SacI/BamHI fragment se poměr B2:B1 avermektinům sníží na přibližně 3,7:1. Post-fermentační analýza kultur transformantů potvrdila přítomnost transformující DNA.
2,9 kb fragment pSE119 byl sekvencován a byl identifikován 0,9 kb ORF (obr. 1) (SEQ ID NO: 1), který obsahuje Pstl/Sphl fragment, který byl dříve mutován pro produkci 'pouze B2 produktů (Ikeda et al., 1995, výše). Srovnávání tohoto ORF nebo jemu odpovídajícího polypeptidu se známými databázemi (GenEBML, SWISS-PROT) neukázalo žádnou silnou homologii se známými DNA nebo proteinovými sekvencemi.
.LIr AY·','.,.'.
, A, • · · ·
Tabulka 2 ukazuje fermentační analýzu S.avermitilis kmene 1100-SC38 transformovaného různými plasmidy.
Tabulka 2
Kmen S.avermitilis počet testovaných průměrný poměr
(transformující plasmid) transformantů B2:B1
1100-SC38 (žádný) 9 30,66
1100-SC38 (pWHM3) 21 31,3
1100-SC38 (pSE119) 12 3,7
1100-SC38 (pSE118) 12 30,4
1100-SC38 (pSE185) 14 27,9
Příklad 3: Konstrukce AveC mutantů S.avermitilis
Tento příklad popisuje konstrukci několika různých AveC mutantů S.avermitilis za použití prostředků a způsobů popsaných výše. Obecný popis technik pro vkládání mutací do genu Streptomyces je uveden v Kieser and Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204: 430-458. Podrobnější popis je uveden v Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2): 226-233, a v Stutzman-Engwall et al.,
1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154. Tyto práce jsou zde úplné uvedeny jako odkazy.
1. Inaktivace aveC genu S.avermitilis
AveC mutanty obsahující inaktivované aveC geny byly konstruovány za použití několika metod, jak jsou podrobně popsány dále.
V první metodě byl 640 bp SphI/Pstl fragment vnitřní k aveC genu v pSE119 (plasmidu popsanému výše) nahrazen ermE genem (pro resistenci na erythromycin) ze Sacch. erythraea. ErmE gen • · ···· · » · * byl izolován z pIJ4026 (od John Innes Institute, Norwich, U.K.; viz též Bibb et al., 1985, Gene 41: 357-368) trávením restrikčními enzymy BglII a EcoRI, po kterém následovala elektroforésa a přečištění fragmentu z gelu. Tento 1,7 kb fragment byl ligován do pGEM7Zf (Promega), který byl tráven BamHI a EcoRI a ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost 1,7 kb insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plasmid byl označen jako pSE27.
pSE118 (popsaný výše) byl tráven Sphl a BamHI, produkt trávení byl zpracován elektroforesou a 2,8 kb SphI/BamHI insert byl přečištěn z gelu. pSE119 byl tráven Pstl a EcoRI, produkt trávení byl zpracován elektroforesou a 1,5 kb Pstl/EcoRI insert byl přečištěn z gelu. Kyvadlový vektor pWHM3 byl tráven BamHI a EcoRI. pSE27 byl tráven Pstl a Sphl, produkt trávení byl zpracován elektroforesou a 1,7 kb Pstl/Sphl insert byl přečištěn z gelu. pSE118 (popsaný výše) byl tráven Sphl a BamHI, produkt trávení byl zpracován elektroforesou a 2,8 kb SphI/BamHI insert byl přečištěn z gelu. Všechny čtyři fragmenty (t.j. 2,8 kb, 1,5 kb, 7,2 kb, 1,7 kb) byly ligovány dohromady ve 4-cestné ligaci. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Plasmid byl označen jako pSE180 (obr. 3; ATCC 209605).
pSE180 byl transformován do S. lividans TK64 a transformované kolonie byly identifikovány podle resistence na thiostrepton a erythromycin. pSE180 byl izolován ze S. lividans a byl použit pro transformaci protoplastů S.avermitilis. Byly • * identifikovány 4 transformanty S.avermitilis resistentní na thiostrepton a byly připraveny protoplasty, které byly umístěny na plotny za neselektivních podmínek do RM14 media. Po regeneraci protoplastů byly jednotlivé kolonie vyšetřovány na přítomnost resistence na erythromycin a na nepřítomnost resistence na thiostrepton, což ukazuje na chromosomální integraci inaktivovaného aveC genu a na ztrátu volného replikonu. Byl identifikován ErmrThios transformant a byl označen jako kmen SE180-11. Z kmene SE180-11 byla izolována celková chromosomální DNA, byla trávena restrikčními enzymy BamHI, HindlII, Pstl nebo Sphl, byla zpracována elektroforesou na 0,8% agarosovém gelu, byla přenesena na nylonové membrány a byla hybridizována ermE sondou. Tyto analýzy ukázaly, že došlo k chromosomální integraci ermE genu pro resistenci a současné deleci 640 bp Pstl/Sphl fragmentu dvojitým crossing-overem.
HPLC analýza fermentačních produktů kmene SE180-11 ukázala, že normální avermektiny nebyly nadále produkovány (obr. 5A).
Ve druhé metodě pro inaktivaci aveC genu byl 1,7 kb ermE gen odstraněn z chromosomu S.avermitilis kmene SE180-11, za zanechání 640 bp Pstl/Sphl delece v aveC genu. Genový přenosový plasmid byl konstruován následujícím způsobem: pSE180 byl částečně tráven Xbal a 11,4 kb fragment byl přečištěn z gelu. 11,4 kb proužek neobsahoval 1,7 kb ermE gen pro resistenci. DNA byla potom ligována a byla transformována do E. coli DH5a buněk. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tento plasmid, který byl označen jako pSE184, byl transformován do E. coli DMI a plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin.
Tento plasmid byl použit pro transformaci protoplastů S.avermitilis kmene SE180-11. Protoplasty byly připraveny z transformantů kmene SE180-11 resistentních na thiostrepton a • * • « byly umístěny jako jednotlivé kolonie na RM14. Po regeneraci protoplastů byly jednotlivé kolonie testovány na nepřítomnost jak resistence na erythromycin, tak resistence na thiostrepton, která ukazuje na chromosomální integraci inaktivní aveC alely a na ztrátu volného replikonu obsahujícího ermE gen. Byl identifikován jeden ErmrThios transformant a byl označen jako SE184-1-13. Analýza fermentačních produktů kmene SE184-1-13 ukázala, že normální avermektiny nebyly nadále produkovány a že SE184-1-13 má stejný fermentační profil jako SE180-11.
Ve třetí metodě pro inaktivaci aveC genu byl do chromosomálního aveC genu vložen posun čtecího rámce přidáním dvou G po C v nukleotidové pozici 471 za použití PCR, což vytvoří BspEl místo. Přítomnost upraveného BspEl místa byla užitečná pro detekci genové substituce. PCR primery byly navrženy tak, aby vkládaly mutaci posouvající čtecí rámec do aveC genu a byly získány od Genosys Biotechnologies, lne. Pravostranný primer měl sekvenci: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO: 8) a levostranný primer měl sekvenci:
5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 9). PCR podmínky byly stejné jako v příkladu 2, sekci 10. 666 bp PCR produkt byl tráven Sphl za vzniku dvou fragmentů délky 278 bp a 388 bp. 388 bp fragment byl přečištěn z gelu.
Plasmid pro genovou náhradu byl piřpraven následujícím způsobem: kyvadlový vektor pWHM3 byl tráven EcoRI a BamHI. pSE119 byl tráven BamHI a Sphl, produkt trávení byl zpracován elektroforesou a 840 bp fragment byl přečištěn z gelu. pSE119 byl tráven EcoRI a XmnI, produkt trávení byl zpracován elektroforesou a 1,7 kb fragment byl přečištěn z gelu. Všechny čtyři fragmenty (t.j. 7,2 kb, 840 bp, 1,7 kb a 388 bp) byly ligovány dohromady 4-cestnou ligací. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk. Plasmidová
DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou a potom analýzou DNA sekvence. Tento plasmid, který byl označen pSE185, byl transformován do E. coli DMI a plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin. Tento plasmid byl použit pro transformaci protoplastů S. avermitilis kmene 1100-SC38. Transformanty 1100-SC38 resistentní na thiostrepton byly izolovány a jejich fermentační produkty byly analyzovány HPLC analýzou. pSE185 neměnil po transformaci do S. avermitilis kmene 1100-SC38 významně poměr B2:B1 avermektinů (Tabulka 2).
pSE185 byl použit pro transformaci protoplastů S. avermitilis pro generování mutací posunu čtecího rámce v chromosomálním aveC genu. Protoplasty byly připraveny z transformantů resistentních na thiostrepton a byly naočkovány jako jednotlivé kolonie na RM14. Po regeneraci protoplastů byly jednotlivé kolonie vyšetřovány na absenci resistence na thiostrepton. Chromosomální DNA z kolonií resistentních na thiostrepton byly izolována a byla analyzována PCR na přítomnost mutací způsobujících posun čtecího rámce, které byly integrovány do chromosomu. PCR primery byly navrženy na základě aveC nukleotidové sekvence a byly získány od Genosys Biotechnologies, lne. (Texas). Pravostranný PCR primer měl sekvenci: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO: 10) a levostranný PCR primer měl sekvenci: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO: 11). PCR podmínky byly stejné jako v příkladu 2, sekci 10. Získaný 543 bp PCR produkt byl tráven BspEI za vzniku tří fragmentů délky 368 bp, 96 bp a 79 bp, což ukazuje na chromosomální integraci inaktivovaného aveC gelu a na ztrátu volného replikonu.
Fermentační analýza S. avermitilis mutantů obsahujících mutaci způsobující posun čtecího rámce v aveC genu ukázala, že normální avermektiny nebyly nadále produkovány a že tyto mutanty mají stejné HPLC profily fermentace jako kmeny SE180-11 a SE184-1-13. Byl identifikován jeden Thios transformant a byl označen jako kmen SE185-5a.
Dále, byly připraveny mutace v aveC genu, které mění nukleotid v pozici 520 z G na A, což vede ke změně kodonu kódujícího tryptofan (W) v pozici 116 na terminační kodon. Kmen S. avermitilis s touto mutací neprodukoval normální avermektiny a měl stejný fermentační profil jako kmeny SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5a.
Dále byly připraveny mutace v aveC genu, které mění jak: (i) nukleotid v pozici 97 z G na A, což mění aminokyselinu v pozici 256 z glycinu (G) na aspartat (D); a (ii) nukleotid v pozici 996 z T na C, což mění aminokyselinu v pozici 275 z tyrosinu (Y) na histidin (H). Kmen S. avermitilis s těmito mutacemi (G256D/Y275H) neprodukoval normální avermektiny a měl stejný fermentační profil jako kmeny SE180-11, SE184-1-13 a SE185-5a.
Kmeny SE180-11, SE184-1-13, SE185-5 a další zde uvedené kmeny S. avermitilis nesoucí aveC inaktivující mutace jsou nástrojem pro hodnocení vlivu jiných mutací v aveC genu. pSE186, který obsahuje přirozenou kopii aveC genu, byl transformován do E. coli DMI a plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin. Tato pSE186 DNA byla použita pro transformaci protoplastů kmene pSEl80-ll S. avermitilis. Byly izolovány transformanty kmene SE180-11 resistentní na thiostrepton, byla stanovena přítomnost resistence na erythromycin a produkty fermentace ThiorErmr transformantů byly analyzovány HPLC. Přítomnost funkčního aveC « » genu v transformantech nahrazovala normální produkci avermektinů v kmenu SE180-11 (obr. 5B).
2. Analýza mutací aveC genu, které ovlivňují poměr tříd B2:B1
Jak bylo popsáno výše, S. avermitilis kmen SE180-11 obsahující inakvitní aveC gen byl komplementován transformací plasmidem obsahujícím funkční aveC gen (pSE186). Kmen SE180-11 byl také použit jako hostitelský kmen pro charakterizaci dalších mutací v aveC genu, jak je popsáno dále.
Chromosomální DNA byla izolována z kmenu 1100-SC38 a byla použita jako templát pro PCR amplifikaci aveC genu. 1,2 kb ORF byl izolován PCR amplifikaci za použití primerů navržených podle aveC nukleotidové sekvence. Pravostranný primer měl sekvenci SEQ ID NO: 6 a levostranný primer měl sekvenci SEQ ID NO: 7 (viz příklad 2). Podmínky PCR a subklonování byly stejné, jak je popsáno v příkladu 2. Analýza DNA sekvence 1,2 kb ORF ukázala mutaci v aveC genu, která mění nukleotid v pozici 337 z C na T, což mění aminokyselinu v pozici 55 ze šeřinu (S) na fenylalanin (F). aveC gen obsahující S55F mutaci byl subklonován do pWHM3 za vzniku plasmidu, který byl oznančen pSE187 a který byl použit pro transformaci protoplastů S. avermitilis kmene SE180-11. Transformanty kmene SE180-11 resistentní na thiostrepton byly izolovány, byla stanovena přítomnost resistence na erythromycín a produkty fermentace ThiorErmr transformantů byly analyzovány HPLC. Přítomnost aveC genu kódujícího změnu v aminokyselinovám zbytku 55 (S55F) nahrazovala normální produkci avermektinů v kmenu SE180-11 (obr. 5C); nicméně, poměr cyklohexyl B2: cyklohexyl B1 byl přibližně 26:1, ve srovnání s kmenem SE180-11 transformovaným pSE!86, který měl poměr B2:B1 přibližně 1,6:1 (tabulka 3), což • · ·* ·β ·· ukazuje na to, že jediná mutace (S55F) ovlivňuje poměr produkovaných cyklohexyl B2: cyklohexyl Bl avermektinů.
Byla identifikována jiná mutace v aveC genu, která mění nukleotid v pozici 862 z G na A, což mění aminokyselinu v pozici 230 ze glycinu (G) na aspartat (D). Kmen S. avermitilis nesoucí tuto mutaci (G230D) produkoval avermektiny v poměru B2:B1 přibližně 30:1.
3. Mutace redukující poměr B2:B1
Bylo vytvořeno několik mutací, které snižují množství produkovaného cyklohexyl B2 ku cyklohexyl Bl.
Byla identifikována mutace v aveC genu, která mění nukleotid v pozici 588 z G na A, což mění aminokyselinu v pozici 139 z alaninu (A) na threonin (T). aveC gen obsahující A139T mutaci byl subklonován do pWHM3 za vzniku plasmidu, který byl označen pSE188 a který byl použit pro transformaci protoplastů S. avermitilis kmene SE180-11. Transformanty kmene SE180-11 resistentní na thiostrepton byly izolovány, byla stanovena přítomnost resistence na erythromycin a produkty fermentace ThiorErmr transformantů byly analyzovány HPLC. Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího změnu v aminokyselinovém zbytku 139 (A139T) obnovila produkci avermektinů v kmenu SE180-11 (obr. 5D); nicméně, poměr B2:B1 byl přibližně 0,94:1, což ukazuje, že tato mutace snižuje poměr cyklohexyl B2:cyklohexyl Bl. Tento výsledek byl neočekávaný, protože publikované výsledky, stejně jako výsledky mutací popsaných výše, vedly pouze k inaktivaci aveC genu nebo ke zvýšení produkce B2 formy avermektinů vzhledem k Bl formě (tabulka 3).
• ·
Protože A139T mutace mění B2:B1 poměr ve prospěch Bl, byla připravena mutace, která kóduje threonin místo šeřinu v aminokyselinové pozici 138. pSE186 byl tráven EcoRI a byl klonován do pGEM3Zf (Promega), který byl tráven EcoRI. Tento plasmid, který byl označen jako pSE186a, byl tráven Apal a KpnI, DNA fragmenty byly separovány na agarosovém gelu a dva fragmenty 3,8 kb a 0,4 kb byly přečištěny z gelu. 1,2 kb DNA insert z pSE186 byl použit jako PCR templát pro vložení jednonukleotidové substtuce v pozici 585. PCR primery byly navrženy tak, aby vkládaly mutaci v nukleotidové pozici 585 a byly získány od Genosys Biotechnologies Inc. (Texas). Pravostranný PCR primer měl sekvence:
5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 12); a levostranný PCR primer měl sekvenci:
5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO: 13). PCR reakce byla provedena za použití Advantage GC genomic PCR kitu (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) v pufru dodávaném výrobcem za přítomnosti 200 M dNTP, 200 pmol každého primeru, 50 ng templátové DNA, 1,0 M GC-Melt a 1 jednotky KlenTaq Polymerase Mix v konečném objemu 50 μΐ. Teplotní profil prvního cyklu byl 94 °C po dobu 1 minut; potom 25 cyklů o 94 °C, 30 sekund a 68 °C, 2 minuty; a 1 cyklus při 68 °C, 3 minuty. PCR produkt délky 295 bp byl tráven Apal a KpnI za vzniku 254 bp fragmentu, který byl zpracován elektroforesou a přečištěn z gelu. Všechny tři fragmenty (3,8 kb, 0,4 kb a 254 bp) bylyligovány dohromady 3cestnou ligací. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tento plasmid byl označen pSE198.
• · «· * * ·· * ♦ · * • · · « · » «· * • · · * ” · * • ····» *· * * · ·»**··• · · 9 ·· · » ·« · · · » pSE198 byl tráven EcoRI, byl klonován do pWHM3, který byl tráven EcoRI a byl transformován do E. coli DH5a. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou a potom analýzou DNA sekvence. Tato plasmidová DNA byla transformována do E. coli DMI a plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou a potom analýzou DNA sekvence. Tento plasmid, který byl označen jako pSE199, byl použit pro transformaci protoplastů S. avermitilis kmene SE180-11. Transformanty kmene SE180-11 resistentní na thiostrepton byly izolovány, byla stanovena přítomnost resistence na erythromycin a fermentační produkty ThiorErmr transformatů byly analyzovány HPLC analýzou.
Přítomnost mutovaného aveC genu kódujícího změnu v aminokyselinovém zbytku 138 (S138T) nahrazovala normální produkci avermektinů v kmenu SE180-11; nicméně, poměr B2:B1 byl přibližně 0,88:1, což ukazuje, že tato mutace snižuje produkci cyklohexyl B2 vzhledem k cyklohexyl B1 (tabulka 3). Tento poměr B2:B1 je ještě nižší, než poměr 0,94:1 pozorovaný pro A139T mutaci připravenou transformací kmene SE180-11 pSEl88, jak bylo popsáno výše.
Byla připravena jiná mutace pro vložení threoninu do aminokyselinových pozic 138 a 139. 1,2 kb DNA insert z pSE186 byl použit jako DNA temlát. PCR primery byly navrženy tak, aby vkládaly mutace v nukleotidových pozicích 585 a 588 a byly získány od Genosys Biotechnologies, lne. (Texas). Pravostranný PCR primer měl sekvenci:
5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3 ' (SEQ ID NO: 14); a levostranný PCR primer měl sekvenci:
5' -GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). PCR reakce byla provedena za podmínek uvedených v tomto příkladu výše. PCR • · · · produkt délky 449 bp byl tráven Apal a KpnI za vzniku 254 bp fragmentu, který byl zpracován elektroforesou a přečištěn z gelu. pSE186a byl tráven Apal a KpnI, DNA fragmenty byly separovány na agarosovém gelu a dva fragmenty délky 3,8 kb a 0,4 kb byly přečištěny z gelu. Všechny tři fragmenty (3,8 kb, 0,4 kb a 254 bp) byly ligovány dohromady 3-cestnou ligací a ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tento plasmid byl označen pSE230.
pSE230 byl tráven EcoRI, byl klonován do pWHM3, který byl tráven EcoRI a byl transformován do buněk E. coli DH5cc. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou a potom analýzou DNA sekvence. Tento plasmid byl transformován do E. coli DMI a plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tento plasmid, který byl označen jako pSE231, byl použit pro transformaci protoplastů S. avermitilis kmene SE18011. Transformanty kmene SE180-11 resistentní na thiostrepton byly izolovány, byla stanovena přítomnost resistence na erythromycin a ThiorErmr transformaty byly analyzovány fermentací. Přítomnost dvojitě mutovaného aveC genu kódujícího S138T/A139T nahrazovala normální produkci avermektinů v kmenu SE180-11; nicméně, poměr B2:B1 byl přibližně 0,84:1, což ukazuje, že tato mutace dále snižuje produkci cyklohexyl B2 vzhledem k cyklohexyl Bl (tabulka 3) na ještě nižší poměr, než je snížení pozorované při transformaci kmenu SE180-11 pSE188 nebo pSE199, jak bylo popsáno výše.
• · • ·
Tabulka 3
Kmen S. avermitilis Počet testovaných Relativní Relativní Průměrný
(transformační plasmid) transformantů konc. B2 konc. B1 poměr B2:B1
SE180-11 (žádný) 30 0 0 0
SE180-11 (pWHM3) 30 0 0 0
SE180-11 (pSE186) 26 222 140 1,59
SE180-11 (pSE187) 12 283 11 26, 3
SE180-11 (pSE188) 24 193 206 0,94
SE180-11 (pSE199) 18 155 171 0,88
SE180-11 (pSE231) 6 259 309 0,84
Tyto výsledky jsou první demonstrací specifických mutací aveC genu, které vedou k produkci vyšších množství komerčně výhodnějších avermektinů třídy 1 vzhledem k avermektinům třídy
2.
Příklad 4: Konstrukce 5'-delečních mutantů
Jak bylo uvedeno výše, S. avermitilis nukleotidová sekvence uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) obsahuje čtyři různé GTG kodony v pozicích 42, 174, 177 a 180, které jsou potenciálními start kodony. Tento příklad popisuje konstrukci mnohotných deleci 5' regionu aveC ORF (obr. 1, SEQ ID NO: 1), které byly provedeny pro stanovení toho, které z těchto kodonů mohou fungovat jako start kodony v aveC ORF pro expresi proteinů.
Fragmenty aveC genu s různými delecemi na 5' konci byly izolovány z chromosomální DNA S. avermitilis PCR amplifikací. PCR primery byly navrženy podle aveC DNA sekvence a byly získány od Genosys Biotechnologies, lne. Pravostranné primery měly sekvence: 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID NO: 16) (D1F1);
5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID NO: 17) (D1F2);
5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID NO: 18) (D1F3); a 5'TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID NO: 19) (D2F2). Levostranné primery měly sekvence: 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID NO: 20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 21); a 5'AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID NO: 22). PCR reakce byla provedena způsobem popsaným v příkladu 3.
PCR produkty byly separovány elektroforesou na 1% agarosovém gelu a byl detekován jeden proužek délky buď 1,0 kb, nebo 1,1 kb. PCR produkty byly přečištěny z gelu a byly ligovány s 25 ng linearizovaného pCR2.1 vektoru (Invitrogen) v molárním poměru vektor:insert 1:10, podle návodu výrobce. Ligační směsi byly použity pro transformaci One Shot™ kompetentních E. coli buněk (Invitrogen) podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost insertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou DNA sekvence. Tyto plasmidy byly označeny pSE190 (získaný pomocí primeru D1F1), pSE191 (získaný pomocí primeru D1F2), pSE192 (získaný pomocí primeru D1F3) a pSEl93 (získaný pomocí primeru D2F2).
DNA inserty byly všechny tráveny BamHI/Xbal, byly separovány elektroforesou, přečištěny z gelu a odděleně ligovány s kyvadlovým vektorem pWHM3, který byl tráven BamHI/Xbal, v celkové DNA koncentraci 1 μg v molárním poměru vektor:insert 1:5. Ligační směsi byly použity pro transformaci kompetentních E. coli DH5cc buněk. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tyto plasmidy byly označeny pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) apSE197 (D2F2), které byly každý zvlášť transformovány do E. coli DMI, • *
Ί9
999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tyto DNA byly použity pro transformaci protoplastů S. avermitilis kmene SE180-11. Transformanty kmene SE180-11 resistentní na thiostrepton byly izolovány, byla stanovena přítomnost resistence na erythromycin a produkty fermentace ThiorErmr transformatů byly analyzovány HPLC analýzou pro stanovení toho, které z GCG míst je nutné pro aveC expresi. Výsledky ukazují, že GTG kodon v pozici 42 může být eliminován bez narušení aveC exprese, protože pSE194, pSE195 a pSE196, které neobsahují GTG v pozici 42, ale které obsahují všechna další tři GTG místa v pozicích 174, 177 a 180, byly schopné obnovit normální produkci avermektinů při transformaci do SE180-11. Normální produkce avermektinů nebyla obnovena po transformaci kmene SE180-11 pSE197, který neobsahuje žádné ze čtyř GTG míst (Tabulka 4).
Tabulka 4
Kmen S. avermitilis Počet testovaných Relativní Relativní Průměrný
(transformační plasmid) transformantů konc. B2 konc. B1 poměr B2:B1
SE180-11 (žádný) 6 0 0 0
SE180-11 (pWHM3) 6 0 0 0
SE180-11 (pSE186) 6 241 152 1,58
SE180-11 (pSE194) 6 35 15 2,43
SE180-11 (pSE195) 6 74 38 1, 97
SE180-11 (pSE196) 6 328 208 1,58
SE180-11 (pSE197) 12 0 0 0
Příklad 5: Klonování aveC homologů ze S. hygroscopicus a S. griseochromogenes
Předkládaný vynález umožňuje identifikaci a klonování genů homologických k aveC z jiných kmenů Streptomyces produkujících avermektin nebo milbemycin. Například, kosmidová knihovna S. hygroscopicus (FERM-BP-1901) genomové DNA byla hybridizována s 1,2 kb aveC sondou ze S. avermitilis, jak byla popsána výše. Bylo identifikováno několik kosmidových klonů, které vykazovaly silnou hybridizací. Chromosomální DNA byla izolována z těchto kosmidů a byl identifikován 4,9 kb fragment, který hybrídizoval s aveC sondou. Tato DNA byla sekvenována a byla identifikován ORF (SEQ ID NO: 3), který vykazoval významnou homologii s aveC ORF S. avermitilis. Aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 4) odvozená od S. hygroscopicus homologického aveC ORF je uvedena na obr. 6.
Dále, kosmidová knihovna genomové DNA S. griseochromogenes byla hybridizována s 1,2 kb aveC sodnou ze S. avermitilis, jak byla popsány výše. Bylo identifikováno několik silně hybridizujících kosmidových klonů. Chromosomální DNA byla izolována z těchto kosmidů a byl identifikován 5,4 kb Pstl fragment, který hybrídizoval s aveC sondou. Tato DNA byla sekvenována a byl identifikován parciální ORF homologický s aveC, který měl významnou homologii s aveC ORF S. avermitilis. Odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 5) je uvedena na obr. 6.
Analýza DNA a aminokyselinové sekvence aveC homologů S. hygroscopicus a S. griseochromogenes ukázaly, že tyto regiony mají významnou homologii (přibližně 50% identitu sekvence na úrovni aminokyselin) jak navzájem, tak s aveC S. avermitilis a AveC genovým produktem (obr. 6).
Příklad 6: Konstrukce plasmidů s aveC genem za ermE promotorem • · • ·
1,2 kb aveC ORF z pSE186 byl subklonován v pSE34, což je kyvadlový vektor pWHM3 obsahující 300 bp ermE promotor insertovaný jako Kpn/BamHI fragment v Kpn/BamHI místě pWHM3 (viz Ward et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 203: 468-478). pSE186 byl tráven BamHI a HindlII, produkt trávení byl zpracován elektroforesou a 1,2 kb fragment byl izolován z agarosového gelu a ligován s pSE34, který byl tráven BamHI a HindlII. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk podle návodu výrobce. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost 1,2 kb insertu byla potvrzena restrikční analýzou. Tento plasmid, který byl označen pSE189, byl transformován do E. coli DMI a plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin. Protoplasty kmene 1100-SC38 S. avermitilis byly transformovány pSE189. Transformanty kmene 1100-SC38 resistentní na thiostrepton byly analyzovány a produkty jejich transformace byly analyzovány HPLC.
Transformanty kmene 1100-SC38 S. avermitilis produkovaly změněný poměr cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů (přibližně 3:1), ve srovnání s kmenem 1100-SC38 (přibližně 34:1) a celková produkce avermektinů byla zvýšena na přibližně 2,4-násobek ve srovnání s kmenem 1100-SC38 transformovaným pSE119 (tabulka 5).
pSE189 byl transformován také do protoplastů přirozeného kmene S. avermitilis. Byly izolovány transformanty resistentní na thiostrepton a produkty fermentace byly analyzovány HPLC. Celkové množství avermektinů produkované přirozenými S. avermitilis transformovanými pSE189 bylo zvýšeno přibližně na 2,2-násobek ve srovnání s přirozenými S. avermitilis transformovanými pSE119 (tabulka 5).
Tabulka 5
Kmen S. avermitilis (transformační plasmid) Počet testovaných transformantů Relat. množství B2 Relat. množství Bl Relativní množství celkových avermektinů Průměrný poměr B2:B1
1100-SC38 6 155 4,8 176 33, 9
1100-SC38 (pSE119) 9 239 50,3 357 4,7
1100-SC38 (pSE189) 16 546 166 849 3,3
přirozený 6 59 42 113 1,41
přirozený (pSE119) 6 248 151 481 1,64
přirozený (pSE189) 5 545 345 1,071 1,58
Příklad 7: Chimérický plasmid obsahující sekvence aveC ORF S. avermitilis a aveC homologu S. hygroscopicus
Byl připraven hybridní plasmid označený pSE350, který bsahoval 564 bp část aveC homologu S. hygroscopicus nahrazující 564 bp homologickou část aveC ORF S. avermitilis (obr. 7). pSE350 byl připraven za pužití BsaAI restrikčního místa, které je konzervované v obou sekvencích (aveC pozice 225) a KpnI restrikčního místa, které je přítomné v aveC genu S.
avermitilis (aveC pozice 810). KpnI místo bylo vloženo do DNA S. hygroscopicus PCR za použití pravostranného primeru 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 23) a levostranného primeru 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 24) (od Genosys Biotechnologies), za použití PCR podmínek popsaných v příkladu 2. Produkt PCR byl tráven BsaAI a KpnI, fragmenty byly separovány elektroforesou na 1% agarosovém gelu a z gelu byl izolován 564 bp BsaAI/Kpnl fragment. pSE179 (popsaný v příkladu
2, sekci 10) byl tráven KpnI a HindlII a fragmenty byly separovány elektroforesou na 1% agarosovém gelu a z gelu byl izolován 4,5 kb fragment. pSE179 byl tráven HindlII a BsaAI, fragmenty byly separovány elektroforesou na 1% agarosovém gelu a z gelu byl izolován 0,2 kb BsaAI/HindlII fragment. 4,5 kb HindlII/KpnI fragment, 0,2 kb BsaAI/HindlII fragment a 564 bp BsaAI/Kpnl fragment ze S. hygroscopicus byly ligovány dohromady
3-cestnou ligaci a ligačni směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5a buněk. Plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou za použití KpnI a Aval. Plasmid byl tráven HindlII a Xbal za zisku 1,2 kb insertut, který byl potom ligován s pWHM3, který byl tráven HindlII a Xbal. Ligační směs byla transformována do kompetentních E. coli DH5ct buněk, plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou za použití HindlII a Aval. Tato plasmidová DNA byla transformována do kompetentních E. coli DMI buněk, plasmidová DNA byla izolována z transformantů resistentních na ampicilin a přítomnost správného insertu byla potvrzena restrikční analýzou a analýzou DNA sekvence. Tento plasmid byl označen pSE350 a byl použit pro transformaci protoplastů S. avermitilis kmene SE18011. Transformanty kmene SE180-11 resistentní na thiostrepton byly izolovány, byla stanovena přítomnost resistence na erythromycin a fermentační produkty ThiorErmr transformatů byly analyzovány HPLC analýzou. Výsledky ukazují, že transformanty obsahující S. avermitilis/S. hygroscopicus hybridní plasmid produkují průměrný poměr B2:B1 přibližně 109:1 (tabulka 6).
Tabulka 6
Kmen S. avermitilis Počet testovaných Relativní Relativní Průměrný
(transformační plasmid) transformantů konc. B2 konc. Bl poměr B2:B1
SE180-11 (žádný) 8 0 0 0
SE180-11 (pWHM3) 8 0 0 0
SE180-11 (pSE350) 16 233 2 109
Uložení biologických materiálů
Následující biologický materiál byl uložen v American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 29.1.1998, pod následujícími přírůstkovými čísly:
Plasmid Přírůstkové č.
plasmid pSE180 209605 plasmid pSE186 209604
Všechny výše citované patenty, patentové přihlášky a publikace jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.
Předkládaný vynález není omezen popsanými specifickými provedeními, které jsou uvedeny pro dokreslení jednotlivých aspektů vynálezu, a funkčně ekvivalentní metody a složky spadají do rozsahu vynálezu. Kromě toho, různé modifikace vynálezu, kromě popsaných modifikací, budou jasné odborníkům v oboru z uvedeného popisu a připojených výkresů. Takové modifikace spadají do rozsahu připojených patentových nároků.
Seznam sekvencí <110> Pfizer Products lne. (všechny přihlášky mimo U.S.) <120> Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:Bl avermektinů <130> PC9916A <140>
<141>
<150> 60/074636 <151> 1998-02-13 <160> 24 <170> Patentln verš. 2.0 - beta <210> 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220>
<221> CDS <222> (174)..(1085) <400> 1
tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60
tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120
aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg 176
Val
gtg Val gtg Val tgg gcc ggg gtc Val ggc Gly ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac Tyr 224
Trp Ala '5 Gly Leu Leu 10 Phe Leu Ala Leu Gin 15 Ala
gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag acg 272
Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr
20 25 30
gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat gtg 320
Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val
35 40 45
gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc ačc gcc gcg gca aca tnn
416
L..Z:xí 86 4· • * • • ··>· V» d r • 4· •» ·» # * T *
Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala Trp
50 55 60 65
ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa ega cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt
Leu Phe Arg Arg cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu
70 75 80
tec ctc ggg ctg ctg ttc gcg age tgg cag age ccg ctc atg aac
Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gin Ser Pro Leu Met Asn
85 90 95
tgg tec ca* tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg
Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val
100 105 110
ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg ggt
Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin Gly Ala Gly Pro Gly
115 120 125
gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg tcg gcc tcc gtc tgc atg tcg get
Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala
130 135 140 145
ctg atc gtc acc gtg ctg tgc age aag gca ctg ggg tgg atc aag gcc
Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys Ala
150 155 160
cgc cgg ccg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc
Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe Phe
165 170 175
are ggc atc gtg ctc ggt ctg tcc gag ccg ctg ccg tcc gcc tcc ggg
Zle Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly
180 185 190
atc age gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc
Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly
195 200 205
gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc
Glu Trp Tyr Gin Phe Pro Val Tyr Gin Ala Val Gly Ser Gly Leu Val
210 215 220 225
tgc tgc atg ctg ggc tcg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag
Cvs Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu
230 235 240
tec tgg gtg gaa cgg gga gcc tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg aac
Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gin Arg Ala Ala Asn
245 250 255
464
512
560
608
656
704
752
800
848
896
944
tgg Trp gcg Ala cgc Arg 260 ttc Phe ctc Leu gcc Ala gtg Val gtc Val 265 ggt Gly ggg gtg aat Asn gcc gtg atg Met ttc Phe 992
Gly Val Ala 270 Val
ctc tac acc tgt ttc cat atc ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ccg 1040
Leu Tyr Thr cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gin Pro
275 280 285
ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa g<=g ccg gcc gct tac tga 1085
Pro Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr
290 295 300
gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145 ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205 i
acactcctcg gttcagcgat catg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> S. avermitilis <400> 2
Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gin Ala 15 10 15
Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu i 20 25 30 !
Thr Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp 35 40 45
Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60
Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala 65 70 75 80
Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gin Ser Pro Leu Met í
90 95 I
Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala
100 105 110 j
Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin Gly Ala Gly Pro 115 120 125 • »
Gly Alci Glu Ale Glu. 130 Met Pro 135 Leu Ala Ser Ala Ser 140 Val Cys Met Ser
Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys
145 150 155 160
Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe
165 170 175
Phe Tle Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser
180 185 190
Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser
195 200 205
Gly Glu Trp Tyr Gin Phe Pro Val Tyr Gin Ala Val Gly Ser Gly Leu
210 215 220
Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp
225 230 235 240
Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gin Arg Ala Ala
245 250 255
Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met
260 265 270
Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gin
275 280 285
Pro Pro Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr
290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <22 0>
<221> CDS <222> (58) . . (990) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg
Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val
5 10 15
105
ctg gga ctt cag gtg tac gtg
Leu Gly Leu Gin 20 Val Tyr Val
tac cgc atc gag aag gcg tcc
Tyr Arg Ile 35 Glu Lys Ala Ser
cgg atc gcc gat gtg ctg atc
Arg Ile 50 Ala Asp Val Leu Ile 55
gtc ctc gca gtg tgt ctg tac
Val 65 Leu Ala Val Cys Leu 70 Tyr
acg ttc gac gcg tcg ctc ttc
Thr Phe Asp Ala Ser 85 Leu Phe
agt ccc ttg atg aac tgg atc
Ser Pro Leu Met 100 Asn Trp Ile
gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg
Val Phe Gly Ala Val Ala Ser
115
ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac agc ggc
Phe Ala 25 Ala Trp Leu Ala Asp 30 Ser Gly
ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag
Pro 40 Ala Arg Gly Gly Gly 45 Asp Ser Glu
ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg
Pro Leu Leu Ser Val 60 Val Gly Ala Val
cgg agg tat cgg gcc agg agg cgg ctg
Arg Arg Cys Arg 75 Ala Arg Arg Arg Leu 80
atc ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag
Ile Gly Leu 90 Leu Ser Ala Ser Trp 95 Gin
aat ccg gtg ctc gcg tca aac gtc aat
Asn Pro 105 Val Leu Ala Ser Asn 110 Val Asn
tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag
Trp 120 Gly Pro Tyr Val Pro 125 Gly Trp Gin
153
201
249
297
345
393
441 ggg gcg ggg gcg cac cag gag gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg agc Gly Ala Gly Ala His Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser
130 135 140 atc tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg
Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met
145 150 155 160 ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc
Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile
165 170 175 gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg
Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu
180 185 190
489
537
585
633 gtg tcc Val Ser ttc gcg ggc gtc tcc gtg Phe Ala Gly Val Ser Val 195 200 tgg acg cgg gca Trp Thr Arg Ala gtg ccc gag ctg Val Pro Glu Leu 205 acc atc tgg agt ggg cac tgg tat Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr cag ttc ccg ctg Gin Phe Pro Leu tat cag atg gtg Tyr Gin Met Val
681
729 • ·
210 215 220
gct Ala 225 tcg Ser gcg Ala ctc Leu ttc ggc gcc tet ttg Leu ggg Gly gcc Ala 235 gcg Ala ege Arg cac His ttt Phe ege Arg 240 777
Phe Gly 230 Ala Ser
aac cgg ege ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg 825
Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro
245 250 255
gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873
Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
260 265 270
aac atc age atc gcc ctc tac acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg 921
Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu
275 280 285
rte tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969
Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe
290 295 300
cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatgt 1020
Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 gcggccgggg 1150 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 4
Val 1 Phe Thr Leu Pro 5 Val Thr Leu Trp Ala 10 Cys Val Gly Ala Leu 15 Val
Leu Gly Leu Gin 20 Val Tyr Val Phe Ala 25 Ala Trp Leu Ala Asp 30 Ser Gly
Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu
40 45
Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60
91 ....... • · « · * • • · · · · * • * • ·
t * ..
Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu
65 70 75 80
Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin
85 90 95
Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn
100 105 110
Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin
115 120 125
Gly Ala Gly Ala His Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser
130 135 140
Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met
145 150 155 160
Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile
165 170 175
Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu
‘180 185 190
Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu
195 200 205
Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gin Phe Pro Leu Tyr Gin Met Val
210 215 220
Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg
225 230 235 240
Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro
245 250 255
Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
260 265 270
Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu
275 280 285
Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe
290 295 300
Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 • · <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400> 5
Val 1 Ile Gly Trp Ala Ala 5 Leu Gly Ala Val 10 Phe Leu Val Leu Gin 15 Val
Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp
20 25 30
Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp
35 40 45
Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe
50 55 60
Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala
65 70 75 80
Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met
85 90 95
Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala
100 105 110
Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro
115 120 125
Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr
130 135 140
Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gin Val Met Ser Arg Val Arg
145 150 155 160
Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gin Leu Val Gly Leu Ala Phe
165 170 175
Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala
180 185 190
Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg
195 200 205
Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 ♦ ♦ <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 rcacgaaacc ggacacac <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 2C ggttccggat gccgttctcg <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <4 00> 9 aactccggtc gactcccctt c ·?τ <210> <211> <212> <213> <4 00>
DNA
Streptomyces avermitilis 10 gcaaggatac ggggactac • · • « <210> <211> <212> <213> <4 00>
DNA
Streptomyces avermitilis 11 gaaccgaccg cctgatac <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Streptomyces avermitilis 12 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg <210> <211> <212> <213> <4 00>
DNA
Streptomyces avermitilis 13 ggaaccgacc gcctgataca <210> <211> <212> <213> <4 00>
DNA
Streptomyces avermitilis 14 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Streptomyces avermitilis 15 ggaacatcac ggcattcacc • · • « • · · * ·
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Streptomyces
<4 00> 16
aacccatccg agccgctc
Ϊ8 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 17 tcggcctgcc aacgaac <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 18 ccaacgaacg tgtagtag
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Streptomyces
<400> 19
tgcaggcgta cgtgttcagc <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Streptomyces avermitilis catgatcgct gaaccga <210> <211> <212> <213> <4 00>
DNA
Streptomyces avermitilis 21 catgatcgct gaaccgagga <210> <211> <212> <213> <4 00>
DNA
Streptomyces avermitilis 22 aggagtgtgg tgcgtctgga <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Streptomyces avermitilis 23 cttcaggtgt acgtgttcg <210> <211> <212> <213> <4 00>
DNA
Streptomyces avermitilis gaactggtac cagtgccc >· · * · * ·· f------' ·« · · ·· ··
část. kde tato molekula
Patentové η

Claims (71)

1. Izolovaná polynukleotidové molekula ORF S. avermitilis nebo jeho významnou neobsahuje další úplný ORF, který je umístěn za aveC ORF in sítu v chromosomu S. avermitilis.
2. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 1 obsahující stejnou nukleotidovou sekvenci, jako je kódující sekvence pro AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo nukleotidovou sekvenci stejnou jako je nukleotidové sekvence aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1), nebo její významná část.
3. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 2, která dále obsahuje nukleotidové sekvence, které za přirozeného stavu sousedí s aveC genem in sítu v S. avermitilis.
4. Izolovaná polynukleotidové molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která je homologické ke kódující sekvenci pro AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSEl86 (ATCC 209604), nebo k nukleotidové sekvenci aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1), nebo její významné části.
5. Izolovaná polynukleotidové molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologické k aminokyselinové sekvenci kódované sekvencí kódující AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo k aminokyselinové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), nebo její významné části.
6. Izolovaná polynukleotidové molekula obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3 nebo její významnou část, nebo nukleotidovou sekvenci, která je homologická k nukleotidové sekvenci SEQ ID NO: 3.
7. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, který je homologický k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 4.
8. Oligonukleotidová molekula, která hybridizuje na polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO: 3, nebo na polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k nukleotidové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO: 3, za podmínek vysoké přísnosti.
9. Oligonukleotidová molekula podle nároku 8, která je komplementární k nukleotidové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO: 3, nebo k polynukleotidové molekule mající nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k nukleotidové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo SEQ ID NO: 3.
10. Rekombinantní vektor vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z:
(a) nukleotidové sekvence, která je stejná jako kódující sekvence pro AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo která je stejná jako nukleotidová sekvence aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1), nebo její významná část;
(b) nukleotidové sekvence, která je homologická ke kódující sekvenci pro AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo k nukleotidové sekvenci aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1), nebo její významné části; a
ΤΓ»'· (c) nukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je homologická k aminokyselinové sekvenci kódované kódující sekvenci pro AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo k aminokyselinové sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), nebo její významné části.
11. Rekombinantní vektor podle nároku 10 vyznačuj ící se t i m, že dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující jeden nebo více regulačních elementů, kde tato nukleotidové sekvence kódující regulační elementy je v operativní vazbě s nukletidovou sekvencí podle nároku 10.
12. Rekombinantní vektor podle nároku 11 vyznačuj ící se t i m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selektovatelný markér.
13. Rekombinantní vektor podle nároku 12 vyznačuj ící se t i m, že se jedná o plasmid pSE186 (ATCC 209604).
14. Hostitelská buňka vyznačující se tim, že obsahuje rekombinantní vektor podle nároku 12.
15. Hostitelská buňka podle nároku 14 vyznačuj ící se t i m, že jí je Streptomyces avermitilis.
16. Rekombinantní vektor vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 3 nebo její významné části; nukleotidové sekvence, která je homologická k nukleotidové sekvenci SEQ ID NO: 3; a nukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid, který je homologický k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 4.
r *
100 í
r »··
17. Rekombinantní vektor podle nároku 16 vyznačuj ící se t í m, že dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující jeden nebo více regulačních elementů, kde tato nukleotidová sekvence kódující regulační elementy je v operativní vazbě s nukletidovou sekvencí podle nároku 16.
18. Rekombinantní vektor podle nároku 17 vyznačuj ící se t i m, že obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selektovatelný markér.
19. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní vektor podle nároku 18.
20. Hostitelská buňka podle nároku 19 vyznačuj ící se tím, žejíje Streptomyces hygroscopicus.
21. Rekombinantně exprimovaný AveC genový produkt S.
avermitilis mající aminokyselinovou sekvenci kodovanou nukleotidovou sekvencí kódující AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 2, nebo její významné části, nebo polypeptid k němu homologický.
22. Rekombinantně exprimovaný genový produkt S. hygroscopicus homologický k AveC mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4, nebo polypeptid k němu homologický.
23. Způsob přípravy rekombinantního AveC genové produktu vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci hostitelské buňky transformované rekombinantním expresním vektorem, kde uvedený rekombinantní expresní vektor obsahuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci „'••Φ-.Χ-..• ·
101 kódující aminokyselinovou sekvenci kodovanou kódující sekvencí pro AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604), nebo kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo její významnou část, kde tato polynukleotidová molekula je v operativní vazbě s jedním nebo více regulačními elementy, které kontrolují expresi polynukleotidové molekuly v hostitelské buňce, kde tato kultivace je provedena za podmínek umožňujících produkci rekombinantního AveC genového produktu, a získání AveC genového produktu z buněčné kultury.
24. Způsob přípravy rekombinantního produktu genu homologického k AveC vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci hostitelské buňky transformované rekombinantním expresním vektorem, kde uvedený rekombinantní expresní vektor obsahuje polynukleotidovou molekulu mající nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4 nebo její významnou část, kde tato polynukleotidová molekula je v operativní vazbě s jedním nebo více regulačními elementy, které kontrolují expresi polynukleotidové molekuly v hostitelské buňce, kde tato kultivace je provedena za podmínek umožňujících produkci rekombinantního produktu genu homologického k AveC, a získání AveC genového produktu z buněčné kultury.
25. Polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovu sekvenci, která je stejná jako sekvence kódující AveC genový produkt S. avermitilis z plasmidu pSE186 (ATCC 209604) nebo nukleotidová sekvence aveC ORF S. avermitilis, jak je uvedena na obr. 1 (SEQ ID NO: 1) s tou výjimkou, že tato nukleotidová sekvence dále obsahuje jednu nebo dvě mutace, takže buňky S. avermitilis kmene ATCC 53692, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a které exprimují polynukleotidovou molekulu obsahující mutovanou nukleotidovou sekvenci, produkují avermektiny v odlišném poměru a množství, než jsou produkovány « 9
102 buňkami S. avermitilis kmene ATCC 53692, které exprimuji pouze přirozenou aveC alelu.
26. Polynukleotidová molekula podle nároku 25, která ovlivňuje produkci avermektinů tak, že buňky S. avermitilis kmene ATCC 53692, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a které exprimuji polynukleotidovou molekulu podle nároku 25, produkuji avermektiny ve sníženém poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání s buňkami S. avermitilis ATCC 53692, které exprimuji pouze přirozenou alelu.
27. Polynukleotidová molekula podle nároku 26, kde avermektiny třídy 2:třídy 1 jsou cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektiny.
28. Polynukleotidová molekula podle nároku 27, kde snížený poměr cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů je menší než
1,6:1.
29. Polynukleotidová molekula podle nároku 28, kde snížený poměr cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů je přibližně 0,94:1.
30. Polynukleotidová molekula podle nároku 29, kde mutace S. avermitilis aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) kóduje aminokyselinovou substituci ve zbytku 139 AveC genového produktu z alaninu na threonin.
31. Polynukleotidová molekula podle nároku 28, kde snížený poměr cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů je přibližně 0,88:1.
32. Polynukleotidová molekula podle nároku 31, kde mutace S. avermitilis aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) kóduje • ·
103 aminokyselinovou substituci ve zbytku 138 AveC genového produktu ze šeřinu na threonin.
33. Polynukleotidová molekula podle nároku 28, kde snížený poměr cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektinů je přibližně 0,84:1.
34. Polynukleotidová molekula podle nároku 33, kde mutace S. avermitilis aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) kóduje první aminokyselinovou substituci ve zbytku 138 AveC genového produktu ze šeřinu na threonin a druhou aminokyselinovou substituci ve zbytku 139 AveC genového produktu z alaninu na threonin.
35. Polynukleotidová molekula podle nároku 25, kde mutace S. avermitilis aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) kóduje aminokyselinovou substituci ve zbytku 55 AveC genového produktu ze šeřinu na fenylalanin.
36. Polynukleotidová molekula podle nároku 25, kde mutace S. avermitilis aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) kóduje aminokyselinovou substituci ve zbytku 230 AveC genového produktu z glycinu na aspartat.
37. Polynukleotidová molekula obsahující silný promotor v operativní vazbě se S. avermitilis aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1).
38. Polynukleotidová molekula podle nároku 37, kde silný promotor je ermE promotor ze Saccharopolyspora erythraea.
39. Polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt, který byl inaktivován insercí • »
104 heterologní nukleotidové sekvence do uvedené nukleotidové sekvence.
40. Polynukleotidová molekula podle nároku 25 obsahující aveC alelu, která byla inaktivována deleci 640 bp Pstl/Sphl fragmentu z aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1).
41. Polynukleotidová molekula podle nároku 25 obsahující aveC alelu, která byla inaktivována vložením mutace způsobující posun čtecího rámce do alely.
42. Polynukleotidová molekula podle nároku 41, do které byla vložena mutace způsobující posun čtecího rámce přidáním dvou G nukleotidů po C nukleotidu v nukleotidové pozici 471 aveC ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1).
43. Polynukleotidová molekula podle nároku 25 obsahující aveC alelu, která byla inaktivována vložením terminačního kodonu v nukleotidové pozici, která kóduje aminokyselinu 116 AveC genového produktu S. avermitilis.
44. Polynukleotidová molekula podle nároku 25 obsahující aveC alelu, která byla inaktivována vložením první mutace v aminokyselinové pozici 256 AveC genového produktu, která mění glycin na aspartat, a druhé mutace v pozici 275 AveC genového produktu, která mění tyrosin na histidin.
45. Genový substituční vektor vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotidovou molekulu obsahující nukleotidové sekvence, které za přirozeného stavu sousedí s aveC ORF in šitu v chromosomu S. avermitilis.
• · • ·
105
46. Rekombinantní vektor vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotidovou molekulu podle jakéhokoliv z nároků 25 až 44.
47. Rekombinantní vektor obsahující polynukleotidovou molekulu podle nároku 39 vyznačující se tím, že jde o vektor pSE180 (ATCC 209605).
48. Hostitelská buňka Streptomyces vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní vektor podle nároku 46.
49. Způsob pro identifikaci mutací aveC ORF schopných měnit poměr produkovaných avermektinů třídy 2:třídy 1 vyznačující se tím, že obsahuje: (a) stanovení poměru avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a do kterých byla vložena a ve kterých je exprimována polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt; (b) stanovení poměru avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis jako v kroku (a), které však exprimují pouze aveC alelu mající nukleotidovou sekvenci ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo nukleotidovou sekvenci homologickou k této sekvenci; a (c) srovnání poměru avermektinů třídy 2-.třídy 1 produkovaných buňkami S. avermitilis kroku z (a) s poměrem avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), kdy pokud je poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S. avermitilis kroku z (a) odlišný od poměru avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), tak byla identifikována mutace aveC ORF schopná měnit poměr avermektinů třídy 2:třídy 1.
• · *
106
50. Způsob podle nároku 49vyznačující se tím, že poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 je snížen v důsledku mutace.
51. Způsob pro identifikaci mutací aveC ORF nebo genetických konstruktů schopných měnit množství produkovaných avermektinů vyznačující se tím, že obsahuje: (a) stanovení avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis, ve kterých byla přirozená aveC alela inaktivována a do kterých byla vložena a ve kterých je exprimována polynukleotidová molekula obsahující nukleotidovou sekvenci kódující mutovaný AveC genový produkt, nebo obsahující genetický konstrukt obsahující nukleotidovou sekvenci kódující AveC genový produkt; (b) stanovení množství avermektinů produkovaných buňkami stejného kmene S. avermitilis jako v kroku (a), které však exprimují pouze aveC alelu mající nukleotidovou sekvenci ORF podle obr. 1 (SEQ ID NO: 1) nebo nukleotidovou sekvenci homologickou k této sekvenci; a (c) srovnání množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis kroku z (a) s množstvím avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), kdy pokud je množství avermektinů třídy produkovaných buňkami S. avermitilis kroku z (a) odlišné od množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis z kroku (b), tak byla identifikována mutace aveC ORF schopná měnit množství avermektinů.
52. Způsob podle nároku 51 vyznačující se tím, že množství produkovaných avermektinů je zvýšeno v důsledku mutace.
53. Způsob přípravy nových kmenů S. avermitilis obsahujících buňky, které exprimují mutovanou aveC alelu a produkují pozměněný poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 ve srovnání • ·
107 s buňkami stejného kmene S. avermitilis, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu vyznačující se tím, že obsahuje transformaci buněk kmene S. avermitilis vektorem, který obsahuje mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, který mění poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu, a selekci transformovaných buněk, které produkují avermektiny v pozměněném poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání s poměrem avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami kmene exprimujícího pouze přirozenou alelu.
54. Způsob podle nároku 53 vyznačující se tím, že poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 je snížen v důsledku mutace.
55. Způsob přípravy nových kmenů S. avermitilis obsahujících buňky, které produkují pozměněné množství avermektinů vyznačující se tím, že obsahuje transformaci buněk kmene S. avermitilis vektorem, který obsahuje mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, jehož exprese vede ke změně množství avermektinů produkovaných buňkami kmene S. avermitilis exprimujících mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene, které exprimují pouze přirozenou aveC alelu, a selekci transformovaných buněk, které produkují avermektiny v pozměněném množství ve srovnání s množstvím avermektinů produkovaných buňkami kmene exprimujícího pouze přirozenou alelu.
56. Způsob podle nároku 55 vyznačující se tím, že množství produkovaných avermektinů je zvýšeno v důsledku mutace.
• ·
108
57. Způsob přípravy nových kmenů S. avermitilis jejichž buňky obsahující inaktivovanou aveC alelu vyznačující se t i m, že obsahuje transformaci buněk kmene S. avermitilis vektorem, který inaktivuje aveC alelu, a selekci transformovaných buněk, ve kterých byla aveC alela inaktivována.
58. Způsob podle nároku 57 vyznačující se tím, že vektorem je pSE 180 (ATCC 209605).
59. Kmen S. avermitilis vyznačující se tím, že obsahuje buňky exprimující mutovanou aveC alelu, což způsobuje produkci avermektinů těmito buňkami v pozměněném poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání s buňkami exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu.
60. Kmen podle nároku 59 vyznačující se tím, že poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 je snížen v důsledku mutace.
61. Kmen podle nároku 60 vyznačující se tím, že buňky produkují cyklohexyl B2:cyklohexyl Bl avermektiny v poměru menším než 1,6:1.
62. Kmen podle nároku 61 vyznačující se tí m, že buňky produkují cyklohexyl B2:cyklohexyl Bl avermektiny v poměru menším než 0,94:1.
63. Kmen podle nároku 61 vyznačující se tím, že buňky produkují cyklohexyl B2:cyklohexyl Bl avermektiny v poměru menším než 0,88:1.
• 9 • » • 9
109
64. Kmen podle nároku 61 vyznačující se tím, že buňky produkují cyklohexyl B2:cyklohexyl B1 avermektiny v poměru menším než 0,84:1.
65. Kmen S. avermitilis vyznačující se tím, že obsahuje buňky exprimující mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt, což způsobuje produkci avermektinů těmito buňkami ve vyšším množství ve srovnání s buňkami exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu.
66. Kmen S. avermitilis vyznačující se tím, že obsahuje buňky, ve kterých byl aveC gen inaktivován.
67. Způsob výroby avermektinů vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci buněk kmene S. avermitilis, kde tyto buňky exprimují mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, který mění poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene neexprimujícími mutovanou alelu a exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu, v kultivačním mediu za podmínek umožňujících nebo indukujících produkci avermektinů těmito buňkami, a získání uvedených avermektinů z kultury.
68. Způsob podle nároku 67 vyznačující se tím, že poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 je snížen v důsledku mutace.
69. Způsob výroby avermektinů vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci buněk kmene S. avermitilis, kde tyto buňky exprimují mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt obsahující aveC alelu, které mění množství avermektinů produkovaných buňkami S. avermitilis exprimujícími • · • ·
110 mutovanou aveC alelu nebo genetický konstrukt ve srovnání s buňkami stejného kmene neexprimujícími mutovanou alelu či genetický konstrukt a exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu, v kultivačním mediu za podmínek umožňujících nebo indukujících produkci avermektinů těmito buňkami, a získání uvedených avermektinů z kultury.
70. Způsob podle nároku 69 vyznačující se tím, že množství produkovaných avermektinů je zvýšeno v důsledku exprese mutované aevC alely nebo genetického konstruktu.
71. Přípravky obsahující avermektiny produkované buňkami kmene S. avermitilis, kde tyto buňky exprimují mutovanou aveC alelu kódující genový produkt, který snižuje poměr avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaných buňkami S. avermitilis exprimujícími mutovanou aveC alelu ve srovnání s buňkami stejného kmene neexprimujícími mutovanou alelu a exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu, kde avermektiny jsou produkovány ve sníženém poměru třídy 2:třídy 1 ve srovnání s poměrem avermektinů třídy 2:třídy 1 produkovaným buňkami stejného kmene S. avermitilis neexprimujícími mutovanou aveC alelu a exprimujícími pouze přirozenou aveC alelu.
CZ20002794A 1999-01-25 1999-01-25 Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů CZ20002794A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20002794A CZ20002794A3 (cs) 1999-01-25 1999-01-25 Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20002794A CZ20002794A3 (cs) 1999-01-25 1999-01-25 Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20002794A3 true CZ20002794A3 (cs) 2000-11-15

Family

ID=5471478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002794A CZ20002794A3 (cs) 1999-01-25 1999-01-25 Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ20002794A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2281935A1 (en) Streptomyces avermitilis regulatory genes for increased avermectin production
US6511841B2 (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
KR100499214B1 (ko) 아베르멕틴의 b2:b1의 비를 제어할 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유전자
US6632673B1 (en) Directing the ratio of B2:B1 avermectins in Streptomyces avermitilis host cells
KR100718378B1 (ko) Ｂ2:ｂ1 아베르멕틴의 비를 제어하는 스트렙토마이세스아베르미틸리스 유전자
CZ20002794A3 (cs) Gen Streptomyces avermitilis řídící poměr B2:B1 avermektinů
MXPA00007915A (en) I(streptomyces avermitilis) gene directing the ratio of b2:b1 avermectins